一種新型黑曲霉菌株及其在多種真菌毒素降解中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型黑曲霉（Aspergillus?niger）菌株FS-UV1，保藏編號CCTCC?NO:M2013553。該菌株對黃曲霉毒素具有良好的降解效果，降解率達(dá)到95.3%；較原菌株提高了37.8%；對玉米赤霉烯酮的降解效率達(dá)到93%，較原菌株提高了7%，對嘔吐毒素的降解率達(dá)到52.6%，較原菌株提高了9.5%。大鼠實驗證明該新型菌株是一種無毒副作用的安全有效的降解方法。
【專利說明】一種新型黑曲霉菌株及其在多種真菌毒素降解中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種黑曲霉，特別是一種誘變獲得的，對黃曲霉毒素 B1具有良好降解 效果的菌株。

【背景技術(shù)】
[0002] 真菌毒素對食品尤其是對糧食的危害極大，真菌可在糧食作物田間生長及收獲后 儲藏過程中毒素的生物合成及代謝。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織估計，全世界谷物供應(yīng)25%受真菌 毒素污染而不能食用，對真菌毒素的防治成為保證食品安全刻不容緩的頭等大事。而微生 物防治具有安全、高效、經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用性強、環(huán)境友好型等優(yōu)勢，成為近年來備受推崇的防治方 法。而真菌毒素中危害較大當(dāng)屬黃曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮以及嘔吐毒素。
[0003] 自從1960年英國爆發(fā)了火雞的黃曲霉毒素中毒事件以來，國內(nèi)外對黃曲霉毒素 開展了大量深入而廣泛的研究。由于真菌的繁殖速度快、孢子的數(shù)量大、散布遠(yuǎn)，因此糧食 等農(nóng)作物在種植、收獲、貯藏和加工過程中極易受到產(chǎn)毒真菌和黃曲霉毒素的污染。在已發(fā) 現(xiàn)的18種黃曲霉毒素中，以AFBi的致畸性、致突變性和致癌性最強。早在1993年，AFBi已 被國際癌癥研究機構(gòu)定為人類I類致癌物。
[0004] 研究表明多種細(xì)菌對黃曲霉毒素具有生物防治作用。如桿菌、伯克霍爾德菌、鏈霉 菌、鏈球菌和乳酸菌等均可抑制產(chǎn)毒霉菌的生長，產(chǎn)毒作用。暢曉淵發(fā)現(xiàn)從埃及傳統(tǒng)奶酪中 分離出的擴(kuò)展短桿菌對黃曲霉生長有較強的抑制作用；從泰國發(fā)酵豆醬中分離出的地衣芽 胞桿菌和短小桿菌不僅能抑制黃曲霉生長，而且還能降解74?85%的AFBi ;Cho從韓國醬 油中分離出一株短小芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)該菌分泌的伊枯草素能抑制產(chǎn)毒黃曲霉和寄生曲霉的 生長；高雅從豆瓣中分離出一株能抑制黃曲霉生長的枯草芽孢桿菌；章挺也從枯草芽孢桿 菌中分離出抑制黃曲霉孢子萌發(fā)的表面活性肽和桿菌霉素 D。因此分離出一種對黃曲霉毒 素具有良好防治及降解效果的菌株具有十分重要的意義。
[0005] 紫外誘變是應(yīng)用最廣泛的一種物理誘變方法，郭繼平采用紫外誘變對米曲霉K61 菌株進(jìn)行改造，最終篩選出一株蛋白酶活力高且遺傳性能穩(wěn)定的突變株Y29 ;潘濤在紫外 誘變過程中篩選到一株穩(wěn)定高產(chǎn)菌株lOmirT5,檸檬酸產(chǎn)量增加了 5. 33% ;趙瓊等以木醋桿 菌（Acetobacter xylinum)C5為出發(fā)菌株，對其進(jìn)行紫外誘變，將照射時間3min作為紫 外誘變劑量，經(jīng)過初篩和復(fù)篩，獲得1株細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌株A. xylinumC544,該突變株 的產(chǎn)量是原始菌株的1. 5倍；可見菌株經(jīng)過誘變后往往可以表現(xiàn)出比原菌株更加優(yōu)良的特 性。因而，對菌株進(jìn)行誘變篩選選育出對黃曲霉毒素降解效果較好的菌株具有良好的應(yīng)用 前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種新型黑曲霉（Aspergillus niger)FS-UVl，已于2013年11月6 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC N0:M2013553 ;以其18SrDNA全序列為 基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹如說明書附圖1所示。
[0007] 本發(fā)明提供了一種誘變黑曲霉，該菌株對黃曲霉毒素B1具有良好的降解效果，降 解率達(dá)到95. 3% ;較原菌株提高了 37. 8% ;對玉米赤霉烯酮的降解效率達(dá)到93%，較原菌株提 高了 7%，對嘔吐毒素的降解率達(dá)到52. 6%，較原菌株提高了 9. 5%。
[0008] 所述黑曲霉保藏條件如下：從生長良好的固態(tài)平板培養(yǎng)基PDA上接取3環(huán)誘變黑 曲霉到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C搖床（200rpm)培養(yǎng)36h，取0. 65mL移入含有0. 3mL無菌甘油的 甘油管中，放入_70°C超低溫冰箱保存。
[0009] 所述固態(tài)平板培養(yǎng)基PDA為（w/v):馬鈴薯300g、葡萄糖20g、瓊脂20g、氯霉素 〇. lg、蒸饋水1L、自然pH、121°C高壓滅菌15min。
[0010] 所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基PDB為（w/v):馬鈴薯300g、葡萄糖20g、蒸餾水1L，自然pH， 121°C高壓滅菌15min。 toon] 所述誘變黑曲霉的培養(yǎng)條件為：將已保藏甘油管的誘變黑曲霉接入液體培養(yǎng)基， 28°C，130rpm，搖床培養(yǎng) 36h。
[0012] 所述黑曲霉的獲得方法為：將從醬醅中篩選出來的黑曲霉親代接種到PDA固體 培養(yǎng)基中，28°C 130rpm，培養(yǎng)36h，取50ml生理鹽水洗下孢子，振蕩均勻，形成單孢子懸浮 液，制成l〇8CFU/ml的菌懸液。取上述孢子懸液5ml，經(jīng)200w紫外照射5min，微波處在高 檔時加熱80s。將誘變后的菌株接種于PDB培養(yǎng)基，從菌落中挑取適當(dāng)孢子按上述方式制成 10 8CFU/ml菌懸液，接種到30ml培養(yǎng)基中，28°C 130rpm，搖床培養(yǎng)36h。吸取10ul發(fā)酵液于 酪蛋白平板上進(jìn)行復(fù)篩。將上述復(fù)篩后菌株及原菌株接種到30ml培養(yǎng)基中，28°C 130rpm， 搖床培養(yǎng)36h。向發(fā)酵液中加入0· 05ppm AFB1、0. 5ppm玉米赤霉烯酮及0· 5ppm嘔吐毒素， 比較原菌株及新型誘變菌株對AFB1、玉米赤霉烯酮及嘔吐毒素的降解效果。
[0013] 本發(fā)明是從醬醅中分離得到的經(jīng)紫外微波復(fù)合誘變的對AFB1具有良好降解效果 的新型菌株，對黃曲霉毒素 B1的降解率達(dá)到95. 3%，較原菌株對AFB1提高了 37. 8% ;對玉米 赤霉烯酮的降解效率達(dá)到93%，較原菌株提高了 7% ;對嘔吐毒素的降解率達(dá)到52. 6%，較原 菌株提高了 9. 5%。誘變后的菌株可應(yīng)用食品，農(nóng)產(chǎn)品，糧食以及飼料等領(lǐng)域中多種真菌毒素 的降解中，達(dá)到降低真菌毒素尤其是黃曲霉毒素 B1含量的目的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1 :新型黑曲霉FS-UV1的系統(tǒng)發(fā)育樹
[0015] 圖2 :新型黑曲霉FS-UV1對AFB1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素的降解效果
[0016] 圖3 :新型黑曲霉FS-UV1的酶活性
[0017] 圖4 :新型黑曲霉FS-UV1降解玉米漿中毒素大鼠實驗切片圖
[0018] A :飼料組；B :標(biāo)準(zhǔn)品組；C :花生柏組；D :實驗組。

【具體實施方式】
[0019] 實施例1 :醬醅中黑曲霉的篩選方法
[0020] 從發(fā)酵4d后的醬中用含β -環(huán)糊精的PDA培養(yǎng)基定性地分離出醬醅中的非產(chǎn)毒 絲狀真菌，然后用ELISA方法對所分離菌株的產(chǎn)毒能力進(jìn)行定量分析，最后篩選出非產(chǎn)毒 的霉囷。
[0021] 對能抑制黃曲霉產(chǎn)毒菌進(jìn)行復(fù)篩，篩選出能降解AFBi的菌株，降解率為58%。篩選 出AFBi的防治菌株。
[0022] 通過菌落特征觀察和個體形態(tài)觀察，并將菌株的18S rDNA與GenBank數(shù)據(jù) 庫（http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)中已知序列對比，發(fā)現(xiàn)其與黑曲霉 (Aspergillus niger)同源性達(dá)100%。結(jié)合菌株的形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定，可確定菌 株為黑曲霉。本菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCC N0:M2013553。
[0023] 實施例2 :紫外微波復(fù)合誘變黑曲霉制備方法
[0024] 取上述孢子懸液5ml，經(jīng)200w紫外照射5min，微波處在高檔時加熱80s。將誘變后 的菌株接種于PDB培養(yǎng)基，從菌落中挑取適當(dāng)孢子按上述方式制成10 8CFU/ml菌懸液，接種 到30ml培養(yǎng)基中，28°C 130rpm，搖床培養(yǎng)36h。吸取10ul發(fā)酵液于酪蛋白平板上進(jìn)行復(fù)篩。 通過菌落特征觀察，個體形態(tài)觀察，并將菌株的18SrDNA與GenBank數(shù)據(jù)庫（http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中已知序列對比，發(fā)現(xiàn)其與黑曲霉（Aspergillus niger) 同源性達(dá)100%。結(jié)合菌株的形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定，可確定菌株為黑曲霉。新型黑曲 霉FS-UV1的進(jìn)化樹如圖1。本菌株已于2013年11月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，保藏編號CCTCC N0:M2013553,保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。
[0025] 實施例3 :新型黑曲霉對多種真菌毒素的降解
[0026] 將上述菌株FS-UV1及原菌株接種到30mlPDB培養(yǎng)基中，28°C 130rpm，搖床培養(yǎng) 36h。向發(fā)酵液中加入0· 05ppmAFBl、0. 5ppm玉米赤霉烯酮及0· 5ppm嘔吐毒素，比較原菌株 及新型誘變菌株對AFB1、玉米赤霉烯酮以及嘔吐毒素的降解效果。
[0027] 1)新型黑曲霉FS-UV1對AFB1的降解
[0028] 將復(fù)合誘變菌株FS-UV1及原菌株接種到30mlPDB培養(yǎng)基中，28°C 130rpm，搖床培 養(yǎng)36h。向發(fā)酵液中加入0. 05ppm黃曲霉毒素 B1，從中吸取lml并加入3ml三氯甲燒，萃取 兩次，氮氣吹干，加入三氟乙酸l〇〇ul，正己烷200ul，衍生化30min，應(yīng)用高效液相色譜法進(jìn) 行檢測。色譜條件為C18柱6mmX 150mmX5um ;流動相乙腈：水=20:80檢測溫度：30°C ;流 速：lml/min ;檢測波長：激發(fā)波長：360nm ;發(fā)射波長：440nm。
[0029] 2)新型黑曲霉FS-UV1對玉米赤霉烯酮的降解
[0030] 將復(fù)合誘變菌株FS-UV1及原菌株接種到30mlPDB培養(yǎng)基中，28°C 130rpm，搖床 培養(yǎng)36h。向發(fā)酵液中加入0. 5ppm玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品，再從中吸取lml并加入3ml三 氯甲烷，萃取兩次，氮氣吹干，高效液相色譜法進(jìn)行含量檢測。色譜條件為色譜柱：C18柱 6_X 150_X5um ;流動相：乙腈：水=50:50 ;檢測溫度：25°C ;流速：lml/min ;檢測波長：激 發(fā)波長：240nm ;發(fā)射波長：440nm
[0031] 3)新型黑曲霉FS-UV1對嘔吐毒素的降解
[0032] 將上述誘變后菌株及原菌株接種到30mlPDB培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)36h。向發(fā)酵 液中加入〇. 5ppm嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品，吸取10ml,再從中吸取lml加入3ml三氯甲燒進(jìn)行萃 取兩次，氮氣吹干，高效液相色譜法進(jìn)行含量檢測。色譜條件：色譜條件為色譜柱：C18柱 6_X 150_X5um ;流動相：甲醇：水=20:80 ;檢測溫度：30°C ;流速：0· 8ml/min ;檢測波長： 218nm。
[0033] 結(jié)果如圖2所示，新型黑曲霉FS-UV1 (CCTCC N0:M2013553)對黃曲霉毒素 B1的 降解率達(dá)到95. 3%，較原菌株對AFB1提高了 37. 8% ;對玉米赤霉烯酮的降解效率達(dá)到93%， 較原菌株提高了 7% ;對嘔吐毒素的降解率達(dá)到52. 6%，較原菌株提高了 9. 5%。
[0034] 實施例4 :新型黑曲霉FS-UV1對毒素污染的花生柏、棉籽柏中黃曲霉毒素 B1的防 治
[0035] 取適量復(fù)合誘變黑曲霉FS-UV1 (CCTCC N0:M2013553)孢子接種于黃曲霉毒素污 染的棉籽柏或花生柏中（黃曲霉毒素 B1含量68 μ g/mL)，28°C發(fā)酵培養(yǎng)7d，取40g棉籽柏 或花生柏粉碎試樣溶于l〇〇ml乙腈-水（9:1)溶液中，高速均質(zhì)器攪拌提取2min，定性濾紙 過濾，移取l〇ml濾液加入40ml水稀釋混勻，玻璃濾紙過濾1?2次至濾液澄清。取適量濾 液與氯仿按1:2混合萃取兩次。氮氣吹干，溶于1.0ml流動相，待測。經(jīng)高效液相色譜法測 定，發(fā)現(xiàn)棉籽柏或花生柏中黃曲霉毒素 B1殘留量低于2 μ g/mL，降解率達(dá)到98%。
[0036] 實施例5 :降解產(chǎn)物大鼠動物試驗驗證
[0037] 大鼠飼喂前禁食12h，自由飲水，稱體質(zhì)量并記錄，做好標(biāo)記，隨機分成4組，S卩：飼 喂普通飼料組A (簡稱：空白組);灌胃黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)品組B (簡稱：對照組);飼喂被黃 曲霉毒素污染的花生柏組C (簡稱：花生柏組);飼喂污染花生柏和黑曲霉發(fā)酵液共培養(yǎng)48h 實驗組D(簡稱：降解組)，每組各8只。各組小鼠每日同一時間飼喂處理，自由采食飲水，持 續(xù)30天，最后脫頸處死。取出大鼠的肝臟和腎臟，經(jīng)過石蠟包埋，切片，HE染色，在100X和 400X的光學(xué)顯微鏡下觀察其組織切片圖4(左為肝臟，右為腎臟）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，花生柏組由 于毒素含量高，導(dǎo)致大鼠的肝腎明顯損壞；而降解組的大鼠肝腎未發(fā)現(xiàn)明顯的組織損壞，這 說明黑曲霉發(fā)酵液能夠降解花生柏中的黃曲霉毒素，并使其毒性消失。因此，該黑曲霉對毒 素降解是安全無毒副產(chǎn)物的菌株，為動物飼料提供了 一種高效安全的脫毒方法。
[0038] 可以理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā) 明構(gòu)思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保 護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種新型黑曲霉（Aspergillus niger)FS-UVl，于2013年11月6日保藏于中國典 型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCC N0:M2013553,保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黑曲霉，其特征在于能夠防治黃曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮、 嘔吐毒素的菌株。
3. 權(quán)利要求2所述的黑曲霉，其特征在于所述黑曲霉是經(jīng)過紫外微波復(fù)合誘變得到 的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的黑曲霉，其特征在于所述誘變條件為紫外燈200w，5min，微波 高檔加熱80s。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的黑曲霉應(yīng)用于降解毒素污染的花生柏、棉籽柏中黃曲 霉毒素。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的黑曲霉應(yīng)用于降解毒素污染的花生柏、棉籽柏中玉米 赤霉稀麗。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的黑曲霉應(yīng)用于降解毒素污染的花生柏、棉籽柏中嘔吐 毒素。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的黑曲霉在食品、飼料領(lǐng)域的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/14GK104099251SQ201410146585
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】孫秀蘭, 張曉雪, 李耘, 張銀志, 錢和 申請人:江南大學(xué)