與肉牛肉質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】與肉牛肉質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明提供一種動(dòng)物分子標(biāo)記，具體涉及牛DNMT3a基因片段的克隆及作為分子標(biāo)記的應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?No.1所示，在第278位有1個(gè)A278-G278堿基突變，導(dǎo)致肉質(zhì)性狀出現(xiàn)多態(tài)性。
【專利說明】與肉牛肉質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體地說，涉及一種與肉牛肉質(zhì)性狀相關(guān)的DNMT3a基因作為分子標(biāo)記的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肉牛業(yè)作為我國畜牧業(yè)的重要組成部分，近年來發(fā)展迅速，對(duì)于促進(jìn)生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展及國民膳食結(jié)構(gòu)的改善等方面發(fā)揮了積極作用。肉牛的肉質(zhì)性狀是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，隨著人們生活水平的提高,對(duì)肉質(zhì)的要求越來越高,對(duì)優(yōu)質(zhì)牛肉的需求也越來越大，因此優(yōu)質(zhì)牛肉帶來的可觀經(jīng)濟(jì)效益決定了肉牛育種中肉質(zhì)性狀選擇的重要性。肉質(zhì)性狀作為一種重要的經(jīng)濟(jì)性狀，由于無法活體測(cè)定受到傳統(tǒng)育種方法的限制，因此許多研究從分子標(biāo)記入手對(duì)肉質(zhì)性狀進(jìn)行探索。根據(jù)發(fā)達(dá)國家經(jīng)濟(jì)發(fā)展的一般規(guī)律，當(dāng)國民經(jīng)濟(jì)收入達(dá)到人均1000美元的水平時(shí)，牛肉消費(fèi)將趨于旺盛。隨著我國人均國民收入的穩(wěn)步提升，牛肉消費(fèi)已經(jīng)在我國大城市呈風(fēng)靡之勢(shì)，國產(chǎn)高檔牛肉消費(fèi)市場(chǎng)也不斷升溫，并進(jìn)入到五星級(jí)餐飲企業(yè)。[0003]表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)的概念最初由著名生物學(xué)家ConradH.Waddington在1942年提出。表觀遺傳是指DNA序列不發(fā)生變化的情況下，基因表達(dá)在細(xì)胞增殖和發(fā)育過程中發(fā)生了能穩(wěn)定傳遞的可遺傳的改變。傳統(tǒng)育種中的表型可以剖分為遺傳和環(huán)境兩部分，說明表型是由基因和環(huán)境共同控制的，而表觀遺傳正如在基因和環(huán)境之間搭了一座橋梁，補(bǔ)充了“中心法則”的內(nèi)容，說明核酸并不是存儲(chǔ)遺傳信息的唯一載體，表觀遺傳信息可通過調(diào)控基因的表達(dá)時(shí)間、空間位置和表達(dá)方式等方面影響生物機(jī)體的各種生理反應(yīng)。因此，許多用DNA序列變異不能解釋的現(xiàn)象可能通過表觀遺傳學(xué)的研究找到答案。
[0004]目前，表觀遺傳學(xué)已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的前沿和熱點(diǎn)，其研究涉及到了多個(gè)領(lǐng)域，在疾病和腫瘤方面，通過表觀遺傳學(xué)研究其致病機(jī)理等有了更為成熟的認(rèn)識(shí)。隨著研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)在其他方面，比如環(huán)境因子中的營養(yǎng)狀況，年齡及生長性能等都有一定的影響。但研究主要是表觀相關(guān)基因的表達(dá)量的變化引起的相關(guān)基因的表觀的改變，而對(duì)于表觀遺傳學(xué)相關(guān)基因本身的多態(tài)性研究還不多見。肉質(zhì)性狀作為一種重要的經(jīng)濟(jì)性狀，從遺傳學(xué)水平上對(duì)肉質(zhì)性狀的研究已經(jīng)有很多了，控制肉質(zhì)性狀的主效基因也研究地比較清楚，然而從表觀遺傳的水平上研究肉質(zhì)的報(bào)道還非常少。肉質(zhì)性狀是受遺傳、營養(yǎng)、屠宰后處理等多因素共同控制的，尤其是在營養(yǎng)方面，可以通過改變一些飼料成分調(diào)節(jié)，比如說飼料中添加葉酸，可以影響甲基化的程度，從而調(diào)控主效基因的表達(dá)；在牛育肥的過程中，通過增加能量飼料，可能會(huì)影響到基因表達(dá)的變化，從而對(duì)肉質(zhì)產(chǎn)生一定的影響，因此肉牛肉質(zhì)性狀很有可能受表觀遺傳的調(diào)控。
[0005]DNA甲基化是表觀遺傳調(diào)控中最重要的形式之一。本發(fā)明選擇一個(gè)在催化DNA甲基化過程中起重要作用的基因一DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3a (DNMT3a)作為對(duì)象，牛DNMT3a基因定位在11號(hào)染色體上(NCBI序列登陸號(hào)AC_000168.1), DNMT3a基因大約有40kb長，包含20個(gè)外顯子，19內(nèi)含子，編碼909個(gè)氨基酸。針對(duì)該基因的SNP位點(diǎn)，在13個(gè)肉牛群體(西門塔爾、蒙貝利亞、挪威紅牛、安格斯牛、夏洛萊牛、利木贊牛、和牛、復(fù)州牛、魯西牛、渤海黑牛、新疆褐牛、三河牛以及和牛與復(fù)州牛雜交一代商品名雪龍黑牛)中進(jìn)行多態(tài)性分析，同時(shí)，利用收集到的肉質(zhì)性狀記錄進(jìn)行SNP關(guān)聯(lián)分析，探索表觀遺傳學(xué)相關(guān)基因與肉質(zhì)性狀的關(guān)系，以期利用遺傳學(xué)手段對(duì)肉牛肉質(zhì)性狀的不斷改良與提高提供準(zhǔn)確的科學(xué)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種與肉牛肉質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種與肉牛肉質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示，在第278位有I個(gè)A278-G278堿基突變，導(dǎo)致肉質(zhì)性狀出現(xiàn)多態(tài)性；
[0008]所述肉質(zhì)性狀為排酸前/后胴體重、牛腩厚、三角牛腩厚以及上腦蓋厚。
[0009]進(jìn)一步地，所述堿基突變的位點(diǎn)為Intronl 1-A27G位點(diǎn)，位于DNMT3a基因第11內(nèi)含子第27bp處。
[0010]本發(fā)明還提供了一種前述分子標(biāo)記的制備方法，其是以?；蚪MDNA為模板，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的在于擴(kuò)增包含Intronll-A27G位點(diǎn)的DNA序列。
[0011]本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增前述分子標(biāo)記的引物對(duì)，其核苷酸序列如下:
[0012]正向引物:5’-agcactggattgaggtcctg-3’ ；
[0013]反向引物:5’-gccaagtctgtcctttgagg-3’。
[0014]本發(fā)明還提供了前述分子標(biāo)記在肉牛標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
[0015]進(jìn)一步地，所述應(yīng)用具體為利用前述分子標(biāo)記對(duì)肉牛進(jìn)行基因分型，選擇基因型為AA的肉牛進(jìn)行育種。作為優(yōu)選，所述肉牛為雪龍黑牛。
[0016]本領(lǐng)域的技術(shù)人員都清楚，有很多分析方法可用于檢測(cè)基因序列中是否存在該單核苷酸多態(tài)性。這些技術(shù)包括但并不限于:DNA測(cè)序、雜交測(cè)序、DNA芯片、PCR-RFLP,PCR-SSCP、變性梯度凝膠電泳、變性高效液相色譜(DHPLC )、飛行質(zhì)譜法等。
[0017]作為一個(gè)實(shí)施例，所述對(duì)肉牛進(jìn)行基因分型的方法如下:
[0018](I)提取待測(cè)肉牛的基因組DNA ;
[0019](2)以基因組DNA為模板，運(yùn)用飛行質(zhì)譜法對(duì)所述分子標(biāo)記進(jìn)行基因分型，確定待測(cè)肉牛的基因型為AA或AG或GG。
[0020]本發(fā)明的有益效果在于:
[0021]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)雪龍黑牛群體中DNMT3a基因內(nèi)含子11中存在一個(gè)SNP分子標(biāo)記(A/G)，在雪龍黑牛群體共141頭個(gè)體中經(jīng)過關(guān)聯(lián)分析得出該SNP對(duì)排酸前/后胴體重、牛腩厚、三角牛腩厚以及上腦蓋影響顯著(P〈0.05)，AA型表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)基因型。本發(fā)明提供的標(biāo)記可靠，可用于對(duì)肉牛群體肉質(zhì)性狀的篩選。本發(fā)明為優(yōu)質(zhì)肉牛分子育種提供理論依據(jù)和遺傳基礎(chǔ)，有助于進(jìn)一步加快肉牛育種進(jìn)程，具有極其重大的應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為DNMT3a內(nèi)含子11基因池的PCR擴(kuò)增膠圖；由左至右分別為:樣品池I至樣品池5的DNMT3a內(nèi)含子11的PCR擴(kuò)增條帶、Marker ;其中，Marker:由上到下600，500，400，300，200，IOObp0
[0023]圖2為DNMT3a內(nèi)含子11基因池的測(cè)序峰圖(丨處為突變位點(diǎn))。
[0024]圖3為部分基因組DNA提取瓊脂糖檢測(cè)電泳結(jié)果；由左至右分別為:雪龍黑牛樣品I至樣品9的基因組DNA電泳條帶。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0026]實(shí)施例1SNP的發(fā)現(xiàn)和分型
[0027]采用DNA池篩查SNPs，隨機(jī)選取雪龍黑牛10個(gè)樣品進(jìn)行DNA混池，提取凍精基因組DNA，將其濃度配成大約IOOng/μ 1，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度并達(dá)到均一，每個(gè)個(gè)體取10 μ I共100 μ I的DNA混合構(gòu)建成DNA池。
[0028]對(duì)混池DNA中DNMT3a內(nèi)含子11的一段序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0029]PCR擴(kuò)增的引物對(duì)如下:
[0030]正向引物F:5，-agcactggattgaggtcctg-3，；
[0031]反向引物R:5’ -gccaagtctgtcctttgagg-3’。
[0032]上述引物對(duì)針對(duì)的靶序列如下所示:SEQ ID N0.1
[0033]PCR反應(yīng)體系見表1。
[0034]表1PCR反應(yīng)體系
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種與肉牛肉質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ IDN0.1所示，在第278位有I個(gè)A278-G278堿基突變，導(dǎo)致肉質(zhì)性狀出現(xiàn)多態(tài)性； 所述肉質(zhì)性狀為排酸前/后胴體重、牛腩厚、三角牛腩厚以及上腦蓋厚。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記，其特征在于，所述堿基突變的位點(diǎn)為Intronl 1-A27G位點(diǎn)，位于DNMT3a基因第11內(nèi)含子第27bp處。
3.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記的制備方法，其特征在于，以?；蚪MDNA為模板，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的在于擴(kuò)增包含Intronll-A27G位點(diǎn)的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下: 正向引物:5，-agcactggattgaggtcctg-3’ ；
反向引物:5’ -gccaagtctgtcctttgagg-3’。
5.一種用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的引物對(duì)，其核苷酸序列如下: 正向引物:5，-agcactggattgaggtcctg-3’ ； 反向引物:5’ -gccaagtctgtcctttgagg-3’。
6.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在肉牛標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，具體為利用權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記對(duì)肉牛進(jìn)行基因分型，選擇基因型為AA的肉牛進(jìn)行育種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述肉牛為雪龍黑牛。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103911375SQ201410120565
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】王雅春, 劉軒, 俞英, 張毅, 張旭, 吳蒙, 徐仙洲 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)