具有改善生長(zhǎng)特征的木本植物以及使用轉(zhuǎn)錄因子制備它們的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于從使用生物信息學(xué)工具、來自EST測(cè)序和DNA陣列的數(shù)據(jù)鑒定的大量候選基因中選擇具有可能的商業(yè)價(jià)值表型的基因的新型大規(guī)模分析平臺(tái)。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了產(chǎn)生相比于野生型具有提高的生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植物的方法。所述方法包括在植物中改變?cè)谀举|(zhì)形成的不同階段中特異性表達(dá)的至少一種基因的基因產(chǎn)物水平。這可以使用轉(zhuǎn)基因方法或特定雜交方法進(jìn)行。本發(fā)明的另一些方面提供了具有根據(jù)本發(fā)明調(diào)節(jié)的基因表達(dá)的植物細(xì)胞或植物后代和木材。另一些方面涉及包含本發(fā)明核苷酸序列的DNA構(gòu)建體以及包含所述DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞或植物后代。
【專利說明】具有改善生長(zhǎng)特征的木本植物以及使用轉(zhuǎn)錄因子制備它們的方法
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2008年12月18日、申請(qǐng)?zhí)枮椤?00880127543.2”、發(fā)明名稱為“具有改善生長(zhǎng)特征的木本植物以及使用轉(zhuǎn)錄因子制備它們的方法”的中國專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)是國際申請(qǐng)PCT / SE2008 / 051495的中國國家階段申請(qǐng)。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明一般地涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，還涉及改善植物生長(zhǎng)特征的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及用于表型修飾植物和轉(zhuǎn)基因植物以及通過特定雜交方法獲得的植物的方法，所述植物具有改變的基因表達(dá)，其導(dǎo)致改變的生長(zhǎng)表型。本發(fā)明還提供了可用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體。另外，本發(fā)明涉及所述植物的植物細(xì)胞或植物后代，以及本發(fā)明的植物產(chǎn)生的木材。
【背景技術(shù)】
[0003]目前，林木工程和分子育種的主要目標(biāo)是改進(jìn)木材的品質(zhì)和產(chǎn)量。全球?qū)δ局破返男枰磕暝鲩L(zhǎng)約1.7%，盡管已經(jīng)達(dá)到或超過全球森林的最大可持續(xù)收獲率，但是木材消耗量仍在增加。因此，需要提高全世界的種植木材生產(chǎn)。作為對(duì)日益增加的大氣CO2的響應(yīng)，林業(yè)栽植還具有作為碳回收作物(carbon sequestration crop)的優(yōu)點(diǎn)。類似地,希望來自非木本植物的生物質(zhì)生產(chǎn)的增加，例如以滿足對(duì)能源生產(chǎn)原料的需要。因此，改變高等植物細(xì)胞發(fā)育過程中的特定過程具有很大的商業(yè)價(jià)值，這不僅是指改善樹木的特性，還包括其它植物。
[0004]通過頂端分生組織實(shí)現(xiàn)的植物生長(zhǎng)使得一系列初生組織發(fā)育，還使得莖和根伸長(zhǎng)。除了初生生長(zhǎng)外，木本物種還發(fā)生次生生長(zhǎng)，從形成層產(chǎn)生次生組織“木質(zhì)”。次生生長(zhǎng)提聞了莖和根的周長(zhǎng)。
[0005]多年生植物例如長(zhǎng)壽樹種具有顯著不同于一年生植物例如擬南芥(Arabidopsis)的生活方式，因?yàn)槎嗄晟参锢鐦渚哂袩o限的生長(zhǎng)，而諸如擬南芥的植物在植物開花時(shí)生長(zhǎng)終止。擬南芥植株的最終尺寸在許多方面取決于從萌芽到開花和結(jié)籽的發(fā)育程序。一個(gè)實(shí)例是這些事件發(fā)生時(shí)間的任何變化可顯著改變植物的大小。
[0006]多年生植物還在活躍生長(zhǎng)期和休眠期之間循環(huán)。在活躍生長(zhǎng)期間，葉進(jìn)行光合作用，捕獲能量，然后其用于驅(qū)動(dòng)多種細(xì)胞過程。轉(zhuǎn)化為蔗糖的固定碳輸送到莖組織和頂芽，在休眠狀態(tài)期間存儲(chǔ)在這里，最初作為淀粉，后來作為蔗糖。隨著休眠解除之后生長(zhǎng)重新開始，該蔗糖轉(zhuǎn)移至活躍生長(zhǎng)的組織，因?yàn)閺?fù)蘇的早期階段在光合作用開始之前進(jìn)行。類似地，對(duì)于氮，氨基酸也轉(zhuǎn)移到莖和頂端組織，在休眠期間儲(chǔ)存為貯藏蛋白，隨著生長(zhǎng)的開始發(fā)生分解。因此，長(zhǎng)壽樹種的生活周期與一年生作物有顯著差異，一年生作物經(jīng)常將碳和氮轉(zhuǎn)移到種子中。由于一年生作物和多年生植物例如樹的這些差異，產(chǎn)量的決定因素和測(cè)量它們的能力很可能有很大差異。事實(shí)上，在許多情況下，模式系統(tǒng)(如歐美楊(PopulustremulaX tremuloides))更可靠地發(fā)現(xiàn)可用于增加生物質(zhì)生產(chǎn)的基因。例如,對(duì)于一年生作物，已經(jīng)提出將種子大小/產(chǎn)量作為植物大小和生產(chǎn)力的度量，但是情況不太可能是這樣，因?yàn)槎嗄晟参锢鐦淠疽ㄙM(fèi)數(shù)年才能開花，因此，種子產(chǎn)量(即便是的話)僅僅是在植物開花的年份中占優(yōu)勢(shì)的生長(zhǎng)條件指示。所以，直接轉(zhuǎn)用一年生作物中的研究和發(fā)現(xiàn)不太可能對(duì)樹木有用。
[0007]樹木生物質(zhì)中非常重要的一部分存在于莖組織中。此生物質(zhì)的積累是葉的光合作用和氮獲得以及營養(yǎng)再分配到多種細(xì)胞過程的結(jié)果。因此，葉的大小、葉光合作用、根系獲得氮能力的大小都可以是決定植物生產(chǎn)力和生物質(zhì)生產(chǎn)的重要因素。但是，僅用它們自身并不能解釋整個(gè)生物質(zhì)生產(chǎn)。例如，葉大小并不總是與生物質(zhì)相關(guān)，因?yàn)槿~大小可存在顯著的變化。此外，作物應(yīng)對(duì)脅迫的能力是生物質(zhì)生產(chǎn)的重要決定因素。因此，為了提高樹木的生物質(zhì)生產(chǎn)，需要改變幾種因素。
[0008]此外，木質(zhì)密度是生物質(zhì)生產(chǎn)提高的重要性狀，木質(zhì)密度的提高使得運(yùn)輸體積減少,并且單位體積中含有更多的能量含量。因此，即使總生物質(zhì)不增加,增加密度也是有意義的。密度的重要性還在于其顯示出，高度和直徑可測(cè)量生長(zhǎng)的提高并不與木質(zhì)密度的減少相偶聯(lián)。
[0009]一種增加生長(zhǎng)的方式是了解更多的基因功能并且使用這些信息增加生長(zhǎng)和生物質(zhì)生產(chǎn)。這些基因功能的知識(shí)和使用這些知識(shí)的方法描述于本專利中。
[0010]大多數(shù)基因已在許多植物中得到鑒定，例如擬南芥(Arabidopsis thaliana)(Arabidopsis Genome Initiative2000)和歐美楊(Populus tremulaX tremuloides)(Sterky 等 2004)以及毛果楊(Populus trich ocarpa) (Tuskan 等 2006)。
[0011]Hertzberg等2001和Schrader等2005已經(jīng)使用轉(zhuǎn)錄譜分析來顯示木質(zhì)部發(fā)育過程中數(shù)千個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄序位(transcriptional hierarchy)并提供表達(dá)數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)可利于進(jìn)一步闡明具有未知功能的許多基因White等1999 ；Aharoni等2000。
[0012]仍存在的一個(gè)問題是如何鑒定參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂以及其它生長(zhǎng)相關(guān)過程的可能最重要的基因。在本發(fā)明中，我們檢測(cè)了許多轉(zhuǎn)錄因子的用途，在過表達(dá)時(shí)其導(dǎo)致出人意料的生長(zhǎng)增加。選擇轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析的原因是已知它們?cè)诨钌?包括植物)中是許多(如果不是大多數(shù)的話)過程的部分調(diào)節(jié)子。預(yù)計(jì)，擬南芥含有1500種不同的轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)序列同源性其可分為約30個(gè)亞類(Riechmann等2000)。某些轉(zhuǎn)錄因子在植物中的功能與所調(diào)節(jié)的基因緊密相關(guān)，例如，盡管轉(zhuǎn)錄因子亞類(如MYB類)中的轉(zhuǎn)錄因子是相似的，但是已知它們調(diào)節(jié)植物中若干不同的過程。轉(zhuǎn)錄因子是通過抑制或活化特定基因或含有不同基因的基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄起始來調(diào)芐基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。
[0013]特別地，以前已經(jīng)有過在植物中靶向轉(zhuǎn)錄因子，以發(fā)現(xiàn)可用于改變植物特征的基因。例如在W002 / 15675中，分析了很多轉(zhuǎn)錄因子，并提到了它們中許多的可能應(yīng)用。US2007 / 0039070描述并列出了很多按樹(Eucalyptus)和福射松(Pinus radiata)的轉(zhuǎn)錄因子基因，并推測(cè)了這些基因的用途。本文中，我們給出了在顯著增加生長(zhǎng)方面具有工業(yè)意義效果的特定轉(zhuǎn)錄因子，并有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。
[0014]盡管，從使用DNA陣列技術(shù)進(jìn)行的表達(dá)研究、基因組測(cè)序和EST程序得到的結(jié)果顯然可驗(yàn)證基因在何處何時(shí)表達(dá)，但是僅從這些類型的分析工具不太可能闡明基因的生物和/或技術(shù)功能。為了分析和驗(yàn)證基因功能，必須進(jìn)行功能表征，例如通過基因失活和/或基因過表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。但是 ，為了能夠鑒定目的基因以及最出人意料的商業(yè)特征，必須基于功能性分析以及用多種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量生長(zhǎng)增加來評(píng)價(jià)候選基因。
[0015]MYB轉(zhuǎn)錄因子。本文給出的基因之一(SEQ ID NO:12)屬于MYB類轉(zhuǎn)錄因子。在擬南芥中，MYB轉(zhuǎn)錄因子家族預(yù)計(jì)有約180個(gè)成員(Riechmann等2000)。在植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了MYB基因的幾種不同功能(Jin和Martinl999)。更具體地說，就我們所知，與SEQ ID NO:12密切相關(guān)的基因未顯示出參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)速度和生物質(zhì)生產(chǎn)。密切相關(guān)的基因AT2G01060和AB192880顯示參與生物脅迫應(yīng)答，US2003101481和Katou等2005。
[0016]SET結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(Ng等2007)。本文給出的基因之一 SEQ ID NO:11屬于SET結(jié)構(gòu)域類轉(zhuǎn)錄因子。SET結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。已知擬南芥基因組含有至少29種有活性的set結(jié)構(gòu)域蛋白。就我們所知，與SEQ ID N0:11密切相關(guān)的基因未顯示出參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)速度和生物質(zhì)生產(chǎn)。
[0017]bHLH類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子在植物中是一個(gè)大的轉(zhuǎn)錄因子類別，例如在擬南芥中，預(yù)計(jì)有約139個(gè)成員(Riechmann等2000)。bHLH蛋白已經(jīng)顯示參與了許多不同的過程,有關(guān)水稻中的綜述參見Xiaoxing等2006。本文給出的基因之一 SEQ ID NO: 10屬于bHLH類轉(zhuǎn)錄因子。就我們所知，與SEQ ID:10密切相關(guān)的基因未顯示出參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)速度和生物質(zhì)生產(chǎn)。
[0018] 基因SEQ ID:9屬于同源盒(Homeobox)類基因。與使用構(gòu)建體TF0013過表達(dá)的基因最接近的擬南芥同源物預(yù)計(jì)為AT1G23380。與使用構(gòu)建體TF0013過表達(dá)之基因相關(guān)的馬鈴薯(Solarium tuberosum)同源物的過表達(dá)降低了生長(zhǎng)、節(jié)間長(zhǎng)度和葉片大小(US7265263)。過表達(dá)與構(gòu)建體TF0013過表達(dá)之基因相關(guān)的擬南芥同源物改變了葉片形態(tài)(US7265263, US20070022495和W001036444)。通過改變構(gòu)建體TF0013過表達(dá)的基因的表達(dá)水平來提高產(chǎn)量和生物質(zhì)生產(chǎn)，這在之前是未知的。
[0019]IAA / AUX類轉(zhuǎn)錄因子是主要發(fā)現(xiàn)于植物中的一小類轉(zhuǎn)錄因子(預(yù)計(jì)在擬南芥中有26個(gè)成員，Riechmann等2000)。對(duì)應(yīng)于SEQID:13的基因?qū)儆谠擃?，其由Moyle等2002描述。就我們所知，與SEQ ID:13密切相關(guān)的基因未顯示參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)速度和生物質(zhì)生產(chǎn)。
[0020]WRKY基因家族。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在植物中是一個(gè)大的基因家族。預(yù)計(jì)水稻中有超過90個(gè)成員，預(yù)計(jì)擬南芥有74個(gè)成員(Ulker和SomSSich2004)。與WRKY基因最相關(guān)的功能之一是傷口和病原體防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及與非生物脅迫相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，和針對(duì)非生物和生物脅迫的抗性。
[0021]本文給出的基因中有八個(gè)屬于WRKY類轉(zhuǎn)錄因子。
[0022]SEQ ID:4和SEQ ID:7屬于WRKY基因的一個(gè)亞類。就我們所知，與SEQ ID:4和SEQ ID:7密切相關(guān)的基因未顯示出參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)速度和生物質(zhì)生產(chǎn)。
[0023]SEQ ID:1屬于WRKY基因的另一個(gè)亞類。與基因SEQ ID:1密切相關(guān)的擬南芥同源物(AT2G23320)被認(rèn)為參與C / N感受(US20060272060)、改變?nèi)~片大小(US7238860、US20030226173、US20040019927 和 TO02015675)以及改變種子蛋白質(zhì)含量(US20030226173)。根據(jù)專利申請(qǐng)W004087952，還認(rèn)為AT2G23320參與對(duì)過氧化物脅迫的反應(yīng)和適應(yīng)。US20040019927、US7238860、US20030226173、W002015675 提到基因 AT2G23320涉及葉片大小提聞和樹聞增加，并推測(cè)該基因的過表達(dá)可用于增加生長(zhǎng)和生物質(zhì)生廣。在本文中我們顯示，SEQ ID:1可用于樹木中，從而以工業(yè)顯著程度增加生長(zhǎng)。
[0024]SEQ ID:6屬于WRKY基因的一個(gè)亞類，該亞類與SEQ ID:1所屬亞類相關(guān)，但是明顯不同于這一基因類別。與該基因密切相關(guān)的基因已知在擬南芥中是基礎(chǔ)抗性的負(fù)調(diào)節(jié)物。Journot-Catalino等2006。認(rèn)為密切相關(guān)的基因AT4G31550與種子異戊二烯基脂類和種子葉黃素水平相關(guān)(US20060195944和US20070022495以及W001035727)。另一個(gè)預(yù)測(cè)的SEQID:6的擬南芥同源物AT2G24570被認(rèn)為參與C / N感受(US20070022495和20060272060)。就我們所知，與SEQ ID:6密切相關(guān)的基因未顯示出參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)速度和生
物質(zhì)生產(chǎn)。
[0025]SEQ ID:2屬于WRKY基因的另一個(gè)亞類。就我們所知，與SEQ ID:2密切相關(guān)的基因未顯示出參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)速度和生物質(zhì)生產(chǎn)。
[0026]SEQ ID:3和SEQ ID:5屬于一個(gè)大的含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域的WRKY基因類別。根據(jù)專利申請(qǐng)W02007003409，SEQ ID:3和SEQ ID:5的許多含有兩個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域的相關(guān)同源物被認(rèn)為在水稻(Oryza sativa)中參與改變種子產(chǎn)量和花數(shù)。通過改變表達(dá)水平來提高生長(zhǎng)和生物質(zhì)生產(chǎn)的用途之前是未知的。
[0027]SEQ ID:8屬于WRKY基因的另一個(gè)亞類。密切相關(guān)的擬南芥基因AT4G23810已知減少植物大小，并參與改變種子蛋白質(zhì)含量(US20030226173)。另一個(gè)相關(guān)的擬南芥同源物(ATSG24110)已知參與改變種子蛋白質(zhì)含量和誘導(dǎo)早開花(US20030226173)。就我們所知，與SEQID:8密切相關(guān)的基因未顯示出參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)速度和生物質(zhì)生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0028]本發(fā)明涉及可用于增加生長(zhǎng)的新基因。通過使用著眼于基于多種標(biāo)準(zhǔn)的組合來分析生長(zhǎng)行為的分析平臺(tái)發(fā)現(xiàn)了所述基因。本發(fā)明提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其通過改變選自滿足所述標(biāo)準(zhǔn)的一組基因的一種或多種基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明涉及用于表型修飾植物和轉(zhuǎn)基因植物以及通過特異性雜交方法獲得的植物的方法，所述植物具有改變的基因表達(dá)，從而導(dǎo)致修飾的生長(zhǎng)表型。本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體。另外，本發(fā)明涉及所述植物的植物細(xì)胞或植物后代，以及本發(fā)明植物產(chǎn)生的具有出人意料的優(yōu)良性能的木材。
[0029]使用該分析平臺(tái)分析的許多基因顯示令人感興趣的并且經(jīng)常是出人意料的商業(yè)特性。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了產(chǎn)生與其野生型相比具有出人意料高生長(zhǎng)的植物的方法，其包括改變(增加)植物中屬于轉(zhuǎn)錄因子序列SEQ ID:1-13、97-115之一的至少一種基因的基因產(chǎn)物的水平。
[0030]可通過將在溫室中在18小時(shí)光周期、22°C / 15°C (白天/夜晚)的溫度下培養(yǎng)八周且每周用1:100稀釋的Weibulls Rika S NPK7-1-5施肥的一組轉(zhuǎn)基因植物與相同條件下培養(yǎng)的一組野生型植物進(jìn)行比較，來觀察所述生長(zhǎng)的增加。
[0031]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物或者有意改變(增加)了 SEQID:1-13,97-115之一種基因的水平并包含重組多核苷酸的植物的植物細(xì)胞或植物后代。
[0032]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了由具有如上所述特征的目的植物產(chǎn)生的生物質(zhì)和其產(chǎn)物。
[0033]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含至少一種本文所述序列的DNA構(gòu)建體。
[0034]最后，本發(fā)明的一方面提供了包含根據(jù)本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞或植物后代?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0035]圖1顯示了具有所示四種不同數(shù)據(jù)點(diǎn)線性回歸線的高度生長(zhǎng)曲線實(shí)例，黑色回歸線顯示最大高度生長(zhǎng)速度。
[0036]發(fā)明詳述
[0037]定義
[0038]在詳細(xì)討論本發(fā)明之前，首先定義下列術(shù)語和習(xí)慣用語:
[0039]術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物”指含有在相同物種、變種或栽培種的野生型植物中不存在的遺傳物質(zhì)的植物。所述遺傳物質(zhì)可包括轉(zhuǎn)基因、插入誘變事件(例如通過轉(zhuǎn)座子或T-DNA插入誘變)、活化標(biāo)簽序列、突變序列、同源重組事件或通過嵌合修復(fù)術(shù)(chimeraplasty)修飾的序列。通常，外源遺傳材料是通過人為操縱引入植物中的。該術(shù)語還指已經(jīng)插入遺傳物質(zhì)作為選擇標(biāo)記的植物。這些選擇標(biāo)記的實(shí)例包括卡那霉素、潮霉素、膦絲菌素、氯磺隆、甲氨蝶呤、慶大霉素、大觀霉素、咪唑啉酮、d-氨基酸和草甘膦。
[0040]在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“生長(zhǎng)”包括初生生長(zhǎng)，其包括莖和根的延長(zhǎng)，還包括植物的次生生長(zhǎng)， 其包括從形成層產(chǎn)生次生組織——“木質(zhì)”，以及莖和根周長(zhǎng)的增加。因此，“提高的生長(zhǎng)”這一表述在上下文中涉及在相同生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物與轉(zhuǎn)基因植物所來源的野生型植物相比生長(zhǎng)的提高。如下所述，如果植物滿足下文實(shí)施例中所定義的“生長(zhǎng)差異選擇標(biāo)準(zhǔn)”至少之一的話，則轉(zhuǎn)基因植物表征為具有提高的生長(zhǎng)。
[0041]術(shù)語“表型”在本文上下文中指單個(gè)植物的總體物理表現(xiàn)，例如生長(zhǎng)。上下文中所用的不同生長(zhǎng)表型的實(shí)例列于下表1.2中。
[0042]術(shù)語“基因”廣義地表示與生物學(xué)功能相關(guān)的任何DNA區(qū)段。基因包括編碼序列和/或其表達(dá)所需的調(diào)節(jié)序列?；蜻€包括非表達(dá)DNA核酸區(qū)段，其例如形成其它蛋白質(zhì)的識(shí)別序列(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其它調(diào)節(jié)區(qū))?？蓮亩喾N來源獲得基因，包括從目的來源克隆或者從已知或預(yù)測(cè)的序列信息合成，并且可包括設(shè)計(jì)具有所需參數(shù)的序列。
[0043]“過表達(dá)”表示由引入宿主細(xì)胞的SEQ ID NO: 1_13、97_115的DNA或類似序列編碼的多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)，其中所述多肽或蛋白質(zhì)通常不存在于宿主細(xì)胞中，或者其中所述多肽或蛋白質(zhì)以高于通常編碼所述多肽或蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因所表達(dá)的水平存在于所述宿主細(xì)胞中。
[0044]本發(fā)明蛋白質(zhì)的過表達(dá)可通過下述方式實(shí)現(xiàn)，首先構(gòu)建嵌合基因，其中編碼區(qū)與能夠指導(dǎo)基因在所需發(fā)育階段在所需組織中表達(dá)的啟動(dòng)子有效連接。嵌合基因可包含來源于相同基因的啟動(dòng)子序列和翻譯前導(dǎo)序列。還可提供編碼轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的3'非編碼序列。本嵌合基因還可包含一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子以利于基因表達(dá)。合適的啟動(dòng)子可以是CaMV35S啟動(dòng)子，其可與作為載體的農(nóng)桿菌(Agrobacterium) —起使用。
[0045]術(shù)語“RNA干擾”或“RNAi ” 一般表示雙鏈RNA分子或短發(fā)夾RNA改變與其具有顯著同源性或完全同源性的核酸序列之表達(dá)的方法。
[0046]術(shù)語“RNAi下調(diào)”表示一種或多種RNAi物質(zhì)介導(dǎo)的核酸序列表達(dá)減少。術(shù)語“RNAi物質(zhì)”表示引發(fā)RNAi的獨(dú)特RNA序列。
[0047]術(shù)語“光周期”指每天的光照和黑暗周期。
[0048]術(shù)語“核酸構(gòu)建體”、“DNA構(gòu)建體”和“載體”表示用于轉(zhuǎn)化植物或其它生物的基因序列。核酸構(gòu)建體或DNA構(gòu)建體可以能在轉(zhuǎn)化植物中指導(dǎo)蛋白質(zhì)或核酸序列的表達(dá)，例如反義RNA。通常，這些核酸構(gòu)建體或DNA構(gòu)建體至少包含與Y和:V翻譯調(diào)節(jié)元件有效連接的預(yù)期基因產(chǎn)物編碼區(qū)或者預(yù)期核酸產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，這些核酸構(gòu)建體或DNA構(gòu)建體是嵌合的，即由來自不同來源的序列混合物組成。但是，非嵌合核酸構(gòu)建體或DNA構(gòu)建體也可用于本發(fā)明。
[0049]在與例如細(xì)胞、核苷酸、載體、蛋白質(zhì)或多肽一起使用時(shí)，術(shù)語“重組的”通常表示所述細(xì)胞、核苷酸或載體已通過引入異源(或外源)核酸或者改變天然核酸而被修飾，或者表示所述蛋白質(zhì)或多肽已通過引入異源氨基酸而被修飾，或者所述細(xì)胞來源于經(jīng)這些修飾的細(xì)胞。重組細(xì)胞表達(dá)在天然(非重組)形式細(xì)胞中不存在的核酸序列(例如基因)，或者表達(dá)異常低表達(dá)或者根本不表達(dá)的天然核酸序列(例如基因)。術(shù)語“重組的”在修飾細(xì)胞時(shí)表示該細(xì)胞復(fù)制異源核酸，或者表達(dá)異源核酸所編碼的肽或蛋白質(zhì)。重組細(xì)胞可含有天然(非重組)形式細(xì)胞中不存在的基因。重組細(xì)胞還可含有天然形式細(xì)胞中存在的基因，其中所述基因通過人工手段進(jìn)行了修飾并重新引入細(xì)胞中。該術(shù)語還涵蓋下列細(xì)胞，其含有經(jīng)修飾的細(xì)胞內(nèi)源核酸,而不從該細(xì)胞除去所述核酸；這些修飾包括通過基因替換、定點(diǎn)突變和相關(guān)技術(shù)獲得的修飾。
[0050]術(shù)語“核酸序列”表示單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的多聚體。除非具體限定，否則該術(shù)語涵蓋含有已知天然核苷酸類似物的核酸序列，所述類似物具有與參考核酸 相似的結(jié)合特性，并且以類似于天然核苷酸的方式代謝。除非另有陳述，否則特定的核酸序列還暗示涵蓋其保守修飾的變體(例如簡(jiǎn)并密碼子替換)和互補(bǔ)序列以及明確顯示的序列。
[0051]“多核苷酸”是包含多個(gè)聚合的核苷酸殘基的核酸序列，例如至少約15個(gè)連續(xù)的聚合核苷酸殘基，任選地至少約30個(gè)連續(xù)核苷酸，至少約50個(gè)連續(xù)核苷酸。在許多情況中，多核苷酸包括編碼多肽(或蛋白質(zhì))或其結(jié)構(gòu)域或片段的核苷酸序列。另外，所述多核苷酸可包含啟動(dòng)子、內(nèi)含子、增強(qiáng)子區(qū)、多腺苷酸化位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)、5'或3'非翻譯區(qū)、報(bào)告基因、選擇標(biāo)記等。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA。多核苷酸任選地包含修飾堿基或經(jīng)修飾主鏈。多核苷酸可以是例如基因組DNA或RNA、轉(zhuǎn)錄本(例如mRNA)、cDNA、PCR產(chǎn)物、克隆的DNA、合成的DNA或RNA等。多核苷酸可包括有義或反義方向的序列。
[0052]術(shù)語“多肽”廣義地用于定義直鏈氨基酸殘基，包括天然的及其合成類似物。
[0053]在本發(fā)明上下文中，“互補(bǔ)”表示兩個(gè)核苷酸序列彼此精確配對(duì)的能力。例如，如果寡核苷酸某些位置的核苷酸能夠與DNA或RNA分子對(duì)應(yīng)位置的核苷酸形成氫鍵，則該寡核苷酸和DNA或RNA被認(rèn)為在該位置彼此互補(bǔ)。在寡核苷酸中足夠個(gè)數(shù)的核苷酸可與靶DNA或RNA中對(duì)應(yīng)核苷酸形成氫鍵使得形成穩(wěn)定復(fù)合物時(shí)，認(rèn)為DNA或RNA鏈彼此互補(bǔ)。
[0054]因此，在上下文中，表述“互補(bǔ)序列”或“互補(bǔ)”還表示將在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的核酸分子退火的核苷酸序列。
[0055]術(shù)語“嚴(yán)格條件”指高嚴(yán)格、弱嚴(yán)格或低嚴(yán)格的一般條件。
[0056]術(shù)語“嚴(yán)格度”是本領(lǐng)域中公知的，用于表示進(jìn)行核酸雜交的條件(溫度、離子強(qiáng)度以及其他化合物例如有機(jī)溶劑的存在情況)。與“弱”或“低”嚴(yán)格度條件相比，使用“高嚴(yán)格度”條件時(shí)，僅在具有高頻率互補(bǔ)堿基序列的核酸片段之間會(huì)發(fā)生核酸堿基配對(duì)。測(cè)試雜交的合適條件包括在5 X SSC中預(yù)浸泡，以及在20%甲酰胺、5 XDenhardt溶液、50mM磷酸鈉、pH6.8和50mg變性超聲處理的小牛胸腺DNA的溶液中在約40°C下預(yù)雜交I小時(shí)，然后在添加了 IOOmM ATP的相同溶液中在約40°C下雜交18小時(shí)，之后用2XSSC、0.2% SDS在40°C下清洗濾膜30分鐘(低嚴(yán)格度)，優(yōu)選50°C (中嚴(yán)格度)，更優(yōu)選65°C (高嚴(yán)格度)，甚至更優(yōu)選約75°C (非常高的嚴(yán)格度)。有關(guān)雜交方法的更多細(xì)節(jié)可見于SambiOOk等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor, 1989。
[0057]術(shù)語“雜交”廣義地用于表示互補(bǔ)或部分互補(bǔ)的核酸序列之間的結(jié)合，例如使其分離的變性過程的反轉(zhuǎn)。雜交通過互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基之間的氫鍵鍵合發(fā)生，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen、反Hoogsteen氫鍵鍵合等。DNA中常見的四種核苷堿基是G、A、T和C，其中G與C配對(duì)，A與T配對(duì)。在RNA中，T被尿嘧啶(U)代替，其與A配對(duì)。核苷堿基中參與形成標(biāo)準(zhǔn)雙鏈體的化學(xué)基團(tuán)組成Watson-Crick面。數(shù)年之后,Hoogsteen顯示嘌呤核苷堿基(G和A)除了沃森-克里克面之外還具有Hoogsteen面，其可從雙鏈體外被識(shí)另O，并且用于通過氫鍵鍵合結(jié)合嘧啶寡核苷酸，由此形成三螺旋結(jié)構(gòu)。
[0058]“子序列”或“片段”是完整序列的任何一部分。因此，片段或子序列指分別包含較長(zhǎng)氨基酸序列(例如多肽)或核酸(例如多核苷酸)的一部分的氨基酸或核酸序列。
[0059]在本文上下文中，術(shù)語“同源性”表示兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相似性，其由參數(shù)“序列同一性”描述。
[0060]術(shù)語“序列同一性”表示相同長(zhǎng)度的兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核酸序列之間同源性程度的定量測(cè)量。如果比較不同長(zhǎng)度的兩個(gè)序列，則它們必須將其進(jìn)行比對(duì)以給出最佳可能匹配，允許插入缺口或者在多肽序列或核苷酸序列末端截短。序列同一性可以通過
【權(quán)利要求】
1.產(chǎn)生與其野生型相比生長(zhǎng)和/或生物質(zhì)受到調(diào)節(jié)的植物的方法，其包括改變?cè)撝参镏兄辽僖环N基因的基因產(chǎn)物水平，所述基因包含選自下列的核苷酸序列: a)SEQ ID NO:1_10、12、13、97_115 的核苷酸序列； b)與SEQID N0:l-10、12、13、97-115的核苷酸序列具有至少60%同一性的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述方法步驟包括: (i)提供包含選自下列的核苷酸序列的表達(dá)載體 a)SEQ ID NO:1-10、12、13、97_115 的核苷酸序列；或 b)與SEQID N0:l-10、12、13、97-115的核苷酸序列具有至少60%同一性的核苷酸序列；或 c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段，以及 d)與所述多核苷酸序列有效連接的至少一個(gè)調(diào)節(jié)元件，其中所述至少一個(gè)調(diào)節(jié)元件控制所述多核苷酸序列在靶植物中的表達(dá)； (?)將所述表達(dá)載體引入至少一種植物中；和 (iii)選擇與其野生型相比生長(zhǎng)和/或生物質(zhì)受到調(diào)節(jié)的至少一種轉(zhuǎn)基因植物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括 i)選擇表達(dá)選自下列的至少一種核苷酸序列的植物物種 a)SEQ ID NO:1_10、12、13、97_115 的核苷酸序列； b)與SEQID N0:l-10、12、13、97-115的核苷酸序列具有至少60%同一性的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段， ?)將i)中選擇的植物物種與i)中選擇的相同或另一植物物種進(jìn)行雜交， iii)選擇與i)中所選植物物種相比至少一種選自下列的核苷酸序列的表達(dá)受到調(diào)節(jié)的植物 a)SEQ ID NO:1-10、12、13、97_115 的核苷酸序列； b)與SEQID N0:l-10、12、13、97-115的核苷酸序列具有至少60%同一性的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段， iv)任選地，將iii)中所得植物回交一次或多次，并選擇與任何i)中所用植物物種和/或iii)中所得植物相比至少一種選自下列的核苷酸序列的表達(dá)受到調(diào)節(jié)的植物 a)SEQ ID NO:1_10、12、13、97_115 的核苷酸序列； b)與SEQID N0:l-10、12、13、97-115的核苷酸序列具有至少60%同一性的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述受到調(diào)節(jié)的表達(dá)通過引入遺傳修飾來實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選在編碼包含SEQ ID NO:1-10、12、13、97-115多肽或這些多肽之同源物的基因座中引入。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述修飾通過下列之一來實(shí)現(xiàn):使用SEQID NO:1-10,.12、13、97-115中一種或多種作為該方法任何步驟中的標(biāo)記物的T-DNA活化、TILLING、同源重組、定點(diǎn)誘變或定向育種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述調(diào)節(jié)是生長(zhǎng)和/或生物質(zhì)的產(chǎn)量提高。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4-6中任一項(xiàng)的方法，其包括提供重組DNA構(gòu)建體的步驟，所述構(gòu)建體包含選自下列的核苷酸序列: a)包含選自SEQID NO:1-10、12、13、97-115之序列的核苷酸序列； b)與核苷酸序列a)互補(bǔ)的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段； d)與a)、b)和c)中任一序列具有至少60%同一'丨生的核酸序列；和 e)在嚴(yán)格條件下與核苷酸序列a)、b)或c)雜交的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述核苷酸序列編碼包含多肽(a)的保守性替換變體的多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替換。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述子序列或片段與權(quán)利要求7的(a)中所述核苷酸序列的保守結(jié)構(gòu)域具有至少65%的序列同一性。
11.根據(jù)權(quán)利要求7至10中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組DNA構(gòu)建體還包含與所述核苷酸序列有效連接的組成型、誘導(dǎo)型或組織特異性啟動(dòng)子。
12.根據(jù)權(quán)利要求7至10中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組DNA構(gòu)建體在包含權(quán)利要求7所定義核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄盒之前還包含強(qiáng)組成型啟動(dòng)子，所述轉(zhuǎn)錄盒之后是植物功能性內(nèi)含子，之后是反向的權(quán)利要求4中所定義核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求7至12中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包括用所述重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物的可再生細(xì)胞以及從所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物的步驟。
14.與其野生型相比生長(zhǎng)和/或生物質(zhì)受到調(diào)節(jié)的植物，其包含能夠改變?cè)撝参镏兄辽僖环N基因的基因產(chǎn)物水平的核苷酸，其中所述至少一種基因包含選自下列的核苷酸序列: a)SEQ ID NO:1_10、12、13、97_115 的核苷酸序列； b)與SEQID NO:1-10、12、13、97-115的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。
15.轉(zhuǎn)基因植物，其包含重組多核苷酸(DNA構(gòu)建體)，所述重組多核苷酸(DNA構(gòu)建體)包含選自下列的核苷酸序列: a)包含選自SEQID NO:1-10、12、13、97-115之序列的核苷酸序列； b)與核苷酸序列a)互補(bǔ)的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段； d)與a)、b)和c)中任一序列具有至少60%同一'丨生的核酸序列；和 e)在嚴(yán)格條件下與核苷酸序列a)、b)或c)雜交的核苷酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述核苷酸序列編碼包含a)或d)多肽之保守性替換變體的多肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求15至16中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物,其中核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替換。
18.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述子序列或片段與權(quán)利要求16所述核苷酸序列的保守結(jié)構(gòu)域具有至少65%的序列同一性。
19.根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述重組DNA構(gòu)建體還包含與所述核苷酸序列有效連接的組成型、誘導(dǎo)型或組織特異性啟動(dòng)子。
20.根據(jù)權(quán)利要求14至19中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述重組DNA構(gòu)建體在包含權(quán)利要求4中所定義核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄盒之前還包含強(qiáng)組成型啟動(dòng)子，所述轉(zhuǎn)錄盒之后是植物功能性內(nèi)含子，之后是反向的權(quán)利要求16中所定義核苷酸序列。
21.植物的植物細(xì)胞或植物后代，所述植物可以是根據(jù)權(quán)利要求14至20中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物。
22.植物生產(chǎn)的木材，所述植物可以是根據(jù)權(quán)利要求14至20中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物。
23.DNA構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求7至10所述的至少一種序列。
24.植物細(xì)胞或植物后代，其包含權(quán)利要求23的DNA構(gòu)建體。
25.權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的核苷酸序列，其中所述a)的序列選自SEQIDNO:1、4、6、7、9、10、101、102、104、106 和 107。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103911392SQ201410108913
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2007年12月28日
【發(fā)明者】芒努斯·赫茨貝里, 里希凱?！ぐ屠談? 大衛(wèi)·約恩森, 利努斯·默勒, 帕埃爾·瓊森 申請(qǐng)人:瑞典樹木科技公司