用于改善植物應激耐性的玉米乙烯信號轉導基因及其調節(jié)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了分離的玉米EIN3、ERF3、EBF1、EBF2、EIN5核酸及其編碼的蛋白，所述核酸與植物中乙烯信號轉導相關。本發(fā)明提供了涉及改變植物乙烯敏感性的方法和組合物。本發(fā)明還提供了重組表達盒、宿主細胞、轉基因植物和抗體組合物。
【專利說明】用于改善植物應激耐性的玉米乙烯信號轉導基因及其調節(jié)
發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明通常涉及植物分子生物學。具體而言，其涉及核酸以及調節(jié)核酸在植物中表達的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]植物激素對植物生命的不同和復雜效應已廣泛研究了數(shù)十年。在5種主要的激素一植物生長激素、乙烯、脫落酸、細胞分裂素和赤霉素中，乙烯的分子信號轉導(molecular signaling)和乙烯的作用模式闡述的最清楚。該進展主要在上世紀90年代通過克隆對應于乙烯產生和信號轉導中突變的基因得以完成。
[0004]乙烯(C2H4)是一種氣態(tài)植物激素，其影響植物多種發(fā)育過程和適應性反應，例如發(fā)芽、花和葉衰老、果實成熟、葉離現(xiàn)象、根生節(jié)、程序化細胞死亡和對應激和病原體攻擊的反應性。在過去的十年中，基因篩選鑒定了超過一打多與植物中乙烯反應有關的基因。乙烯支配植物的多種過程，這些效應有時受到其他植物激素、其他生理學信號和生物和非生物環(huán)境影響。例如，已知細胞分裂素能通過乙烯的作用引起類乙烯效應。此外，脫落酸能抑制乙烯產生和信號轉導。植物生長激素和乙烯還已知能在多種生理現(xiàn)象中合作。根據(jù)現(xiàn)有技術，一般而言，看起來乙烯并不是植物生命周期嚴格需要的，但其確實顯著地改變了發(fā)育并調節(jié)對應激的條件反應。
[0005]現(xiàn)有技術所需的是，通過調節(jié)植物中乙烯介導的反應改善植物、尤其是谷類作物例如玉米農藝性狀的方法。
[0006]發(fā)明概述
[0007]本發(fā)明涉及與乙烯信號轉導途徑有關的玉米基因的鑒定和其用于改善植物的應激耐性的調節(jié)。本發(fā)明涉及鑒定和調節(jié)與乙烯途徑有關的4種不同的玉米基因，包括EIN3、ERF3、EBFU EBF2和EIN5，以產生對應激和其他乙烯誘導條件的反應發(fā)生改變的植物。
[0008]本文給出了與乙烯轉導途徑有關的本發(fā)明玉米序列的多核苷酸、相關多肽和所有保守修飾的變體。包括乙烯信號轉導相關基因的新的和部分玉米序列，包括EIN3、ERF3、EBFU EBF2 和 EIN5。
[0009]本發(fā)明還包括改變作物植物尤其是玉米遺傳組成的方法，使所述作物可對應激條件和其他乙烯介導的反應更有耐性。本發(fā)明這一類作物的用途是產量提高和應激耐性。
[0010]乙烯介導的反應包括涉及以下的反應:擁擠耐性、結籽(seed set)和發(fā)育、壓實土壤中的生長、耐?勞性(flooding tolerance)、成熟和衰老以及抗病性。本發(fā)明提供了在植物的乙烯介導的反應中實現(xiàn)各種改變的方法和組合物，這可導致農藝性狀獲得改善，尤其是在應激條件下。
[0011]因此 ，一方面本發(fā)明涉及分離的核酸，其包括與玉米乙烯信號轉導有關的分離的多核苷酸序列。本發(fā)明的一個實施方案是分離的多核苷酸，其包含選自以下的核苷酸序列:(a)包含 SEQ ID N0:1(EIN3)、3(EBF1)、5(EBF2)、7(EIN5)或 9(ERF3)的核苷酸序列；(b)編碼包含SEQ ID N0:2、4、6、8或10的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)與編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸具有指定的序列同一'I"生的多核苷酸；(d)與(a)的多核苷酸互補的多核苷酸；(e)包含來自(a)或(b)的多核苷酸中指定數(shù)目的連續(xù)核苷酸的多核苷酸。分離的核酸可以是DNA。
[0012]本發(fā)明的組合物包括分離的多肽，其包含選自以下的氨基酸序列:(a)包含SEQ IDN0:2、4、6、8或10的氨基酸序列，以及(b)包含與SEQ ID N0:2、4、6、8或10具有指定的序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有乙烯信號轉導活性。
[0013]在另一方面，本發(fā)明涉及包含所述核酸的重組表達盒。此外，本發(fā)明涉及含有所述重組表達盒的載體。此外，含有重組表達盒的載體可促進宿主細胞中核酸的轉錄和翻譯。本發(fā)明還涉及能表達本發(fā)明多核苷酸的宿主細胞。可使用多種宿主細胞，例如但不限于微生物、哺乳動物、植物或昆蟲。
[0014]在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及轉基因植物或植物細胞，其含有本發(fā)明的核酸。優(yōu)選的含有本發(fā)明的多核苷酸的植物包括但不限于玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉(canola)、小麥、苜猜、棉花、水稻、大麥、番爺和谷子。在另一個實施方案中，該轉基因植物是玉米植物或植物細胞。另一個實施方案是來自該轉基因植物的轉基因種子。
[0015]與對照植物相比，本發(fā)明的植物可改變對乙烯的反應。在某些植物中，該改變的乙烯反應位于營養(yǎng)組織、生殖組織或營養(yǎng)組織和生殖組織中。本發(fā)明的植物可具有至少一種下列表型，包括但不限于:在擁擠耐性、結籽和發(fā)育、壓實土壤中的生長、耐澇性、成熟和衰老以及抗病性方面與未轉化植物的差異。
[0016]本發(fā)明的另一個實施方案是在基因組位點已被遺傳修飾的植物，其中，該基因組位點編碼本發(fā)明的乙烯信號轉導多肽。
[0017]提供了提高植物中乙烯信號轉導多肽活性的方法，該方法包括向所述植物引入本發(fā)明的乙烯信號轉導多肽。
[0018]同樣提供了降低或消除植物中乙烯信號轉導多肽水平的方法。所述多肽的水平或活性也可在具體組織中降低或消除，從而引起植物生長速率的改變。降低乙烯信號轉導基因的水平和/或活性將產生對乙烯激素的反應發(fā)生改變的植物。
[0019]在另一方面，本發(fā)明涉及使用在嚴緊條件下與本發(fā)明多核苷酸內位點選擇性雜交的引物從玉米(Zea mays)核酸文庫中擴增的多核苷酸。
[0020]
[0021]單位、前綴和標號以其SI接受的形式表示。除非另外指明，核酸以5’到3’方向從左到右書寫；氨基酸以從氨基到羧基方向從左到右書寫。說明書中引用的數(shù)值范圍包括定義范圍的數(shù)字，并且包括該定義的范圍內的每個整數(shù)。在本文中，氨基酸可通過其公知的三字母符號或由IUPAC-1UB生物化學命名委員會所建議的單字母符號表示。同樣，核酸以其通常所接受的單字母代碼表示。除非另外提供，本文使用的軟件、電或電子術語如The NewIEEE Standard Dictionary of Electrical and Electronics Terms(5th edition, 1993)(電和電子新IEEE標準詞典(第5版，1993))中所定義。下面定義的術語通過參照說明書整體更完整地定義。
[0022]“擴增”表示構建核酸序列的多個拷貝或與核酸序列互補的多個拷貝，其使用至少所述核酸序列之一作為模板。擴增系統(tǒng)包括聚合酶鏈式反應(PCR)系統(tǒng)、連接酶鏈反應(LCR)系統(tǒng)、基于核酸序列的擴增(NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario)、Q-Beta 復制酶系統(tǒng)、基于轉錄的擴增系統(tǒng)(TAS)和鏈置換擴增技術(SDA)。參見例如DiagnosticMolecular Microbiology !Principles and Applications (診斷分子生物學:原理和應用)，Persing, et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, DC(1993)。擴增的產物稱為擴增子。
[0023]術語“抗體”包括涉及抗體的抗原結合形式。術語“抗體”通常指本質上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因編碼的多肽或其特異性結合并識別分析物(抗原)的片段。然而，盡管可以根據(jù)完整抗體的消化定義多種抗體片段，但本領域技術人員應當理解，可以化學方式或利用重組DNA技術從頭合成所述片段。因此，本文所用術語抗體還包括抗體片段，例如單鏈FV、嵌合抗體(即包含不同來源的恒定區(qū)和可變區(qū))、人源化抗體(即包含非人來源的互補決定區(qū)(CDR))和異源耦聯(lián)抗體(例如雙特異性抗體)。
[0024]術語“抗原”包括涉及這樣的材料:可產生針對其的抗體和/或抗體對其具有特異性免疫反應性?？乖瓋鹊奶禺愋悦庖叻磻晕稽c稱為表位或抗原決定簇。這些表位可以是多聚組合物中單體的線性陣列，例如蛋白質中的氨基酸，或包含更復雜的二級或三級結構或有其組成。本領域技術人員應當認識到，所有的免疫原(即能引起免疫反應的物質)都是抗原，然而某些抗原例如半抗原不是免疫原，但可與載體分子偶聯(lián)致免疫原性。對特定抗原具有免疫反應性的抗體可在體內或通過重組方法產生，例如噬菌體或類似載體中選擇重組抗體庫。參見例如 Hus e, et al., (1989) Science246:1275-1281;和 Ward, et al., (1989)Nature341:544-546;and Vaughan, et al, (1996)Nature Biotech.14:309-314。
[0025]本文所用“反義方向”包括涉及在反義鏈轉錄的方向與啟動子可操作地連接的雙鏈多核苷酸序列。該反義鏈與內源性轉錄產物足夠互補，因此內源性轉錄產物的翻譯通常被抑制。
[0026]術語“保守修飾的變體”適用于氨基酸序列和核酸序列。對于具體的核酸序列，保守修飾的變體是指那些編碼氨基酸序列的相同變體或其保守修飾變體的核酸。由于遺傳密碼的簡并性，許多功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU均編碼氨基酸丙氨酸。因此，在每個由密碼子定義丙氨酸的位置，其密碼子可以變?yōu)槿魏紊鲜雒艽a子，而不改變編碼的多肽。所述核酸變異是“沉默變異”，代表一類保守修飾的變異。本文中編碼多肽的每一核酸序列同樣參照遺傳密碼描述了該核酸的每一可能的沉默變異。
[0027]本領域技術人員應當了解，核酸中的各密碼子(除AUG，其通常為甲硫氨酸的唯一密碼子，以及UGG，其通常為色氨酸的唯一密碼子)經修飾可以產生功能相同的分子。因此，每一描述的多肽序列中暗含了編碼本發(fā)明多肽的核酸的各沉默變異，其落于本發(fā)明的范圍之內。
[0028]對于氨基酸序列，本領域技術人員應當了解，對核酸、肽、多肽或蛋白序列的個體取代、缺失和添加，其改變、添加或刪除編碼的序列中的單個氨基酸或低百分率氨基酸，為“保守修飾的變體”，其中所述改變導致化學類似的氨基酸取代某一氨基酸。因此，可改變選自1-15的整數(shù)的任意數(shù)目的氨基酸殘基。因此，例如可進行1、2、3、4、5、7或10個改變。
[0029]保守修飾的變體通常提供與衍生它們的未修飾多肽序列類似的生物學性質。例如，底物特異性，酶活性或受體/配體結合通常為天然蛋白與其天然底物的30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。提供功能類似的氨基酸的保守取代表，在本領域內是公知的。
[0030]以下六組各自含有互相保守取代的氨基酸:1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T) ；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K) ；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。同樣參見 Creighton (1984) Proteins (蛋白)W.H.Freeman and Company。
[0031]對于指定的核酸，“編碼”或“編碼的”表示包括翻譯到指定的蛋白中的信息。編碼蛋白的核酸可包含核酸翻譯區(qū)域內的插入序列(例如內含子)，或可以缺乏所述插入非翻譯序列(例如cDNA中)。編碼蛋白質的信息通過使用密碼子說明。通常，氨基酸序列由核酸使用“通用“遺傳密碼編碼。然而，當表達核酸時，可使用例如存在于某些植物、動物和真菌線粒體、細菌山羊支原體或纖毛大核中的通用密碼的變體。當合成制備或改變核酸時，可利用預期表達核酸的宿主已知密碼子的優(yōu)點。
[0032]例如，雖然本發(fā)明的核酸序列在單子葉植物和雙子葉植物中均可表達，但可修飾序列以解釋單子葉植物或雙子葉植物的具體密碼子偏好和GC含量偏好，這些偏好已顯示是不同的(Murray, et al., (1989)Nucl.Acids Res.17:477-498),因此,對于一具體的氨基酸，玉米優(yōu)選密碼子可來源于已知的玉米基因序列。上述Murray等的表4中列出了來自玉米植物28個基因的玉米密碼子用法。
[0033]涉及指定的多核苷酸或其編碼的蛋白時，本文所用“全長序列”表示具有該指定的蛋白的天然(非合成)、內源性、生物活性形式的全長氨基酸序列。確定某一序列是否為全長的方法是本領域公知的，示例性的技術包括RNA或蛋白質印跡、引物延伸、SI保護和核糖核酸酶保護。參見例如Plant Molecular Biology:A Laboratory Manual (植物分子生物學:實驗室手冊)，Clark, Ed.，Springer-Verlag, Berlin (1997)。與已知的全長同源(直系同源或旁系同源)序列比較也可用于鑒定本發(fā)明的全長序列。此外，通常位于mRNA5’和3’非翻譯區(qū)的共有序列幫助鑒定全長的多核苷酸。例如共有序列ANNNN_G，其中帶下劃線的密碼子代表N末端甲硫氨酸，能幫助確定該多核苷酸是否具有完整的5’端。3’端的共有序列，例如多腺苷酸序列，能幫助確定該多核苷酸是否具有完整的3’端。
[0034]涉及核酸時，本文所用“異源”是指來源于外來種類的核酸，或者，如果來源于同一種類，其本質上已通過故意的人為干預在組成和/或基因組位點上由天然形式進行了修飾。例如，可操作地連接于異源結構基因的啟動子來源于不同于衍生該結構基因的種類，或者，如果來源于同一種類，其中之一或兩者本質上由其天然形式進行了修飾。異源蛋白可來自外來種類，或者如果來自同一種類，其通過故意的人為干預本質上由原始形式進行了修飾。
[0035]“宿主細胞”表示含有載體并支持載體復制和/或表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞，例如E.coli，或真核細胞，例如酵母、昆蟲、兩棲類、或哺乳動物細胞。優(yōu)選地，宿主細胞是單子葉植物或雙子葉植物細胞。尤其優(yōu)選地，單子葉宿主細胞是玉米宿主細胞。
[0036]術語“雜交復合物”包括涉及由兩條單鏈核酸序列選擇性雜交所形成的雙鏈核酸結構。
[0037] “免疫反應條件”或“免疫反應性條件”表示允許對具體表位具有反應性的抗體與該表位結合達到的程度可檢測地大于(例如至少比背景高2倍)該抗體與包含該具體表位的反應混合物中實質上所有其他表位結合的程度。免疫反應性條件依賴于抗體結合反應的形式，通常為用于免疫測定法中的那些。關于免疫測定的形式和條件，參見Harlowand Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (抗體:實驗室手冊)，Cold Spring HarborPublications, New York(1988)。[0038]在將核酸插入細胞的意境中，術語“引入”表示“轉染”或“轉化”或“轉導”，包括涉及將核酸并入原核或真核細胞，其中該核酸可并入細胞的基因組中(例如染色體、質粒、質體或線粒體DNA)，轉化為自主復制子，或瞬時表達(例如轉染的mRNA)。
[0039]術語“分離的”表示諸如核酸或蛋白的材料，其(I)實質或基本上不含天然條件下通常與之伴隨或與之相互作用的成分。該分離的材料任選地包含在天然條件下未發(fā)現(xiàn)與該材料在一起的材料或(2)如果該材料處于天然環(huán)境中，其通過故意的人為干預被合成地(非天然的)改變?yōu)榻M合物，和/或置于對在該環(huán)境中所發(fā)現(xiàn)的材料而言非天然的細胞內位置(例如基因組或亞細胞器)?？梢詫μ烊粻顟B(tài)或由天然狀態(tài)除去的材料進行產生合成材料的改變。例如，如果天然存在的核酸通過在其來源細胞內進行的人為干預的方法被改變，或從已改變的DNA中轉錄，則該天然存在的核酸變成分離的核酸。參見例如，Compounds andMethods for Site Directed Mutagenesis in Eukaryotic Cells (在真核細胞中定點誘變的化合物和方法)，Kmiec, US 專利 5，565，350 號；In Vivo Homologous Sequence Targetingin Eukaryotic Cells (真核細胞內的體內同源序列尋革巴)；Zarling等的PCT/US93/03868。同樣，如果將天然存在的核酸(例如啟動子)通過非天然存在的方法引入到對該核酸而言并非天然的基因組位點時，則該天然存在的核酸變成分離的核酸。本文所定義“分離的”核酸也稱為“異源”核酸。
[0040]除非另外說明，術語“EIN3、ERF3、EIN5、EBF1或EBF2核酸”是本發(fā)明的核酸，表示包含編碼EIN3、ERF 3、EIN5、EBF1或EBF2多肽的本發(fā)明多核苷酸(“EIN3、ERF3、EIN5、EBF1或EBF2多核苷酸”)的核酸。“EIN3、ERF3、EIN5、EBF1或EBF2基因”是本發(fā)明的基因，并指全長EIN3、ERF3、EIN5、EBFl或EBF2多核苷酸的異源基因組形式。
[0041]對于具體的標記，本文所用“位于定義的染色體區(qū)域和包括”是指以一定標記劃界并包括所述標記的連續(xù)長度的染色體。
[0042]本文所用“標記”包括涉及染色體上的位點，其用于鑒定染色體上的獨特位置?！岸鄳B(tài)性標記”包括涉及這樣的標記，其以多種形式(等位基因)出現(xiàn)，以致當不同形式的標記存在于同源對中時，它們可遺傳所述對中待追蹤的每一染色體?；蛐涂墒褂靡环N或多種標記定義。
[0043]本文所用“核酸”包括涉及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸或核糖核酸聚合物，除非另外限制，包括具有天然核苷酸基本屬性的已知類似物，因為它們以類似于天然存在核苷酸的方式與單鏈的核酸雜交(例如肽核酸)。
[0044]“核酸文庫”表示分離的DNA或RNA分子的集合，其包含并實質上代表了特定生物體基因組的整個轉錄的部分。示例性核酸文庫例如基因組和cDNA文庫的構建在標準分子生物學參考文獻中有教導，例如Berger and Kimmel, Guide to MolecularCloning Techinquej Methods in Enzymologyj Vol.152，Academic Press, Inc.，SanDiego, CA(Berger) ; Sambrookj et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (分子克隆-實驗室手冊)，2nd ed.(第二版)，Vol.1-3 (1989);和 Current Protocols in MolecularBiology (最新分子生物學方法)，Ausubelj et al.，Eds.，Current Protocols, a jointventure between Greene Publishing Associates, Inc.and John Wiley&Sons,Inc.(Greene Publishing Associates和約翰威立國際出版公司的合資公司)(1994)。
[0045]本文所用“可操作地連接”包括涉及啟動子和第二序列間的功能性連接。其中啟動子序列起始并介導對應于第二序列的DNA序列的轉錄。通常，可操作地連接表示連接的核酸序列是連續(xù)的，當需要連接兩個蛋白編碼區(qū)時，是連續(xù)的并位于同一閱讀框(readingframe)內。
[0046]本文所用術語“植物”包括涉及完整植物、植物器官(例如葉、莖、根等)、種子和植物細胞及其后代。本文所用植物細胞包括但不限于種子、懸液培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉、根、枝條、配子體、孢子體、花粉和小孢子?？捎糜诒景l(fā)明方法中的植物種類通常為能接受轉化技術的高等植物，包括單子葉植物和雙子葉植物。尤其優(yōu)選的植物是玉米。
[0047]本文所用“多核苷酸”包括涉及脫氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸、或其類似物，該類似物具有天然核苷酸的基本性質，因為它們在嚴緊雜交條件下與本質上和天然存在的核苷酸相同的核苷酸序列雜交，和/或可翻譯為和天然核苷酸同樣的氨基酸。多核苷酸可以是天然或異源結構或調芐基因的全長或亞序列。除非另外說明，該術語包括涉及特定的序列及其互補序列。因此，骨架由于穩(wěn)定性或其他原因而修飾的DNA或RNA是本文該術語所意指的“多核苷酸”。此外，包括稀有堿基或修飾的堿基的DNA或RNA，稀有堿基例如肌苷，修飾的堿基例如三苯甲基堿基，僅舉兩個實例，也是如同本文所用術語的多核苷酸。應當理解，可對DNA和RNA進行多種修飾，所述修飾用于本領域技術人員已知的多種有用的目的。
[0048]本文所用術語多核苷酸包括此類化學、酶促或代謝修飾形式的多核苷酸，以及有病毒和細胞特征的化學形式的DNA和RNA，除此之外，還包括簡單和復雜的細胞。
[0049]術語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可交換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。這些術語除適用于天然存在的氨基酸聚合物外，還適用于一個或多個氨基酸殘基是相應天然存在的氨基酸的人工化學類似物的氨基酸聚合物。天然存在的氨基酸的此類類似物的本質屬性是，當其并入某一蛋白中時，該蛋白對針對相同蛋白所誘發(fā)的但是全部由天然氨基酸組成的抗體具特異反應 性。術語“多肽”、“肽”和“蛋白”也包括修飾，所述修飾包括但不限于，糖基化、脂質連接、硫酸化作用、谷氨酸殘基的Y羧化、羥基化和ADP核糖基化。應當理解，如同公知的和上文所述的，多肽并非總是是完全線性的。例如，多肽可以由于泛素化而是分枝的，它們也可以是含或不含支鏈的環(huán)狀，通常是翻譯后事件的結果，包括天然加工事件和非天然發(fā)生的人為操作事件。環(huán)狀、分枝的和分枝的環(huán)狀多肽可通過非翻譯天然方法和完全合成方法合成。此外，本發(fā)明考慮了本發(fā)明蛋白的含甲硫氨酸變體和少甲硫氨酸氨基末端變體兩者的用途。
[0050]本文所用“啟動子”包括涉及轉錄起始開始上游的DNA區(qū)域，并與RNA聚合酶的識別和結合以及起始轉錄的其他蛋白有關?！爸参飭幼印笔悄芷鹗贾参锛毎修D錄的啟動子，不論其來源是否為植物細胞。示例性的植物啟動子包括但不限于從植物、植物病毒和包含在植物細胞中表達基因的細菌如農桿菌(Agrobacterium)或根瘤菌(Rhizobium)中獲得的那些啟動子。發(fā)育控制下的啟動子實例包括優(yōu)先在某些組織例如葉、根和種子中起始轉錄的啟動子。此類啟動子稱為“組織優(yōu)選的”。僅在某些組織中起始轉錄的啟動子稱為“組織特異性的”。“細胞類型”特異性啟動子主要在一種或多種器官的某些細胞類型中驅動表達，例如，根或葉中的維管細胞?！罢T導型”或“抑制型”啟動子是在環(huán)境控制下的啟動子。通過誘導型啟動子實現(xiàn)轉錄的環(huán)境條件的實例包括缺氧條件或光照。組織特異性、組織優(yōu)選、細胞類型特異性和誘導型啟動子構成“非組成型”啟動子類型。“組成型”啟動子是在大多數(shù)環(huán)境條件下有活性的啟動子。[0051]術語“EIN3、ERF3、EIN5、EBF1或EBF2多肽”是本發(fā)明的多肽，指糖基化或非糖基化形式的一個或多個氨基酸序列。該術語還包括其片段、變體、同系物、等位基因或前體(例如前蛋白原或前蛋白)。“EIN3、ERF3、EIN5、EBFl或EBF2蛋白”是本發(fā)明的蛋白，并包含EIN3、ERF3、EIN5、EBFl 或 EBF2 多肽。
[0052]本文所用“重組”是包括涉及通過引入異源核酸修飾的細胞或載體，或所述細胞來源于如此修飾的細胞。因此，例如，作為蓄意人為干預的結果，重組細胞表達在天然(非重組)形式的細胞中未發(fā)現(xiàn)的相同形式的基因，或表達在其他情況下異常表達、低表達或不表達的天然基因。本文所用術語“重組”不包括通過天然發(fā)生的事件(例如自發(fā)突變、天然轉化/轉導/轉座)，例如不需要蓄意人為干預就發(fā)生的事件改變細胞或載體。
[0053]本文所用“重組表達盒”是重組或合成產生的核酸構建體，含有一系列特定的核酸元件，這些元件允許具體核酸在宿主細胞內轉錄。可將重組表達盒并入質粒、染色體、線粒體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常，除其他序列外，表達載體的重組表達盒部分包括要轉錄的核酸和啟動子。[0054]術語“殘基”或“氨基酸殘基”或“氨基酸”在本文中交換使用，是指并入蛋白、多肽或肽(統(tǒng)稱為“蛋白”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另外限制，可包括天然氨基酸的非天然類似物，該類似物以相似的方式發(fā)揮天然氨基酸的功能。
[0055]術語“選擇性雜交”包括涉及嚴緊條件下核酸序列與其他生物制品的雜交。因此在指定的免疫測定條件下，特定的抗體與具有可識別的表位的分析物結合的程度，比與實質上樣品中所有缺乏該表位的分析物結合的程度高的多(例如至少2倍背景)。在這樣的條件下與抗體的特異性結合需要選擇對具體蛋白具有特異性的抗體。例如，可選擇針對本發(fā)明多肽而產生的抗體，以獲得對本發(fā)明的多肽具有特異性反應性的抗體。用作免疫原的蛋白可以是天然構象或變性的以提供線性表位。
[0056]多種免疫測定形式可用于選擇與具體的蛋白(或其他分析物)特異性反應的抗體。例如，固相ELISA免疫測定法通常用于選擇與蛋白特異性免疫反應的單克隆抗體。關于可用于測定選擇反應性的免疫測定形式和條件說明，參見Harlow and Lane, Antibodies, ALaboratory Manual (抗體，實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Publications, NewYork(1988)。
[0057]術語“嚴緊條件”或“嚴緊雜交條件”包括涉及這樣的條件，在該條件下探針與其靶序列雜交的程度可檢測地比與其他序列結合的程度更高(例如至少2倍背景)。嚴緊條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境下不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴緊度，可鑒定與探針100%互補的祀序列(同源雜交(homologous probing))。
[0058]或者，可調節(jié)嚴緊條件以在序列中允許某些錯配，這樣可檢測較低程度的相似性(異源雜交(heterologous probing))。通常,探針的長度低于約1000個核苷酸,任選低于500個核苷酸。
[0059]通常，嚴緊條件如下:鹽濃度低于約1.5M Na離子，通常為約0.01至1.0M Na離子濃度(或其他鹽)，？117.0至8.3，對短探針(例如10到50個核苷酸)而言，溫度至少約30°C，對長探針(例如超過50個核苷酸)而言為至少約60°C。嚴緊條件也可通過加入諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑獲得。示例性的低嚴緊條件包括用30-35%的甲酰胺、IMNaCl、l%SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩沖液在37°C下雜交，用IX到2 X SSC (20 X SSC=3.0MNaCl/0.3M 檸檬三鈉)在50_55°C下洗滌。示例性的中等嚴緊條件包括在40-45%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS中、在37°C下雜交，在〈RTI0.5X到I XSSC中在55_60°C下洗滌。示例性的高嚴緊條件包括在50%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS在37°C下雜交，在0.1XSSC中在60_65°C下洗滌。雜交后洗滌的功能通常是特異性的，關鍵因素是最終洗滌溶液的離子強度和溫度。對于DNA/DNA雜交物，Tm可根據(jù)Meinkoth和Wahl的方程式近似計算:(1984) Anal.Biochem.138:267-284:Tm=81.5°C +16.6 (log Μ) +0.41 (%GC) -0.61 (%form) -500/L ;其中 M 是單價陽離子的摩爾濃度，%GC是DNA中鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是甲酰胺在雜交溶液中的百分比，L是雜交物堿基對的長度。Tm是50%互補靶序列與完美匹配的探針雜交的溫度(在給定的離子強度和PH下)。每1%的錯配Tm降低約1°C ;因此，可調節(jié)Tm、雜交和/或洗滌條件以與所需同一性的序列雜交。例如，如果需要尋找>90%同一性的序列，可將Tm值降低10°C。一般而言，在給定的離子強度和pH下，選擇嚴緊條件的溫度為比特異性序列及其互補序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C。然而，嚴格的嚴緊條件可使用比熱解鏈溫度(Tm)低1、2、3或4°C的雜交和/或洗滌沖等嚴緊條件可使用比熱解鏈溫度(Tm)低
6、7、8、9或10°C的雜交和/或洗滌；低嚴緊條件可使用比熱解鏈溫度(Tm)低11、12、13、14,15或20°C的雜交和/或洗滌。使用該方程式，雜交和洗滌組合物以及所需的Tm，本領域技術人員應當理解雜交和/或洗滌溶液的嚴緊度的變化，已經做了固有描述。如果所需的錯配度導致Tm低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，優(yōu)選增加SSC濃度，這樣可使用更高的溫度。關于核酸雜交更廣泛的指導見Ti jssen, Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, PartI, Chapter2〃0verview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid probe assays", Elsevier, New York (1993) ；Current Protocols in MolecularBiology (最新分子生物學方法)，Chapter2 (第 2 章)，Ausubel, et al., Eds., GreenePublishing and ffiley-1nterscience, New York(1995)。
[0060]“受試植物”或“受試植物細胞”是其目的基因已實現(xiàn)遺傳改變例如轉化的植物或植物細胞，或者是遺傳自如此改變并包含所述改變的植物或植物細胞?！皩φ铡被颉皩φ罩参?，，或“對照植物細胞”提供了測定植物或植物細胞表型變化的參照點。
[0061]對照植物或植物細胞可以包括，例如:(a)野生型的植物或細胞，即與導致受試植物或細胞的遺傳改變的起始材料基因型相同；(b)與起始材料基因型相同，但已用空構建體(即對目的性狀無已知影響的構建體，例如包含標記基因的構建體)轉化的植物或植物細胞；(c)，是受試植物或植物細胞子代的未轉化分離子的植物或植物細胞；(d)與受試植物或植物細胞遺傳上相同的植物或植物細胞，但未暴露于誘導目的基因表達的條件或刺激下；或者(e)有關基因不表達條件下的受試植物或植物細胞本身。
[0062]在本發(fā)明中，例如，可通過比較受試植物或植物細胞與對照植物或植物細胞，測量乙烯反應的變化，包括乙烯產生的量或時間選擇、乙烯活性、乙烯分布、乙烯信號轉導、乙烯識別，或者植物或植物細胞表型中的變化，例如開花時間、結籽、分枝、衰老、應激耐性或根質量。
[0063]本文所用“轉基因植物”包括涉及基因組內包含異源多核苷酸的植物。一般而言，將異源多核苷酸在基因組中穩(wěn)定整合，這樣該多核苷酸可被連續(xù)的世代遺傳。異源多核苷酸可單獨整合到基因組中或作為重組表達盒的一部分。本文所用“轉基因”包括任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，其基因型由于異源多核苷酸的存在發(fā)生改變，包括轉最初就發(fā)生如此改變的那些轉基因，以及通過最初轉基因的有性雜交或無性生殖產生的那些。本文所用“轉基因”不包括通過常規(guī)植物育種方法或通過天然發(fā)生的事件例如隨機異體受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉化、非重組轉座或自發(fā)突變造成的基因組改變(染色體或染色體外的)。
[0064]本文所用“載體”包括涉及宿主細胞轉染所用的且可以插入多核苷酸的核酸。載體通常是復制子，表達載體允許插入其中的核酸的轉錄。
[0065]以下術語用于描述本發(fā)明多核苷酸/多肽與參考多核苷酸/多肽的序列關系:(a) “參考序列”，(b) “比較窗”，(C) “序列同一性”和(d) “序列同一性百分比”。
[0066](a)本文所用“參考序列”是用作與本發(fā)明的多核苷酸/多肽序列進行比較的基礎的確定序列。參考序列可以是特定序列的子集或整體；例如，全長cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。
[0067](b)本文所用“比較窗口 ”包括涉及多核苷酸/多肽的連續(xù)和特定的片段，其中所述多核苷酸/多肽序列可與參考序列比較，比較窗內的多核苷酸/多肽部分與參考序列(其不含添加或缺失)相 比，可包含添加或缺失(即缺口)以用于兩條序列的最佳匹配。一般而言，比較窗的長度為至少20個連續(xù)的核苷酸/氨基酸殘基，任選地，可以是30、40、50、100或更長。本領域技術人員應對理解，為避免由于在所述多核苷酸/多肽序列中加入缺口而導致的與參考序列的高相似性，通常引入缺口罰分，從匹配數(shù)量中減去。
[0068]用于比較的序列比對方法是本領域公知的。用于比較的最佳序列比對可按照下列方法進行:Smith and Waterman, (1981)Adv.Appl.Math.2:482 的局部同源性算法；Needleman and ffunsch, (1970)J.Mol.Biol.48:443 的同源性比對算法；Pearsonand Lipman, (1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.85:2444 的相似性檢索方法；這些算法的計算機化執(zhí)行，包括但不限于:PC/Gene程序中的CLUSTAL, Intelligenetics, MountainView, California ；GCG Wisconsin 軟件包中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA,第 10 版(Accelrys Inc.,9685Scranton Road,San Diego,California, USA)。CLUSTAL 程序在下述文獻中有詳細描述:Higgins and Sharp, (1988)Gene73:237-244 ;Higgins and Sharp, (1989) CAB10S5:151-153;Corpet et al., (1988)Nucle icAcids Researchl6:10881-90 ；Huang et al.(1992)Computer Applications inthe Biosciences8:155-65, 以及 Pearson et al., (1994)Methods in MolecularBiology24:307-331o
[0069]可用于數(shù)據(jù)庫相似性檢索的BLAST家族程序包括:用于針對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列的核苷酸查詢序列的BLASTN ;用于針對蛋白數(shù)據(jù)庫的核苷酸序列檢索的BLASTX ;用于針對蛋白數(shù)據(jù)庫序列的蛋白質查詢序列的BLASTP ;用于針對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列的蛋白查詢序列的TBLASTN ；以及用于針對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列的核苷酸查詢序列的TBLASTX。參見 Current Protocols in Molecular Biology (最新分子生物學方法)，Chapterl9 (第19 章),Ausubel,et al., Eds., Greene Publishing and ffiley-1nterscience,NewYork(1995) ;Altschul,et al.，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410 和 Altschul,etal., (1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402。
[0070]公眾可從例如國家醫(yī)學圖書館的國家生物技術信息中心Building38A, Bethesda,Maryland, USA獲得進行BLAST分析的軟件。該算法包括首先通過在查詢序列中確定長度為W的短字串確定高評分序列對(HSPs)，當其與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字串比對時，匹配或滿足某種正值閾值(positive-valued threshold)評分T。T稱為相鄰字串序列評分閾值。這些起始的相鄰字串搜索(word hit)作為啟動檢索的種子，以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長的HSP。字串搜索沿每一序列在兩個方向上延伸，直到累積的比對評分增加。對于核苷酸序列，用參數(shù)M(匹配殘基對獎分，總是>0)和N(錯配殘基罰分，總是〈O)計算累積的評分。對于氨基酸序列，使用評分矩陣計算累積的評分。
[0071]當累積的比對評分從其最大獲得值減少X時；當一個或多個負評分殘基比對的累積，使累積的評分為O或以下時；或當?shù)竭_任一序列的終點時，停止字串搜索在每一方向上的延伸。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對于核酸序列)使用以下作為缺省值:字長(W)為11，期望值(E)為10，截斷為100，M=5, N=_4，比較兩條鏈。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下作為缺省值:字長(W)為3，期望值(E)為10，以及 BL0SUM62 評分矩陣(參見 Henikoff and Henikoff, (1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915)。
[0072]除計算序列同一性百分比外，BLAST算法還對兩條序列的相似性進行統(tǒng)計學分析(參見例如 Karl in and Altschul, (1993) Proc.Nat' 1.Acad.Sc1.USA90:5873-5877) oBLAST算法提供的一種相似性測量是最小和概率(smallest sum probability (P (N)),其表示兩條核苷酸或氨基酸序列間可能偶然匹配的概率。BLAST檢索假定蛋白質可作為隨機序列模建，然而，許多實際的蛋白包含非隨機的序列區(qū)域，其可能是同聚物域(homopolymerictract)、短期重復(short-period repeat)或富含一種或多種氨基酸的區(qū)域。這些低復雜度區(qū)域可在不相關的蛋白間比對，甚至所述蛋白的其他區(qū)域完全不同。可使用多種低復雜度過濾程序降低此類低復雜度比對。例如，可單獨或組合使用SEG(W00ten andFederhen, (1993)Comput Chem.17:149-163)和XNU(Claverie and States, (1993)Comput.Chem.17:191-201)低復雜度過濾程序。
[0073]除非另外說明，本文提供的核苷酸和蛋白同一性/相似性值使用GAP(第10版GCG)根據(jù)缺省值計算。GAP(全局比對程序)也可用于比較本發(fā)明的多核苷酸或多肽和參考序列。GAP 使用 Needleman 和 Wunsch (J.Mol.Biol.48:443-453 (1970))的算法尋找兩條完整序列的比對，該比對使匹配數(shù)最大并使缺口數(shù)最小。GAP考慮所有可能的比對和缺口位置，并產生具有最大數(shù)目的匹配堿基和最少的缺口的比對。其提供了匹配堿基單元的缺口產生罰分和缺口延伸罰分。對于其插入的每一缺口，GAP必須利用匹配的缺口產生罰分數(shù)。如果選擇了大于O的缺口延伸罰分，則對于每個插入的缺口，GAP還必須利用缺口長度乘以缺口延伸罰分。在用于蛋白序列的第10版Wisconsin Genetic軟件包中，缺省缺口產生罰分值和缺口延伸罰分值分別為8和2。對于核酸序列而言，缺省缺口產生罰分是50，而缺口延伸罰分是3。 缺口產生和缺口延伸罰分可以表示為選自0-100的整數(shù)，因此，例如，缺口產生和缺口延伸罰分每一個都可以獨立地是3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60或更聞。
[0074]GAP給出最佳比對家族的一個成員。該家族可以有很多成員，但無任何其他成員具有更好的性質。GAP給出比對的4個優(yōu)值:性質(Quality)、比率(Ratio)、同一性(Identity)和相似性(Similarity)。計量最大化性質以比對序列。比率是性質除以較短片段中的堿基數(shù)。同一性百分比是實際匹配的符號百分比。相似性百分比是類似符號的百分t匕。忽略缺口對面的符號。當一對符號的評分矩陣值大于等于相似性閾值0.50時，對相似性評分。第10版Wisconsin Genetic軟件包中所用的評分矩陣是BL0SUM62 (參見Henikoffand Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915)。
[0075]序列的多重比對可使用CLUSTAL比對方法進行(Higgins and Sharp (1989)CAB10S5:151-153)，使用缺省參數(shù)(GAP罰分=10，GAP長度罰分=10)。使用CLUSTAL方法進行成對比對的缺省參數(shù)是KTUPLE1，GAP(缺口罰分)=3，Window(窗口)=5并且DIAGONALSSAVED (現(xiàn)有診斷)=5。
[0076](C)在兩條核酸或多肽序列的語境中，本文所用“序列同一性”或“同一性”包括涉及當在特定的比較窗口中進行最大一致性比對時在兩條序列中相同的殘基。當在涉及蛋白時，使用序列同一性百分比，則應認識到，不同的殘基位置通常由于保守性氨基酸的取代而不同，其中用氨基酸殘基取代具有類似化學性質(例如電荷或疏水性)的其他氨基酸殘基，并且因此不改變所述分子的功能特性。如果序列的區(qū)別在于保守取代，則可上調序列同一性百分比，以校正取代的保守屬性。認為因此類保守性取代而不同的序列具有“序列相似性”或“相似性”。進行該調整的方法對本領域技術人員來說是公知的。通常其包括將保守取代作為部分而非全部錯配進行評分，由此增加序列同一性百分比。因此，例如當相同氨基酸被給予評分1，而非保守取代被給予評分O時，給予保守取代0-1之間的評分。保守取代的評分根據(jù)例如Meyers and Miller, (1988)Computer Applic.Biol.Sc1.4:11-1, e.<RTI g的算法計算，如程序 PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, USA)所執(zhí)行的。
[0077](d)本文所用“序列同一性百分比”表示，通過在比較窗內比較兩條最佳比對的序列確定的值，其中比較 窗口中一部分多核苷酸序列與參考序列(其不包括添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即缺口)，以用于兩條序列的最佳比對。該百分比通過下述方式計算:確定在兩條序列中存在相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目，以產生匹配位置的數(shù)目，用比較窗中的位置總數(shù)除匹配位置的數(shù)目，將結果乘以100獲得序列同一性百分比。
[0078]附圖簡要說明
[0079]圖1是MPSS文庫中Zm ERF3表達的組織分布圖。
[0080]圖2是微陣列中Zm ERF3表達的冷誘導時程圖。
[0081]圖3是在表達UB1::ZmERF3的轉基因玉米的E3和E18中，上調或下調超過5倍的基因數(shù)目的圖示。
[0082]發(fā)明的詳細描述
[0083]鐘述
[0084]除了其他事項外，本發(fā)明提供了調節(jié)(即增加或降低)植物中本發(fā)明的多核苷酸和多肽水平的方法。特別是，本發(fā)明的多核苷酸和多肽可在一定時間或空間表達，例如在發(fā)育階段在組織中，和/或大量表達，這不是非重組工程植物的特征。因此，本發(fā)明提供了在下文所提供的示例性應用中的用途。
[0085]EIN3是與乙烯反應因子例如ERFl或ERF3的啟動子中存在的乙烯反應元件結合的核轉錄因子。因此下調EIN3會降低乙烯敏感性。
[0086]EBFl和EBF2是與EIN3結合并靶向EIN3蛋白用于通過泛素/蛋白酶途徑降解的F-盒蛋白。因此EBFl和EBF2的超表達會降低乙烯的敏感性。
[0087]EIN3蛋白水平對乙烯做出反應而迅速增加，該反應需要若干乙烯信號轉導途徑組分，包括乙烯受體(ETR1 和EIN4)、CTR1、EIN2、EIN5和EIN6。在無乙烯時，EIN3通過EBFl和EBF2介導的泛素/蛋白酶途徑迅速降解。
[0088]EIN5具有對EBFl和EBF2轉錄物的內切核酸酶活性，由此通過促進EBFl和EBF2mRNA降解拮抗對EIN3的負反饋。因此下調EIN5可降低乙烯敏感性。
[0089]乙烯反應的變化可包括乙烯產生的量或時間選擇、乙烯活性、乙烯分布、乙烯信號轉導和乙烯識別中的一個或多個變化，其可以導致表型變化，例如改變的開花時間、結籽、分枝、衰老、應激耐性或根形成。
[0090]在某些實施方案中，本發(fā)明的核酸構建體可與其他目的多核苷酸序列組合(疊加)使用，以產生具有所需表型的植物。本發(fā)明的多核苷酸可與任何基因或基因組合疊加，產生的組合可包括任一或多個目的多核苷酸的多重拷貝。需要的組合可影響一種或多種性狀，g卩，為了調節(jié)影響乙烯反應的基因表達，可產生某些組合。其他組合可設計成產生具有多種所需性狀的植物，例如本文中其他部分描述的那些。
[0091]擁擠耐性
[0092]作物植物的農藝性狀通常是它們耐受種植密度程度的函數(shù)。過度擁擠應激可能是由于簡單限制營養(yǎng)物、水和陽光而引起的。擁擠應激也可以是由于植物間接觸增強而導致的，植物通常通過減緩生長和加厚組織對身體接觸做出反應。
[0093]乙烯與植物的 擁擠耐性有關，例如，乙烯不敏感的煙草植物與相鄰植物接觸時并未減緩生長(Knoester, et al., (1998)PNAS USA95:1933-1937)。同樣，有證據(jù)表明乙烯和植物對乙烯的反應與缺水應激有關，乙烯可引起植物發(fā)生變化，除損失水分本身外，該變化還限制其生長和惡化干旱應激癥狀。
[0094]本發(fā)明提供了通過調節(jié)EIN3、ERF3、EBFU EBF2或EIN5基因或基因產物中的一種或多種的表達或活性，降低植物尤其是諸如玉米的谷物的乙烯敏感性，以增加密集間隔(close spacing)耐受同時降低應激并使產量損失最小化。
[0095]玉米的結籽和發(fā)育
[0096]乙烯在種子發(fā)育中發(fā)揮多方面作用。例如，在玉米中，乙烯與發(fā)育中的胚乳細胞的程序性死亡有關(Young, et al.，(1997)Plant Physi0.115:737-751)。此外，乙烯與例如在穗尖端發(fā)生的核敗育(kernel abortion)有關,尤其是在應激條件下生長的植物中(Chenget al.，Lur，(1996)Physiol.Plant98:245-252)。核結籽降低理所當然導致產量降低。因此，本發(fā)明提供了通過調節(jié)與乙烯反應有關的基因的表達降低乙烯作用的植物，尤其是玉米植物。
[0097]壓實十壤中的牛長
[0098]植物生長受土壤的密度和壓實狀態(tài)影響。更密、更壓實的土壤通常導致更差的植物生長。農業(yè)趨向于更多的最小化，直到目標為土壤和能量節(jié)約的種植和栽培實踐的傾向，日益增加了在這些條件下能良好發(fā)育的作物植物的需要。
[0099]已公知乙烯影響植物的生長和發(fā)育，乙烯的一種效應是，當遭遇機械應激例如壓實土壤時促進組織增厚和生長遲緩。這可以影響根和枝條。該效應假定在某些環(huán)境中是適應性的，因為其產生能打破障礙例如壓實土壤的更強壯、更緊密的組織。然而，在這類條件下，乙烯的產生和乙烯途徑的激活可能超過對壓實土壤機械應激的適宜性調節(jié)的所需。任何導致的不必要的生長抑制是不需要的農藝結果。
[0100]本發(fā)明提供了通過調節(jié)EIN3、ERF3、EBF1、EBF2或EIN5基因或基因產物中的一種或多種的表達或活性，降低植物尤其是諸如玉米的谷物的乙烯敏感性。此類調節(jié)的植物在壓實土壤中更好地生長和發(fā)芽，導致更高的群從計數(shù)(stand count)，預示著更高的產量。
[0101]耐澇件
[0102]每年全世界的淹水土壤(flooding soil)和水潰土壤(water-logged soil)弓丨起作物產量的大量損失。淹水可以是廣泛的或局部的和短暫或延長的。乙烯與淹水介導的損傷有關。實際上，乙烯產量在淹沒的條件下升高。該升高有兩個主要原因:1)在導致缺氧的此類淹沒條件下，植物產生更多的乙烯，以及2)在淹沒條件下，乙烯從植物中的擴散減緩，因為乙烯在水中幾乎不溶，導致植物內乙烯水平上升。
[0103]在水稻中，耐淹沒性(submergence tolerance)已知通過乙烯信號轉導傳遞(Perata and Voesenek, (2007)Trends Plant Sci12 (2):43_46)。
[0104]淹沒的玉米根中的乙烯還可抑制向地性，其在發(fā)芽期間通常是適宜的，因為其使根向下，并使枝條向上。向地性是決定根結構的因素，其反過來在土壤來源獲取中起重要作用。乙烯水平的操作可用于影響耐旱性、耐澇性、更高的穩(wěn)定性和/或營養(yǎng)吸收改善的根的角度(root angle)。例如，以更直立的角度(更陡峭)生長的根，在土壤中生長的更深，由此在更深的地方獲得水，從而改善耐旱性。無干旱應激時，對于根通過更平行于土壤表面的根更有效的吸收土壤上層中的營養(yǎng)和水分，可獲得相反的觀點。通常，具有接近于垂直(陡峭)的角度的根也比具有淺角度(平行于表面)的根對根倒伏更敏感，后者更耐根倒伏。
[0105]除了抑制向地性，可能的是，淹沒條件下的乙烯進化抑制生長，尤其是根的生長。此類抑制會導致總體較差的植物生長，因此是不利的農藝性狀。
[0106]本發(fā)明提供了通過調節(jié)EIN3、ERF3、EBF1、EBF2或EIN5基因或基因產物中的一種或多種的表達或活性，降低植物尤其是諸如玉米的谷物的乙烯敏感性。此類植物在淹沒條件下或水潰土壤中更好的生長和發(fā)芽，從而導致更高的群從計數(shù)。
[0107]植物成熟和衰老
[0108]已知乙烯與控制衰老、果實成熟和脫落有關。乙烯在果實成熟中的作用歷史悠久并應用于工業(yè)中。預期乙烯產生不足/不敏感會導致種子成熟或果實成熟變緩，反之則會導致種子成熟或果實成熟更快。主要研究了雙子葉植物的脫落，顯然脫落對單子葉植物例如谷物有很少的應用。乙烯介導的衰老也已在雙子葉植物中進行了廣泛研究，但衰老的控制對雙子葉和單子葉作物種類在農學上都是重要的。乙烯不敏感性可延遲、但非抑制衰老。乙烯介導的衰老過程與細胞死亡過程在疾病癥狀和脫落區(qū)中具有某些相似性。通過控制EIN3、ERF3、EBF1、EBF2或EIN5基因中的一種或多種控制乙烯敏感性，可調節(jié)作物植物例如玉米的成熟速率。
[0109]本發(fā)明提供了通過調節(jié)EIN3、ERF3、EBF1、EBF2或EIN5基因或基因產物中一種或多種的表達或活性，降低植物尤其是諸如玉米的谷物的乙烯敏感性，其導致植物晚熟，這對于在不同的成熟區(qū)安置作物多樣性是需要的。
[0110] 對其他非生物應激的耐性
[0111]許多對植物的應激誘導乙烯產生(參見Morgan and Drew, (1997)Physiol.PlantlOO:620-630) ο這些應激例如可以是冷、熱、創(chuàng)傷、污染、干旱和高鹽度。上文描述了機械阻抗(土壤壓實)和淹水應激。似乎某些所述應激通過普通機制起作用，例如水分缺陷。顯然干旱引起水分缺陷，擁擠應激也可引起水分缺陷。此外，在玉米中，冷卻可引起乙烯產量和活性升高，并且顯然該誘導是因為冷卻引起細胞的水分缺陷而導致的(Janowaik和 Dorffling, (1995)J.Plant Physiol.147:257-262)。
[0112]應激后某些乙烯的產生可通過調節(jié)植物中乙烯介導的過程用于適應性的目的，該過程更適于所經歷的應激、以這種方式改造的植物。然而，也有證據(jù)表明，在應激過程中乙烯產生可導致由應激造成的陰性癥狀的惡化，例如黃化、組織死亡和衰老。
[0113]在應激過程中的乙烯產生引起或增加陰性應激相關癥狀的情況下，需要產生對乙烯的敏感性較低的作物植物。為此，本發(fā)明提供了通過調節(jié)EIN3、ERF3、EBF1、EBF2或EIN5基因或基因產物中的一種或多種的表達或活性，降低植物尤其是諸如玉米的谷物的乙烯敏感性，以產生乙烯介導效應更少的植物。
[0114]杭病件
[0115]作物植物對廣泛 的病原體易感，無論病毒、細菌、真菌還是昆蟲。該易感性導致每年世界范圍內作物產量大幅下降。作物育種工作者盡力培育能抵抗病原體攻擊的更具抗性或耐性的品種。另外基因工程策略也尋求同樣的目標。在許多植物-病原體相互作用中，已知疾病癥狀，最常見的是組織壞死和導致弱植物生長，是植物針對病原體而做出的活性防御反應的結果。即，所述癥狀由植物直接引起，而非病原體簡單造成。在所有作物植物及其潛在病原體列表中，抗性是規(guī)則，易感性是例外。易感相互作用通常認為由植物不適宜的或不充分的激活防御導致，其導致癥狀發(fā)展增加和無法控制所述病原體。
[0116]已知乙烯與植物病原體防御系統(tǒng)有關。許多致病相關基因在表達時在mRNA的水平上受到乙烯誘導。我們對乙烯在植物病原體防御中所起作用的理解趨勢是，乙烯和乙烯介導效應是對病原體攻擊的下游反應的主要部分，如在癥狀發(fā)展中。乙烯似乎與植物對病原體攻擊的反應和病原體導致的組織損傷有關。在易感相互作用中，乙烯實際上可以促進組織損傷。因此在這種情況下阻斷乙烯產生或作用可實際上導致較少的組織損傷，即更明顯的抗性，即使所述病原體與該植物相容。已知阻斷乙烯作用能導致更高的易感性(如 Knoester, et al., (1988))或更多的抗性(如 Lund, et al., (1998) PlantCell 10:371-382)，這表明，跟預期一樣，乙烯作用的機制是復雜的，其依賴于不同植物和病原體的相互作用。
[0117]本發(fā)明提供了 EIN3、ERF3、EBF1、EBF2或EIN5基因中的一種或多種基因實現(xiàn)對植物病原體的抗性增加的用途，尤其是對于單子葉植物，例如玉米。
[0118]對于大多數(shù)應用而言，這將涉及到通過調節(jié)EIN3、ERF3、EBFl、EBF2或EIN5基因或基因產物的表達或活性降低乙烯信號轉導，目標是，產生對乙烯反應更少的植物，由此產生在病原體感染后不致老是發(fā)生組織損傷的植物。
[0119]已認識到，對于某些病原體而言，乙烯信號轉導是獲得實質性抗性所需的。這可以通過以下方式操作:將功能性乙烯敏感基因連接于病原體誘導型啟動子，尤其是其誘導優(yōu)先對一種病原體或多種病原體作出反應的啟動子，對于所述病原體而言，實現(xiàn)主動抗性需要植物乙烯信號轉導。
[0120]棺物轉化[0121]轉基因植物的產生對作物植物基因工程策略非常重要。轉基因通常包括將外源DNA通過多種方法引入植物細胞中，例如粒子轟擊或農桿菌感染，隨后通常進行組織培養(yǎng)和植物再生。轉基因植物生產依然是基因工程中昂貴和低效率的步驟，尤其是對于許多經濟上最重要的作物植物，例如谷物，如玉米來說。
[0122]因此改善該過程的效率是非常重要的。
[0123]很長時間以來，人們認為乙烯作用對植物轉化有負面影響。因此多種結合、捕捉或其他阻斷乙烯積聚的方法被用于轉化和組織培養(yǎng)中(參見Songstad, et al.，(1991)PlantCell Reports9:694-702)。粒子轟擊方法引起大量組織/細胞損傷，該損傷已知能導致乙烯積聚。而且，在大多數(shù)組織培養(yǎng)方法中，某些組織比另一些生長的更好，如在轉化體的化學選擇中設計的那樣。這類瀕死的組織可放出乙烯，引起陽性轉化體的抑制。將植物組織限制在容器中用于組織再生加重了所述效果，其導致乙烯的積聚，同樣引起生長遲緩。由于已知乙烯能降低組織生長速率，甚至能促進細胞/組織死亡，需要在轉化期間具有阻斷或最小化乙烯作用的方法。
[0124]因此，本發(fā)明還提供了通過降低一種或多種EIN3、ERF3、EBFU EBF2或EIN5基因的表達或活性，EIN3、ERF3、EBF1、EBF2或EIN5基因產生乙烯作用暫時或穩(wěn)定降低的用途。
[0125]其他用途
[0126]本發(fā)明還提供了分離的核酸用作檢測、定量或分離基因轉錄物的探針或擴增引物，所述核酸包含足夠長并與本發(fā)明基因互補的多核苷酸。例如，本發(fā)明分離的核酸可用作:在篩選所需的轉基因植物中檢測mRNA水平不足的探針，檢測基因突變(例如取代、缺失或添加)，在化合物篩選測定中監(jiān)測表達上調或酶活性變化的探針，檢測基因的任何數(shù)目的等位基因變體(多態(tài)性)、直系同源或旁系同的探針，或用于在原核細胞中定向誘變(參見例如美國專利5，565，350號)的探針。本發(fā)明分離的核酸可用于其編碼的多肽的重組表達，或在抗體的制備和/或篩選中用作免疫原。本發(fā)明分離的核酸還可用于在宿主細胞、組織或植物中有義或反義抑制一種或多種本發(fā)明基因。結合、嵌入、切割和/或交聯(lián)本發(fā)明分離的核酸的化學試劑的連接，也可用于調節(jié)轉錄或翻譯。
[0127]本發(fā)明還提供了分離的蛋白，其包含本發(fā)明的多肽(例如，前酶原、酶原或酶)。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明多肽的至少一個表位的蛋白。本發(fā)明的蛋白可用于測定酶功能的酶激動劑或拮抗劑，或用作免疫原或抗原以獲得與本發(fā)明的蛋白特異性免疫反應的抗體。這些抗體可用于測定表達水平、從表達文庫中鑒定和/或分離本發(fā)明的核酸、從其他種類中鑒定同源多肽或純化本發(fā)明的多肽。
[0128]本發(fā)明分離的核酸和多肽可用于多種植物類型中，尤其是單子葉植物，例如禾本科的種類，包括大麥屬(Hordeum)、黑麥屬(Secale)、小麥屬(Tritium)、高粱屬(Sorghum)(例如高粱(S.bicolor))和玉米屬(例如玉米(Z.mays))。本發(fā)明分離的核酸和蛋白也可用于下列屬的種類中:南瓜屬(Cucurbita)、玫瑰屬(Rosa)、葡萄屬(Vitis)、胡桃屬(Juglans)、草莓屬(Fragaria)、蓮花屬(Lotus)、苜蓿屬(Medicago)、紅豆草屬(Onobrychis)、紅花草屬(Trifolium)、葫蘆巴屬(Trigonella)、紅豆屬(Vigna)、柑桔屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鶴草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬(Daucus)、擬南芥屬(Arabidopsis)、芥屬(Brassica)、蘿卜屬(Raphanus)、白芥屬(Sinapis)^H施屬(Atropa)、辣椒屬(Capsicum)、曼陀羅屬(Datura)、莨菪屬(Hyoscyamus)、番爺屬(Lycopersicon)、煙草屬(Nicotiana)、爺屬(Solanum)、喇口入花屬(Petunia)、洋地黃屬(Digitalis)、墨角絕屬(Majorana)、菊苣屬(Ciahorium)、向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhiunum)、萱草屬(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵屬(Pelargonium)、稷屬(Panieum)、狼尾草屬(Pennisetum)、毛良屬(Ranunculus)、千里光屬(Senecio)、喇機舌屬(Salpiglossis)、黃瓜屬(Cucumis)、紫水晶屬(Browallia)、甘氨酸屬(Glycine)、豌豆屬(Pisum)、菜豆屬(Phaseolus)、黑麥草屬(Lolium)、稻屬(Oryza)和燕麥屬(Avena)。
[0129]趁璧
[0130]除其他外，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明多核苷酸的分離的RNA、DNA核酸及其類似物和/或嵌合體。
[0131]本發(fā)明的多核苷酸包括:
[0132](a)編碼SEQ ID NOS: 2、4、6、8或 10多肽的多核苷酸及其保守修飾和多態(tài)性變體，包括示例性的 SEQ ID NOS:1 (EIN3)、3 (EBFl)、5 (EBF2)、7 _5)或 9 (ERF3)的多核苷酸；
[0133](b)分離的多核苷酸，其為使用在嚴緊條件下與本發(fā)明多核苷酸內位點選擇性雜交的引物對從植物核酸文庫中擴增的產物；
[0134](c)分離的多核苷酸，其與(a)或(b)的多核苷酸選擇性雜交；
[0135](d)分離的多核苷酸,其與(a)、(b)或(C)的多核苷酸具有特定的序列同一'丨生；
[0136](e)分離的多核苷酸，其編碼具有原型多肽的特定數(shù)目連續(xù)氨基酸的蛋白，其中所述蛋白被由該蛋白呈遞所誘發(fā)的抗血清特異性識別，其中該蛋白不與完全被該蛋白免疫吸附的抗血清可檢測地免疫反應；
[0137](f) (a)、(b)、(c)、(d)或(e)的多核苷酸的互補序列；以及
[0138](g)分離的多核苷酸，包含至少一定數(shù)目的來自(a)、(b)、(C)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸的連續(xù)核苷酸；
[0139](h)來自全長富集的cDNA文庫的分離的多核苷酸,所述文庫具有與(a)、(b)、(C)、
(d)、(e)、(f)或(g)的多核苷酸選擇性雜交的物理化學性質；
[0140](i)分離的多核苷酸，通過下列過程制備:1)提供全長富集的核酸文庫，2)將所述多核苷酸與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的多核苷酸選擇性雜交，由此從核酸文庫中分離該多核苷酸。
[0141]A.編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸
[0142]如上文(a)中所述，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明多核苷酸的分離的核酸。其中所述多核苷酸編碼本發(fā)明的多肽。參考遺傳密碼，本文中的每個編碼多肽的核酸序列，同樣記述了該核酸的每個可能的沉默變異。本領域技術人員應當認識到，核酸中的每個密碼子(除通常為甲硫氨酸的唯一密碼子的AUG及通常為色氨酸的唯一密碼子的UGG外)經修飾，可以產生功能相同的分子。因此，編碼本發(fā)明多肽的核酸的各沉默變異暗含于每一描述的多肽序列中，并落于本發(fā)明的范圍內。因此，本發(fā)明包括本發(fā)明的多核苷酸和編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。
[0143]B.從植物核酸文庫中擴增的多核苷酸
[0144]如上文(b)中所述，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明多核苷酸的分離的核酸，其中所述多核苷酸在核酸擴增條件下從植物核酸文庫中擴增。[0145]各種擴增方法中每一方法的核酸擴增條件，是本領域技術人員公知的。植物核酸文庫可從單子葉植物例如谷物作物構建。示例性的谷物包括玉米、高粱、苜蓿、卡諾拉、小麥或水稻。植物核酸文庫也可從雙子葉植物例如大豆中構建。玉米株系B73、PHRE1、A632、BMP2#10、W23和Mol7是已知的并且公眾可獲得。其他公眾已知并可獲得的玉米株系可從玉米遺傳公司(Maize Genetics Cooperation, Urbana, IL)獲得。
[0146]小麥株系可從小麥遺傳資源中心(Wheat Genetics ResourceCenter, Manhattan, KS)獲得。核酸文庫可以是cDNA文庫、基因組文庫、或由內含子加工的任何階段的核轉錄物一般性構建的文庫。cDNA文庫可被標準化以增加相對稀少的cDNA的代表性。在任選的實施方案中，cDNA文庫使用富集的全長cDNA合成方法構建。此類方法的實例包括 Oligo-Capping 法(Maruyama and Sugano, (1994)Genel38:171-174)、生物素化的 CAP Trapper 法(Carninci, et al., (1996) Genomics37:327-336)和 CAP RetentionProcedure (Edery, et al., (1995)Molecular and Cellular Biologyl5:3363-3371)。優(yōu)選快速生長組織或快速分裂細胞作為構建cDNA文庫的mRNA源。玉米的生長階段描述于1993年 2 月再版的"How a Corn Plant Develops, "Special Report48, 1wa State Universityof Science and Technology Cooperative Extension Service, Ames, 1wa 中。
[0147]該實施方案的多核苷酸(或其子序列)例如可通過使用擴增引物獲得，所述擴增引物在核酸擴增條件下，選擇性雜交于并延伸至本發(fā)明多核苷酸內至少兩個位點，或位于本發(fā)明多核苷酸的側翼并包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸內的兩個位點，或本發(fā)明多核苷酸內的位點和包含本發(fā)明多核苷酸的核酸內的位點。獲得載體插入物5’和/或3’末端的方法是本領域公知的。參見例如Frohman, PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications (PCR 策略:方法和應用指南)，Innis, et al., Eds.(AcademicPress,Inc., San Diego)，pp.28-38(1990))中描述的 RACE(Rapid Amplification ofComplementary Ends ( 互補末端的快速擴增))；同樣參見美國專利5，470，722號以及Current Protocols in Molecular Biology (最新分子生物學方法)，Unitl5.6，Ausubel, etal., Eds., Greene Publishing and ffiley-1nterscience, New York(1995);Frohman andMartin, (1989)Techniquesl:165。
[0148]任選地，所述引物與其擴增的靶核酸子序列互補，但相對于以下多核苷酸可具有約85%到99%的序列同一性:所述引物經設計與所述多核苷酸退火。如本領域技術人員應當了解的，選擇引物對選擇性雜交的位點，使得在所需的核酸擴增條件下能形成單個連續(xù)的核酸。核苷酸中引物的長度選自由至少15-50組成的整數(shù)組。因此，引物的長度可以是至少15、18、20、25、30、40或50個核苷酸。本領域技術人員應當理解，可使用加長的引物序列以增加與靶序列結合(即退火)的特異性。在引物5’端可加入非退火序列(尾)，以便例如在擴增子的末端引入克隆位點。
[0149]擴增產物可使用本領域技術人員公知的表達系統(tǒng)翻譯。所得翻譯產物可例如通過測定適宜的催化活性(例如比活性和/或底物特異性)，或驗證對本發(fā)明的多肽具有特異性的一個或多個表位的存在，證實為本發(fā)明的多肽。從PCR衍生模板的蛋白合成方法是本領域已知的，并且可從商業(yè)上獲得。參見例如Amersham LifeSciences, Inc, Catalog' 97, p.354。
[0150]C.與(A)或(B)的多核苷酸選擇性雜交的多核苷酸[0151]如上文(c)中所述，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明多核苷酸的分離的核酸，其中該多核苷酸在選擇性雜交條件下與上述(A)或(B)部分的多核苷酸選擇性雜交。因此，該實施方案的多核苷酸可用于分離、檢測和/或定量包含(A)或(B)的多核苷酸的核酸。例如，本發(fā)明的多核苷酸可用于鑒定、分離或擴增存儲庫中的部分或全長克隆。
[0152]在某些實施方案中，所述多核苷酸是基因組或cDNA序列，其分離自雙子葉或單子葉核酸文庫或相反與雙子葉或單子葉核酸文庫的cDNA互補。
[0153]單子葉植物和雙子葉植物的示例性種類包括但不限于，玉米、卡諾拉、大豆、棉花、小麥、高粱、向日葵、苜猜、燕麥、甘蔗、谷子、大麥和水稻。cDNA文庫包含至少50%-95%的全長序列(例如至少50%、60%、70%、80%、90%或95%的全長序列)?？蓸藴驶痗DNA文庫以增加稀有序列的代表性。參見例如美國專利5，482，845號。序列同一性相對于互補序列降低的序列，通常但非絕對使用低嚴緊雜交條件。對于具有更高同一性的序列可任選地使用中等和高嚴緊條件。低嚴緊條件允許具有約70%到80%序列同一性的序列選擇性雜交，可用于鑒定正向同源和共生同源序列。[0154]P.與(A)、(B)或(C)的多核苷酸具有特定序列同一,性的多核苷酸
[0155]如上文(d)中所述，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明多核苷酸的分離的核酸，其中該多核苷酸在核苷酸水平上與上述(A)、(B)或(C)部分的多核苷酸具有特定的同一性。同一性可使用例缺省條件下的BLAST、CLUSTALff或GAP算法計算。與參考序列的同一性百分比為至少60%，向上四舍五入至最接近的整數(shù)，可表達為選自60-99的整數(shù)。因此，例如與參考序列的同一性百分比可為至少70%、75%、80%、85%、90%或95%。
[0156]任選地，該實施方案的多核苷酸將編碼這樣的多肽，其與(A)、(B)或(C)部分的多核苷酸所編碼的多肽共有表位。因此，這些多核苷酸編碼誘發(fā)包含抗體的抗血清產生的第一多肽，所述抗體與由(A)、(B)或(C)的多核苷酸所編碼的第二多肽特異性反應。然而，當抗血清被第一多肽完全免疫吸附時，第一多肽并不與針對其本身而產生的抗血清結合。因此，該實施方案的多核苷酸可用于產生抗體，其用于例如篩選包含(A)、(B)或(C)的多核苷酸的核酸的表達文庫，或用于純化或免疫測定(A)、(B)或(C)的多核苷酸所編碼的多肽。本實施方案的多核苷酸包含可用于與編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸選擇性雜交的核酸序列。
[0157]可使用肽展示文庫方便的篩選與抗血清特異性結合的多肽。該方法包括在大量的肽結合中篩選具有所需功能或結構的個體成員。
[0158]肽展示文庫的抗體篩選是本領域公知的。展示的肽序列的長度可以為3-5000或更多個氨基酸，通常為5100個氨基酸，通常為約8-15個氨基酸。除直接化學合成產生肽文庫外，已描述了某些重組DNA方法。一類方法包括在噬菌體或細胞表面展示肽序列。每個噬菌體或細胞含有編碼具體展示的肽序列的核苷酸序列。這樣的方法描述于PCT專利公開91/17271號、91/18980號、91/19818號和93/08278號中。其他用于產生肽文庫的系統(tǒng)具有體外化學合成和重組方法兩方面的內容。參見PCT專利公開92/05258號、92/14843號和97/20078號。同樣參見美國專利5，658，754號和5，643，768號。肽展示文庫、載體和篩選試劑盒可從諸如Invitrogen(Carlsbad, CA)的供應商處商購獲得。
[0159]E.編碼具有來自原型多肽的子序列并對原型多肽具有交叉反應性的蛋白的多核苷酸
[0160]如上文(e)中所述，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明多核苷酸的分離的核酸，其中該多核苷酸編碼具有上述(a)中所提供的來自本發(fā)明原型多肽的連續(xù)氨基酸的子序列的蛋白。來自原型多肽的連續(xù)氨基酸的長度選自至少10到所述原型序列中的氨基酸數(shù)目之間的整數(shù)。因此，例如，所述多核苷酸可編碼具有來自原型多肽的至少10、15、20、25、30、35、40、45或50個連續(xù)氨基酸的子序列的多肽。此外，本實施方案的多核苷酸編碼的此類子序列數(shù)目可以為選自1-20的任意整數(shù)，例如2、3、4或5。所述子序列可被I到序列中核苷酸數(shù)目之間的任意整數(shù)的核苷酸分離，例如至少5、10、15、25、50、100或200個核苷酸。
[0161]該實施方案多核苷酸編碼的蛋白當作為免疫原呈遞時，誘發(fā)與原型多肽特異性結合的多克隆抗體，所述原型多肽包括但不限于上文(a)或(b)的多核苷酸所編碼的多肽。然而，當抗血清被原型多肽完全免疫吸附時，通常該實施方案的多核苷酸所編碼的蛋白不與針對原型多肽而產生的抗血清結合。制備和測定抗體結合特異性/親和性的方法是本領域公知的。示例性的免疫測定方法包括ELISA、競爭性免疫測定、放射免疫測定、蛋白質印跡、間接免疫熒光測定等。
[0162]在優(yōu)選的測定方法中，可在競爭性結合測定中使用原型多肽誘發(fā)的完全吸附和合并的抗血清測試蛋白。測定抑制50%抗血清與原型多肽結合所需的原型多肽的濃度。如果抑制結合所需的蛋白量 低于原型蛋白量的兩倍，則就說該蛋白與該免疫原所誘發(fā)的抗血清特異性結合。
[0163]因此，本發(fā)明的蛋白包括原型多肽的等位變體、保守修飾的變體以及次要的重組修飾。
[0164]本發(fā)明的多核苷酸任選地編碼具有這樣分子量的蛋白:作為非糖基化蛋白，其分子量在本發(fā)明全長非糖基化多肽的20%以內。分子量可在還原條件下通過SDS-PAGE方便地測定。任選地，所述分子量在本發(fā)明全長多肽的15%以內，更優(yōu)選在10%或5%以內，最優(yōu)選在本發(fā)明全長多肽的3%、2%或1%以內。任選地，該實施方案的多核苷酸編碼具有特定酶活性的蛋白，所述酶活性至少為包含本發(fā)明的天然、內源性全長多肽的細胞提取物的50%、60%、80% 或 90%。
[0165]此外，該實施方案的多核苷酸所編碼的蛋白將任選地具有與天然的內源性全長蛋白實質上相似的親和常數(shù)(Km)和/或催化活性(即，微觀速率常數(shù)，kcat)。本領域技術人員應當認識到，kcat/Km值決定了競爭底物的特異性，通常稱為特異性常數(shù)。該實施方案的蛋白的kcat/Km值為至少本發(fā)明全長多肽的10%，這可使用多肽的內源性底物測定。任選地，該kcat/Km值為本發(fā)明全長多肽kcat/Km值的至少20%、30%、40%、50%和最優(yōu)選至少60%、70%、80%、90% 或 95%。
[0166]kcat、Km和kcat/Km的測定可通過任何本領域技術人員公知的方法進行。例如，起始速率(即最初5%或更少的反應)可使用快速混合和取樣技術(例如恒流或快速中止技術)、快速光解或松弛法(例如溫度躍變)與諸如分光光度法、熒光分光光度法、核磁共振或放射性方法的此類示例性方法聯(lián)合測定。使用Lineweaver Burk或Eadie-Hofstee作圖法可方便的獲得動力學值。
[0167]F.與(A)-(B)的多核苷酸互補的多核苷酸
[0168]如上文(f)中所述，本發(fā)明提供了分離的核酸，其包含與上文A-E段中的多核苷酸互補的多核苷酸。本領域技術人員應當認識到，互補序列在其整個長度內與(A)-(E)部分多核苷酸堿基配對(即在其整個長度內具有100%的序列同一性)?；パa堿基在雙鏈核酸內通過氫鍵結合，例如，下列堿基對是互補的:鳥嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；以及腺嘌呤和尿嘧啶。
[0169]G.為(A)-(F)的多核苷酸的子序列的多核苷酸
[0170]如上文(g)中所述，本發(fā)明提供了包含多核苷酸的分離的核酸，所述多核苷酸包含來自上文所述A(A)到(F)的多核苷酸的至少15個連續(xù)堿基。給出的該多核苷酸的長度為選自至少15到核酸序列的長度，所述多核苷酸是所述核酸序列的子序列。因此例如，本發(fā)明的多核苷酸包括包含來自(A)到(F)多核苷酸的長度為至少15、20、25、30、40、50、60、75或100個連續(xù)核苷酸的多核苷酸。任選地，該實施方案的多核苷酸所編碼的此類子序列的數(shù)目可以是選自1-20的任意整數(shù)，例如2、3、4或5。所述子序列可被I到序列中核苷酸數(shù)目之間的任意整數(shù)的核苷酸分離，例如至少5、10、15、25、50、100或200個核苷酸。
[0171]子序列可通過體外合成、體外生物合成或體內重組方法制備。在任選的實施方案中，子序列可通過核酸擴增制備。例如，可構建核酸引物以與編碼區(qū)內的序列(或其互補物)選擇性雜交或與或編碼區(qū)共同延伸。
[0172]本發(fā)明的子序列可包括本領域已知的結構文庫，其是本領域已知的并在下文作了簡要描述。cDNA文庫包含至少50%-95%的全長序列(例如，至少50%、60%、70%、80%、90%或95%的全長序列)。該cDNA文庫可從不同發(fā)育階段的單子葉或雙子葉植物的多種組織中構建。示例性的種類包括玉米、小麥、水稻、卡諾拉、大豆、棉花、高粱、向日葵、苜蓿、燕麥、甘蔗、谷子、大麥和水稻。在選擇性雜交條件下，使全長富集的文庫中的多核苷酸與本發(fā)明的多核苷酸選擇性雜交的方法，是本領域普通技術人員已知的?？墒褂萌魏螖?shù)目的嚴緊條件，以允許選擇性雜交。在任選的實施方案中，該嚴緊度允許在雜交區(qū)域長度內具有至少70%、75%、80%、85%、90%、 95%或98%的序列同一性的序列選擇性雜交。可標準化全長富集的cDNA文庫，以增加稀有序列的代表性。
[0173]1.通過cDNA分離方法制備的多核苷酸產物
[0174]如上文(I)中所述，本發(fā)明提供了分離的核酸，其由下列方法制備:1)提供全長富集的核酸文庫，2)使所述多核苷酸與(a)、(b)、(C)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的多核苷酸選擇性雜交，由此從核酸文庫中分離該多核苷酸。如(G)段和下文所討論的，構建全長富集的核酸文庫。選擇性雜交條件如(G)段中所討論的。核酸純化方法在本領域是公知的。
[0175]純化可使用固相方法方便地完成；此類方法是本領域技術人員公知的，試劑盒可從例如Advanced Biotechnologies (Surrey, UK)的供應商處獲得。例如，可將(A)-(H)段的多核苷酸固定至固相支持體例如膜、珠或顆粒上，參見例如美國專利5，667，976號。使本方法的多核苷酸產物與固定的多核苷酸選擇性雜交，隨后通過包括但不限于離心、磁分離(magnetic separation)、過濾、電泳等的方法,從非雜交的多核苷酸中分離固相支持體。
[0176]核酸的構建
[0177]本發(fā)明分離的核酸可使用以下制備:(a)標準重組方法，(b)合成技術或其組合。在某些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸將從單子葉植物例如玉米、水稻或小麥中，或雙子葉植物例如大豆中克隆、擴增或構建。
[0178]除本發(fā)明的多核苷酸外，所述核酸可方便地包含其他序列。例如，可在核酸中插入包含一個或多個內切核酸酶限制性位點的多克隆位點，以幫助分離所述多核苷酸。同樣可插入可譯的序列以幫助分離翻譯的本發(fā)明的多核苷酸。例如，六組氨酸標記序列提供了純化本發(fā)明蛋白的便利方法。本發(fā)明的多核苷酸可與載體、接頭(adapter)或連接子連接，用于克隆和/或表達本發(fā)明的多核苷酸。在此類克隆和/或表達序列中可添加其他序列，以優(yōu)化其克隆和/或表達功能，幫助分離所述多核苷酸或改善所述多核苷酸向細胞的引入。通常，本發(fā)明的核酸長度低于其本發(fā)明多核苷酸的長度，為低于20千個堿基對，通常低于15kb，更通常低于10kb?？寺≥d體、表達載體、接頭和連接子的用途是本領域公知的，并有廣泛描述。對于各種核酸的描述，可參見例如Stratagene CloningSystems, Catalogsl999(La Jolla, CA);和Amersham Life Sciences, Inc, Catalog’ 99(ArIington Heights, IL)。
[0179]A.構建核酸的重組方法
[0180]本發(fā)明的分離的核酸組合物，例如RNA、cDNA、基因組DNA或其雜交物，可使用任何本領域技術人員已知的克隆方法從植物生物來源獲得。在某些實施方案中，使用在嚴緊條件下與本發(fā)明的多核苷酸選擇性雜交的寡核苷酸探針在cDNA或基因組DNA文庫中鑒定所需的序列。RNA的分離及cDNA和基因組文庫的構建是本領域技術人員公知的。參見例如 Plant Molecular Biology:A Laboratory Manual (植物分子生物學:實驗室手冊)，Clark, Ed.，Springer-Verlag, Berlin (1997);以及 Current Protocols inMolecular Biology (最新分子生物學方法)，Ausubel, et al., Eds., Greene Publishingand ffiley-1nterscience, New York(1995)。
[0181]Al.全長富集的cDNA f庫
[0182]已描述了許多cDNA合成的方法，其提供了富集的全長cDNA文庫。構建富集的全長cDNA文庫，使其在含有插入物的克隆中包含至少60%、更優(yōu)選70%、80%、90%或95%全長插入物。此類文庫中插入物的長度可以為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多千堿基對。容納這些大小的插入物的載體是,本領域已知的且可商業(yè)上購買獲得。參見例如Stratagene's lambda ZAP Express (克隆能力為 0_12kb 的 cDNA 克隆載體)。構建超過 95%純度的全長cDNA文庫的不例性方法描述于Carninci, et al., (1996) Genomics37:327-336中。產生全長文庫的其他方法是本領域已知的，參見例如Edery, et al.，(1995)Mol.CellBiol.15(6):3363-3371;以及 PCT 申請 W096/34981。
[0183]A2標準化或扣除的cDNA f庫
[0184]非標準化的cDNA文庫代表其來源組織的mRNA群。由于衍生自高表達基因的克隆在數(shù)量上超過獨特的克隆，因此獨特克隆的分離是費力的。cDNA文庫的標準化是建立文庫的方法，在該文庫中更能平等地代表每個克隆。標準化文庫的構建描述于Ko, (1990)Nucl.Acids.Res.18 (19): 5705-5711; Pat an jali, et al., (1991) Proc.Natl.Acad.USA88:1943-1947; US 專利 5，482，685 號、5，482，845 號和 5，637，685 號中。在 Soares 等所述的示例性方法中，標準化導致克隆的豐度從4個數(shù)量級降低到僅I個數(shù)量級。Pioc.Natl.Acad.Sc1.USA, 91:9228-9232 (1994)。
[0185] 扣除的cDNA文庫是增加豐度較少的cDNA種類比例的另一種方法。在該方法中，從mRNA —個庫中制備的cDNA被存在于mRNA的第二庫的序列通過雜交耗竭。cDNA:mRNA雜交物得以除去，對于對該庫獨特的序列，富集剩余的未雜交cDNA庫。參見 Foote, et al., in, Plant Molecular Biology:A Laboratory Manual (植物分子生物學:實驗室手冊)，Clark, Ed.，Springer-Verlag, Berlin (1997) ;Kho and ZarbI, (1991)Technique3(2): 58-63;Sive and St.John, (1988)Nucl.Acids Res.16(22):10937;CurrentProtocols in Molecular Biology (最新分子生物學方法)，Ausubel, et al., Eds., GreenePublishing and ffiley-1nterscience,New York (1995)； 以及 Swaroop,etal.，(1991) Nucl.Acids Res.19 (8): 1954。cDNA扣除試劑盒可商購獲得。參見例如PCR-Select(Clontech, Palo Alto, CA)。
[0186]為了構建基因組文庫，例如使用限制性內切核酸酶，通過斷裂，產生基因組DNA的大片段，并與載體DNA連接，形成可包裝入適當載體內的多聯(lián)體。完成該過程的方法以及驗證核酸序列的測序方法是本領域公知的。足以指導本領域技術人員進行多種構建、克隆和篩選方法的適當分子生物學技術和說明參見Sambrook, et al., MolecularCloning: A Laboratory Manual (分子克隆:實驗室手冊)，2nd Ed.(第二版)，ColdSpring Harbor Laboratory Vols.1-3(1989), Methods in Enzymology, Vol.152:Guideto Molecular Cloning Techinque (分子克隆技術指南)，Berger and Kimmel, Eds., SanDiego: Academic Press, Inc.(1987), Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物學方法)，Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and ffiley-1nterscience, NewYork (1995) ; Plant Molecular Biology:A Laboratory Manual (植物分子生物學:實驗室手冊)，Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997)。構建基因組文庫的試劑盒也是商業(yè)上可獲得的。
[0187]cDNA或基因組文庫可使用基于本發(fā)明的多核苷酸序列的探針篩選，例如本文中公開的那些。可使用探針與基因組DNA或cDNA序列雜交，以分離同種或不同植物種類中的同源基因。本領域技術人員應當了解，該測定中可使用各種程度的雜交嚴緊度，雜交或洗滌介質可以是嚴緊的。
[0188]使用擴增技術，有關核酸也可從核酸樣品中擴增。例如，聚合酶鏈式反應(PCR)技術可用于擴增本發(fā)明多核苷酸的序列，并從基因組DNA或cDNA文庫中直接擴增相關基因。PCR和其他體外擴增方法也可用于，例如克隆編碼要表達的蛋白的核酸序列，制備用作檢測樣品中所需mRNA存在的探針的核酸,核酸測序或其他目的。T4基因32蛋白(BoehringerMannheim)可用于改善長PCR產物的產量。
[0189]已描述了基于PCR的篩選方法。Wilfinger等描述了基于PCR的方法，其中在第一步鑒定最長的cDNA，以從研究中除去不完整的克隆。BioTechniques22(3):481-486(1997)。所述方法與前述全長cDNA構建方法組合時尤其有用。_0] B.構建核酸的合成方法
[0191] 本發(fā)明的分離的核酸也可通過下列方法使用直接化學合成制備:，Narang, etal., (1979)Meth.Enzymol.68:90-99 的憐酸三酯法；Brown, et al., (1979)Meth.Enzymol.68:109-151 的憐酸二酯法；Beaucage, et al., (1981) Tetra.Lett.22:1859-1862的二乙基亞憐酸胺法；Beaucage and Caruthers, (1981) Tetra.Letts.22 (20): 1859-1862描述的固相亞磷酰胺三酯法，例如使用自動合成器，例如Needham-VanDevanter, etal., (1984) Nucleic Acids Res.12:6159-6168 中所述；以及美國專利 4，458，066 號的固相支持體法。化學合成通常產生單鏈寡核苷酸。其可以通過與互補序列雜交，或通過使用該單鏈作為模板的DNA聚合酶聚合轉化成雙鏈DNA。本領域技術人員應當了解，盡管對于約100個堿基或更少的序列，最好使用DNA的化學合成，但可通過連接較短的序列獲得更長的序列。
[0192]重組表達盒
[0193]本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明核酸的重組表達盒。編碼本發(fā)明的所需多肽的核酸序列，例如編碼本發(fā)明全長多肽的cDNA或基因組序列可用于構建重組表達盒，其可被引入所需的宿主細胞。重組表達盒通常包含可操作地連接于轉錄起始調控序列的本發(fā)明的多核苷酸，該轉錄起始調控序列將指導所述多核苷酸在預期的宿主細胞例如轉化的植物的組織中轉錄。
[0194]例如，植物表達載體可包括:(I)在5’和3’調控序列轉錄控制下的克隆的植物基因，以及(2)顯性選擇標記。如需要的話，此類植物表達載體還可含有啟動子調節(jié)區(qū)(例如賦予誘導型或組成型、環(huán)境或發(fā)育調節(jié)的、或細胞或組織特異性/選擇性表達的啟動子調節(jié)區(qū))、轉錄起始位點、核糖體結合位點、RNA加工信號、轉錄終止位點和/或多腺苷酸化信號。
[0195]植物啟動子片段可用于指導本發(fā)明多核苷酸在再生植物的所有組織中表達。這類啟動子在本文中稱為“組成型”啟動子，在大多數(shù)環(huán)境條件和發(fā)育或細胞分化狀態(tài)下是活性的。組成型啟動子的實例包括花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S轉錄起始區(qū)、來源于根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) T-DNA 的 I’ -或 2’ -啟動子、泛素 I 啟動子、Smas 啟動子，肉桂醇脫氫酶啟動子(美國專利5，683，439號)、Nos啟動子、pEmu啟動子、rubisco啟動子、GRP1-8啟動子和來自本領域技術人員已知的各種植物基因的其他轉錄起始區(qū)。
[0196]可選地，植物啟動子可指導本發(fā)明的多核苷酸在特定的組織中表達，或可以受更精確的環(huán)境或發(fā)育控制。這類啟動子在本文中稱為“誘導型”啟動子。通過誘導型啟動子可影響轉錄的環(huán)境條件包括病原體攻擊、缺氧條件或存在光。誘導型啟動子的實例是，被缺氧或冷應激誘導的Adhl啟動子，被熱應激誘導的Hsp70啟動子，以及被光誘導的PPDK啟動子。
[0197]發(fā)育控制下啟動子的實例包括僅在或優(yōu)選在某些特定組織，例如葉、根、果實、種子或花中起始轉錄的啟動子。示例性的啟動子包括花藥特異性啟動子5126(美國專利5，689，049號和5，689，051號)41013-1啟動子和、玉米醇溶蛋白啟動子。啟動子的操作也可根據(jù)其在基因組中的位置而變化。因此可誘導的啟動子可以在某些位點變成完全或部分組成型的。
[0198]異源和非異源(即，內源性)啟動子均可用于指導本發(fā)明的核酸的轉錄。這些啟動子也可例如用于重組表達盒中以驅動反義核酸的表達，從而降低、增加或改變在所需組織中本發(fā)明蛋白的濃度和/或組成。因此，在某些實施方案中，核酸構建體將包括在植物細胞例如玉米內有功能的啟動子，其可操作地連接于本發(fā)明的多核苷酸連接。用于這些實施方案中的啟動子包括驅動本發(fā)明多肽表達的內源性啟動子。
[0199]許多啟動子可用于實施本發(fā)明，包括目的多核苷酸序列的天然啟動子。所述啟動子可基于所需的結果選擇。核酸可與組成型、誘導型、組織優(yōu)選或其他啟動子組合，用于在植物中表達。
[0200]此類組成型啟動子包括，例如Rsyn7啟動子的核心啟動子，以及W099/43838和美國專利6，0 72，050號中公開的其他組成型啟動子；核心CaMV35S啟動子(Odel 1，etal., (1985) Nature313:810-812)；水稻肌動蛋白(McElroy, et al., (1990) PlantCell2:163-171)；泛素(Christensen, et al., (1989)Plant Mol.Biol.12:619-632 和Christensen,et al., (1992)Plant Mol.Biol.18:675-689) ；pEMU(Last, et al., (1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588) ；MAS(Velten, et al., (1984)EMBO J.3:2723-2730) ；ALS啟動子(美國專利5，659，026號);dMMV(煙草花葉病毒啟動子的雙倍增強版本；參見Deyand Maiti (1999) Plant Molecular Biology40 (5): 771-782)，LESVBV (增強的草莓脈結病毒啟動子；參見美國專利申請2002/0182593號)等。其他組成型啟動子包括，例如美國專利 5，608，149 號、5，608，144 號、5，604，121 號、5，569，597 號、5，466，785 號、5，399，680 號、5，268，463 號、5，608，142 號和 6，177，611 號。
[0201]組織優(yōu)選啟動子可用于在具體植物組織中靶向增強的表達。組織優(yōu)選啟動子包括 Yamamoto, et al., (1997)Plant J.12(2):255-265;Kawamata, etal., (1997)Plant Cell Physiol.38 (7): 792-803;Hansen, et al., (1997)Mo 1.Gen Genet.254 (3):337-343;Russell, et a 1., (1997)TransgenicRes.6(2):157-168;Rinehart, et al.，(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341;VanCamp,et al., (1996)Plant Physiol.112(2):525-535;Canevascini, et al., (1996)Plant Physiol.112(2):513-524;Yamamoto, et al., (1994)Plant CellPhysiol.35(5):773-778;Lam(1994)Results Prob1.Cell Differ.20:181-196;Orozco, etal., (1993)Plant Mol Biol.23 (6): 1129-1138;Matsuoka, et al., (1993)Proc Natl.Acad.Sc1.USA90(20):9586-9590和 Guevara-Garcia，et al., (1993)Plant J.4(3):495-505。如果需要，可修飾這些啟動子，用于弱表達。同樣參見美國專利申請2003/0074698號，在此將其通過引用并入。
[0202]葉優(yōu)選啟動子是本領域已知的。例如參見Yamamoto, et al.，(1997)PlantJ.12(2):255-265;Kwon, et al., (1994)Plant Physiol.105:357-67;Yamamoto, etal., (1994)Plant Cell Physiol.35 (5):773-778;Gotor,et al.，(1993)PlantJ.3:509-18;Orozco, et al., (1993)Plant Mol.Biol.23(6):1129-1138;Baszczynski,et al., (1988)Nucl.Acid Res.16:4732;Mitra,等，(1994)Plant MolecularBiology26:35-93;Kayaya, et al., (1995)Molecular and General Genetics248:668-674;以及Matsuoka, et al.，(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90 (20): 9586-9590。也使用調節(jié)衰老的啟動子，例如 SAM22 (Crowell, et al., (1992) Plant Mol.Biol.18:459-466)。也參見美國專利5，689，042號，在此將其其通過引用并入。
[0203]根優(yōu)選啟動子是已知的，可選自可從篇文獻獲得的許多啟動子，或從不同的適合種類中重新分離。參見，例如 Hire, et al., (1992) Plant Mol.Biol.20 (2): 207-218 (大豆根特異性的谷氨酰胺合成酶基因)；Keller and Baumgartner (1991)PlantCell3 (10):1051-1061 (菜豆 GRPl.8 基因中根特異性的控制元件)；Sanger, et al.，(1990)Plant Mol.Biol.14(3):433-443(根瘤農桿菌甘露堿合酶(MAS)基因的根特異性啟動子)；以及Miao，et al.，(1991)Plant Cell3 (I): 11-22 (編碼細胞質谷氨酰胺合成酶(GS)的全長cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表達)。還參見Bogusz，et al.，(1990)Plant Cell2 (7): 633-641,其中描述了從來自固氮的非豆類 Parasponia andersonii和有關的非固氮非豆類山黃麻(Trema tomentosa)血紅蛋白基因中分離的兩種根特異性啟動子。這些基因的啟動子與葡糖苷酸酶報告基因連接，并引入非豆類煙草(Nicotiana tabacum)和豆類百脈根(Lotus corniculatus)中，在兩種情況下根特異性啟動子的活性均得以保留。Leach和Aoyagi (1991)描述了他們關于毛根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)高表達的rolC和rolD根誘導基因啟動子的分析(參見Plant Science (Limerick) 79 (I):69-76)。他們得出的結論是,增強子和組織優(yōu)選DNA決定子在這些啟動子中解離。Teeri，et al.，(1989)使用與IacZ的基因融合物表明，編碼章魚堿合酶的T-DNA基因在根尖的表皮中尤其具有活性，并且TR2’基因在完整的植物中是根特異性的，并受葉組織的創(chuàng)傷刺激，它們是特別期望的特征組合，用于與殺蟲或殺幼蟲基因一起使用(參見EMBO J.8 (2):343-350)。與nptll (新霉素磷酸轉移酶II)融合的TR1’基因顯示了類似的性質。其他根優(yōu)選啟動子包括VfEN0D-GRP3基因啟動子(Kuster，etal., (1995)Plant Mol.Biol.29(4):759-772) ;rolB 啟動子(Capana, et al., (1994)PlantMol.Biol.25(4):681-691 ;以及帶有ADH第一內含子的CRWAQ81根優(yōu)選啟動子(美國專利申請公開2005/0097633號)。還參見美國專利5，837，876號、5，750，386號、5，633，363號、5，459，252 號、5，401，836 號、5，110，732 號和 5，023，179 號。
[0204]“種子優(yōu)選”啟動子是指在種子發(fā)育過程中有活性的啟動子，可包括在種子起始物或有關母體組織中的表達。這類種子優(yōu)選啟動子包括但不限于，Ciml(細胞分裂素誘導的信息)、CZ19B1 (玉米19kDa玉米醇溶蛋白)、milps (肌紅蛋白-肌醇-1-磷酸合酶)(參見W000/11177和美國專利6，225，529號；在此將其通過引用并入)。Y玉米醇溶蛋白是胚乳特異性啟動子。球蛋白-1(Glob-1)是代表性胚特異性啟動子。對于雙子葉植物來說，種子特異性啟動子 包括但不限于，豆β_菜豆蛋白、napin、β -伴大豆球蛋白(β-conglycinin)、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。對于單子葉植物來說，種子特異性啟動子包括但不限于，玉米15kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、、玉米醇溶蛋白、waxy、shrunken I和shrunken2。同樣參見W000/12733,其中公開了來自endl和end2基因的種子優(yōu)選啟動子；在此將其通過引用并入。其他胚特異性啟動子公開于 Sato, et al., (1996) Proc.Natl.Acad.Sc1.93:8117-8122; Nakase, et al., (1997) PlantJ12:235-46;以及 Postma-Haarsma, et al., (1999)Plant Mol.Biol.39:257-71。其他胚乳特異性啟動子披露于 Albani, et al., (1984)EMB03:1405-15;Albani, et al., (1999)Theor.Appl.Gen.98:1253-62;Albani, et al., (1993)Plant J.4:343-55;Mena, etal., (1998)The Plant Journal116:53-62,以及 Wu, et al.，(1998)Plant CellPhysiology39:885-889。
[0205]同樣感興趣的是在分生組織區(qū)有活性的啟動子，例如發(fā)育中的花序組織，以及驅使在花期或早期核發(fā)育時表達的啟動子。其可包括，例如玉米Zag啟動子，包括 Zagl 和 Zag2(參見，Schmidt,et al., (1993) The Plant Cell5:729-37;GenBankX80206;Theissen, et al., (1995)Genel56:155-166;以及美國專利申請 10/817，483 號)；玉米Zap啟動子(也稱為ZmMADS ;美國專利申請10/387，937號；W003/078590);玉米ckxl-2啟動子(美國專利申請公開2002/0152500A1號；W002/0078438);玉米e印I啟動子(美國專利申請10/817，483號)；玉米end2啟動子(美國專利6，528，704號和美國專利申請10/310，191號)；玉米Iecl啟動子(美國專利申請09/718，754號)；玉米F3.7啟動子(Baszczynski, et al., (1997)Maydica42:189-201);玉米 tbl 啟動子(Hubbarda, etal., (2002)Geneticsl62:1927-1935 和 Wang, et al., (1999)Nature398:236-239);玉米eep2啟動子(美國專利申請10/817，483號)；玉米硫氧還蛋白H啟動子(美國臨時專利申請60/514，123號);玉米Zm40啟動子(美國專利6，403，862號和W001/2178);玉米mLIP15啟動子(美國專利6，479,734號)；玉米ESR啟動子(美國專利申請10/786，679號)；玉米PCNA2啟動子(美國專利申請10/388，359號)；玉米細胞分裂素氧化酶啟動子(美國專利申請 11/094，917 號)；Weigal，et al., (1992)Cell69:843-859 中所披露的啟動子;登錄號 AJ131822;登錄號 Z71981;登錄號 AF049870;以及 McAvoy, et al., (2003) Acta Hort.(ISHS) 625:379-385中披露的枝條優(yōu)選啟動子。其他目的分裂細胞或分生組織優(yōu)選啟動子披露于 Ito, et al., (1994) Plant Mol.Biol.24:863-878 ;Regad, et al., (1995)M0.Gen.Genet.248:703-711;Shaul，et al., (1996)Proc.Natl.Acad.Sc1.93:4868-4872;Ito, etal., (1997)Plant J.11:983-992;和Trehin,et al., (1997)Plant Mol.Biol.35:667-672，在此將所有上述文獻通過引用并入。
[0206]花序優(yōu)選啟動子包括查耳酮合酶啟動子(Van der Meer, et al., (1990)PlantMol.Biol.15:95-109)、LAT52(Twell, et al., (1989)Mol.Gen.Genet.217:240-245)、花粉特異性基因(Albani, et al., (1990) Plant Mol Biol.15:605)、Zml3 (Buerrero, etal., (1993)Mol.Gen.Genet.224:161-168),玉米花粉特異性基因(Hamilton, etal., (1992)Plant Mol.Biol.18:211-218)、向日葵花粉表達的基因(Baltz, et al., (1992)The Plant Journal2:713-721),以及油菜(B.Napus)花粉特異性基因(Arno I do, etal., (1992)J.Cell.Biochem, Abstract Number Y101204)。
[0207]應激誘導啟動子包括鹽誘導或水應激誘導啟動子，例如P5CS (Zang, etal., (1997) Plant Sciences 129:81-89);冷誘導啟動子，例如 corl5a (Hajela, etal.，(1990)Plant Physiol.93:1246-1252)、cor15b(fflihelm,et al.，(1993)PlantMol Biol23:1073-1077) 、wscl20(0uellet, et al., (1998)FEBS Lett.423-324-328)、ci7 (Kirch, et al.，(1997)Plant Mol Biol.33:897-909) , ci21A (Schneider, etal., (1997)Plant Physiol.113:335-45);干旱誘導啟動子，例如 Trg-31 (Chaudhary, etal., (1996)Plant Mol.Biol.30:1247-57);滲透誘導啟動子，例如 Rabl7 (Vilardell, etal.，(1991)Plant Mol.Biol.17:985-93;Busk(1997)Plant Jll(6):1285-1295)和滲調蛋白(osmotin) (Raghothama, et al., (1993)Plant Mol Biol23:1117-28)；以及熱誘導啟動子，例如熱休克蛋白(Barros, et al., (1992)Plant Mol.19:665-75;Marrs, etal., (1993)Dev.Genet.14:27-41),和 smHSP(Waters, et al., (1996)J.ExperimentalBotany47:325-338)。其他應激誘導啟動子包括rip2 (美國專利5，332，808號和美國專利申請公開 2003/0217393 號)，以及 rd29a (Yamaguch1-Shinozaki, et al., (1993)Mol.Gen.Genetics236:331-340 ;同樣參見GenBank登陸號D13044)。應激不敏感啟動子也可用于本發(fā)明的方法中。
[0208]氮敏感啟動子(nitrogen-responsive promoter)也可用于本發(fā)明的方法中，此類啟動子包括但不限于，22kDa玉米醇溶蛋白啟動子(Spena，et al.，(1982)EMBO Jl:1589-1594 和 Muller, et al., (1995)J.Plant Physiol145:606-613) ；19kDa玉米醇溶蛋白啟動子(Pedersen, et al., (1982) Cell29:1019-1025) ;14kDa 玉米醇溶蛋白啟動子(Pedersen, et al., (1986) J.Biol.Chem.261:6279-6284)、b_32 啟動子(Lohmer, et al., (1991)EMBO JlO:617-624);以及亞硝酸還原酶(NiR)啟動子(Rastogi, etal., (1997)Plant Mol Biol.34 (3):465-76 和 Sander,et al.，(1995)Plant MolBiol.27(1): 165-77)。氮誘導啟動子共有序列的綜述參見例如Muller, et al.，(1997)ThePlant Journal12:281-291。
[0209]通過應用外源性化學調節(jié)劑，可使用化學調節(jié)的啟動子調節(jié)植物中基因的表達。根據(jù)不同的目的，啟動子可以是化學誘導啟動子，其中化學制劑的應用誘導基因表達，或者是化學阻抑啟動子，其中化學制劑的應用抑制基因表達。化學誘導啟動子是本領域已知的，包括但不限于，玉米Ιπ2-2啟動子，其由苯磺酰胺除草劑安全劑激活；玉米GST啟動子，其由作為在萌發(fā)前施用的除草劑使用的疏水親電化合物激活，以及煙草PR-1a啟動子，其由水楊酸激活。其他目的化學調節(jié)的啟動子包括類固醇敏感啟動子(參見例如，Schena, etal., (1991)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:10421-10425 和 McNellis, et al., (1998)PlantJ.14(2):247-257)中的糖皮質激素誘導啟動子，以及四環(huán)素誘導和四環(huán)素抑制啟動子(參見例如，Gatz,等，(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237，和美國專利 5，814，618 號和5，789，156號)，在此通過引用并入。
[0210]其他誘導型啟動子包括熱休克啟動子，例如Gmhspl7.5_E(大豆)(Czarnecka, etal., (1989)Mol Cell Biol.9 (8): 3457 - 3463)、APXl 基因啟動子(擬南芥)(Storozhenko, et al., (1998) Plant Physiol.118 (3): 1005 - 1014) > Ha hspl7.7G4(向日葵(Helianthus annuus))(Almoguera, et al., (2002)Plant Physiol.129(1):333 - 341;和玉米 Hsp70 (Rochester, et al., (1986) EMBO J.5:451-8。
[0211]在某些實施方案中，可在本發(fā)明多核苷酸的非異源形式的適當位置(通常是上游)引入作為啟動子或增強子元件的分離的核酸，以上調或下調本發(fā)明多核苷酸的表達。例如，體內的內源性啟動子可通過突變、缺失和/或取代改變(參見Kmiec的美國專利5，565，350號；Zarling等的PCT/US93/03868)，或者在本發(fā)明基因的合適方向和距離處，將分離的啟動子引入植物細胞中，以控制基因的表達。基因表達可在適合植物生長的條件下調節(jié)，以改變本發(fā)明多肽在植物細胞中的總濃度和/或組成。
[0212]因此，本發(fā)明提供了制備可操作地連接于天然、內源(即非異源)形式的本發(fā)明多肽的異源啟動子和/或增強子的組合物和方法。
[0213]就組織類型、細胞類型、發(fā)育階段和/或環(huán)境條件來講，鑒定具有特定表達特征的啟動子 的方法是本領域公知的。參見例如玉米手冊TheMaize Handbook(玉米手冊),Chaptersl14-115 (第 114-115 章),Freeling and ffalbot, Eds., Springer,NewYork (1994) ；Corn and Corn Improvement (玉米和玉米改良)，3rd edition (第 3版),Chapter6,(第 6 章)，Sprague and Dudley, Eds., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin(1988)。
[0214]啟動子分離方法中的典型步驟是，鑒定在靶組織中以某種程度特異性表達的基因產物。方法包括:cDNA文庫差示雜交、扣除雜交、差異展示、差異2-D蛋白凝膠電泳、DNA探針陣列；以及分離已知在靶組織中以某種程度的特異性表達的蛋白。此類方法對本領域技術人員來說是公知的。鑒定啟動子的商業(yè)上可獲得的產品是本領域已知的，例如Clontech’s (Palo Alto, CA)Universal Genome Walker Kit。
[0215]對于該基于蛋白的方法，有幫助的是，獲得至少一部分已鑒定蛋白的氨基酸序列，隨后用該蛋白序列作為制備核酸的基礎，該核酸可用作探針直接鑒定基因組DNA，或優(yōu)選鑒定來自由靶組織制備的文庫的cDNA。一旦鑒定了此類cDNA克隆，則該序列可用于鑒定所示基因轉錄物5’端的序列。對于差示雜交、扣除雜交和差異展示，使用靶組織中鑒定為富集的核酸序列鑒定所示基因轉錄物5’端的序列。一旦鑒定了此類序列，從蛋白序列或核酸序列開始，任何鑒定為來自所述基因轉錄物的序列，可用于篩選從靶生物體制備的基因組文庫。鑒定和確認轉錄起始位點的方法是本領域公知的。
[0216]在分離特定環(huán)境條件或應激下或特定組織中或特定發(fā)育階段中表達的啟動子的過程中，鑒定了許多在所需環(huán)境下、在所需組織中或在所需階段中表達的基因。進一步的分析表明，每種具體基因在該植物的一種或多種其他組織中表達。可鑒定在所需組織或條件下具有活性，但在任何其他普通組織中沒有活性的啟動子。
[0217]為鑒定啟動子序列，分析本文所述克隆的5’部分，以鑒定啟動子序列的特征性序列。例如，啟動子序列元件包括TATA盒共有序列(TATAAT)，其通常為5_10個bp的富含AT的一段序列，位于轉錄起始位點上游約20-40個堿基對。TATA盒的鑒定是本領域公知的。例如，一種預測該元件位置的方法是，使用標準mRNA作圖技術，例如引物延伸、SI分析和/或RNA酶保護鑒定轉錄起始位點。為證實富含AT序列的存在，可進行結構功能分析，包括誘變假定的區(qū)域，量化突變對連接的下游報告基因表達的影響。參見例如The MaizeHandbook (玉米手冊),Chapterl 14 (第 114章)，F(xiàn)reeling and ffalbot, Eds., Springer, NewYork, (1994)。
[0218]在植物中，TATA盒的另一上游，位置約-80到-100處，通常有一個啟動子元件(即，CAAT盒)，其具有圍繞三核苷酸G(或T)N G —連串腺嘌呤。J.Messing,et al., in Genetic Engineering in Plants,Kosage,Meredith andHollaender, Eds., pp.221-2271983。在玉米中，沒有良好保守的CAAT盒，但在TATA盒上游有若干短的保守的蛋白結合基序。如果對每個基因是合適的，這些包括與光調節(jié)、缺氧誘導、激素調節(jié)或花青素 生物合成有關的反式作用轉錄因子的基序。
[0219]—旦啟動子和/或基因序列是已知的，從基因組DNA轉錄起始或翻譯起始位點的5’端選取適當大小的區(qū)域，隨后將所述序列連接于編碼序列。如果使用轉錄起始位點作為融合點，可在轉錄起始位點和部分編碼序列之間使用許多可能的5’非翻譯區(qū)域中的任何非翻譯區(qū)。如果使用特定啟動子3’端的翻譯起始位點，則隨后將其直接連接到編碼序列的甲硫氨酸起始密碼子上。
[0220]如果需要多肽表達，通常需要在多核苷酸編碼區(qū)的3’端包括多腺苷酸化區(qū)。該多腺苷酸化區(qū)可衍生自多種其他植物基因的天然基因或衍生自T-DNA。要加入的3’端序列可衍生自，例如胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因，或可選地另一植物基因，或較不優(yōu)選地任何其他真核基因。
[0221]可向5’非翻譯區(qū)或部分編碼序列的編碼序列添加內含子序列，以增加細胞溶質中積累的成熟信息的量。已顯示在植物和動物表達構建體的轉錄單位中加入可剪切的內含子能使mRNA和蛋白水平上的基因表達增加高達1000倍，Buchman and Berg, (1988)Mol.Cell Biol.8:4395-4405;Callis, et al., (1987) Genes Dev.1:1183-1200。此類基因表達的內含子增強通常在置于轉錄單位的5’端附近時最大。玉米內含子Adhl-S內含子1、2和6, Bronze-1內含子的使用是本領域已知的。通常參見The Maize Handbook(玉米手冊)，Chapter (第 116 章)，F(xiàn)reeling and ffalbot, Eds., Springer, New York (1994) ?[0222]包含來自本發(fā)明多核苷酸的序列的載體通常包含標記基因，其賦予植物細胞選擇表型。通常，選擇標記基因編碼抗生素抗性，并帶有合適的基因，包括編碼抗生素壯觀霉素抗性的基因(例如aada基因)，編碼鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉移酶(SPT)基因，編碼卡那霉素或遺傳抗性的新霉素磷酸轉移酶(NPTII)基因，編碼潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉移酶(HPT)基因，編碼抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草劑抗性的基因，尤其是磺酰脲類除草劑(例如含有導致所述抗性的突變的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，尤其是S4和/或Hra突變)、編碼抑制谷氨酰胺合酶作用的除草劑例如草胺磷或basta抗性的基因(例如bar基因)，或本領域已知的其他基因。Bar基因編碼除草劑basta抗性，nptll基因編碼抗生素卡那霉素抗性，ALS基因編碼除草劑氯磺隆抗性。
[0223]可用于在高等植物中表達基因的典型啟動子是本領域公知的，包括衍生自根瘤農桿菌的腫瘤誘導(Ti)質粒的載體，Rogers, et ak,, (1987)Meth.1n Enzymo1.153:253-277其做了描述。這些載體是植物整合型載體，因為轉化后，所述載體將部分載體DNA整合到宿主植物的基因組中。本文所用的示例性根瘤農桿菌載體是Schardl，et al.，(1987)Gene61:1-11 和 Berger,et al., (1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:8402-8406 的質粒pKYLX6和pKYLX7?？捎糜诒疚牡牧硪惠d體是質粒pBI 101.2，其可從ClontechLaboratories, Inc.(Palo Alto, CA)獲得。
[0224]本發(fā)明的多核苷酸可根據(jù)需要以有義或反義方向表達。應當理解，有義或反義方向的基因表達的控制，對于可觀察的植物特征具有直接影響。反義技術可方便地用于抑制植物中的基因表達。為實現(xiàn)此目的，從所需基因中克隆核酸片段并可操作地連接于啟動子，以轉錄RNA的反義鏈。隨后將構建體轉化入植物中，產生RNA的反義鏈。
[0225]在植物細胞中，已證明，反義RNA通過防止編碼目的酶的mRNA的積聚而抑制基因表達。參見例如 Sheehy, et al.，(1988) Proc.Nat’ 1.Acad.Sc1.USA85:8805-8809;和Hiatt, et al.,美國專利 4，801，340 號。
[0226]另一種抑制方法是有義抑制。已證明，在有義方向上引入配置的核酸，是阻斷靶基因轉錄的有效方法。使用該方法調節(jié)內源性基因表達的實例，參見Napoli，et al.，(1990)The Plant Cell2:279_289 和美國專利 5，034，323 號。
[0227]催化性RNA分子或核酶也可用于抑制植物基因的表達?？赡艿氖牵O計與任何靶標RNA特異性配對并在特定位點切割磷酸二酯骨架的核酶，由此使靶RNA的功能失活。在進行該切割時，核酶本身不發(fā)生改變，因此能重復利用并再切割其他分子，從而使之成為真正的酶。在反義RNA中加入核酶序列，賦予它們RNA切割活性，由此增加了構建體的活性。靶RNA-特異性核酶的設計和使用描述于Haseloff, et al.，(1988)Nature334:585591中。多種交聯(lián)劑、烷化劑和作為本發(fā)明多核苷酸的懸垂基團的基團產生分子(radicalgenerating species)，可用于結合、標記、檢測和/或切割核酸。例如，Vlassov, etal., (1986)Nucleic Acids Resl4:4065-4076,描述了單鏈DNA片段與和祀序列互補的核苷酸的烷化衍生物的共價結合。同一研究組的類似工作報道是Knorre, et al.，(1985)Biochimie67:785-789。 Iverson 和 Dervan0
[0228]本發(fā)明還提供了包含與本發(fā)明的多肽具有特定序列同一性的多肽的蛋白。該序列同一性百分比選自由60-99組成的整數(shù)，示例性的序列同一性值包括60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%和 95%。[0229]如本領域技術人員所了解的，本發(fā)明包括本發(fā)明的催化活性多肽(即酶)。催化活性多肽具有的特異性活性，為天然(非合成)內源性多肽的特異性活性的至少20%、30%或40%，并且優(yōu)選至少50%、60%或70%，最優(yōu)選至少80%、90%或95%。此外，底物特異性(kcat/Km)任選實質上類似于天然(非合成)內源性多肽。通常，Km至少是天然(非合成)內源性多肽Km的至少30%、40%或50%，更優(yōu)選為至少60%、70%、80%或90%。酶活性和底物特異性(熱/km)測定和定量測量方法是本領域技術人員已知的。
[0230]通常，本發(fā)明的蛋白作為免疫原呈遞時，能誘發(fā)對本發(fā)明多肽具有特異反應性的抗體產生。此外，本發(fā)明的蛋白不結合針對本法多肽產生的已被同樣多肽完全免疫吸附的抗血清。測定結合的免疫測定是本領域技術人員公知的。優(yōu)選的免疫測定是下文所討論的競爭性免疫測定。因此，對于如免疫測定或擔保純化技術的此類示例性用途，可用本發(fā)明的蛋白作為構建對本發(fā)明蛋白具有免疫反應性的抗體的免疫原。
[0231]宿主細胞中蛋白的表達
[0232]使用本發(fā)明的核酸，可在重組的工程細胞，例如細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物或優(yōu)選植物細胞中表達本發(fā)明的蛋白。所述細胞在非天然的條件下(例如數(shù)量、組成、位點和/或時間)產生蛋白，因為，它們?yōu)榇艘淹ㄟ^人為干預發(fā)生遺傳改變。[0233]預期本領域技術人員知曉大量的可用于表達編碼本發(fā)明蛋白的核酸的表達系統(tǒng)。不試圖詳細描述已知的各種用于在原核和真核細胞中表達蛋白的方法。
[0234]簡而言之，編碼本發(fā)明蛋白的分離核酸的表達通常通過以下實現(xiàn):可操作地將例如DNA或cDNA連接于啟動子(組成型或調節(jié)型)，隨后整合到表達載體中。所述載體適于在原核或真核細胞中復制和整合。典型的表達載體含有轉錄和翻譯終止子、起始序列和啟動子，用于調節(jié)編碼本發(fā)明蛋白的DNA的表達的啟動子。為獲得克隆基因的高水平表達，需要構建這樣的表達載體，其至少含有指導轉錄的強啟動子、啟動翻譯的核糖體結合位點以及轉錄/翻譯終止子。本領域技術人員應當了解，可在不損失生物活性的情況下對本發(fā)明的蛋白進行修飾?？蛇M行某些修飾，以便利于引導分子(targeting sequence)的克隆、表達或并入融合蛋白中。
[0235]這些修飾對本領域技術人員是公知的，包括例如在氨基端添加甲硫氨酸以提供起始位點，或在任一端添加氨基酸(例如多個組氨酸)以產生便于定位的純化序列。也可引入限制性位點或終止密碼子。
[0236]A.原核牛物中的表汰
[0237]原核細胞可用作表達宿主。最常用的原核生物是大腸桿菌(E.coli)的各種菌株，然而，其他微生物菌株也可使用。通常使用的原核細胞控制序列在本文中定義為包括用于轉錄起始的啟動子，任選地含操縱子以及核糖體結合位點序列，包括諸如以下啟動子的常用啟動子:β_內酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(Lac)啟動子系統(tǒng)(Chang, etal., (1977)Naturel98:1056),色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel, et al., (1980)NucleicAcids Res.8:4057)和λ衍生的P L啟動子和N-基因核糖體結合位點(Shimatake, etal.，(1981)Nature292:128)。在E.coli中轉染的DNA載體中加入選擇標記也是有用的。此類標記的實例包括確定氨芐西林、四環(huán)素或氯霉素抗性的基因。
[0238]選擇載體以在適當?shù)乃拗骷毎幸?。細菌載體通常是質粒或噬菌體來源的。適當?shù)募毦毎檬删w載體顆粒感染，或用裸噬菌體載體DNA轉染。如果使用質粒載體，則用所述質粒載體DNA轉染細菌細胞。使用芽孢桿菌(Bacillus sp.)和沙門氏菌(Salmonella),可獲得表達本發(fā)明蛋白的表達系統(tǒng)(Palva, et al., (1983)Gene22:229-235;Mosbach, et al., (1983)Nature302:543-545)。
[0239]B.直核牛物中的表汰
[0240]本領域技術人員已知多種真核表達系統(tǒng)，例如酵母、昆蟲細胞系,植物和哺乳動物細胞。如下簡述，本發(fā)明的多核苷酸可在這些真核系統(tǒng)中表達。在某些實施方案中，下文所討論的轉化的/轉染的植物細胞可用作產生本發(fā)明蛋白的表達系統(tǒng)。
[0241]異源蛋白在酵母中的合成是公知的。Sherman, et al., Methods in YeastGenetics (酵母遺傳學方法)，Cold Spring Harbor Laboratory (1982)是公認的著作，其描述了在酵母中產生蛋白的多種方法。兩種用于廣泛產生真核蛋白的酵母是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。在酵母和畢赤酵母中表達的載體、菌株和方法是本領域已知的，并可從供應商處獲得(例如Invitrogen)。
[0242]適當?shù)妮d體通常具有表達控制序列，例如啟動子，包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶，以及復制的起點，終止序列等。
[0243]本發(fā)明的蛋白一旦表達，可通過裂解細胞，并對裂解液應用標準蛋白分離技術，從酵母中分離。純化過程的監(jiān)測可使用蛋白質印跡技術或放射免疫測定或其他標準免疫測定技術完成。
[0244]編碼本發(fā)明蛋白的序列也可與多種表達載體連接，用于轉染例如哺乳動物、昆蟲或植物來源的細胞培養(yǎng)物。可用于產生肽的示例性細胞培養(yǎng)物是哺乳動物細胞。盡管也可以使用哺乳動物細胞懸液，但哺乳動物細胞系統(tǒng)通常是單層細胞的形式。本領域已開發(fā)了許多能表達完整蛋白的適宜的宿主細胞系，包括HEK293、BHK21和CHO細胞系。這些細胞的表達載體可包括表達控制序列，例如復制起點、啟動子(例如CMV啟動子、HSVtk啟動子或Pgk (磷酸甘油酸激酶)啟動子)、增強子(Queen, et al., (1986) Immunol.Rev.89:49)和必要的加工信息位點，例如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點(例如SV40大TAg poly A(多A)添加位點)和轉錄終止序列。其他可用于生產本發(fā)明蛋白的動物細胞可從例如美國典型菌株保藏中心(American Type Culture Collection)獲得。
[0245]在昆蟲細胞中表達本發(fā)明蛋白的適當載體，通常衍生自SF9桿狀病毒。適當?shù)睦ハx細胞系包括蚊幼蟲、蠶、粘蟲、蛾和果蠅細胞系，例如Schneider細胞系(參見Schneider, (1987)J.Embryol.Exp.Morpho1.27:353-365)。
[0246]與酵母一樣，當使用更高級的動物或植物宿主細胞時，通常在載體中并入多腺苷酸化或轉錄終止序列。終止序列的實例是來自牛生長激素基因的多腺苷酸化序列。也可包括精確剪接轉錄物的序列。剪接序列的實例是來自SV40的VPl內含子(Sprague，etal., (1983)J.Virol.45:773-781)。此外，可在載體中并入在宿主細胞中控制復制的基因序列，例如在牛乳頭狀瘤病毒類型載體中發(fā)現(xiàn)的那些。Saveria-Campo, Bovine PapillomaVirus DNA a Eukaryotic Cloning Vector in DNA Cloning Vol.1I a PracticalApproach, Glover, Ed., IRL Press, Arlington, Virginia pp.213-238 (1985)。
[0247]增加乙烯信號轉導相關多肽的活性和/或水平
[0248]提供了增加本發(fā)明乙烯信號轉導相關多肽的活性和/或水平的方法。本發(fā)明乙烯信號轉導相關多肽的活性和/或水平的增加，可通過向植物提供乙烯信號轉導相關多肽完成?？赏ㄟ^向植物中引入編碼乙烯信號轉導相關多肽的氨基酸序列或向植物中引入編碼乙烯信號轉導相關多肽的核苷酸序列，或可選地通過修飾編碼本發(fā)明乙烯信號轉導相關多肽的基因組位點，提供乙烯信號轉導相關多肽。
[0249]如本文其他地方所述，本領域已知可向植物提供多肽的許多方法,包括但不限于，直接向植物引入多肽，向植物中引入(臨時或穩(wěn)定地)編碼具有活性增強的多肽的多核苷酸構建體等。同樣已知，本發(fā)明的方法可使用不能在轉化植物中指導蛋白或RNA表達的多核苷酸。因此，可通過改變編碼乙烯信號轉導相關多肽的基因或其啟動子，增加乙烯信號轉導相關多肽的水平和/或活性。參見例如Kmiec的美國專利5，565，350號；Zarling等的PCT/US93/03868。因此，提供了誘變的植物，其在乙烯信號轉導相關基因中具有突變，其中該突變增加了乙烯信號轉導相關基因的表達，或增加了編碼的乙烯信號轉導相關多肽的乙烯信號轉導相關活性。
[0250]降低乙烯信號轉導相關多肽的活性和/或水平
[0251]提供了通過用表達抑制乙烯信號轉導相關多肽的多核苷酸的表達盒轉染植物細胞，降低或消除本發(fā)明乙烯信號轉導相關多肽的活性的方法。所述多核苷酸可通過以下方式直接或間接抑制乙烯信號轉導相關多肽的表達:防止乙烯信號轉導相關信使RNA的轉錄和翻譯，或編碼這樣的多肽，該多肽抑制編碼乙烯信號轉導相關多肽的乙烯信號轉導相關基因的轉錄或翻譯。抑制或消除植物中基因表達的方法是本領域公知的，本發(fā)明可使用任何所述方法抑制乙烯信號轉導相關多肽的表達。
[0252]根據(jù)本發(fā)明，如果乙烯信號轉導相關多肽的蛋白水平低于未被遺傳修飾或誘變以抑制乙烯信號轉導相關多肽表達的植物中同樣的乙烯信號轉導相關多肽蛋白水平的70%，則乙烯信號轉導相關多肽的表達受到抑制。在本發(fā)明的具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明，修飾的植物中乙烯信號轉導相關多肽的蛋白水平，低于非突變體或未被遺傳修飾以抑制乙烯信號轉導相關多肽表達的植物中同樣的乙烯信號轉導相關多肽蛋白水平的60%、50%、40%、30%、20%、10%,5%或2%。乙烯信號轉導相關多肽的表達水平可直接測定，例如通過測定植物細胞或植物中表達的乙烯信號轉導相關多肽水平，或間接測定，例如通過測量植物細胞或植物中的乙烯反應，或通過測量植物中的表型變化。進行此類測定的方法在本文其他地方做了描述。
[0253]在本發(fā)明的其他實施方案中，通過用包含編碼抑制乙烯信號轉導相關多肽的多核苷酸的表達盒轉染植物細胞，降低或消除乙烯信號轉導相關多肽的活性。根據(jù)本發(fā)明，如果乙烯信號轉導相關多肽的活性低于未被修飾以抑制所述多肽乙烯信號轉導相關活性的植物中同樣的乙烯信號轉導相關多肽活性的70%，則該乙烯信號轉導相關多肽受到抑制。在本發(fā)明的具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明，修飾的植物中乙烯信號轉導相關多肽的乙烯信號轉導相關活性低于未被遺傳修飾以抑制該乙烯信號轉導相關多肽表達的植物中同樣的多肽的乙烯信號轉導相關活性的60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%。根據(jù)本發(fā)明，當不能被本文其他地方所述的測定方法檢測到時，乙烯信號轉導相關多肽的乙烯信號轉導相關活性被“消除”。測定乙烯信號轉導相關多肽活性改變的方法，在本文的其他地方做了描述。
[0254]在其他實施方案中，可通過破壞編碼乙烯信號轉導相關多肽的基因降低或消除乙烯信號轉 導相關多肽的活性。本發(fā)明包括在乙烯信號轉導相關基因中攜帶突變的誘變植物，其中所述突變降低了乙烯信號轉導相關基因的表達，或抑制編碼的乙烯信號轉導相關多肽的活性。
[0255]因此，許多方法可用于降低或消除乙烯信號轉導相關多肽的活性。此外，超過一種以上方法可用于降低單個乙烯信號轉導相關多肽的活性。
[0256]1.基于多核苷酸的方法
[0257]在本發(fā)明的某些實施方案中，植物用能表達抑制本發(fā)明乙烯信號轉導相關多肽表達的多核苷酸的表達盒轉化。本文所用術語“表達”是指基因產物的生物合成，包括所述基因產物的轉錄和/或翻譯。例如，為本發(fā)明的目的，能表達抑制至少一種乙烯信號轉導相關多肽表達的多核苷酸的表達盒是能夠產生抑制至少一種本發(fā)明乙烯信號轉導相關多肽轉錄和/或翻譯的RNA分子的表達盒。從DNA分子“表達”或“產生”蛋白或多肽是指轉錄和翻譯編碼序列以產生蛋白或多肽，而從RNA分子“表達”或“產生”蛋白或多肽是指翻譯RNA編碼序列以產生蛋白或多肽。
[0258]抑制乙烯信號轉導相關多肽表達的多核苷酸實例在下文給出。
[0259]1.有義抑制/共抑制
[0260]在本發(fā)明的某些實施方案中，可通過有義抑制或共抑制抑制乙烯信號轉導相關多肽的表達。對于共抑制，將表達盒設計為以“有義”方向表達對應于全部或部分編碼乙烯信號轉導相關多肽的信 使RNA的RNA分子。RNA分子的超表達可導致天然基因的表達降低。因此，篩選用所述共抑制表達盒轉化的多個植物株系，以鑒定顯示最強的乙烯信號轉導相關多肽抑制的那些植物株系。
[0261]用于共抑制的多核苷酸可對應于全部或部分編碼乙烯信號轉導相關多肽的序列，全部或部分乙烯信號轉導相關多肽轉錄物5’和/或3’非翻譯區(qū)，或全部或部分編碼乙烯信號轉導相關多肽的轉錄物的編碼序列和非翻譯區(qū)。在多核苷酸包含全部或部分乙烯信號轉導相關多肽的編碼區(qū)的某些實施方案中，將表達盒設計為消除該多核苷酸的起始密碼子，從而不會翻譯任何蛋白產物。
[0262]共抑制可用于抑制植物基因的表達，以產生具有不可檢測蛋白水平的所述基因編碼的蛋白的植物。參見例如，Broin，et al., (2002)Plant Celll4:1417-1432。共抑制也可用于抑制同一植物中多種蛋白的表達。參見例如，美國專利5，942，657號。使用共抑制抑制植物內源性基因表達的方法描述于Flavell, et al., (1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:3490-3496;Jorgensen,et al., (1996)Plant Mol.Biol.31:957-973;Johansen andCarrington, (2001)Plant Physiol.126:930-938;Broin, et al., (2002)Plant Celll4:1417-1432;Stoutjesdijk, et al., (2002)Plant Physiol.129:1723-1731;Yu,et al.，(2003)Phytochemistry63:753-763 ;以及美國專利 5，034，323 號、5，283，184 號和 5，942，657號中，上述每一文獻，通過引用并入。可通過在有義序列3’且多腺苷酸化信號5’位置處在表達盒內添加多poly-dt(多dT)區(qū)，增加共抑制的效率。參見美國專利申請公開2002/0048814號，其在此通過引用并入。通常，此類核苷酸序列與內源性基因轉錄物的序列具有本質序列同一性，優(yōu)選超過約65%的序列同一性，更優(yōu)選超過約85%的序列同一性，最優(yōu)選超過約95%的序列同一性。參見美國專利5，283，184號和5，034, 323號，其在此通過引用并入。
[0263]i1.反義抑制
[0264]在本發(fā)明的某些實施方案中，可通過反義抑制抑制乙烯信號轉導相關多肽的表達。對于反義抑制，將表達盒設計為表達與全部或部分編碼乙烯信號轉導相關多肽的信使RNA互補的RNA分子。反義RNA分子的超表達可導致天然基因的表達降低。因此，可篩選用所述反義抑制表達盒轉化的多種植物株，以鑒定顯示最強乙烯信號轉導相關多肽抑制的那些。
[0265]用于反義抑制的多核苷酸可對應于全部或部分編碼乙烯信號轉導相關多肽的序列的互補物，全部或部分乙烯信號轉導相關多肽轉錄物5’和/或3’非翻譯區(qū)的互補物，或全部或部分編碼乙烯信號轉導相關多肽的轉錄物的編碼序列和非翻譯區(qū)的互補物。此外，反義多核苷酸可以與靶序列完全互補(即與靶序列的互補物100%相同)或部分互補(即與革巴序列的互補物低于100%相同)。反義抑制可用于抑制同一植物中多種蛋白的表達。參見例如，美國專利5，942，657號。此外，部分反義核苷酸可用于破壞靶基因的表達。通常使用至少50個核苷酸、100個核苷酸、200個核苷酸、300、400、450、500、550或更多核苷酸的序列。使用反義抑制在植物中抑制內源性基因表達的方法描述于，例如Liu，et al., (2002)Plant Physiol.129:1732-1743 和美國專利 5，759，829 號和 5，942，657 號中，上述每一文獻在此通過引用并入?？赏ㄟ^在反義序列3’且腺苷酸化信號5’位置處在表達盒內添加poly-dT區(qū)，增加反義抑制的效率。參見美國專利申請公開2002/0048814號，在此通過引用將其并入。
[0266]ii1.雙鏈 RNA 干擾
[0267]在本發(fā)明的某些實施方案中，可通過雙鏈RNA(dsRNA)干擾抑制乙烯信號轉導相關多肽的表達。對于dsRNA干擾,在同一細胞中表達如同上述用于共抑制的有義RNA分子和與有義RNA分子完全或部分互補的反義RNA分子。從而導致相應內源性信使RNA表達的抑制。
[0268]有義和反義分子的表達可通過將表達盒設計為包含有義序列和反義序列完成?；蛘?，可針對有義和反義序列使用分離的表達盒。隨后可篩選用dsRNA干擾表達盒轉化的多種植物株系，以鑒定顯示最強乙烯信號轉導相關多肽抑制的植物株系。使用dsRNA干擾抑制內源性植物基因表達的方法描述于Waterhouse, et al., (1998)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95:13959-13964, Liu, et al., (2002)Plant Physiol.129:1732-1743，和 W099/49029, W099/53050, W099/61631,以及W000/49035，其中上述每一篇文獻在此通過引用并入。
[0269]iv.發(fā)夾RNA干擾和含內含子的發(fā)夾RNA干擾
[0270]在本發(fā)明的某些實施方案中，可通過發(fā)夾RNA(hpRNA)干擾或含內含子的發(fā)夾RNA(ihpRNA)干擾抑制乙烯信號轉導相關多肽的表達。這些方法在抑制內源性基因表達方面是極為有效的，參見Waterhouse and Helliwell, (2003)Nat.Rev.Genet.4:29_38和其引用的參考文獻。
[0271] 對于hpRNA干擾，將表達盒設計為表達與其自身雜交形成包含單鏈環(huán)區(qū)和堿基配對的莖的發(fā)夾結構的RNA分子。該堿基配對的莖區(qū)包含對應于全部或部分編碼要被抑制表達的基因的內源性信使RNA的有義序列，以及與所述有義序列全部或部分互補的反義序列?；蛘?，堿基配對的莖區(qū)可對應于控制要被抑制基因表達的部分啟動子序列。因此，該分子堿基配對的莖區(qū)通常決定了 RNA干擾的特異性。hpRNA分子在抑制內源性基因表達方面是極為有效的，其誘導的RNA干擾可被植物的后代遺傳。參見例如，Chuang and Meyerowitz, (2000)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA97:4985-4990;Stoutjesdijk, etal., (2002)Plant Physiol.129:1723-1731;以及 Waterhouse and Helliwell, (2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38。使用hpRNA干擾抑制或沉默基因表達的方法描述于，例如Chuang and Meyerowitz, (2000)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA97:4985-4990;Stoutjesdijk, etal., (2002)Plant Physiol.129:1723-1731;Waterhouse and Helliwell, (2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38;Pandolfini et al., BMC Biotechnology3:7 以及美國專利申請公開2003/0175965號，每一上述文獻，在此通過引用并入。短期測定hpRNA構建體在體內沉默基因表達效果的方法描述于 Panstruga, et al.，(2003)Mol.Biol.Rep.30:135-140，在此將其通過引用并入。
[0272]對于ihpRNA,干擾分子具有與hpRNA相同的通式結構,但該RNA分子還包含能在表達ihpRNA的細胞內剪接的內含子。內含子的使用使剪接后發(fā)夾RNA分子中的環(huán)最小化，這提高了干擾的效率。參見例如，Smith, et al.，(2000)Nature407:319-320。實際上，Smith等顯示使用ihpRNA介導的干擾可抑制100%的內源性基因表達。使用ihpRNA干擾抑制內源性植物基因表達的方法描述于，例如 Smith, et al.，(2000) Nature407:319-320; Wesley, etal., (2001)Plant J.27:581-590;Wang and Waterhouse, (2001)Curr.0pin.PlantBiol.5:146-150;Waterhouse and Helliwell, (2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38;HelliwelIand Waterhouse, (2003)Methods30:289-295,以及美國專利申請公開 2003/0180945 號，每一篇上述文獻在此通過引用并入。
[0273]用于hpRNA干擾的表達盒也可如此設計:即使有義序列和反義序列不對應于內源性RNA。在該實施方案中，有義和反義序列位于環(huán)序列的側翼，所述環(huán)序列包含對應于全部和部分靶基因的內源性信使RNA的核苷酸序列。因此，是環(huán)區(qū)決定了 RNA干擾的特異性。參見例如，W002/00904;Mette, et al., (2000)EMBO J19:5194-5201 ;Matzke, etal., (2001) Curr.0pin.Genet.Devel.11:221-227 ; Scheid, et al., (2002) Proc.Natl.Acad.Sc1., USA99:13659-13662; Aufsaftz, et al., (2002) Proc.Nat ’ 1.Acad.Sc1.99 (4): 16499-16506 ; Si jen, et al., Curr.Biol.(2001) 11:43 6-440),在此將上述文獻通過引用并入。
[0274]V.擴增子介導的干擾
[0275]擴增子表達盒包含植物病毒衍生的序列，其含有全部或部分靶基因，但通常不含全部天然病毒的基因。存在于表達盒轉錄產物中的病毒序列允許轉錄產物指導其自身的復制。擴增子所產生的轉錄物相對于靶序列(即，乙烯信號轉導相關多肽的信使RNA)可以是有義的或反義的。使用擴增子抑制內源性植物基因表達的方法描述于例如Angelland Baulcombe, (1997)EMBO J.16:3675-3684，Angell and Baulcombe, (1999)PlantJ.20:357-362,以及美國專利6，646，805號，每一篇上述文獻在此通過引用并入。
[0276]v1.核酶
[0277]在某些實施方案中，本發(fā)明的表達盒所表達的多核苷酸是催化性RNA，或具有乙烯信號轉導相關多肽的信使RNA特異性的核酶活性。因此，該多核苷酸引起內源性信使RNA的降解，導致乙烯信號轉導相關多肽的表達降低。該方法描述于例如，美國專利4，987，071號中，其在此通過引用并入。
[0278]vi1.小干擾 RNA 或微 RNA
[0279]在本發(fā)明的某些實施方案中，乙烯信號轉導相關多肽表達的抑制，可通超表達編碼微RNA(miRNA)的基因的RNA干擾獲得。miRNA是由約22個核糖核苷酸組成的調節(jié)劑。miRNA在抑制內源性基因的表達方面非常有效，參見，例如Javier，et al., (2003)Nature425:257-263，在此將其通過引用并入。
[0280]對于miRNA干擾，將表達盒設計為，表達在內源性miRNA基因上被模擬的RNA分子。miRNA基因編碼RNA，該RNA形成含有與另一個內源性基因(靶序列)互補的22個核苷酸序列的發(fā)夾結構。為抑制乙烯信號轉導相關的表達，該22個核苷酸序列選自乙烯信號轉導相關轉錄物序列，并在有義方向上含有所述乙烯信號轉導相關序列的22個核苷酸和與所述有義序列互補的相應反義序列的21個核苷酸。miRNA分子在抑制內源性基因表達方面非常有效，其誘導的RNA干擾可被植物后代遺傳。
[0281 ] 2.基因表達基于多妝的抑制
[0282]在一個實施方案中，所述多核苷酸編碼與編碼乙烯信號轉導相關多肽的基因結合的鋅指蛋白，導致所述基因的表達降低。在具體的實施方案中，所述鋅指蛋白與乙烯信號轉導相關基因的調節(jié)區(qū)結合。在其他實施方案中，所述鋅指蛋白與編碼乙烯信號轉導相關多肽的信使RNA結合并防止其翻譯。已描述了選擇鋅指蛋白靶向的位點的方法，例如在美國專利6，453，242號中，以及使用鋅指蛋白抑制植物基因表達的方法，例如在美國專利申請公開2003/0037355號中，在此將上述兩篇文獻通過引用并入。
[0283]3.蛋白活性基于多肽的抑制
[0284]在本發(fā)明的某些實施方案中，所述多核苷酸編碼與至少一種乙烯信號轉導相關多肽結合的抗體，并且降低了乙烯信號轉導相關多肽活性的增強。在另一個實施方案中，所述抗體的結合通過細胞質量控制機制導致抗體-乙烯信號轉導相關復合物的周轉增加?？贵w在植物細胞中的表達以 及通過抗體的表達和與植物中蛋白的結合抑制分子途徑是本領域公知的，參見例如，Conrad and Sonnewald, (2003) Nature Biotech.21:35-36，在此通過引用將其并入。
[0285]4.基因破壞
[0286]在本發(fā)明的某些實施方案中，乙烯信號轉導相關多肽的活性通過破壞編碼乙烯信號轉導相關多肽的基因得以降低或消除。編碼乙烯信號轉導相關多肽的基因可通過本領域已知的任何方法破壞。例如，在一個實施方案中，所述基因通過轉座子標記破壞，在另一個實施方案中，所述基因通過隨機或定向誘變使植物發(fā)生誘變進行破壞，從而選擇活性降低的植物。
[0287]1.轉座子標記
[0288]在本發(fā)明的一個實施方案中，使用轉座子標記降低或消除一種或多種乙烯信號轉導相關多肽的乙烯信號轉導活性。轉座子標記包括在內源性乙烯信號轉導相關基因中插入轉座子，以降低或消除乙烯信號轉導相關多肽的表達。
[0289]在該實施方案中，通過在編碼乙烯信號轉導相關多肽的基因的調節(jié)區(qū)或編碼區(qū)插入轉座子，降低或消除一種或多種乙烯信號轉導相關多肽的表達。外顯子、內含子、5’或3’非翻譯序列、啟動子或任何其他乙烯信號轉導相關基因的調節(jié)序列內的轉座子，可用于降低或消除編碼的乙烯信號轉導相關多肽的表達和/或活性。
[0290]用于植物中特定基因的轉座子標記的方法是本領域公知的，參見例如，Maes, etal., (1999)Trends Plant Sc1.4:90-96;Dharmapuri and Sonti, (1999)FEMS Microbiol.Lett.179:53-59;Meissner, et al., (2000)Plant J.22:265-274;Phogat, et al., (2000)J.Biosc1.25:57-63;ffalbot, (2000)Curr.0pin.Plant Biol.2:103-107;Gai,eta 1., (2000)Nucleic Acids Re s.28:94-96;Fitzmaurice，et a 1., (1999)Geneticsl53:1919-1928)。此外，在選定的基因中選擇Mu插入物的TUSC方法描述于Bensen,et al., (1995)Plant Cell7:75-84;Mena, et al., (1996)Science274:1537-1540;以及美國專利5，962，764號，在此將每一篇上述文獻，通過引用并入。
[0291]i1.活性降低的突變植物
[0292]用于降低或消除植物內源性基因表達的其他方法也是本領域已知的，可類似地用于本發(fā)明。這些方法包括其他形式的誘變，例如甲磺酸乙酯誘導的突變、缺失誘變、以及用于反求遺傳學意義(用PCR)中鑒定內源性基因缺失的植株的快速中子缺失誘變。這些方法的實例參見 Ohshima, et al., (1998) Virology243:472-481;Okubara, et al., (1994)Geneticsl37:867-874 ;以及Quesada, et al.，(2000)Geneticsl54:421_436，將每一上述文獻在此通過引用并入。此外，用于篩選化學誘導突變的快速自動方法TILLING(TargetingInduced Local Lesion In Genomes,定向誘導基因組局部病變)也適用于本發(fā)明,其使用變性HPLC或選擇性內切核酸酶消化選定的PCR產物。參見McCallum，et al.，(2000)Nat.Biotechnol.18:455-457，其引入本文作為參考。
[0293]影響基因表達或干擾編碼的蛋白功能(增強的活性)的突變，是本領域公知的?；蛲怙@子中插入的突變通常導致無效突變體。保守殘基中的突變在抑制編碼的蛋白活性方面尤其有效。已描述了適 于誘變以消除乙烯信號轉導相關活性的植物乙烯信號轉導相關多肽的保守性殘基。此類突變體可根據(jù)公知的方法分離，不同乙烯信號轉導相關位點中的突變可通過遺傳雜交聚集。參見例如，Gruis, et al., (2002)Plant Celll4:2863-2882。
[0294]在本發(fā)明的另一個實施方案中，可使用顯性突變體觸發(fā)基因倒置和復制的基因位點的重組導致的 RNA 沉默。參見例如，Kusaba, et al., (2003)Plant Celll5:1455-1467。
[0295]本發(fā)明包括降低或消除一種或多種乙烯信號轉導相關多肽活性的其他方法。其他用于改變或突變植物中基因組核苷酸序列的方法的實例是本領域已知的，包括但不限于，RNA = DNA載體、RNA = DNA突變載體、RNA = DNA修復載體、混合的雙鏈寡核苷酸、自體互補性RNA:DNA寡核苷酸和重組發(fā)生寡核堿基(oligonucleobase)的使用。此類載體和使用方法是本領域已知的，參見例如，美國專利5，565，350號、5，731，181號、5，756，325號、5，760, 012號、5，795，972號和5，871，984號，每一上述專利在此通過引用并入。同樣參見W098/49350, W099/07865, W099/25821 和 Beetham, et al., (1999) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96:8774-8778，每一上述文獻，在此通過引用并入。
[0296]細胞的轉染/轉化
[0297]轉化/轉染的方法對本發(fā)明不是關鍵性的。多種轉化或轉染方法目前是可以利用的，可應用較新的方法轉化可被直接應用的作物或其他宿主細胞。
[0298]因此開發(fā)了多種方法以將DNA序列插入到宿主細胞基因組中，使所述序列轉錄和翻譯，從而實現(xiàn)生物體內的表型變化。因此，可使用任何能有效轉化/轉染的方法。
[0299]A.棺物轉化
[0300]編碼所需是本發(fā)明多肽的DNA序列，例如編碼全長蛋白的cDNA或基因組序列，將用于構建重組表達盒，可將該表達盒引入所需的植物中。[0301] 本發(fā)明分離的核酸可根據(jù)本領域已知的技術引入植物中。一般而言，制備上述且適于轉化植物細胞的重組表達盒。轉化多種高等植物的技術是公知的，描述于技術、科學和專利文獻中。參見例如，Weising, et al.，(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477。例如，DNA構建體可使用諸如電穿孔、聚乙二醇(PEG)、穿孔、粒子轟擊、硅纖維送遞或植物細胞原生質體或胚胎發(fā)生的愈傷組織微量注射的技術直接引入植物細胞的基因組DNA。參見例如Tomes, et al., Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via MicroprojectileBombardment.pp.197213in Plant Cell,Tissue and Organ Culture,FundamentalMethods, eds.Gamborg and Phillips.Springer-Verlag Berlin Heidelberg NewYork, 1995?；蛘撸珼NA構建體可與適當?shù)腡-DNA側翼區(qū)結合，并引入到常規(guī)的根瘤農桿菌宿主載體中。當細胞受到細菌感染時，根瘤農桿菌宿主的毒性功能將指導構建體和鄰近標記插入到植物細胞DNA中。參見美國專利5，591，616號。
[0302]使用PEG 沉淀引入 DNA 構建體描述于 Paszkowski, et al., (1984) EmboJ.3:2717-2722 中。電穿孔技術描述于 Fromm, et al.，(1985) Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA) 82:5824 中。彈道轉化技術(ballistic transformation technique)描述于Klein, etal.，(1987) Nature327:70-73 中。
[0303]根瘤農桿菌介導的轉化技術在科學文獻中有充分描述。參見例如Horsch, etal., (1984) Science233:496-498，以及 Fraley, et al., (1983) Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA) 80:4803。盡管農桿菌主要用于雙子葉植物，某些單子葉植物也可使用農桿菌轉化。例如，玉米的農桿菌轉化描述于美國專利5，550，318號中。
[0304]轉染或轉化的其他方法包括(I)毛根農桿菌介導的轉化(參見例如Lichtensteinand Fuller In:Genetic Engineering, vol.6, Rigby, Ed., London, Academic Press, 1987;以及 Lichtenstein and Draper, In:DNA Cloning, Vol.1I, Glover, Ed., Oxford, IRIPress, 1985)，申請PCT/US87/02512 (W088/02405，1988 年 4 月 7 日公開)描述了毛根農桿菌菌株A4和Ri質粒及其根瘤農桿菌載體pARC8或pARC16的使用；(2)脂質體介導的DNA攝取(參見例如 Freeman, et al., (1984)Plant Cell Physiol.25:1353) ； (3)潤旋方法(參見例如 Kindle, (1990) Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA) 87:1228)。
[0305]DNA也可通過DNA向花粉內的直接轉移引入植物，如Zhou et al.，(1983)Methodsin EnzymologylOl:433 ；Hess, (1987)Intern Rev.Cytol.107:367> Luo, et al., (1988)Plant 1101.8丨01.1?印0代6抑:165所述。多肽編碼基因的表達可通過將DNA注射到植物的生殖器官中獲得，如 Pena, et al., (1987) Nature325:274 所述。
[0306]DNA也可直接注射到未成熟胚的細胞中，干燥胚的再水合，如Neuhaus，etal.，(1987) Theor.Appl.Genet.75:30 以及 Benbrook, et al., (1986) in Proceedings BioExpol986, Butterworth, Stoneham, Mass., pp.27-54所述。可用作載體的多種植物病毒在本領域中是已知的，包括花椰菜花葉病毒(CaMV)、雙粒病毒組、雀麥草花葉病毒和煙草花葉病毒。
[0307]B.原核細胞、低等真核細胞和動物細胞的轉染
[0308]動物和低等真核(例如酵母)宿主細胞可通過多種方法轉染或致轉染。有若干公知的將DNA引入動物細胞的方法。其包括:磷酸鈣沉淀、受體宿主細胞與含有DNA的細菌原生質體融合、用含有DNA的脂質體處理受體細胞、DEAE葡聚糖、電穿孔、基因槍以及直接將DNA微量注射到細胞內。轉染的細胞通過本領域公知的方法培養(yǎng)。Kuchler，BiochemicalMethods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson and Ross, Inc.(1977)。
[0309]蛋白的合成
[0310]本發(fā)明的蛋白可使用非細胞合成方法構建。長度低于約50個氨基酸的蛋白質的固相合成，可通過在將所述序列的C末端氨基酸連接在不溶性支持體上，隨后依次添加序列中剩余的氨基酸完成。固相合成的技術描述于Barany and Merrifield, Solid-PhasePeptide Synthesis, pp.3-284in The Peptides: Analysis, Synthesis, BiologyVol.2: Special Methods inPeptide Synthesis, Part A.; Merrifield, et al., (1963)J.Am.Chem.Soc.85:2149-2156 以及 Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis (固相肽合成法)，2nd ed(第二版)，Pierce Chem.C0., Rockford, IL (1984) ? 更長的蛋白質可通過較短片段的氨基和羧基端縮合合成。通過活化羧基端形成肽鍵(例如，通過使用偶聯(lián)劑N，N’ - 二環(huán)己基碳化二亞胺)的方法是本領域技術人員已知的。
[0311]蛋白的鈍仆,
[0312]本發(fā)明的蛋白可通過本領域技術人員公知的標準技術純化。本發(fā)明重組產生的蛋白可直接表達或表達為融合蛋白。重組蛋白通過細胞裂解(例如聲裂法、弗氏細胞壓碎器)和親和層析的組合純化。對于融合產物，用合適的蛋白水解酶隨后消化融合蛋白，釋放所需的重組蛋白。
[0313]本發(fā)明的蛋白，重組或合成的，可通過本領域公知的標準技術純化為實質純度，所述技術包括去垢劑增溶、用諸如硫酸銨的物質選擇性沉淀、柱層析、免疫純化方法等。參見例如 R.Scopes, Protein Purif icat ion !Principles and Practice(蛋白純化:原理和實踐),Springer-Verlag:New York (1982) ; Deutscher, Guide to ProteinPurification, Academic Press(1990)。例如,可產生針對本文所述蛋白的抗體。按照美國專利4，511，503號所述的方法,可實現(xiàn)從大腸桿菌的純化。蛋白隨后從表達該蛋白的細胞內分離，通過本文所述的標準的蛋白質化學技術進一步純化。表達的蛋白的檢測通過本領域已知的方法實現(xiàn)，包括，例如放射免疫測定、蛋白質印跡技術或免疫沉淀。
[0314]轉基因植物再生
[0315]通過任何上述轉化技術衍生的植物細胞經培養(yǎng)可再生具有轉化的基因型的完整植物。此類再生技術通常依賴于組織培養(yǎng)生長培養(yǎng)基中的某些植物激素的操作。對于玉米的轉化和再生，參見 Gordon-Kamm, et al., (1990) The Plant Cell2:603-618。
[0316]用植物表達載體轉化的植物細胞可按照標準植物組織培養(yǎng)技術從例如單細胞、愈傷組織或葉片再生。本領域公知的是，幾乎任何植物的各種細胞、組織和器官經成功的培養(yǎng)可再生完整的植物。從培養(yǎng)的原生質體中再生植物描述于Evans, et al., ProtoplastsIsolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture (植物細胞培養(yǎng)手冊:原生質體的分離和培養(yǎng))，Macmillan Publishing Company, New York, pp.124-176 (1983);以及 Binding, Regeneration of Plants,Plant Protoplasts, CRC Press,BocaRaton, pp.21-73(1985)。
[0317]含有通過葉外植體的農桿菌引入的外源基因的植物的再生，可按照Horsch, etal.，(1985) Science227:1229-1231的描述實現(xiàn)。在該方法中，轉化體在選擇性試劑存在下，在誘導正轉化的植物種類的枝條再生的培養(yǎng)基中生長，如Fraley, et al.，(1983) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:4803所述。該方法通常在2_4周內產生枝條，隨后將這些轉化枝條轉移至含有選擇性試劑和預防細菌生長的抗生素的適當根誘導培養(yǎng)基中。本發(fā)明的轉基因植物可以是可育和不育的。
[0318]再生也可從植物愈傷組織、外植體、器官或其部分實現(xiàn)。此類再生技術通常描述于Kleen, et al., (1987) Ann.Rev.0f Plant Phys.38:467-486。從單個植物原生質體或各種外植體再生植物是本領域公知的。參見例如,Methods for Plant Molecular Biology(植物分子生物學方法)，Weissbach and ffeissbach, eds., Academic Press, Inc., SanDiego, Calif.(1988)。該再生和生長過程包括如下步驟:選擇轉化細胞和枝條，使所述轉化體枝條生根并在土壤中生長小植株。玉米細胞培養(yǎng)和再生一般參見The MaizeHandbook (玉米手冊)，F(xiàn)reeling and ffalbot, Eds., Springer, New York (1994) ; Corn andCorn Improvement, 3rd edition, Sprague and Dudley Eds., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin(1988)。
[0319]本領域技術人員應當認識到，在重組表達盒穩(wěn)定地并入到轉基因植物中，經確認是可操作的后，其可以通過有性雜交引入其他植物。依賴于要雜交的種類，可使用任何標準育種技術。在無性繁殖的作物中，成熟的轉基因植物可通過采集碎塊或組織培養(yǎng)技術繁殖，產生多個相同的植物。
[0320]進行需要的轉基因選擇，獲得新品種并無性繁殖以供商業(yè)使用。在種子繁殖的作物中，成熟的轉基因植物可自交以產生純合的近交植物。近交植物產生含有新引入異源核酸的種子，種植這些種子，產生能產生所選表型的植物。
[0321] 從再生的植物中獲得的部分，例如花、種子、葉、枝、果實等包括在本發(fā)明范圍內，只要這些部分包括包含本發(fā)明分離的核酸的細胞。所述再生植物的子代和變體以及突變體也包括在本發(fā)明的范圍內，只要這些部分包括引入的核酸序列?？赏ㄟ^例如標準免疫印跡和DNA檢測技術篩選表達可選標記的轉基因植物以遺傳本發(fā)明的核酸。通常評估轉基因系異源核酸的表達水平。最初可測定RNA水平的表達，以鑒定和量化表達陽性的植物?？墒褂肦NA分析的標準技術，其包括使用經設計僅擴增異源RNA模板的寡核苷酸引物的PCR擴增測定和使用異源核酸特異性探針的溶液雜交測定?？呻S后使用本發(fā)明的特異反應性抗體通過蛋白質免疫印跡，分析RNA陽性植物的蛋白表達。此外，可按照標準方法，使用異源核酸特異性多核苷酸探針和抗體，分別進行原位雜交和免疫細胞化學測定，以定位轉基因組織中的表達位點。通常，經常對大量轉基因株篩選并入的核酸，以鑒定和選擇具有最適表達特征的植物。
[0322]優(yōu)選的實施方案是對添加的異源核酸是純合的轉基因植物，即含有兩條添加的核酸序列的轉基因植物，一個基因位于染色體對的每條染色體上同樣的位點。純合的轉基因植物可通過有性交配(自交)含有單個添加的異源核酸的雜合的轉基因植物，從而使部分產生的種子發(fā)芽，并分析所產生的所得植物的本發(fā)明的多肽表達相對于對照植物(即天然的非轉基因的)的改變。也考慮與親本植物的回交和與非轉基因植物的異型雜交。
[0323]多肽水平和/或組成的調節(jié)
[0324]本發(fā)明還提供了調節(jié)(即增加或降低)本發(fā)明的多肽在植物或其部分中濃度或比例的方法。調節(jié)可通過增加或降低本發(fā)明的多肽在植物中的濃度和/或比例實現(xiàn)。
[0325]該方法包括向植物細胞中引入包含如前所述的本發(fā)明多肽的重組表達盒，以獲得轉化的植物細胞，在植物細胞生長條件下培養(yǎng)所述轉化的植物細胞，并將本發(fā)明多肽在植物中的表達誘導或抑制足以調節(jié)所述多肽在植物或植物部分中的濃度和/或比例的時間。
[0326]在某些實施方案中，本發(fā)明多肽在植物中的濃度和/或比例，可通過體內或體外改變基因的啟動子以上調或下調基因的表達來調節(jié)。在某些實施方案中，本發(fā)明天然基因的編碼區(qū)可通過取代、添加、插入或缺失改變，以降低編碼的酶的活性。參見例如Kmiec的美國專利5，565，350號；Zarling等的PCT/US93/03868。在某些實施方案中，將包含啟動子序列的分離的核酸(例如載體)轉染到植物細胞中。
[0327]隨后，通過本領域技術人員已知的方法選擇包含與本發(fā)明的多核苷酸可操作地連接的啟動子的植物細胞，所述方法例如但不限于，DNA印跡、DNA測序或使用對所述啟動子和基因具有特異性的引物進行PCR分析并檢測其產生的擴增子。將通過上述實施方案改變或修飾的植物或植物部分在植物形成條件下生長一段時間，以調節(jié)植物中本發(fā)明多肽的濃度和/或比例。植物形成條件是本領域公知的，如上文中所討論。
[0328]一般而言，所述多肽的濃度或比例相對于缺乏上述重組表達盒的天然對照植物、植物部分或細胞增加或降低至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。本發(fā)明的調節(jié)可在植物生長至需要的發(fā)育階段過程中和/或該過程后進行。臨時和/或在特定的組織中調節(jié)核酸表達可通過使用例如在有義或反義方向可操作地連接于本發(fā)明的多核苷酸的適當啟動子控制，如前文所詳細討論的。本發(fā)明多核苷酸表達的誘導也可通過外源性施用有效量的誘導化合物進行控制。誘導型啟動子和激活這些啟動子表達的誘導化合物是本領域公知的。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽在單子葉植物、尤其是玉米中受到調節(jié)。
[0329]分子fair3,
[0330]本發(fā)明提供了 對包含本發(fā)明的多核苷酸的植物進行基因分型的方法。任選地，所述植物是單子葉植物，例如玉米或高粱。基因分型提供了區(qū)分染色體對同系物的方法，可用于區(qū)分植物種群中的分離子。分子標記方法可用于系統(tǒng)發(fā)育研究，表征作物品種間的親緣關系，鑒定雜交或體細胞雜種，定位影響單基因性狀的染色體片段，基于作圖的克隆，以及數(shù)量遺傳研究。參見例如 Clark, Ed.，Plant Molecular Biology:A Laboratory Manual (植物分子生物學:實驗室手冊).Berlin, Springer Verlag, 1997.Chapter (第7章)。分子標記方法一般參見〃The DNA Revolution (DNA 革命)〃in:Paterson, Genome Mappingin Plants (植物基因組作圖)(Austin, TX, Academic Press/R.G.Landis Company, 1996)pp.7_21o
[0331]本發(fā)明中基因分型的具體方法可使用任何數(shù)目的分子標記分析技術，例如但不限于，限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs)。RFLP是核苷酸序列變異導致的DNA限制性片段間等位基因區(qū)別的產物。如本領域技術人員所公知的，RFLP通常通過提取基因組DNA并用限制酶消化進行檢測。通常，所得片段根據(jù)大小分離，并使之與探針雜交；優(yōu)選單拷貝探針。來自同源染色體的限制性片段被顯示。
[0332]等位基因間片段大小差異代表了 RFLP。因此，本發(fā)明還提供了使用諸如RFLP分析的技術分離本發(fā)明基因或核酸以及與這些基因或核酸遺傳連接的染色體序列的方法，連接的染色體序列在本發(fā)明基因的50個厘摩(CM)以內，通常在40或30cM、優(yōu)選20或10cM、更優(yōu)選5、3、2或IcM以內。
[0333]在本發(fā)明中，用于植物核基因組分子標記作圖的核酸探針，在選擇性雜交條件下與編碼本發(fā)明多核苷酸的基因選擇性雜交。在優(yōu)選的實施方案中，從本發(fā)明的多核苷酸中選擇所述探針。
[0334]通常，這些探針是cDNA探針或限制酶(例如Pst I)處理的基因克隆。探針的長度在上文做了詳細討論，但通常其長度為至少15個堿基，更優(yōu)選至少20、25、30、35、40或50個堿基。然而，通常探針的長度小于約Ik個堿基。優(yōu)選地，所述探針是與單倍體染色體組中獨特位點雜交的單拷貝探針。RFLP作圖所用的某些示例性限制酶是EcoR1、EcoRv和Sst10本文所用術語“限制酶”包括涉及識別并單獨或與其他組合物聯(lián)合在特定核苷酸序列處切割的組合物。
[0335]檢測RFLP的方法包括下列步驟:(a)用限制酶消化植物的基因組DNA ； (b)在選擇性雜交條件下，使核酸探針與所述基因組DNA的的本發(fā)明多核苷酸的序列雜交；(c)由此檢測RFLP。其他區(qū)分本發(fā)明多核苷酸多態(tài)性(等位基因的)變體的方法可利用本領域技術人員公知的分子標記技術進行，包括諸如以下的技術:1)單鏈構象分析(SSCA) ;2)變性梯度凝膠電泳(DGGE) ;3)RNA酶保護測定；4)等位基因特異性寡核苷酸(ASOs) ；5)使用識別核昔酸錯配的蛋白，例如E.coli mutS蛋白，以及6)等位基因特異性PCR?；跈z測兩條互補DNA鏈間錯配的其他方法包括,夾緊變性凝膠電泳(clamped denaturing gelelectrophoresis, CDGE);異源雙鏈體分析(HA);以及化學錯配切割(CMC)。因此,本發(fā)明還提供了基因分型的方法，包括在嚴緊雜交條件下使核酸探針與疑似包含本發(fā)明多核苷酸的樣品接觸的步驟。通常，該樣品是植物樣品；優(yōu)選疑似包含本發(fā)明的玉米多核苷酸(例如基因，mRNA)的樣品。所述核酸探針在嚴緊條件下與包含多態(tài)性標記的本發(fā)明多核苷酸的子序列選擇性雜交。核酸 探針與多態(tài)性標記核酸序列的選擇性雜交產生雜交復合物。雜交復合物的檢測表明樣品中存在多態(tài)性標記。在優(yōu)選的實施方案中，該核酸探針包含本發(fā)明的多核苷酸。
[0336]UTR和密碼子偏好
[0337]通常，已發(fā)現(xiàn)RNA的5’非編碼或非翻譯區(qū)(5’ UTR)中的特異性序列元件調節(jié)翻譯效率。陽性序列基序包括翻譯起始共有序列(Kozak, (1987)Nucleic Acids Res.15:8125)和 7-甲基鳥苷帽結構(Drummond, et al., (1985)Nucleic Acids Res.13:7375) ? 陰性兀件包括穩(wěn)定的分子內5’UTR莖環(huán)結構(Muesing, et al.，(1987)Cell48:691)和5’UTR中的 AUG 序列或適當 AUG 后的短可讀框(Kozak, supra, Rao, et al., (1988)Mol.and Cell.Biol.8:284)。因此，本發(fā)明提供了調節(jié)異源編碼序列翻譯的5’和/或3’非翻譯區(qū)。
[0338]此外，本發(fā)明多核苷酸的多肽編碼片段經修飾可以改變密碼子選擇。改變的密碼子選擇可用于改變翻譯效率和/或優(yōu)化用于在所需宿主內表達的編碼序列，例如優(yōu)化在玉米中表達的異源序列的密碼子選擇。本發(fā)明多核苷酸編碼區(qū)的密碼子選擇可使用商用軟件包進行統(tǒng)計學分析，例如威斯康星大學遺傳計算機組的"Codon Preference〃(參見 Devereaux, et al., (1984)Nucleic Acids Res.12:387-395)或 MacVector4.1(EastmanKodak C0., New Haven, Conn.)。因此,本發(fā)明提供了特征為至少一種本發(fā)明多核苷酸的編碼區(qū)的密碼子選擇頻率。可用于確定密碼子選擇頻率的多核苷酸的數(shù)目可以是I到本文所提供的本發(fā)明多核苷酸數(shù)之間的任意整數(shù)。任選地，該多核苷酸是全長序列。用于統(tǒng)計學分析的示例性序列數(shù)目可以是至少1、5、10、20、50或100。
[0339]序列改組(sequence shuffling)[0340]本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的多核苷酸進行序列改組的方法，以及其產生的組合物。序列改組描述于PCT公開W097/20078號中，同樣參見Zhang, et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:4504-4509。一般而言，序列改組提供了產生具有可被選擇或篩選的所需特征的多核苷酸文庫的方法。重組多核苷酸文庫由有關序列多核苷酸群體產生，其包括具有實質序列同一性并可在體外或體內同源重組的序列區(qū)域。序列重組的多核苷酸的群體包括具有所需或有利特征且可通過適當?shù)倪x擇或篩選方法選擇的多核苷酸亞群。所述特征可以是任何能在篩選系統(tǒng)中被選擇或檢測的性質或屬性，可包括下列性質:編碼的蛋白、轉錄元件、序列控制轉錄、RNA加工、RNA穩(wěn)定性、染色質構象其他基因或轉基因的表翻譯或達性質、復制元件、蛋白結合元件等，例如賦予任何選擇或檢測性質的特征。在某些實施方案中，選擇的特征是相對于本文提供的野生型蛋白降低的Km和/或增加的KCat。在其他實施方案中，由序列改組產生的蛋白或多核苷酸將具有比非改組的野生型多核苷酸更高的配體結合親和性。所述性質的增加可以是野生型值的至少110%、120%、130%、140%或至少150%。
[0341]通用和共有序列
[0342]本發(fā)明的多核苷酸和多肽還包括分別具有以下的多核苷酸和多肽:(a)至少兩種本發(fā)明同源多核苷酸或多肽的通用序列，以及(b)至少三種本發(fā)明同源多核苷酸或多肽的共有序列。本發(fā)明的通用序列包含通用多肽或多核苷酸序列所分別包括的每種多肽或多核苷酸。具有氨基酸或核酸共有序列的多核苷酸所包括的個體種類可用于產生抗體或產生核酸探針或引物，以篩選其他種類、屬、科、目、綱、門或界中的同源物。例如，具有來自玉米基因家族共有序列的多核苷酸可用于產生針對其他禾本科(Gramineae)種類例如小麥、水稻或高粱的抗體或核酸探針或引物。
[0343]或者，可使用具有同源基因所產生的共有序列的多核苷酸鑒定或分離其他分類群的直系同源物。通常，具有共有序列的多核苷酸的長度為至少25、30或40個氨基酸，或20、30、40、50、100或150 個核苷酸。本領域技術人員了解，對于區(qū)別于比對的序列但具有如前所述同樣保守性取代基團的氨基酸，可使用保守氨基酸取代。任選地，對于每10個氨基酸長度的共有序列，取代不超過I或2個保守氨基酸。
[0344]用于產生共有序列或通用序列的類似序列包括本文所提供的任何數(shù)目或組合的相同基因、直系同源或旁系同源序列的等位基因變體。任選地，用于產生共有或通用序列的類似序列使用BLAST算法的最小加和概率(smallest sum probability) (P(N))鑒定。序列分析軟件的不同供應者列于Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物學方法)，Ausubel, et al., Eds., Current Protocols, a joint venture betweenGreene Publishing Associates, Inc.and John ffiley&Sons, Inc.(Greene PublishingAssociates, Inc和約翰威立國際出版公司的合資公司)(附錄30)的第7章中。
[0345]如果測試核酸與參考核酸相比最小加和概率低于約0.1，更優(yōu)選低于約0.01或
0.001，最優(yōu)選低于約0.0001或0.00001，則認為該多核苷酸序列類似于參考序列。類似的多核苷酸可進行比對，使用來自于許多供應者的多重序列比對軟件產生共有或通用序列，例如 Genetics Computer Group (Madison, WI)的 PILEUP 軟件、Vector NTI (NorthBethesda, MD)的 ALIGNX 或 Genecode (Ann Arbor, MI)的 SEQUENCHER?？煞奖愕氖褂盟鲕浖娜笔?shù)產生共有或通用序列。
[0346]機器應用[0347]本發(fā)明提供了鑒定、模擬或分析本發(fā)明多核苷酸和多肽的機器(machine)、制品(articles of manufacture)及方法。鑒定方法可鑒定本發(fā)明多核苷酸或多肽的同源物,而模擬和分析方法可識別目的結構或功能特征。
[0348]A.機器:數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
[0349]在一個實施方案中，本發(fā)明提供了機器，其具有:1)包含代表至少一種通用序列的數(shù)據(jù)的存儲器，2)訪問數(shù)據(jù)的遺傳鑒定、分析或模擬程序，3)根據(jù)程序使用基因序列或其子序列執(zhí)行指令的數(shù)據(jù)處理器，以及4)儲存或顯示數(shù)據(jù)處理結果的輸出端。
[0350]本發(fā)明的機器是數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，通常為數(shù)字計算機。術語“計算機”包括一個或多個臺式或便攜計算機、計算機工作站、服務器(包括內部網和因特網服務器)、主機和任何包括任何上述部件的整合系統(tǒng)，與計算機的處理、存儲、輸入或輸出是遠程或本地，以及計算機模塊的任何聯(lián)網互聯(lián)無關。因此數(shù)據(jù)處理可以是遠程的，或分布在一個或多個位置的若干處理器中。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)包括數(shù)據(jù)處理器，例如中央處理器(CPU)，其根據(jù)應用程序執(zhí)行指令。當代表本發(fā)明多核苷酸或多肽序列的數(shù)據(jù)用于專利性檢索時，本文所用的機器、制品和方法不包括美國專利和商標局或歐洲專利局使用的機器、產品和方法。[0351]本發(fā)明的機器包括包含代表至少一基因序列的數(shù)據(jù)的存儲器。本文所用“基因序列”是指本發(fā)明多核苷酸或多肽的一級序列(即氨基酸或核苷酸序列)?；蛐蛄锌纱韥碜匀L蛋白、基因組DNA或全長cDNA/mRNA的部分序列。包含根據(jù)本發(fā)明鑒定、分析或模擬的基因序列的核酸或蛋白可被克隆或合成。
[0352]如本領域技術人員所了解的，本發(fā)明機器存儲器形式或計算機可讀介質的具體實施方案不是本發(fā)明的關鍵元素，可以是多種形式。所述機器的存儲器包括但不限于ROM或RMA或計算機可讀介質，例如但不限于，諸如計算機磁盤或硬盤的磁性介質，或諸如⑶-ROM、DVD等的介質。包含代表基因序列的數(shù)據(jù)的存儲器包括主存儲器、寄存器和緩存。在某些實施方案中，所述數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)在處理數(shù)據(jù)的同時在存儲器中儲存代表基因序列的數(shù)據(jù)，其中該數(shù)據(jù)的連續(xù)部分被依次拷貝到所述數(shù)據(jù)處理器的至少一個寄存器進行處理。因此，儲存在存儲器中的基因序列可以是在計算機運行期間或預先存儲的基因序列。本發(fā)明的機器包括處理代表基因序列的數(shù)據(jù)的基因鑒定、分析或模擬程序(在下文討論)。該程序可以在軟件或硬件中執(zhí)行。
[0353]本發(fā)明還考慮到本發(fā)明的機器將直接或間接給本發(fā)明多核苷酸或多肽的用途或功能加附注。例如，所述用途/功能可作為機器中的數(shù)據(jù)元件直接被加以附注并可被程序訪問?；蛘?，基因的用途/功能可被間接加以附注為電子記錄或文字記錄?；蛐蛄械墓δ芑蛴猛究梢允腔蛐蛄谢虼硭鲂蛄械臄?shù)據(jù)(即基因序列數(shù)據(jù))的功能或用途。
[0354]示例性的基因序列的功能或用途包括:1)其名稱(根據(jù)國際生物化學和分子生物學聯(lián)合會命名規(guī)則)或所述基因序列代表的酶或蛋白的功能，2)所述基因序列代表的蛋白的代謝途徑，3)所述基因序列代表的蛋白的底物或產物或結構作用，或4)調節(jié)所述基因序列代表的蛋白的表達或活性所影響的表型(例如農藝性狀或藥理學性狀)。
[0355]本發(fā)明的機器還包括輸出端，用于顯示、打印或記錄使用本發(fā)明的基因序列鑒定、分析或模擬的結果。示例性的輸出端包括監(jiān)視器、打印機或各種電子儲存機制(例如軟盤、硬盤、主存儲器)，其可以用于顯示結果或用作將存儲的數(shù)據(jù)輸入隨后的應用或設備的工具。[0356]在某些實施方案中，代表本發(fā)明基因序列的數(shù)據(jù)是數(shù)據(jù)結構內的數(shù)據(jù)元件。該數(shù)據(jù)結構可由定義鑒定、模擬或分析方法的計算機程序定義，或其由單獨的數(shù)據(jù)存儲和恢復程序子程序或系統(tǒng)的編程定義。因此，本發(fā)明提供了用于儲存數(shù)據(jù)結構的存儲器，其可由計算機程序化的執(zhí)行鑒定、分析或模擬基因序列的方法而訪問。存儲在該存儲器中的數(shù)據(jù)結構與代表基因序列的數(shù)據(jù)有關，并反映基因序列的基本組織(underling organizaiton)和結構，以促進程序訪問對應于基因序列邏輯亞成分的數(shù)據(jù)元件。該數(shù)據(jù)結構使得基因序列能被鑒定、分析和1?擬?；蛐蛄械幕镜燃壓徒Y構是代表一級序列聞級組織的數(shù)據(jù)。所述高級結構影響轉錄、翻譯、酶動力學或反映結構域或基序。
[0357]組成基因序列高級組織的示例性邏輯亞成分包括但不限于，限制酶位點、內肽酶位點、大溝、小溝、β折疊、α螺旋、可讀框(ORF)、5’非翻譯區(qū)(UTRs)、3’UTR、核糖體結合位點、糖基化位點、信號肽結構域、內含子-外顯子接頭、poly-A尾、轉錄起始位點、翻譯起始位點、翻譯終止位點、甲基化位點、鋅指結構域、修飾的氨基酸位點、前蛋白原-前蛋白接頭、前蛋白-蛋白接頭、轉運肽結構域、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、簡單序列重復(SSR)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、插入元件、跨膜區(qū)和莖環(huán)結構。
[0358]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，其包括至少一種存儲器中的數(shù)據(jù)結構，其中該數(shù)據(jù)結構支持代表本發(fā)明基因序列的數(shù)據(jù)的加入。該系統(tǒng)還包括至少一個遺傳鑒定、分析或模擬程序，其使用基因序列數(shù)據(jù)鑒定、分析或模擬至少一種作為基因序列邏輯亞成分的數(shù)據(jù)元件，指導系統(tǒng)執(zhí)行指令。同樣提供了處理結果的輸出端。
[0359]B.制品:計算機可讀介質
[0360]在一個實施方案中，本發(fā)明提供了計算機可讀介質中的數(shù)據(jù)結構，其含有代表本發(fā)明基因序列的數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)結構經組織反映所述基因序列的邏輯結構，使該序列可通過能訪問該數(shù)據(jù)結構的軟件程序分析。特別是，本發(fā)明的數(shù)據(jù)結構以允許軟件工具使用每一基因序列的邏輯元件鑒定、分析或模擬的方式組織本發(fā)明的基因序列。
[0361]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了含有計算機程序和基因序列數(shù)據(jù)的機器可讀介質。該程序提供了足以執(zhí)行鑒定、分析或模擬基因序列數(shù)據(jù)的指令。該介質還包括反映數(shù)據(jù)的基本組織和結構的數(shù)據(jù)結構，以利于程序訪問對應于基因序列邏輯亞成分的數(shù)據(jù)元件，數(shù)據(jù)結構是程序內固有的并且以程序組織和訪問數(shù)據(jù)的方式。
[0362]數(shù)據(jù)結構的實例類似于分層的雜湊表，其中在一個方向上所述序列的堿基內容由字符串A、T、C、G和N代表。5’端到3’端的方向反映為從位置O到字符串長度減I的位置。對應于目的核苷酸序列的此類字符串具有一定數(shù)目的亞字符串，其每一個均受到母體字符串內5’端字符串位置和3’端字符串位置的限制。在第二個方向上，每一亞字符串與一種或多種屬性字段(attribute field)有關，此類屬性字段含有對亞字符串所代表的核苷酸序列中區(qū)域的注釋。
[0363]例如，所考察序列的長為520個堿基，用名稱為SeqTarget的字符串表示。在位置12-38的5’上游非編碼區(qū)處有小溝，其被鑒定為增強子蛋白HM-A的結合位點，該位點依次增加SeqTarget所代表的基因的轉錄。這里，亞字符串表示為(12，38)，具有以下屬性:[上游非編碼的]、[小 溝]、[ΗΜ-A結合]和[ΗΜ-A結合后增加轉錄]。類似地，可通過這種方式存儲和構建其他類型的信息，例如與全序列相關的信息，例如所述序列是否為全長的病毒基因、哺乳動物持家基因或克隆X的EST，涉及3’下游非編碼區(qū)例如發(fā)夾結構的信息，以及涉及編碼區(qū)的各種結構域例如鋅指結構的信息。
[0364]該數(shù)據(jù)結構是開放的結構，能適應新產生的數(shù)據(jù)和需要的知識。所述結構還是柔性結構。其可以裁減為al-D字符串以利于數(shù)據(jù)處理和分析步驟，例如群集(clustering)、重復掩蔽(repeat-masking)和HMM分析。同時,所述數(shù)據(jù)結構也可向多個方向延伸相關的屬性。當需要在廣泛的基因組知識庫中促進數(shù)據(jù)管理和處理時，可在各方向屬性間建立指示器。此外，所述數(shù)據(jù)結構是目標定向的。多態(tài)性可用一個家族或一類的序列對象代表，其中的每一個對象具有如前所述的內部結構。提煉共同的性狀并分配給母體對象，其中每一子對象代表所述家族或類別的特定變體。這樣的數(shù)據(jù)結構使數(shù)據(jù)能通過與序列數(shù)據(jù)庫和/或知識庫有關的軟件應用得到有效的恢復、升級和整合。
[0365]C.方法:鑒定、分析或模擬
[0366]本發(fā)明還提供了鑒定、分析或模擬代表本發(fā)明基因序列的數(shù)據(jù)的方法。該方法包括:1)向提供機器代表基因序列的數(shù)據(jù)，所述機器具有硬件或軟件執(zhí)行的基因序列鑒定、模擬或分析程序，2)執(zhí)行該程序，授權其訪問所述基因序列數(shù)據(jù)，以及3)顯示或輸出鑒定、分析或模擬的結果。本文同樣提供了本發(fā)明的方法制備的并在計算機可讀的介質內具體化的數(shù)據(jù)結構。
[0367]本發(fā)明的另一方法包括提供由代表基因序列的數(shù)據(jù)所具體化的存儲器，和在所述存儲器內開發(fā)與數(shù)據(jù)相關的數(shù)據(jù)結構，以及反映所述數(shù)據(jù)的基本組織和結構以利于程序訪問對應于所述序列邏輯亞成的分數(shù)據(jù)元件。計算機編程有含指令的程序，該程序足以執(zhí)行鑒定、分析或模擬基因序列的方法，在計算機上執(zhí)行該程序，同時授權該程序訪問存儲器內的數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)結構 。輸出程序結果。
[0368]鑒定、分析和模擬程序是本領域公知的，可商業(yè)獲得。所述程序通常有至少一種應用，以便I)鑒定所述基因序列編碼或從其翻譯的基因的結構作用或酶功能，2)分析和鑒定基因序列內的聞級結構，或者3)在特定的環(huán)境下I旲擬本發(fā)明的基因序列的理化性質。
[0369]模擬/分析工具包括方法:1)識別與本發(fā)明的多核苷酸重疊的序列(例如從測序項目獲得)，建立稱為“COntig(重疊群)”的比對，2)鑒定本發(fā)明多核苷酸的限制酶位點，3)鑒定本發(fā)明多核苷酸的TI核糖核酸酶消化產物，4)鑒定具有最小自互補性的PCR引物，5)計算比對序列間的配對距離(pairwise distance),使用間隔法重新構建系統(tǒng)發(fā)育樹,并計算兩個蛋白編碼區(qū)的發(fā)散度(degree of divergence),6)鑒定諸如本發(fā)明多核苷酸的編碼區(qū)、終止子、重復和其他共有模式的模式，7)鑒定RNA 二級結構，8)鑒定本發(fā)明多肽的序列基序、等電點、二級結構、疏水性和抗原性，9)翻譯本發(fā)明的多核苷酸和回譯本發(fā)明的多肽，以及10)比較兩條蛋白或核酸序列，鑒定其相似性或異化性點。
[0370]基因序列功能/用途的鑒定通常通過與基因/蛋白數(shù)據(jù)庫的比較分析，建立作為已知功能/用途的基因/蛋白候選同源物(直系同源物或旁系同源物)的基因序列完成。
[0371]候選同源物在統(tǒng)計學上非常可能具有與其比較的參考序列相同的生物學功能(例如，催化同樣的反應、結合同源蛋白/核酸，具有類似的結構作用)。序列同一性/相似性通常用作鑒定候選同源物的標準，同樣，本發(fā)明的基因序列可用于鑒定動物或其他植物種類中的同源物，尤其是禾本科中的植物種類，例如但不限于，高粱、小麥或水稻。功能經常建立在序列同一性/相似性的基礎之上。示例性的序列比較系統(tǒng)在序列軟件中提供，例如Genetics Computer Group (Madison, WI)或 InforMax〈/RTI 所提供的那些軟件。[0372]本發(fā)明還提供了在疑似含有本發(fā)明多核苷酸的核酸樣品中檢測本發(fā)明的多核苷酸的方法，所述樣品例如是植物細胞裂解物、尤其是玉米裂解物。在某些實施方案中，本發(fā)明的基因或其部分可在使核酸樣品與接觸本發(fā)明的多核苷酸前擴增。使所述核酸樣品與多核苷酸接觸形成雜交復合物。所述多核苷酸在嚴緊條件下與編碼本發(fā)明多肽的基因雜交。雜交復合物的形成用于在核酸樣品中檢測編碼本發(fā)明多肽的基因。本領域技術人員應當了解，包含本發(fā)明多核苷酸的分離核酸缺乏與非靶基因共有的交叉雜交序列，該交叉雜交會產生假陽性結果。
[0373]雜交復合物的檢測可通過任何公知的方法完成。例如，核酸樣品或其部分雜交模式測定，所述雜交模式包括但不限于，溶液相、固相、混合相或原位雜交測定。簡而言之，在溶液(或液態(tài))相中，靶核酸和探針或引物都可在反應混合物中自由相互作用。在固相雜交測定中，探 針或引物通常與固相支持體連接，其中，探針或引物可用于與溶液中的靶核酸雜交。在混合相中，在溶液中的核酸中間產物與溶液中的靶核酸雜交，以及與連接于固相支持體連接的核酸雜交。在原位雜交中，靶核酸從其細胞環(huán)境中釋放出來，進而在保留細胞形態(tài)學的情況下雜交，用于隨后的說明和分析。下列文獻提供了關于各種雜交試驗模式的綜述:Singer，et al.，(1986)Biotechniques4 (3): 230-250; Haase, et al.，(1984)Methods inVirology7:189-226;Wilkinson, The theory and practice of in situ hybridizationin:1n situ Hybridization, Wilkinson, Ed., IRL Press,Oxford UniversityPress,Oxford;以及 Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach，Hames，andHiggins, Eds.，IRL Press (1987)。
[0374]核酸標記和檢測方法
[0375]標記本發(fā)明核酸的方法不是本發(fā)明的關鍵方面，并可用已知或后續(xù)開發(fā)的任何方法完成。適用于本發(fā)明的可檢測標記包括任何可通過分光鏡、放射性同位素、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學方法檢測的組合物。
[0376]在本發(fā)明中有用的標記包括用于標記的抗生物素蛋白結合物染色的生物素、磁珠、熒光染料(例如螢光素、得克薩斯紅、羅丹明、綠色熒光蛋白等)、放射性標記(例如3H、1251、35S、14C或32p)、酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和ELISA常用的其他酶)，以及比色標記，例如膠體金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等)珠。
[0377]本發(fā)明的核酸可用通常用于檢測雜交核酸存在的幾個方法中的任何方法標記。一種常用的檢測方法是使用標記有3H、1251、35S、14C或32p等探針的放射自顯影。放射性同位素的選擇依賴于由于所選擇同位素合成的容易度、穩(wěn)定性和半衰期導致的研究偏好。其他標記包括結合標記有熒光團、化學發(fā)光劑和酶的抗體的配體?；蛘?，探針可直接與標記例如熒光團、化學發(fā)光劑或酶綴合。標記的選擇依賴于所需的靈敏度、與探針綴合的容易程度、穩(wěn)定性需要和可用的儀器。通過例如使用標記的PCR引物可方便地標記本發(fā)明的核酸。
[0378]在某些實施方案中，所述標記在制備核酸的擴增步驟中同時并入。因此，例如，使用標記引物或標記核苷酸的聚合酶鏈式反應(PCR)可提供標記的擴增產物。在另一個實施方案中，使用標記的核苷酸(例如熒光素標記的UTP和/或CTP)的轉錄擴增將標記并入到轉錄的核酸中。
[0379]非放射性探針通常通過間接方法標記。例如，配體分子與探針共價結合。所述配基隨后與抗配體分子結合，該分子是固有可檢測的或與可檢測的信號系統(tǒng)共價結合，例如酶、熒光團或化學發(fā)光化合物。作為標記的目的酶主要是水解酶，例如磷酸酶、酯酶和糖苷酶或氧化還原酶、尤其是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹酰、傘形酮等?；瘜W發(fā)光物包括螢光素和2，3 二氫酞嗪二酮，例如魯米諾。
[0380]配體和抗配基可以是各種各樣的，如果配體具有天然抗配體，即諸如生物素、甲狀腺素和皮質醇的配體，其可會同其標記的天然抗配基使用。或者，任何半抗原或抗原化合物可與抗體組合使用。探針也可通過與標記直接綴合而得以標記，例如克隆的DNA探針已與辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶直接偶聯(lián)。
[0381]檢測所述標記的方法是本領域技術人員公知的。因此，例如放射性標記可使用照相膠片或閃爍計數(shù)器檢測，熒光標記可使用光電探測器檢測發(fā)光進行檢測。酶標記通常通過向所述酶提供底物，檢測酶與底物作用產生的反應產物進行檢測，比色標記通過簡單地使染色的標記可視化而檢測。
[0382]蛋白的抗體
[0383]可針對本發(fā)明的蛋白產生抗體，包括所述蛋白的天然形式(全長)或重組形式的個體、等位基因、品系或種類變體及片段。此外，還針對天然構型或非天然構型的蛋白產生抗體。本領域技術人員已知制備抗體的許多方法。多種分析方法可用于產生本發(fā)明蛋白的親水性曲線。所述方法可用于指導技術人員選擇本發(fā)明的肽，用于產生或選擇在免疫原性條件下對本發(fā)明蛋白具特異反應性的抗體。參見例如Janin，(1979)Nature277:491-492;ffolfenden, et al., (1981)Biochemistry20:849-855;KyteandDoolite, (1982)J.Mol Biol.157:105-132;Rose, et al., (1985)Science229:834_838。以下討論是現(xiàn)有技術的一般性綜述；然而本領域技術人員應當了解針對下述方法的許多改變是已知的。
[0384]許多免疫原可用于產生與本發(fā)明蛋白特異性反應的抗體。分離重組的、合成的或天然的本發(fā)明多核苷酸是產生單克隆或多克隆抗體的優(yōu)選抗原。在抗體形成前，用于篩選表達文庫或其他測定，其中本發(fā)明推定的蛋白以非天然二級、三級或四級結構的形式得以表達或變性，本發(fā)明的多肽任選地變性，任選地還原。[0385]隨后將本發(fā)明的蛋白注射到能產生抗體的動物中?？僧a生單克隆或多克隆抗體，隨后用于免疫測定中，測量本發(fā)明蛋白的存在和數(shù)量。產生多克隆抗體的方法是本領域技術人員已知的，簡而言之，用抗原，優(yōu)選純化的蛋白、與適當載體偶聯(lián)的蛋白(例如GST、琥珀?；€孔槭血蘭蛋白等)或并入免疫載體例如重組痘苗病毒中的蛋白(參見美國專利4，722，848號)，與佐劑混合，用所述混合物免疫動物。通過取試驗用血和測定對目的蛋白的反應性滴度監(jiān)測動物對該免疫原制劑的免疫反應。當獲得針對所述免疫原的高滴度抗體時，從動物收集血液并制備抗血清。需要時，進一步分級分離抗血清以富集對所述蛋白具有反應性的抗體(參見例如 Coligan, (1991)Current Protocols in Immunology (最新免疫學方法)，Wiley/Greene, NY;和 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (抗體:實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Press, NY (1989)).[0386]針對本發(fā)明蛋白預定片段的抗體，包括其結合片段和單鏈重組形式，通過例如使用上述片段與載體蛋白的綴合物免疫動物產生。通常，目的免疫原是至少約5個氨基酸的蛋白，更典型地，所述蛋白的長度為10個氨基酸，優(yōu)選為15個氨基酸，更優(yōu)選所述蛋白的長度為20個氨基酸或更長。所述肽通常與載體蛋白偶聯(lián)(例如作為融合蛋白)，或在免疫載體中重組表達。與抗體結合的肽上的抗原決定簇通常長3-10個氨基酸。
[0387]單克隆抗體從分泌所需抗體的雜種細胞制備。篩選單克隆抗體與衍生所述抗原蛋白的結合。特異性單克隆和多克隆抗體通常具有抗體結合位點，對于其同源單價抗原而言，該結合位點的親和常數(shù)至少為106-107，通常至少為108，優(yōu)選至少109，更優(yōu)選至少110，最優(yōu)選至少111升/摩爾。
[0388]在某些情況下，需要從不同哺乳動物宿主中制備單克隆抗體，例如小鼠、嚙齒類、靈長類、人類等。制備這些單克隆抗體的技術說明可參見例如Basic and ClinicalImmunology (基礎和臨床免疫學)，4th ed (第 4 版)，Stites, et al., Eds., LangeMedical Publications, Los Altos, CA 和其中引用的參考文獻；Harlow and Lane,同上；Goding, Monoclonal Antibodies !Principles and Practice (單克隆抗體:原理和實踐)，2nd ed (第 2 版)，Academic Press, New York, NY (1986);和 Kohler andMilstein, (1975)Nature256:495-497。簡而言之，該方法通過向動物注射包含本發(fā)明蛋白的抗原進行。隨后處死動物，從其脾臟取細胞，該細胞與骨髓瘤細胞融合。產生能在體內復制的雜種細胞或“雜交瘤”。
[0389]隨后篩選雜交瘤群以分離個體克隆，每個個體克隆分泌針對抗原的單個抗體分子。由此獲得的個體抗體分子是響應抗原物質上所識別的特異位點而產生的來自免疫動物永生和克隆的單個B細胞的產物。
[0390]其他適當?shù)募夹g包括在噬菌體或類似載體中選擇重組抗體文庫(參見例如Huse,et al., (1989)Science246:1275-1281;和 Ward, et al., (1989)Nature341:544-546和 Vaughan, et al., (1996) Nature Biotechnologyl4:309-314)?；蛘?，高親和力的人單克隆抗體可從包含未重排人重鏈和輕鏈Ig位點片段的轉基因小鼠(即微小基因座轉基因小鼠)獲得。Fishwild, et al., (1996)Nature Biotech.14:845-851。同樣，也可產生重組免疫球蛋白。參見 Cabilly 的美國專利 4，816，567 號和 Queen, et al., (1989)Proc.NatlAcad.Sc1.86:10029-10033。
[0391] 本發(fā)明的抗體也可用于親和層析以分離本發(fā)明的蛋白。使用連接于固相支持體的抗體制備柱，所述固相支持體例如諸如瓊脂糖、SEPHADEX等的顆粒，其中使細胞裂解液通過柱，洗滌并用遞增濃度的溫和變性劑處理，由此釋放純化的蛋白。
[0392]所述抗體可用于篩選特定表達產物的表達庫，例如正?；虍惓５牡鞍住Ｍǔ４朔N情況下的抗體標記有允許方便地通過抗體結合檢測抗原存在的部分(moiety)。針對本發(fā)明的蛋白而產生抗體也可用于產生抗獨特型抗體。這可用于檢測或診斷與各自抗原存在有關的不同病理狀態(tài)。
[0393]本發(fā)明的蛋白和抗體經常通過共價或非共價的連接提供可檢測信號的物質而標記。多種標記和綴合技術是已知的，并在科學和專利文獻中有廣泛報道。適當?shù)臉擞洶ǚ派湫院塑账帷⒚?、底物、輔因子、抑制劑、突光部分(fluorescent moiety)、化學發(fā)光部分(chemiluminescent moiety)、磁性顆粒等。
[0394]在其他方法中，可通過視覺觀察選擇與野生型植物相比顯示乙烯依賴性表型發(fā)生改變的植物。例如，可利用“三重反應”檢測乙烯依賴表型的改變?！叭胤磻庇杀┞队谝蚁┑暮诎瞪L苗的三種不同的形態(tài)學變化組成:抑制下胚軸和根延長、莖向膨脹和頂鉤擴大。因此，乙烯抑制劑存在下所顯示的三重應答顯示了一種發(fā)生改變的乙烯依賴性表型。乙烯廣泛影響農業(yè)上重要的植物過程，包括果實成熟、花和葉衰老以及葉離現(xiàn)象。控制植物對乙烯的敏感性的能力因此能顯著改善許多作物的質量和壽命。本發(fā)明包括通過本發(fā)明方法產生的植物，以及植物組織和種子。
[0395]盡管通過舉例詳細描述了本發(fā)明，并為清楚理解的目的詳細描述了實施例，但顯然可以在所附權利要求范圍內進行某些改變和修飾。
[0396]實施例1
[0397]本實施例描述了cDNA 文庫的構建。SEQ ID NO:1 (EIN3)、SEQ ID NO: 3 (EBFl),SEQ ID N0:5(EBF2)、SEQ ID NO: 7 (EIN5)或 SEQ ID N0:9(ERF3)的總 RNA 從玉米基因型HiII 獲得(Armstrong and Phillips, (1988) Crop Sc1.28:363-369);對于 ZmEIN3_2 (SEQID NO:1),從夜晚收集的玉米基因型B75的V8-V10階段葉組織獲得。所述總RNA用TRIzoI試劑從玉米組織中分離(Life Technology Inc.Gaithersburg, MD),使用 Chomczynski 和Sacchi描述的經修飾的異硫氰酸胍/酸-酹方法(Chomczynski and Sacchi, (1987) Anal.Biochem.162:156)。簡而言之，植物組織樣品在液氮中霧化，隨后加入TRIzol試劑，接著用研缽和研杵進一步均質化。 加入氯仿，離心，用于分離水相和有機相。通過用異丙醇沉淀從水相中獲得的總RNA。
[0398]Polv(A) +RNA 分離
[0399]使用PolyATact 系統(tǒng)(Promega Corporation.Madison, WI),從總 RNA 中選擇Ml(A)+RNA。簡而言之，使用生物素化的寡(dT)引物與mRNA的3’poly(A)尾雜交。使用與順磁性顆粒和磁性分離鏈偶聯(lián)的抗生物素蛋白俘獲該雜交物。在高嚴緊條件下洗滌mRNA,并用無RNA酶的去離子水稀釋。進行cDNA Library Construction cDNA合成,并使用 SuperScript Plasmid 系統(tǒng)(Life Technology Inc.Gaithersburg, MD)構建單向 cDNA文庫。cDNA的第一鏈通過引發(fā)含有Not I位點的寡(dT)引物合成。
[0400]反應由SuperScript 逆轉錄酶 II (SuperScript Reverse Transcriptase II)在45°C下催化。cDNA的第二鏈用a -32P_dCTP標記，一部分反應用瓊脂糖凝膠電泳分析確定cDNA大小。通過Sephacryl_S400層析,除去小于500個堿基對的cDNA分子和未連接的接頭。將選定的cDNA分子連接到pSPORTI載體的Not I和Sal I位點間。
[0401]實施例2
[0402]該實施例描述了 cDNA測序和文庫消減。測序模板的制備:挑取個體菌落，使用M13正向引物和M13反向引物通過PCR制備或通過質粒分離制備DNA。所有的cDNA克隆均使用M13反向引物測序。
[0403]Q-bot消減法:將經歷消減的cDNA文庫以約每板3000菌落的密度平鋪于22X22cm2瓊脂板上。將所述平板在37°C恒溫箱中孵育12-24小時。用自動菌落采集器Q-bot (GENETIX Limited)挑取菌落置于384孔板中。這些平板在37°C孵育過夜。
[0404]一旦挑取了足夠的菌落，使用Q-bot將其用針拴于22X22cm2尼龍膜上。每張膜含有9，216或36，864個菌落。這些膜置于含合適抗生素的瓊脂平板上。將平板在37°C孵育過夜。
[0405]第二天收集菌落后，將這些濾器在用變性溶液預濕的濾紙上放置4分鐘，隨后在沸水浴上方再放置4分鐘。將隨后濾器在用中和溶液預濕的濾紙上放置4分鐘。通過將濾器放置在干燥濾紙上I分鐘，除去過量溶液后，將濾器的菌落側置于蛋白酶K溶液中，在3rc孵育40-50分鐘。將濾器置于干燥濾紙上，干燥過夜。隨后通過紫外光處理將DNA與尼龍膜交聯(lián)。
[0406]菌落雜交按照Sambrook 等所述進行(Molecular Cloning:A laboratoryManual (分子克隆:實驗室手冊)，2nd Edition (第二版))。菌落雜交使用以下探針:
[0407]1.與文庫一樣來自相同組織的第一鏈cDNA，以除去最冗余的克隆。
[0408]2.基于之前的測序數(shù)據(jù)，來自相同文庫的48-192最冗余的cDNA克隆。
[0409]3.整個玉米序列數(shù)據(jù)庫中的192個最冗余的cDNA克隆。
[0410]4.ASal-A20 寡核苷酸:TCG ACC CAC GCG TCC GAA AAA AAA AAA AAA AAA AAAJI^去含有poly A尾但無cDNA的克隆。
[0411]5.衍生自rRNA的cDNA克隆。
[0412]將放射自顯影的圖像掃描進計算機，分析信號強度和每一菌落的冷菌落地址。使用Q-bot將冷菌落從384孔板中重排至96孔板中。
[0413]實施例3 [0414]本實施例描述了根據(jù)計算機同源性搜索的基因鑒定。進行BLAST確定基因同一性(Basic Local Alignment Search Tool;Altschul, et al., (1993)J.Mol.Biol.215:403-410;同樣參見 National Center for BiotechnologyInformation, National Library of Medicine, Building38A, Bethesda, Maryland, USA),以缺省參數(shù)搜索BLAST"nr”數(shù)據(jù)庫中序列的相似性(包含所有的非冗余GenBank⑶S翻譯，衍生自3維結構布克海文蛋白數(shù)據(jù)庫(Brookhaven Protein Data Bank)的序列、SWISS-PROT蛋白序列數(shù)據(jù)庫、EMBL和DDBJ的最新版本)。使用BLASTN算法，分析所述cDNA序列與“nr”數(shù)據(jù)庫中所有公眾可獲得的DNA序列的相似性。
[0415]在所有的閱讀框內翻譯DNA序列，使用BLASTX算法分析與NCBI提供的“nr”數(shù)據(jù)庫中所有公眾可獲得的蛋白序列的相似性(Gish and States, (1993) J.NatureGenetics3:266-272)。在某些情況下，用來自兩個或多個含有重疊DNA片段的克隆的測序數(shù)據(jù)構建連續(xù)的DNA序列。
[0416]實施例4
[0417]載體構建和ZM-ERF3在玉米中的超表達
[0418]PHP21751-UB1:ZM-ERF3
[0419]PCR擴增 ZM-ERF3 的編碼區(qū)，克隆至 pCR2.1T0P0 載體內(Invitrogen)。對 ZM-ERF3進行序列驗證，并連接到含有玉米UBI啟動子和PINII終止子的載體中。該基因盒隨后連接產生UBIPRO:ZM-ERF3:PINII TERM+35S:BAR:PINII。使用 35S:BAR作為除草劑抗性標記。通過限制性消化作圖檢查表達載體質量，并通過電穿孔轉移到根瘤農桿菌LB4404JT中。用該農桿菌株轉化GS3近交玉米。對TO事件進行分子分析，單拷貝的轉基因表達事件用于進一步試驗。
[0420]PHP25534-RAB17:ZM-ERF3
[0421]PCR擴增ZM-ERF3的編碼序列，將其克隆到pCR2.1T0P0載體中(Invitrogen)。對ZM-ERF3進行序列驗證，并連接到含有玉米RAB17啟動子和GZ-W64A終止子以及Gateway (Invitrogen)ATT位點的載體中。在單個位點Gateway (Invitrogen)反應中，使用入門載體(entry vector)和目的載體產生 RAB17:ZM_EFR3:GZ_W64A+UB1:M0PAT:PINII+LTP2:DS-RED:PINI10分別使用UB1:MOPAT和LTP2:RFP作為除草劑抗性和可視標記。通過限制性消化作圖檢查表達載體質量，并通過電穿孔轉移到根瘤農桿菌LB4404JT中。用該農桿菌株轉化GS3近交玉米。對TO事件進行分子分析，單拷貝的轉基因表達事件用于進一步試驗。進一步的試驗包括自花傳受粉或用親本基因型傳粉并選擇轉基因子代。例如，Tl子代包括2倍的親本基因型，可稱為D2。高級株系可與測試基因型雜交，用于現(xiàn)場鑒定。
[0422]在谷物填充階段(即，Howa Corn Plant Develops, 1wa State Universityof Science and Technology Cooperative Extension Service Special ReportN0.48，Reprinted Junel993中描述的R2到R5階段)，將代表10個PHP25534事件的雜種材料種植于經受了干旱應激的重復試驗田中，10個事件中有4個與對照相比顯示出在干旱應激下產量具有統(tǒng)計學上顯著的改善。四個事件之一還在幼苗干旱耐性測定和低溫應激下幼苗早期生長測定中顯示出統(tǒng)計學上顯著改善的性能。
[0423]PHP25536-RYE CBF31PR0:ZM-ERF3
[0424]PCR擴增ZM-ERF3的編碼序列，將其克隆到pCR2.1T0P0載體中(Invitrogen)。對ZM-ERF3進行序列驗證，并與RYE CBF31啟動子(2008年10月23日提交的美國專利申請序號12/256，568) 一起連接到含有玉米GZ-W64A終止子以及Gateway(Invitrogen)ATT位點的載體中。在單個位點Gateway (Invitrogen)反應中，使用入門載體和目的載體產生RABl7: ZM-EFR3:GZ-W64A+UB1:MOPAT:PINII+LTP2:DS-RED:PINII。使用 UB1:MOPAT 和 LTP2: RFP分別作為除草劑抗性和可視標記。通過限制性消化作圖檢查表達載體質量，并通過電穿孔轉移到根瘤農桿菌LB4404JT中。用該農桿菌株轉化GS3近交玉米。對TO事件進行分子分析，單拷貝的轉基因表達事件用于進一步試驗。進一步的試驗包括自花傳粉或用親本基因型傳粉并選擇轉基因子代。例如Tl子代包括2倍的親本基因型，并可稱為D2。高級株系可與測試基因型雜交，用于現(xiàn)場鑒定。 [0425]在谷物填充階段，將代表9個PHP25536事件的雜交材料種植于經受了干旱應激的重復試驗田中，9個事件中有3個與對照相比顯示出在干旱應激下產量具有統(tǒng)計學上顯著的改善。該3個事件中的2個，以及另外2個事件還顯示在低溫應激下幼苗早期生長測定中顯示出統(tǒng)計學上顯著改善的性能。
[0426]PHP25537-RYE CBF31PR0:ZM-ERF3+RYE CBF31PR0:ZM-CBF2
[0427]PCR擴增ZM-ERF3的編碼序列，并將其克隆到pCR2.1T0P0載體中(Invitrogen)。對ZM-ERF3進行序列驗證，并與RYE CBF31啟動子一起連接到含有玉米GZ-W64A終止子以及Gateway (Invitrogen) ATT位點的載體中。在多位點Gateway(Invitrogen)反應中，使用入門載體和 RYE CBF31PR0:ZM-CBF2 入門載體產生 RYE CBF31PR0: ZM-EFR3: GZ-W64A+RYE CBF31:ZM-CBF2:PINII+UB1:MOPAT:PINI10使用UB1:MOPAT作為除草劑抗性標記。通過限制性消化作圖檢查表達載體質量，并通過電穿孔轉移到根瘤農桿菌LB4404JT中。用該農桿菌株轉化GS3近交玉米。對TO事件進行分子分析，單拷貝的轉基因表達事件用于進一步試驗。
[0428]PHP25538-RYE CBF31PR0:ZM-ERF3+RYE CBF31PR0:RYECBF3I
[0429]PCR擴增ZM-ERF3的編碼序列，并將其克隆到pCR2.1T0P0載體中(Invitrogen)。對ZM-ERF3進行序列驗證，并與RYE CBF31啟動子一起連接到含有玉米GZ-W64A終止子以及Gateway (Invitrogen) ATT位點的載體中。在多位點Gateway(Invitrogen)反應中，使用入門載體和 RYE CBF31PR0:ZM-CBF2 入門載體產生 RYE CBF31PR0:ZM-EFR3:GZ-W64A+RYE CBF31:RYE:CBF31:GZ-W64A+UB1:M0PAT:PINII。使用 UB1:MOPAT 作為除草劑抗性標記。通過限制性消化作圖檢查表達載體質量，并通過電穿孔轉移到根瘤農桿菌LB4404JT中。用該農桿菌株轉化GS3近交玉米。對TO事件進行分子分析，單拷貝的轉基因表達事件用于進一步試驗。
[0430]PHP26620-RD29A PRO:ZM-ERF3+RD29A: RYE CBF31
[0431]PCR擴增ZM-ERF3的編碼序列，并將其克隆到pCR2.1T0P0載體中(Invitrogen)。對ZM-ERF3進行序列驗證，與RD29A啟動子一起連接到含有PINII終止子以及Gateway (Invitrogen) ATT位點的載體中。在多位點Gateway(Invitrogen)反應中，使用入門載體和 RD29A PR0:RYE CBF31 入門載體產生 RD29A PRO: ZM-EFR3:PINII+RD29A: RYE: CBF31:GZ-W64A+UB1:MOPAT:PINI10使用UB1:Μ0ΡΑΤ作為除草劑抗性標記。通過限制性消化作圖檢查表達載體質量，并通過電穿孔轉移到根瘤農桿菌LB4404JT中。用該農桿菌株轉化ER)9B近交玉米。對TO事件進行分子分析，單拷貝的轉基因表達事件用于進一步試驗。在花期和谷物填充期，在單獨的干旱應激條件下的2個事件之一中觀察到統(tǒng)計學上顯著的產量改善。
[0432]實施例5
[0433]載體構建和ZM-EIN3在玉米中基因沉默
[0434]UB1:EIN3:PINII RNAi
[0435]PCR擴增兩條約500個堿基對(有義和反義)的ZM-EIN3基因截短的片段，并將其克隆到Invit rogen TOPO載體中。對ZM-EIN3有義和反義截短的片段進行序列驗證，并與ADHl內含子環(huán)序列一起連接到含有玉米UBI啟動子和PINII終止子以及Gateway (Invitrogen) ATT位點的載體中。在單個位點Gateway(Invitrogen)反應中，使用入門載體和目的載體產生 UB1: ZM-EIN3: PINII RNAi+UB1:MOPAT: PINII+LTP2: DS-RED: PINI
I。使用UB1:Μ0ΡΑΤ和LTP2:RFP分別作為除草劑抗性和可視標記。通過限制性消化作圖檢查表達載體質量，并通過電穿孔轉移到根瘤農桿菌LB4404JT中。用該農桿菌株轉化EF09B近交玉米。對TO事件進行分子分析，單拷貝的轉基因表達事件用于進一步試驗。
[0436]實施例6
[0437]序列分離和內源性表達
[0438]序列分離
[0439]使用RNAi策略，將乙烯信號基因EIN3和EIN5用于下調構建體中。制備兩個EIN3RNAi構建體和一個EIN5RNAi構建體。在EIN3的情況下，使用來自cfp7n.pkOl0.h4(PC0642867)的全長插入序列產生在編碼序列5’端具有約500bp截短的片段的兩個RNAi構建體。兩個構建體之一在RNAi片段中包括起始ATG，而第二個避免了使用起始ATG，并且在其后立即開始。EIN5RNAi構建體使用編碼序列5’端約500bp截短片段在第一 ATG后立即開始制備。EIN5RNAi構建體的片段由cfp5n.pk005.cl7.f: fis (PC0637491)擴增。
[0440]表達信肩、:
[0441 ] 玉米乙烯基因ERF3、EIN3、EIN5、EBFl和EBF2在植物中所有的組織內表達(表2)。已發(fā)現(xiàn)ZmERF3的內源性表達在脈管束內最高，顯示628ppm的MPSS表達水平(Solexa, Hayward, CA;Brenner, et al., (2000)Nature Biotechnology 18:630-634),而該基因實際上在所有玉米組織中表達(圖1)。觀察到的ZmEIN3、ZmEIN5、ZmEBFl和ZmEBF2最高表達水平分別為1603ppm(節(jié)間)、168ppm(穗分生組織)、560ppm(根)和902ppm根)。
[0442] 在此考慮的基因在應激或激素存在下也顯示出差異表達，如表2所示。ZmERF3在大多數(shù)組織中觀察到由干旱誘導，盡管某個實驗表明在干旱下葉和根中基因下調。同樣觀察到其由冷應激下調。如為確定冷誘導的玉米幼苗葉中基因表達時間過程而進行的微陣列試驗所顯示的，該基因的表達似乎與應激暴露時間密切相關，該基因的表達在暴露于冷應激后0.5小時的早期時間點達到最高，此后到應激暴露24小時下降到正常未誘導水平(圖2)。
[0443]ZmEIN3在氣生組織中被干旱應激誘導，較小程度被冷應激誘導，而其似乎在根中被干旱下調。它還在暴露于ABA較早時間(24h)時顯示出響應ABA處理的較高表達。與此相反，ZmEIN5表達在大多數(shù)氣生組織中被干旱下調，在根中上調。用ABA和乙烯處理后，其顯示表達增強。
[0444]植物中ZmEBFl和ZmEBF2表達的調節(jié)或多或少相類似。其均在氣生組織中被干旱上調，在根中被下調。此外，ZmEBFl被冷應激誘導，而ZmEBF2被ABA和乙烯處理誘導。
[0445]UB1::Zm ERF3轉某閔玉米中下游某閔表汰
[0446]ZmERF3在玉米中的組成型超表達導致了多效性效應，其中植物的莖生長時彎曲。所述植物還顯示“buggy-whipping”, 一種在抽穗前的生長階段新生葉緊密卷曲和彎曲的現(xiàn)象。然而，當其向生殖階段生長時，它們從該表型恢復。鑒于該基因在脈管束內源性表達最高，該組成型超表達可能不利于影響莖中脈管的形成，這引起生長時莖的彎曲。我們分析了兩個由UBI啟動子組成型表達ZmERF3的轉基因玉米事件，即E3和E18，以鑒定下游基因表達的變化。事件E18顯示顯著的多效性效應，而事件E3未顯示此類效應。通過RNA印跡驗證，事件E18中的轉基因表達相對于內源性水平高很多。由于ZmERF3是轉錄因子，該基因的組成型超表達將導致表達在轉錄水平受ZmERF3調節(jié)的基因的上調或下調。2個事件中上調和下調基因間有顯著的重疊，E18中有比E3更多的基因發(fā)生變化(圖3)。表3中列出了在2個事件中通常上調或下調的已知功能性的基因。下游基因表達的分析表明，應激和/或乙烯相關的基因在上調和下調類別中均存在。為克服UB1::ZmERF3的多效性效應，將構建體設計為由應激調節(jié)的啟動子表達基因。由于在UB1:: ZmERF3轉基因中，若干應激相關的基因被下調，還制備一 RNAi構建體，以評價該轉錄因子在轉基因應激耐性中的效果。
[0447]表2.MPSS庫中所表示的4個乙烯信號基因的內源性表達。
[0448]
【權利要求】
1.分離的核酸，包括選自以下的成員: (a)與編碼選自SEQID N0S:8、6或4的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，所述同一性通過BLAST2.0算法以缺省參數(shù)測定； (b)編碼選自SEQID NOS:8、6或4的多肽的多核苷酸； (c)使用在嚴緊雜交條件下與選自SEQID N0S:7、5和3的多核苷酸內位點選擇性雜交的引物，由玉米(Zea mays)核酸文庫擴增的多核苷酸； (d)在嚴緊雜交條件下并于50°C在2XSSC中洗滌，與選自SEQID N0S:7、5和3的多核苷酸選擇性雜交的多核苷酸； (e)選自SEQID N0S:7、5和3的多核苷酸； (f)與(a)、( b)、(c)，(d)或(e)的多核苷酸互補的多核苷酸；以及 (g)包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸中至少25個連續(xù)核苷酸的多核苷酸。
2.重組表達盒，包含在有義或反義方向可操作地連接于啟動子的權利要求1所述的成員。
3.調節(jié)植物中乙烯反應的方法，包括: (a)將包含可操作地連接于啟動子的多核苷酸的重組構建體引入植物細胞，其中所述多核苷酸與SEQ ID N0S:7、5、3或I的多核苷酸或其互補多核苷酸具有至少90%序列同一性，所述同一性通過BLAST2.0算法以缺省參數(shù)測定； (b)在植物細胞生長條件下培養(yǎng)所述植物細胞；以及 (c)誘導所述多核苷酸表達足以調節(jié)所述植物中EIN5、EBF2、EBF1或EIN3的水平的時間。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述植物是選自玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥和谷子。
5.如權利要求3所述的方法，其中所述植物是單子葉植物。
6.調節(jié)植物中乙烯反應的方法，包括: (a)將包含可操作地連接于啟動子的編碼EIN5、EBF2、EBF1或EIN3蛋白的多核苷酸的核苷酸構建體引入植物細胞； (b)在植物細胞生長條件下培養(yǎng)所述植物細胞；以及 (c)由所述植物細胞再生植物；其中所述植物的乙烯敏感性受到調節(jié)。
7.如權利要求6所述的方法，其中所述植物選自:玉米、大豆、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、谷子、花生和可可。
8.如權利要求6所述的方法，其中所述植物細胞來自單子葉植物。
9.如權利要求6所述的方法，其中所述乙烯敏感性下降。
10.如權利要求6所述的方法，其中所述構建體是抑制構建體。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述抑制構建體抑制EIN3或EIN5活性。
12.如權利要求6所述的方法，其中所述構建體是超表達構建體。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述超表達構建體增加了EBFl或EBF2的活性。
14.如權利要 求6所述的方法，其中所述構建體包含選自SEQID N0:l、3、5或7的序列。
15.分離的蛋白，其包含選自以下的成員: (a)來自選自SEQID N0S:8、6和4的多肽的至少20個連續(xù)氨基酸的多肽； (b)選自SEQID NOS:8、6和4的多肽； (c)與選自SEQID NOS:8、6和4的多肽具有至少80%序列同一性的多肽，其中所述序列同一性使用BLAST2.0以缺省參數(shù)下測定；以及 (d)由權利要求1的成員編碼的至少一種多肽。
【文檔編號】C12N15/29GK103952415SQ201410147980
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2008年11月20日 優(yōu)先權日:2007年11月20日
【發(fā)明者】索巴·希瓦薩恩卡爾, 卡爾利·雷曼 申請人:先鋒國際良種公司