檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力的引物、試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力（檢測(cè)Thy1基因甲基化程度）的引物對(duì)，如SEQ?ID?NO.6～SEQIDNO.9所示，該引物對(duì)擴(kuò)增的核苷酸序列為Thy1基因的一段，如SEQ?ID?NO.16所示。本發(fā)明還公開(kāi)了一種用于檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力的試劑盒，包括SEQ?ID?NO.6～SEQIDNO.9所示的引物，以及PCR擴(kuò)增反應(yīng)所需要的常規(guī)試劑。本發(fā)明還公開(kāi)了檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力的方法。本發(fā)明明確了Thy1基因的甲基化區(qū)域，并證明了根據(jù)Thy1基因甲基化程度可用來(lái)確定任一時(shí)期核移植胚胎所處的發(fā)育階段和發(fā)育能力。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力的引物、試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力(Thyl基因的甲基化程度)的引物、試劑盒及方法，屬于早期胚胎發(fā)育領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近些年來(lái)，體細(xì)胞核移植技術(shù)得到迅猛發(fā)展和廣泛應(yīng)用，使良種動(dòng)物的生產(chǎn)從基礎(chǔ)研究邁進(jìn)產(chǎn)業(yè)化，而產(chǎn)業(yè)化成功的關(guān)鍵就在于體細(xì)胞核移植胚胎的發(fā)育。目前，體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育水平比較低，制約著體細(xì)胞核移植胚胎的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，研究表明，這主要與體細(xì)胞核移植胚胎的重編程程度相關(guān)，其中組織特異性基因的持續(xù)表達(dá)是核移植胚胎發(fā)育失敗的重要原因，而目前對(duì)核移植胚胎中組織特異性基因的甲基化沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，因此，明確組織特異性基因在體細(xì)胞核移植胚胎中甲基化模式，進(jìn)而指導(dǎo)克隆胚胎的產(chǎn)業(yè)化是十分重要的。
[0003]現(xiàn)已證明，體細(xì)胞核移植胚胎重編程不完全導(dǎo)致組織特異性基因持續(xù)表達(dá)，其中Thyl基因是成纖維細(xì)胞的標(biāo)記基因，在核移植胚胎中的沉默程度決定了胚胎的發(fā)育能力，因此檢測(cè)Thyl基因在核移植胚胎中的甲基化程度可預(yù)測(cè)克隆胚胎的發(fā)育潛能。目前，對(duì)于基因甲基化區(qū)域的測(cè)定通常是采用預(yù)測(cè)法，直接將預(yù)測(cè)的區(qū)域作為該基因甲基化區(qū)域。然而研究表明，采用預(yù)測(cè)法獲得的甲基化區(qū)域并不一定能代表該基因的甲基化水平，而且對(duì)于一些基因，并不能預(yù)測(cè)到甲基化區(qū)域，這就需要對(duì)Thyl基因的整個(gè)甲基化區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)一步明確Thyl基因甲基化區(qū)域，Thyl基因甲基化區(qū)域的明確將在體細(xì)胞核移植胚胎的生產(chǎn)和科學(xué)研究領(lǐng)域中具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是明確組織特異性基因Thyl甲基化區(qū)域，檢測(cè)該區(qū)域在核移植胚胎中的甲基化程度，用以確定核移植胚胎的發(fā)育階段及發(fā)育能力。本發(fā)明還根據(jù)該甲基化區(qū)域，提供了用于檢測(cè)的引物、試劑盒及方法。
[0005]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0006]檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力(檢測(cè)Thyl基因甲基化程度)的引物對(duì)，如SEQ IDN0.6~SEQ ID N0.9所示；該引物對(duì)可以擴(kuò)增Thyl基因的一段甲基化區(qū)域，該段的序列如SEQ ID N0.16 所示。
[0007]上述引物對(duì)，可以用于制備檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力(檢測(cè)Thyl基因甲基化程度)的試劑盒。
[0008]一種用于檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力的試劑盒(擴(kuò)增并檢測(cè)SEQ ID N0.16所示序列的試劑盒)，包括SEQ ID N0.6~SEQ ID N0.9所示的引物，以及PCR擴(kuò)增反應(yīng)所需要的常規(guī)試劑。比如:20 μ L 擴(kuò)增體系=1XPCR Buffer (Mg2+Plus) 2 μ L, dNTP Mixture (各
2.5mM) 1.6μ L，上游和下游引物(SEQ ID N0.6 ~SEQ ID N0.9 所示)各 0.4 μ L (lOymol/L)，模板 5 μ L, Taq HS (5U/y L) 0.1 μ L，ddH2012.5 μ L。[0009]上述試劑盒可以用于檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力(檢測(cè)Thyl基因的甲基化程度)，具體應(yīng)用時(shí)，步驟如下:
[0010]I) Proteinase K 消化待測(cè)樣品；
[0011]2)待測(cè)樣品的亞硫酸氫鹽處理；
[0012]3)以步驟2)處理后的基因組DNA為模板，利用前述擴(kuò)增引物對(duì)(SEQ ID N0.6~SEQ ID N0.9所示)，進(jìn)行熱啟動(dòng)PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0013]4)對(duì)步驟3)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)CpG位點(diǎn)的甲基化程度；根據(jù)CpG位點(diǎn)的甲基化程度評(píng)價(jià)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力:甲基化程度為32%以下(不包括32%)時(shí)，體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育到囊胚的能力為32%以下；甲基化程度為32%~55%時(shí)，體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育到囊胚的能力為32%~55% ;甲基化程度為55%以上(不包括55%)時(shí)，體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育到囊胚的能力為55%以上。
[0014]進(jìn)一步地，檢測(cè)某一階段胚胎時(shí)，若甲基化 程度為24.03~30.03%，則該胚胎發(fā)育到囊胚的概率為19.91% (接近實(shí)際比率21.37%)。更近一步地，檢測(cè)核移植后36小時(shí)胚胎的甲基化程度，若為24.03~30.03%，則該胚胎發(fā)育到囊胚的概率為19.91%。
[0015]本發(fā)明的檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力的方法，可根據(jù)核移植胚胎各個(gè)發(fā)育階段的檢測(cè)結(jié)果，評(píng)價(jià)任一時(shí)期克隆胚胎發(fā)育階段和發(fā)育能力。
[0016]本發(fā)明還提供了前述明確的Thyl基因甲基化區(qū)域在體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育過(guò)程中的應(yīng)用，根據(jù)核移植后36小時(shí)胚胎的甲基化檢測(cè)結(jié)果(27.33%)，預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育階段主要是2-4細(xì)胞(2細(xì)胞、4細(xì)胞和8細(xì)胞所占比例分別為44.34%,25.74%和4.26%)，胚胎發(fā)育到囊胚的概率為19.91% (接近實(shí)際比率21.37%)。
[0017]本發(fā)明的研發(fā)思路為:首先，選取了 Thyl基因中的一段核苷酸序列作為甲基化區(qū)域(整個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域)，該甲基化區(qū)域的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。具體而言，選取的是豬Thyl基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1500bp下游300bp內(nèi)富含CpG 二核苷酸的序列，將其CG替換為YG，再將其余C堿基全部替換為T堿基。然后，將該區(qū)域分為了三段(以期尋找具有代表THYI基因甲基化的區(qū)段)，并針對(duì)每一段設(shè)計(jì)了特異性擴(kuò)增引物對(duì)，引物對(duì)如SEQ ID N0.2~SEQ ID N0.13所示。具體而言，如下:
[0018]擴(kuò)增遠(yuǎn)端的擴(kuò)增引物對(duì)的上游內(nèi)外引物核苷酸序列如SEQ ID N0.2和N0.3所示，下游內(nèi)外引物核苷酸序列如SEQ ID N0.4和N0.5所示；
[0019]擴(kuò)增中端的擴(kuò)增引物對(duì)的上游內(nèi)外引物核苷酸序列如SEQ ID N0.6和N0.7所示，下游內(nèi)外引物核苷酸序列如SEQ ID N0.8和N0.9所示；
[0020]擴(kuò)增近端的擴(kuò)增引物對(duì)的上游內(nèi)外引物核苷酸序列如SEQ ID N0.10和N0.11所示，下游內(nèi)外引物核苷酸序列如SEQ ID N0.12和N0.13所示。
[0021]上述各引物在SEQ ID N0.1所示序列中所對(duì)應(yīng)的位置如下:
[0022]SEQ ID N0.2:位于SEQ ID N0.1所示的序列中的204位至222位；
[0023]SEQ ID N0.3:位于SEQ ID N0.1所示的序列中的137位至161位；
[0024]SEQ ID N0.4:位于SEQ ID N0.1所示的序列中的383位至405位；
[0025]SEQ ID N0.5:位于SEQ ID N0.1所示的序列中的434位至457位；
[0026]SEQ ID N0.6:位于SEQ ID N0.1所示的序列中的536位至556位；
[0027]SEQ ID N0.7:位于SEQ ID N0.1所示的序列中的465位至486位；[0028]SEQ ID N0.8:位于SEQ ID N0.1所示的序列中的908位至930位；
[0029]SEQ ID N0.9:位于SEQ ID N0.1所示的序列中的935位至961位；
[0030]SEQ ID N0.10:位于SEQ ID N0.1所示的序列中的1409位至1429位；
[0031]SEQ ID N0.11:位于SEQ ID N0.1所示的序列中的1322位至1341位；
[0032]SEQ ID N0.12:位于SEQ ID N0.1所示的序列中的1620位至1640位；
[0033]SEQ ID N0.13:位于SEQ ID N0.1所示的序列中的1631位至1651位。
[0034]然后利用上述擴(kuò)增引物對(duì)檢測(cè)克隆胚胎1、2、4、8細(xì)胞及囊胚中的甲基化情況，步驟如下:
[0035]I) Proteinase K 消化待測(cè)樣品；
[0036]2)待測(cè)樣品的亞硫酸氫鹽處理；
[0037]3)以步驟2)處理后的基因組DNA為模板，利用前述擴(kuò)增引物對(duì)(SEQ ID N0.2~SEQ ID N0.13所示)，進(jìn)行熱啟動(dòng)PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0038]4)對(duì)步驟3)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)CpG位點(diǎn)的甲基化程度，結(jié)果為:甲基化主要集中在SEQ ID N0.1所示序列的中端,該段序列如SEQ ID N0.16所示，即:該段最能代表THYl基因的甲基化情況。具體結(jié)果如下: [0039]克隆胚胎1、2、4、8細(xì)胞及囊胚中的甲基化情況為18.33%,23.33%,36.67%,60.83%和65.00%，可見(jiàn)，甲基化程度逐步提高；而克隆胚胎(1、2、4、8細(xì)胞及囊胚)發(fā)育到囊胚的能力也是逐步提高的(21.37%,31.38%,39.47%,65.54%和100%)，因此，可以明確，本發(fā)明選定的Thyl基因甲基化區(qū)域隨著克隆胚胎發(fā)育能力的增強(qiáng)，甲基化程度逐步升高。
[0040]另外，本發(fā)明還檢測(cè)了 36小時(shí)克隆胚胎的甲基化情況(27.33%)，根據(jù)上述結(jié)果，本發(fā)明預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育階段主要是2-4細(xì)胞(根據(jù)圖8胚胎發(fā)育曲線，預(yù)測(cè)2細(xì)胞、4細(xì)胞和8細(xì)胞所占比例分別為44.34%,25.74%和4.26%)，胚胎發(fā)育到囊胚的概率為19.91% (接近實(shí)際比率21.37%)，因此，Thyl基因的甲基化程度，可以用來(lái)確定克隆胚胎所處的發(fā)育階段和發(fā)育能力。
[0041]5)根據(jù)基因在成纖維細(xì)胞和體外受精囊胚中的表達(dá)情況確定不同胚胎時(shí)期的甲基化區(qū)域，結(jié)果:在胎兒成纖維細(xì)胞中表達(dá)確定的甲基化區(qū)域的核苷酸序列如SEQ ID N0.14所示；在體外受精囊胚中表達(dá)確定的甲基化區(qū)域的核苷酸序列如SEQ ID N0.15所示。
[0042]本發(fā)明通過(guò)根據(jù)Thyl基因在成纖維細(xì)胞中表達(dá)和體外受精囊胚中不表達(dá)的情況明確甲基化區(qū)域，可代表Thyl基因的甲基化狀態(tài)，所設(shè)計(jì)的Thyl基因甲基化引物序列具有較強(qiáng)的特異性，可用于有效、準(zhǔn)確檢測(cè)Thyl基因在樣品中的甲基化程度，Thyl基因在核移植胚胎中的甲基化程度可用來(lái)確定胚胎發(fā)育階段和發(fā)育能力，該特異性引物所檢測(cè)出的Thyl基因甲基化可作為新型的表觀遺傳分子標(biāo)記，為今后體細(xì)胞核移植胚胎的生產(chǎn)和相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。
[0043]本發(fā)明明確基因甲基化區(qū)域的方法是在Thyl基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1500bp及下游300bp內(nèi)進(jìn)行甲基化測(cè)序，并結(jié)合該基因在成纖維細(xì)胞和體外受精囊胚中的表達(dá)情況進(jìn)行確定，明確的Thyl基因甲基化區(qū)域在基因表達(dá)的胎兒成纖維細(xì)胞中呈現(xiàn)低甲基化，在基因不表達(dá)的體外受精囊胚中呈現(xiàn)高甲基化。該明確的Thyl基因甲基化區(qū)域隨著核移植胚胎發(fā)育能力的增強(qiáng)甲基化程度逐步升高(根據(jù)核移植胚胎發(fā)育進(jìn)程圖獲得核移植胚胎1-細(xì)胞、2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞和囊胚發(fā)育到囊胚的能力分別為21.37%,31.38%,39.47%、65.54% 和 100%, Thyl 基因甲基化分別為 18.33%,23.33%,36.67%,60.83% 和 65.00%)，可見(jiàn)，根據(jù)Thyl基因甲基化程度可用來(lái)確定任一時(shí)期核移植胚胎所處的發(fā)育階段和發(fā)育能力。因此本發(fā)明明確了一個(gè)能評(píng)價(jià)核移植胚胎發(fā)育能力的方法。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0044]圖1為豬Thyl基因甲基化預(yù)測(cè)結(jié)果，其中，A為甲基化區(qū)域遠(yuǎn)端；B為甲基化區(qū)域中端；IC為甲基化區(qū)域近端。
[0045]圖2為Thyl基因的PCR擴(kuò)增效果，其中，A為用于亞硫酸氫鹽測(cè)序的202bp PCR片段(甲基化區(qū)域遠(yuǎn)端)；B為用于亞硫酸氫鹽測(cè)序的395bp PCR片段(甲基化區(qū)域中端)-X為用于亞硫酸氫鹽測(cè)序的232bp PCR片段(甲基化區(qū)域近端)；M:DL500分子量標(biāo)記；1:成纖維細(xì)胞樣品，2:體外受精囊胚樣品。
[0046]圖3為Thyl基因在成纖維細(xì)胞中甲基化情況，其中，A為甲基化區(qū)域遠(yuǎn)端甲基化情況為甲基化區(qū)域中端甲基化情況；C為甲基化區(qū)域近端甲基化情況；白圓圈代表CpG未甲基化；黑圓圈代表CpG甲基化。
[0047]圖4為Thyl基因在體外受精囊胚中甲基化情況，其中，A為甲基化區(qū)域遠(yuǎn)端甲基化情況；B為甲基化區(qū)域中端甲基化情況；C為甲基化區(qū)域近端甲基化情況；白圓圈代表CpG未甲基化；黑圓圈代表CpG甲基化。
[0048]圖5為Thyl基因在成纖維細(xì)胞和體外受精胚胎中的表達(dá)情況，其中，*表示體外受精囊胚中不表達(dá)，并且與成纖維細(xì)胞中的表達(dá)差異極顯著(P < 0.01)。
[0049] 圖6為Thyl基因甲基化區(qū)域中端在核移植胚胎中的PCR擴(kuò)增效果，其中，M:DL500分子量標(biāo)記；1:核移植胚胎I細(xì)胞樣品；2:核移植胚胎2細(xì)胞樣品；3:核移植胚胎4細(xì)胞樣品；4:核移植胚胎8細(xì)胞樣品；5:核移植胚胎囊胚期樣品。
[0050]圖7為Thyl基因在體細(xì)胞核移植胚胎中甲基化情況，其中，A為Thyl基因在核移植胚胎I細(xì)胞中的甲基化情況；B為Thyl基因在核移植胚胎2細(xì)胞中的甲基化情況；C為Thyl基因在核移植胚胎4細(xì)胞中的甲基化情況；D為Thyl基因在核移植胚胎8細(xì)胞中的甲基化情況；E SThyl基因在核移植胚胎囊胚中的甲基化情況；白圓圈代表CpG未甲基化；黑圓圈代表CpG甲基化。
[0051]圖8為體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育進(jìn)程。
[0052]圖9為Thyl基因在核移植后36小時(shí)胚胎中的甲基化情況，其中，白圓圈代表CpG未甲基化；黑圓圈代表CpG甲基化。
【具體實(shí)施方式】
[0053]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所做的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0054]實(shí)施例1Thyl基因甲基化引物設(shè)計(jì)
[0055]針對(duì)豬Thyl基因，選取其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1500bp下游300bp內(nèi)富含CpG 二核苷酸的序列作為目標(biāo)序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。利用Methyl Primer Express軟件先將目標(biāo)序列的CG位點(diǎn)替換為YG，再把所有的C替換為T，得到Thyl基因經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后的轉(zhuǎn)換序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.17所示。根據(jù)亞硫酸氫鹽處理后的轉(zhuǎn)換序列分別針對(duì)Thyl基因上游遠(yuǎn)端、中端和近端設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,使用Primer Premier5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，并通過(guò)01igo6.0軟件校驗(yàn)各項(xiàng)參數(shù)，進(jìn)行篩選，遠(yuǎn)端的擴(kuò)增引物對(duì)的上游內(nèi)外引物核苷酸序列如SEQ ID N0.2和N0.3所示，下游內(nèi)外引物核苷酸序列如SEQ ID N0.4和N0.5所示；中端的擴(kuò)增引物對(duì)的上游內(nèi)外引物核苷酸序列如SEQ ID N0.6和N0.7所示，下游內(nèi)外引物核苷酸序列如SEQ ID N0.8和N0.9所示；近端的擴(kuò)增引物對(duì)的上游內(nèi)外引物核苷酸序列如SEQ ID N0.10和N0.11所示，下游內(nèi)外引物核苷酸序列如SEQ ID N0.12和N0.13所示，所述引物均采用PAGE純化，由上海生工合成。
[0056]實(shí)施例2樣品亞硫酸氫鹽處理和PCR擴(kuò)增
[0057](一)樣品亞硫酸氫鹽處理
[0058]利用EZ DNA Methylat1n-DirectKit?試劑盒對(duì)I X 13成纖維細(xì)胞和30枚體外受精囊胚進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理。具體步驟如下:將790 μ L Μ-Solubilizat1n BufTer、300 μ LM-Dilut1n Buffer 和 160 μ L M-React1n Buffer 添加到 CT Convers1n Reagent 中，制備好 CT Convers1n Reagent ;用 Proteinase K 消化樣品，20 μ L 反應(yīng)體系為:2 XM-Digest1nBufferlO μ L，樣品 9 μ L, Proteinase Kl μ L,在 50 °C 下孵育 20 分鐘；將 130 μ L CTConvers1n Reagent和20 μ L樣品混合，進(jìn)行PCR熱循環(huán)，條件為:98°C 8分鐘，64°C 3.5小時(shí)，4°C不要超過(guò)20小時(shí)；加入600 μ L M-Binding Buffer入柱，將樣品移置到柱中，顛倒混勻，12000rpm離心30秒，棄濾液；添加100 μ LM-ffash Buffer到柱中，12000rpm離心30秒，棄濾液；添加200 μ L M-Desulphonat1n Buffer到柱中，室溫放置20分鐘，12000rpm離心30秒，棄濾液；添加200 μ L M-Wash Buffer到柱中，12000rpm離心30秒，棄濾液；添加10 μ LM-Elut1n Buffer 到柱 中，12000rpm 離心 30 秒洗脫 DNA。
[0059](二)PCR 擴(kuò)增
[0060]針對(duì)Thyl基因上游遠(yuǎn)端、中端和近端的擴(kuò)增，均采用巢式PCR。第一輪擴(kuò)增采用20 μ L 擴(kuò)增體系:10XPCR Buffer (Mg2+Plus) 2 μ L, dNTP Mixture (各 2.5mM) 1.6μ L，上游引物(遠(yuǎn)端、中端和近端引物核苷酸序列分別如SEQ ID N0.3、N0.5和N0.7所示)0.4 μ L(lOymol/L)，下游引物(遠(yuǎn)端、中端和近端引物核苷酸序列分別如SEQ ID N0.9、N0.11和N0.13所示)0.4 μ L (10 μ mol/L),亞硫酸氫鹽處理后的基因組模板5 μ L，Taq HS (5U/ μ L)0.1 μ L，Dnase/Rnase free水補(bǔ)足至20 μ L。反應(yīng)條件為:94°C欲變性5分鐘；94°C變性30秒，50-55°C退火30秒，72°C擴(kuò)增I分鐘，40次循環(huán)；72°C延伸10分鐘。第二輪PCR采用第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，采用50 μ L擴(kuò)增體系=1XPCR Buffer (Mg2+Plus) 5 μ L, dNTPMixture (各2.5mM)4 μ L，上游引物(遠(yuǎn)端、中端和近端引物核苷酸序列分別如SEQ ID N0.2、N0.4和N0.6所示)I μ L (10 μ mol/L),下游引物(遠(yuǎn)端、中端和近端引物核苷酸序列分別如SEQ ID N0.8、N0.10 和 N0.12 所示)I μ L (10 μ mol/L),第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物模板 5 μ L, Taq HS(5υ/μ L) 0.25 μ L，Dnase/Rnase free水補(bǔ)足至50 μ L0反應(yīng)條件為:94°C欲變性5分鐘；94°C變性30秒，55~60°C退火30秒，72°C擴(kuò)增I分鐘，45次循環(huán)；72°C延伸10分鐘，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0061 ](三)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)
[0062]擴(kuò)增完畢后，在1%的瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳，遠(yuǎn)端、中端和近端的擴(kuò)增產(chǎn)物如圖2所示，目的片段大小分別為202bp、395bp和232bp。[0063]實(shí)施例3亞硫酸氫鹽測(cè)序
[0064](一)膠回收
[0065]對(duì)實(shí)施例2第三步擴(kuò)增產(chǎn)物采用凝膠回收試劑盒TIANgel Midi Purificat1n Kit(北京天根生化科技有限公司)回收目的片斷。
[0066](二)連接
[0067]將回收到的目的片段與pEASY-T3CloningVector連接，連接條件為:PCR產(chǎn)物4 μ L 和 pEASY-T3Cloning Vectorl μ L,室溫反應(yīng) 5 分鐘。
[0068](三)轉(zhuǎn)化
[0069]加連接產(chǎn)物于50 μ LTransl-Tl感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘；42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘；加250 μ L平衡至室溫的LB，200轉(zhuǎn)、37°C孵育I小時(shí)；取200 μ L菌液涂在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)8-12小時(shí)。
[0070](四)菌液鑒定和測(cè)序
[0071]挑取單克隆，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)8-12小時(shí)，收集菌液。取I μ L菌液作為PCR反應(yīng)的模板，25 μ L反應(yīng)體系中用Ml3正向和反向引物鑒定重組子，遠(yuǎn)端、中端和近端的重組子的大小分別為455bp、648bp和485bp,用確定包含重組子的菌液進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序 引物為M13F引物，同時(shí)利用BiQ Analyzer軟件對(duì)序列進(jìn)行甲基化分析，如圖3和4所示，Thyl基因上游遠(yuǎn)端、中端和近端在成纖維細(xì)胞中的甲基化程度分別為9.31%,24.17%和96.43%,在體外受精囊胚中甲基化程度分別為14.22%,63.33%和97.62%。
[0072]實(shí)施例4Thyl基因在成纖維細(xì)胞和體外受精囊胚中的表達(dá)
[0073](一)Thyl基因熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)
[0074]根據(jù)Thyl 的 mRNA 序列(NM_001146129),使用 Primer Premier5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，并通過(guò)01igo6.0軟件校驗(yàn)各項(xiàng)參數(shù)，篩選引物對(duì)，引物序列為:5’ AACCCTACCATTGGCATCGCT3’(上游)和 5’ TGAATGGGCAGGTTGGTGGT3’(下游)(如SEQ ID N0.18和N0.19所示)，內(nèi)參基因18SrRNA (NR_002170)引物序列為:5’ AATCTCGGGTGGCTGAACGC3’ (上游)和 5’ CCGTTCTTAGTTGGTGGAGCGAT3’(下游)(如 SEQ IDN0.20 和 N0.21 所示)。
[0075](二)熒光定量PCR擴(kuò)增
[0076]熒光定量PCR反應(yīng)采用SYBR Green I熒光染料法，應(yīng)用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)試劑盒。20 μ L 反應(yīng)體系為=SYBR Premix Ex Taq (2Χ) 10 μ L，上游引物(5 μ Μ)I μ L，下游引物(5 μ Μ) I μ L，cDNA 模板 2 μ L, Dnase/Rnasefree /K 6 μ L。反應(yīng)體系在MicroAmp?0ptical96-ffell React1n Plate 中混勻并用 MicroAmp?Optical Adhesive Film封口。反應(yīng)條件按ABI7500儀器使用說(shuō)明書(shū)設(shè)置，95°C 10秒；95°C 5秒，60°C 31秒(45循環(huán))；95°C 15秒，60°C 30秒，95°C 15秒。每組熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，反應(yīng)結(jié)果使用Sequence Detect1n System 軟件收集和分析。
[0077](三)基因表達(dá)分析
[0078]擴(kuò)增的熒光信號(hào)進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)的熒光值定義為閾值，而PCR擴(kuò)增反應(yīng)在到達(dá)閾值時(shí)，發(fā)生的循環(huán)數(shù)定義為CT值。根據(jù)擴(kuò)增曲線設(shè)定閾值，然后得到CT值，CT值通常在15-30之間，當(dāng)CT值大于35時(shí)，熒光定量PCR檢測(cè)無(wú)效，基因沒(méi)有表達(dá)。
[0079]基因表達(dá)量分析采用以18SrRNA作為內(nèi)參，靶基因在實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)于對(duì)照組的AACT值通過(guò)以下公式計(jì)算:AACT= (CTig基因-CT18sr麗)實(shí)驗(yàn)組-(CT靶基B-CTmrm)對(duì)照組，靶基因在實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)水平通過(guò)以下公式求出:靶基因相對(duì)表達(dá)水平=2_ΛΛετ，所得數(shù)據(jù)使用SPSS13.0進(jìn)行分析，當(dāng)Ρ〈0.05時(shí)即認(rèn)為差異顯著，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果按照“平均值土標(biāo)準(zhǔn)差”的形式進(jìn)行繪圖處理。
[0080]18SrRNA在成纖維細(xì)胞和體外受精囊胚中的CT值分別為15.52和15.80，Thyl基因在成纖維細(xì)胞和體外受精囊胚中的CT值分別為17.91和34.58，可見(jiàn)Thyl基因在成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，在體外受精囊胚中基本沒(méi)有表達(dá)，如圖5所示。
[0081]實(shí)施例5Thyl基因在核移植胚胎中的甲基化情況
[0082](一)卵母細(xì)胞的采集與體外成熟培養(yǎng)
[0083]從屠宰場(chǎng)收集卵巢并用37°C的生理鹽水運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室，抽取直徑為3_5mm的有腔卵泡，洗卵液中洗滌3次，實(shí)體顯微鏡下挑選具有完整三層以上卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞，成熟液中洗滌3次后，將洗凈的卵母細(xì)胞移入500 μ L卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)滴中，每滴放入40-50枚卵細(xì)胞，最后置入培養(yǎng)條件為38.5°C，5%C02和飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0084](二)體細(xì)胞核移植
[0085]成熟培養(yǎng)42h后，將卵母卵丘細(xì)胞復(fù)合物放入含有l(wèi)mg/mL透明質(zhì)酸酶的管內(nèi)，旋渦振蕩3分鐘去除卵丘細(xì)胞，然后用操作液洗滌一遍，并在實(shí)體鏡下挑選排出第一極體并胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞作為體細(xì)胞核移植的受體。
[0086]將成熟的卵母細(xì)胞和消化的胎兒成纖維細(xì)胞放入顯微操作液(添加7.5 μ g/ml細(xì)胞松弛素B的普通操作液)中，用固定管吸住一個(gè)卵母細(xì)胞，并用注射針吸除第一極體及周圍的部分胞質(zhì)完成去核，并注入一個(gè)供體細(xì)胞于透明帶下，使之與卵母細(xì)胞質(zhì)膜緊密接觸，在融合液中直流電擊(1.2kv/cm、30微秒、2次脈沖)誘導(dǎo)體細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞融合形成重構(gòu)胚并使之被激活，然后進(jìn)行胚胎培養(yǎng)。
[0087](三)核移植胚胎發(fā)育和收集
[0088]重構(gòu)胚放入PZM-3里進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:38.5°C，5% 二氧化碳、95%空氣和飽和濕度，體外觀察胚胎發(fā)育情況，并在6、24、48、72和156小時(shí)收集150枚I細(xì)胞階段、100枚2細(xì)胞階段、50枚4細(xì)胞階段和25枚8細(xì)胞階段核移植胚胎及20枚克隆囊胚。
[0089](四)核移植胚胎Thyl基因甲基化測(cè)序分析
[0090]采用實(shí)施例2對(duì)核移植胚胎樣品進(jìn)行處理，并用實(shí)施例1中的中端甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，甲基化測(cè)序采用實(shí)施例3的方法，并利用BiQ Analyzer軟件對(duì)序列進(jìn)行甲基化分析，結(jié)果如圖7所示，Thyl基因在核移植胚胎1、2、4和8細(xì)胞階段及囊胚中甲基化分別為18.33%、23.33%、36.67%、60.83% 和 65.00%。
[0091](五)核移植各階段胚胎發(fā)育能力分析
[0092]核移植后在12、18、24、48、72、120和156小時(shí)統(tǒng)計(jì)1-細(xì)胞、2_細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑椹胚和囊胚比例，繪制體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育進(jìn)程圖，結(jié)果如圖8所示，并計(jì)算各階段胚胎發(fā)育到囊胚的能力，1-細(xì)胞、2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑椹胚和囊胚階段胚胎發(fā)育到囊胚比例分別為 21.37%,31.38%,39.47%,65.54%,85.03% 和 100%。
[0093]實(shí)施例6Thyl基因甲基化預(yù)測(cè)核移植胚胎發(fā)育階段和發(fā)育能力
[0094]采用實(shí)施例5獲取核移植后36小時(shí)的胚胎50枚，采用實(shí)施例2進(jìn)行處理，并用實(shí)施例1中的中端甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，甲基化測(cè)序采用實(shí)施例3的方法，并利用BiQAnalyzer軟件對(duì)序列進(jìn)行甲基化分析，結(jié)果如圖9所示，Thyl基因在核移植后36小時(shí)胚胎中的甲基化為27.33%，根據(jù)實(shí)施例5預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育階段主要是2-4細(xì)胞，發(fā)育到囊胚的概率為19.91%。附錄
[0095]本發(fā)明實(shí)施例5所用的液體配方(均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)試劑):
[0096]1、洗卵液
[0097]稱取NaCl (氯化鈉)6.6633g，KCl (氯化鉀)0.2386g，NaHCO3 (碳酸氫鈉)0.1680g，KH2PO4 (磷酸二氫鉀)0.0408g, Na-Lactate (氯酸鈉)1.868mL, MgCl2.6H20 (六水氯化鎂)0.1017g, HEPES2.3830，Penicillin G (青霉素)0.0650g, Phenol Red (苯酚紅)0.01OOg,CaCl2.2H20 (二水氯化鈣)0.2940g，PVA (聚乙烯醇)0.1OOOg, Sorbitol (山梨糖醇)2.1860g，Gentamicin (慶大霉素)0.0250g, Na-Pyruvate (丙酮酸鈉)0.0220g,調(diào)滲透壓為 275 ~280，調(diào)pH為7.0~7.2，定容1L，用0.22 μ m濾器過(guò)濾滅菌，并4°C保存。
[0098]2、成熟液
[0099]TCM199 添加 0.91mmol/LNa-Pyruvate，75 μ g/ml PenicillinG 和 50 μ g/mlStreptomycin (鏈霉素)，用之前添加 0.57mmol/L Cysteine (半胱氨酸),0.5 μ g/mlLuteinizing Hormone (促黃體生成素)，0.5 μ g/ml Follicle Stimulating Hormone (促卵泡生成素)，lOng/ml Epidermal Growth Factor (表皮生長(zhǎng)因子)和10%體積的卵泡液,用0.22 μ m濾器過(guò)濾滅菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0100]3、操作液
[0101]TCM199 添加 0.91mmol/LNa-Pyruvate,75 μ g/ml PenicillinG 和 50 μ g/mlStreptomycin (鏈霉素),再添加0.3%BSA (牛血清白蛋白),用0.22 μ m濾器過(guò)濾后使用。
[0102]4、融合液
[0103]稱取Mannitol (甘露醇)5.46g, CaCl2.2H20 (二水氯化鈣)0.015g, HEPES0.013g,MgCl2.6H20 (六水氯化鎂)0.002g,調(diào)pH為7.0-7.4，定容10mL,用0.22 μ m濾器過(guò)濾滅菌，并4°C保存，使用前37 °C預(yù)平衡。
[0104]5、胚胎培養(yǎng)液
[0105]稱取NaCl0.6312g, KC10.0746g, NaHCO30.2106g, KH2PO40.0048g, Na-Pyruvate(丙酮酸鈉)0.0022g, MgSO4.7H20 (七水硫酸鎂)0.0099g, Ca-(Lactate)2.5H20 (五水乳酸?丐)0.0.0617g, L-Glutamine (左旋谷氨酸胺)0.0146g, Hypotaurine (牛橫酸)0.0546g,Gentamicin (慶大霉素)0.0050g,調(diào)滲透壓為 286-290，調(diào) pH 為 7.1-7.5，定容 10mL,用
0.22 μ m濾器過(guò)濾滅菌，并4°C保存，使用前添加體積分?jǐn)?shù)為2%的BME (必需氨基酸)和1%的MEM (非必需氨基酸)，再添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的BSA，過(guò)濾，二氧化碳培養(yǎng)箱中37°C預(yù)平衡后使用。
【權(quán)利要求】
1.檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力的引物對(duì)，其特征在于:如SEQID N0.6~SEQ IDN0.9所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力的引物對(duì)，其特征在于:所述引物對(duì)擴(kuò)增的核苷酸序列為Thyl基因的一段，如SEQ ID N0.16所示。
3.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力的引物對(duì)在制備檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力的試劑盒中的應(yīng)用。
4.一種檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力的試劑盒，其特征在于:包括用于擴(kuò)增SEQ IDN0.16所示序列的如SEQ ID N0.6~SEQ ID N0.9所示的引物，以及PCR擴(kuò)增反應(yīng)所需要的常規(guī)試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力的試劑盒，其特征在于:試劑盒組成為:20 μ L 擴(kuò)增體系:10 X PCR Buffer (Mg2+Plus) 2 μ L, dNTP Mixture (各 2.5mM)1.6μ L, SEQ ID N0.6~SEQ ID N0.9所示的上游和下游引物各0.4 μ L (10 μ mol/L)，模板5 μ L, Taq HS (5U/y L) 0.1 μ L，ddH2012.5 μ L。
6.權(quán)利要求4或5所述的檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力的試劑盒在檢測(cè)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:應(yīng)用時(shí)，檢測(cè)方法步驟如下: 1)Proteinase K消化待測(cè)樣品； 2)待測(cè)樣品的亞硫 酸氫鹽處理； 3)以步驟2)處理后的基因組DNA為模板，利用SEQID N0.6~SEQ ID N0.9所示的引物對(duì)，進(jìn)行熱啟動(dòng)PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 4)對(duì)步驟3)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)CpG位點(diǎn)的甲基化程度。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:檢測(cè)CpG位點(diǎn)的甲基化程度后，根據(jù)CpG位點(diǎn)的甲基化程度評(píng)價(jià)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力:甲基化程度為32%以下時(shí)，體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育到囊胚的能力為32%以下；甲基化程度為32%~55%時(shí)，體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育到囊胚的能力為32%~55% ；甲基化程度為55%以上時(shí)，體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育到囊胚的能力為55%以上。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:檢測(cè)CpG位點(diǎn)的甲基化程度后，根據(jù)CpG位點(diǎn)的甲基化程度評(píng)價(jià)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力:檢測(cè)檢測(cè)核移植后36小時(shí)胚胎時(shí)，若甲基化程度為24.03~30.03%，則該胚胎發(fā)育到囊胚的概率為19.91%。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104031985SQ201410150697
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月15日
【發(fā)明者】何洪彬, 郇延軍 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心