鑒定樣品中的pufa-pks的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及鑒定樣品中的PUFA-PKS的篩選方法。本發(fā)明涉及快速簡單地鑒定微生物中的PUFA PKS的方法。所述方法的特征在于，代表PKS的特異性生產(chǎn)PUFA（多不飽和脂肪酸）的DNA片段可在體外再現(xiàn)。PUFA PKS特異的氨基酸序列LGIDSIKRVEIL使之衍生寡核苷酸成為可能，所述寡核苷酸通過PCR有效篩選PUFA PKS基因或產(chǎn)生PUFA的微生物。本發(fā)明方法尤其適用于高通量篩選微生物的PUFA PKS基因。
【專利說明】鑒定樣品中的PUFA-PKS的篩選方法
[0001] 本申請是申請日為2005年4月8日、中國國家申請?zhí)枮?00580018877. 2、發(fā)明名 稱為"鑒定樣品中的PUFA-PKS的篩選方法"申請的分案申請。
[0002] 本發(fā)明描述了一種快速和簡單鑒定在樣品，例如，生物樣品中，特別是在微生物中 的PUFA-PKS基因（PUFA=多不飽和脂肪酸；PKS=多酮化合物合酶）的方法。其特征是對于 產(chǎn)生PUFA的PKS特異性的DNA片段的體外復(fù)制。除了鑒定適當(dāng)?shù)腄NA序列之外，本發(fā)明還 基于擴(kuò)增它們的實(shí)驗(yàn)條件的確立。
[0003] 術(shù)語PUFAs (多不飽和脂肪酸）表示具有鏈長度〉C12和至少兩個(gè)雙鍵的多重不 飽和長鏈脂肪酸。有兩個(gè)PUFA的主要家族，其根據(jù)相對于烷基末端，第一個(gè)雙鍵在ω-3 和在ω-6脂肪酸中的位置而區(qū)別。它們是細(xì)胞膜的重要組分，在那里它們以脂質(zhì)，特別是 磷脂的形式存在。I 3UFAs還作為在人和在動(dòng)物中的重要分子，例如，前列腺素，白三烯和環(huán) 前列腺的初級階段而起作用（Α.Ρ. Simopoulos, essential fatty acids in health and chronic disease, Am. J. Clin. Nutr. 1999 (70)，pp. 560-569)。ω-3 脂肪酸族的重要代表是 DHA(二十二碳六烯酸）和ΕΡΑ(二十碳五烯酸），其可以在魚油和在海洋微生物中發(fā)現(xiàn)。 ω-6脂肪酸的重要代表是ARA(花生四烯酸），其出現(xiàn)在，例如，絲狀真菌中，但是也可以從 動(dòng)物組織如肝和腎中分離。DHA和ARA在人母乳中彼此相接出現(xiàn)。
[0004] PUFAs對于人來說在適當(dāng)發(fā)育方面，特別是對于發(fā)育腦，組織形成及其修復(fù)是必需 的。因而，DHA是人細(xì)胞膜的重要組分，特別是神經(jīng)的細(xì)胞膜。另外，DHA在腦功能的成熟中 發(fā)育重要作用并且對于視力的發(fā)育是必需的?！?3PUFAs如DHA和EPA被用作營養(yǎng)添加劑， 因?yàn)榫哂蠨HA充分供應(yīng)的平衡營養(yǎng)對于某些疾病的預(yù)防有利（A. Ρ. Simopoulos，Essential fatty acids in health and chronic disease, American Journal of Clinical Nutritionl999 (70)，pp. 560-569)。例如，患有非胰島素依賴型糖尿病的成人呈現(xiàn)與后來 出現(xiàn)的心臟問題相關(guān)的DHA平衡的缺陷或者至少是失衡的DHA平衡。同樣地，神經(jīng)元疾病 如，例如，阿爾茨海默病或精神分裂癥伴隨著低的DHA水平。有大量的DHA商業(yè)提取物的 來源，例如，來自海洋冷水魚的油，蛋黃部分或海洋微生物。適于提取n-3PUFA的微生物發(fā) 現(xiàn)于，例如，弧菌屬（Vibrio)的細(xì)菌中（例如，海產(chǎn)弧菌（Vibrio marinus))或腰鞭毛蟲 (Dinophyta)中，其中特別是 Crypthecodinium 屬，如 C.cohnii 或在 Stramenopiles (或 Labyrinthulomycota)中,如 Pinguiophyceae 例如，Glossomastix, Phaeomonas, Pingu iochrysis, Pinguiococcus 和 Polypodochrysis。其它生產(chǎn) PUFA 的優(yōu)選微生物特別屬 于 Thraustochytriales 目,(Thraustchytriidea)Japonochytrium M , Schizochytrium 屬，Thraustochytrium 屬，Althornia 屬，Labyrinthuloides 屬，Aplanochytrium 屬和 Ulkenia 屬。被抱霉屬（Mortierell), Entomophthora 屬，Phytium 屬和 Porphyridium 屬的 微生物被用于ARA的商業(yè)生產(chǎn)。
[0005] 商業(yè)上使用的PUFA的來源如植物或動(dòng)物的特征經(jīng)常是提取自它們的油的組成非 常不均勻。以這種方式提取的油必須進(jìn)行昂貴的純化處理以便能夠富集一種或幾種PUFAs。 來自這些來源的PUFA的供應(yīng)也會(huì)發(fā)生不可控制的波動(dòng)。因而，疾病和天氣影響可減少動(dòng) 物也可減少植物的產(chǎn)量。從魚中提取PUFA出現(xiàn)季節(jié)波動(dòng)并且甚至可以由于過度捕撈或氣 候變化(例如，厄爾尼諾現(xiàn)象）而暫時(shí)性地急劇受限。動(dòng)物油，特別是魚油，可以通過食物 鏈從環(huán)境中積聚有害物質(zhì)。已知?jiǎng)游锸苡袡C(jī)氯化物如，例如，多氯化聯(lián)苯高度脅迫，特別是 在商業(yè)性魚場中，其抵消了魚類消費(fèi)的健康方面（Hites等，2004，Global assessment of organic contaminants in farmed salmon, Science303，pp. 226-229)。魚產(chǎn)品質(zhì)量的所得 損失導(dǎo)致消費(fèi)者對于魚和魚油作為ω-3 PUFA來源的接受度下降。另外，從魚純化DHA因 為高度技術(shù)需要而相對昂貴。另一方面，DHA存在于少數(shù)海洋微生物，占細(xì)胞總脂肪組分的 大約50%，并且它們可在大的發(fā)酵罐中進(jìn)行相對經(jīng)濟(jì)地培養(yǎng)。微生物的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是提取 自它們的油組合物限于一些組分。
[0006] 對于長鏈PUFA的生物合成已知兩種不同的生物代謝途徑。對于所謂的Sprecher 途徑來說，通過延長和去飽和步驟以及停止縮短的流程由棕櫚酸起始來合成長鏈PUFAs如 DHA 和 EPA(Η. Sprecher, Metabolism of highly unsaturated n_3and n-6fatty acids. Biochimica et Biophysica Actal486(2000)pp. 219-231)。在大多數(shù)生物中如所述或以相 似的方式采用這種生物合成途徑，甚至在人和植物中。不過，某些海洋生物采取不同的生物 合成途徑進(jìn)行EPA和DHA的生產(chǎn)。這些生產(chǎn)PUFA的微生物包括γ蛋白細(xì)菌的海洋代表和 到目前為止的真核原生生物Schizochytrium。它們通過所謂的多酮化合物合酶（PKS)來合 成長鏈PUFA。這些PKSs代表催化由酮化合物（ketide)單位組成的次級代謝產(chǎn)物合成的大 SI (G. ff. Wallis, J. L. Watts and J. Browse, Polyunsaturated fatty acid synthesis:what will they think of next?Trends in Biochemical Sciences27(9)(2000)pp. 467-473)〇 多酮化合物的合成包含許多與脂肪酸合成類似的酶反應(yīng)（Hopwood&Sherman Annu. Rev.Genet. 24(1990)pp· 37-66 ;Katz&Donadi〇 Annu. Rev. of Microbiol. 47 (1993) pp.875-912)。
[0007] 已知不同PUFA-PKSs (PUFA-合成性PKSs)的基因序列。由此，從海洋細(xì)菌 Shewanella sp.中分離出38kb的基因組片段，其包含生產(chǎn)二十碳五烯酸（EPA)的信息。 有可能通過包含在基因組片段中的基因簇的轉(zhuǎn)移而在大腸桿菌（E. coli)和Synechoccus 中生產(chǎn)EPA。隨后對這一片段的測序?qū)е妈b定了 8個(gè)開放閱讀框（ORFs)OLTakeyama 等，Microbiologyl43 (1997) pp. 2725-2731)。來自 Shewanella 的這些開放閱讀框的其中五 個(gè)與多酮化合物合酶基因密切相關(guān)。另外的PKS樣基因簇也發(fā)現(xiàn)于其它產(chǎn)生PUFA的海洋細(xì) 菌如，例如，海產(chǎn)弧菌中（M. Tanaka,等，21 (1999) pp. 939-945)。類似的產(chǎn)生PUFA的，PKS 樣ORFs也能夠在真核性原生生物Schizochytrium中鑒定（Metz等，Science293 (2001) ρρ· 290-293 和 W000/42195)。在 Schizochytrium 中確定了三種 ORFs，其與來自 Shewanella 的EPA基因簇呈現(xiàn)部分同一'丨生。在少數(shù)原核生物和真核生物Schizochytrium中存在這些 保守性PKS基因給出了暗示，PUFA-PKS基因可能在原核生物和真核生物之間進(jìn)行了水平轉(zhuǎn) 移。
[0008] 目前關(guān)于PKS在個(gè)別物種之間的分布仍然知之甚少。因而，例如，Schizochytrium 的系統(tǒng)發(fā)育上的近親，海洋原生生物Thraustochytrium sp·，似乎沒有PKS，即使它像 Schizochytrium 一樣富含DHA。它利用極少出現(xiàn)的δ-4去飽和酶生產(chǎn)長鏈PUFA(X Qiu 等，J. Biol. Chem. (2001) pp. 31561-31566)。Thraustochytrium 和 Schizochytrium 二者都 屬于Thraustochytriales目，但對于生產(chǎn)長鏈PUFA卻具有完全不同的生物合成途徑。所 以，在確定PUFA-PKS基因在海洋微生物中的分布上有很大興趣，特別是關(guān)于為了以商業(yè)規(guī) ?？赡苄陨a(chǎn)個(gè)別PUFAs而發(fā)現(xiàn)新的潛在PUFA生產(chǎn)者。此外，當(dāng)前需要特別有效的篩選方 法以便以高通量對大量海洋微生物檢查PUFA生產(chǎn)者。另外，許多不同PUFA-PKS的知識(shí)應(yīng) 當(dāng)提供關(guān)于基因重排和相應(yīng)酶的結(jié)構(gòu)的信息并且以此提供生產(chǎn)不同PUFAs的信息。這對于 許多其它應(yīng)用，例如，對于在轉(zhuǎn)基因微生物或植物中生產(chǎn)PUFA特別重要。通過基因的變異 可以轉(zhuǎn)基因地生產(chǎn)具有不同PUFA組合的由設(shè)計(jì)者設(shè)計(jì)的油。
[0009] 專利申請W002/083870A2描述了一種鑒定包含PUFA-PKS基因的生物的方法。它 在一方面是基于有關(guān)脂肪酸范圍的五種選擇標(biāo)準(zhǔn)，所述范圍應(yīng)當(dāng)在某些培養(yǎng)條件下給出以 便作為PUFA-PKS系統(tǒng)的指示物而起作用。符合的選擇標(biāo)準(zhǔn)越多，對于PUFA-PKS系統(tǒng)的指 示就越強(qiáng)。它在另一方面是基于DNA印跡分析，其中轉(zhuǎn)移到印跡膜上的限制剪切的基因組 DNA由潛在的PUFA-PKS候選物（符合五個(gè)選擇標(biāo)準(zhǔn)）與PUFA-PKS特異性核酸序列雜交。 接下來在示例性實(shí)施方案中對此第二個(gè)檢測步驟進(jìn)行擴(kuò)展來確證基因組DNA庫的篩選結(jié) 果。另外，專利申請W002/083870描述了富集和選擇合適微生物作為上述篩選方法的預(yù)選 擇的策略。
[0010] 不過，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是在W002/083870A2中所述的篩選方法非 常昂貴并且因此不適于進(jìn)行高通量篩選。而且，在第一個(gè)篩選步驟中的選擇參數(shù)的評估似 乎非常含糊，其可能在第二個(gè)篩選步驟中導(dǎo)致陰性結(jié)果。
[0011] 所以根據(jù)技術(shù)狀態(tài)本發(fā)明具有這樣的任務(wù)，即提供一種在不同微生物中鑒定 PUFA-PKS基因的方法。該方法應(yīng)當(dāng)使得有效地，經(jīng)濟(jì)地和在短時(shí)間內(nèi)廣泛篩選微生物成為 可能。所述篩選應(yīng)當(dāng)以高通量進(jìn)行，而無需昂貴的樣品制備。
[0012] 通過本發(fā)明的權(quán)利要求書中所定義的主題解決了這一任務(wù)以及其它未曾被明確 地提及但可以從本文件初始討論的上下文中輕易得到或總結(jié)的任務(wù)。
[0013] 通過權(quán)利要求1中定義的方法給出了鑒定微生物中PUFA-PKS基因的有利方法。 此方法包括利用源自氨基酸序列LGIDSIKRVEIL(SEQ ID No. 5)的降解寡核苷酸(引物)通過 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)體外擴(kuò)增來自樣品，優(yōu)選生物質(zhì)量（biomass)，特別是來自微生物的 核酸。源自氨基酸序列LGIDSIKRVEIL(SEQIDN 0.5)的核酸序列代表，例如，序列5'-CTC GGC ATT GAC TCC ATC AAG CGT GTC GAG ATT CTC-3'（SEQ ID No. 6)。根據(jù)本發(fā)明使用這 里所述的降解引物導(dǎo)致在產(chǎn)生PUFA的微生物中鑒定了 PKS基因片段。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的方法令人驚訝地僅僅以源自上述一種氨基酸序列片段的寡核苷酸 而得以實(shí)施。另外令人吃驚的是，可以在很大程度上省略包含大量N堿基或，例如，肌苷的 重度簡并的寡核苷酸。
[0015] 所述方法包含所有能夠源自上述氨基酸序列LGIDSIKRVEIL (SEQ ID No. 5)的寡核 苷酸用于擴(kuò)增和鑒定PUFA-PKS基因。寡核苷酸的選擇獨(dú)立于選定的部分序列的長度并且 獨(dú)立于其方向（有義或反義或互補(bǔ)或非互補(bǔ))。
[0016] 在優(yōu)選的形式中，將具有10-36bp，優(yōu)選15-25bp和特別優(yōu)選18bp長度的寡核苷 酸用于本發(fā)明的檢測方法中。
[0017] 所用寡核苷酸的量可以變化，只要對于PUFA-PKS存在的檢測方法沒有副作用。這 對于所有其它用于PCR反應(yīng)中的成分也適用。
[0018] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用寡核苷酸的雜交于退火溫度45°C-65°c，優(yōu)選 50°C -60°C和特別優(yōu)選于53°C -57°C發(fā)生。
[0019] PCR的個(gè)別階段，S卩，變性，退火和延伸的持續(xù)時(shí)間也可以變化，只要對于 PUFA-PKS存在的檢測方法沒有副作用。
[0020] PCR循環(huán)數(shù)也可以變化，但優(yōu)選在20和40個(gè)循環(huán)之間，特別優(yōu)選在25和35個(gè)循 環(huán)之間，并且非常特別優(yōu)選大約30個(gè)循環(huán)。
[0021] 可以將所有來自待研究微生物的可分離DNA和RNA核酸以及產(chǎn)生自mRNA的cDNA 用作PCR的模板。在具體的實(shí)施方案中，可以將完整的細(xì)胞或生物質(zhì)量用作PCR的模板。
[0022] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，還可以將根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸用作雜交探針來檢測互補(bǔ) 核酸序列。
[0023] 特別地，根據(jù)本發(fā)明的方法適于高通量篩選微生物的PUFA-PKS基因。
[0024] 因此，本發(fā)明還包括用權(quán)利要求1-7的方法或通過使用根據(jù)權(quán)利要求9的核酸序 列作為雜交探針可獲得(可鑒定）的核酸。
[0025] 還包括含有根據(jù)權(quán)利要求11的核酸的微生物。
[0026] 盡管對于產(chǎn)生PUFA的微生物有很大需求，但是在本發(fā)明之前尚無已知的基于PCR 的有效檢測方法來鑒定包含PUFA-PKS的微生物。Gentile等的論文的確描述了寡核苷酸 對于擴(kuò)增PUFA-PKS基因序列的可能的用途；不過，所述的寡核苷酸并非源自ACP結(jié)構(gòu)域或 源自本發(fā)明所基于的氨基酸序列 LGIDSIKRVEIL(Gentile 等，2003J. Appl. Microbiol. (95) ρρ·1124-1133)。
[0027] 有人懷疑已然以多拷貝存在的序列片段（PKS的APC結(jié)構(gòu)域）的擴(kuò)增是這里所述 PCR方法的高效的基礎(chǔ)。在PCR開始時(shí)存在大量靶序列可能導(dǎo)致效率的提高。這在篩選過 程中對于其部分導(dǎo)致了較高的命中率。不過，令人非常吃驚的是特異性PUFA-PKS基因能夠 在源自氨基酸序列LGIDSIKRVEIL的寡核苷酸的幫助下分離，因?yàn)锳PC結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)在非常多 的其它基因中，例如，對于PUFA以及肽合成酶和脂肪酸合成酶一般并非特異性的PKS。這也 被視為以往未曾嘗試用來自LGIDSIKRVEIL序列的寡聚物進(jìn)行PUFA-PKS基因克隆測試的原 因。
[0028] 另夕卜，到目前為止僅僅開發(fā)了基于鑒定PUFA生產(chǎn)者的生物標(biāo)記的費(fèi)時(shí) 得多和較不可靠的篩選方法（D.S. Nichols 和 T.A.McMeekin2002J. Microbiol. Methods48(2-3)，ρρ· 161-170)。
[0029] 圖 1 顯不來自 Moritella marina, Photobacterium profundum(菌株 SS9)和 Schizochytrium的少數(shù)幾個(gè)先前已知的PUFA-PKSs的酰基載體蛋白結(jié)構(gòu)域的位置和數(shù)目 的比較。還顯示了保守序列LGIDSIKRVEIL的重復(fù)數(shù)。
[0030] 圖2顯不PCR產(chǎn)物（ACP結(jié)構(gòu)域）與來自Schizochytrium的PUFA-PKS的序列同 源性，所述PCR產(chǎn)物用源自序列LGIDSIKRVEIL，以及源自Ulkenia sp. SAM2179的寡核苷酸 擴(kuò)增。
[0031] 下面利用少數(shù)實(shí)施例介紹構(gòu)成根據(jù)本發(fā)明方法基礎(chǔ)的檢測方法。不過，所述檢測 方法和本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。 實(shí)施例
[0032] 實(shí)施例1:
[0033] 由來自Ulkenia sp. SAM2179的分離的DNA擴(kuò)增PUFA-PKS特異性序列
[0034] I. 1基因組DNA的分離
[0035] 在 250ml 帶有阻流板的 Erlenmeyer 燒瓶中用 Ulkenia sp. SAM2179 (Ulkenia spec BP-5601 ;W09803671)接種 50ml DHl 培養(yǎng)基（50g/l 葡萄糖；12. 5g/l 酵母提取物；16. 65g/l Tropic Marin;pH6. 0)并于28°C和150rpm培養(yǎng)48h。隨后用滅菌自來水洗漆細(xì)胞，離心下 去并將細(xì)胞沉淀物冷凍于_85°C中。獲得大約1.25g干重的細(xì)胞質(zhì)量。為了進(jìn)一步的檢查 (workup )，隨后將細(xì)胞沉淀物轉(zhuǎn)移入研缽中并以研棒在液氮下粉碎成精細(xì)粉末。隨后，將大 約1/10研成粉末的細(xì)胞材料與2ml裂解緩沖液（50mM tris/Cl pH7. 2 ;50mM EDTA ;3%(v/ v) SDA ;0. 01%(v/v) 2-巰基乙醇）混合并于68°C溫育lh。隨后加入2ml苯酚/氯仿/異戊 醇（25:24:1)，攪動(dòng)并于IOOOOrpm離心20min。在除去上層水相后，將后者轉(zhuǎn)移入兩個(gè)新的 反應(yīng)容器中，每個(gè)600 μ 1，并且分別再次與600 μ 1苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1)混合，攪 動(dòng)并于13000rpm離心15min。隨后將特定上層相每個(gè)400 μ 1轉(zhuǎn)移入新的反應(yīng)容器中并在 每種情形下加入Iml乙醇（100%)后倒轉(zhuǎn)兩到三次。隨后，將沉淀的DNA纏繞在玻璃棒上， 用70%乙醇洗滌，干燥并溶于50 μ 1蒸餾水中，與2 μ I RNase A混合并保存于4°C。
[0036] 1. 2利用靶標(biāo)特異性寡核苷酸的PCR反應(yīng)
[0037] 將PCR引物MOFl和MORl用作靶標(biāo)（motive)特異性寡核苷酸。
[0038] MOFl: 5，- CTC GGC ATT GAC TCC ATC - 3,（Seq ID No. 7)
[0039] M0R1:5' -GAG AAT CTC GAC ACG CTT - 3,（Seq ID No. 8)
[0040] 將在L 1中所述的來自Ulkenia sp. SAM2179的基因組DNA稀釋1:100。隨后將 2 μ 1的這種稀釋液轉(zhuǎn)移入50 μ 1體積的PCR反應(yīng)混合物中（Ix緩沖液（Sigma) ;dNTPs (每種 200 μ M) ;M0Fl(20pmol)，MORl (20pmol)和 2. 5U Taq-DNA聚合酶（Sigma))。在下列條件下實(shí) 施PCR:起始變性94°C 3min，隨后為30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)于94°C lmin，55 °C lmin，72 °C Imin 和最后8min72°C。隨后通過凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物并通過T/A克?。↖nvitrogen)將具 有合適大小的片段插入載體pCR2. 1T0P0中。在轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10F'之后，分離質(zhì)粒 DNA(Qiaprep Spin, QUAGEN)并進(jìn)行測序。
[0041] 將獲得的序列數(shù)據(jù)（SEQ ID No. 1)與官方的EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(http:// www. ebi. ac. uk/embl/)相比較并進(jìn)行評估。用FASTAX獲得的序列比較對于來自Ulkenia sp. SAM 2179 的 PCR 主要產(chǎn)物與來自 Schizochytrium sp. ATCC 20888 的 PUFA-PKS (0RF A ; 0RF:開放閱讀框）的?；d體蛋白產(chǎn)生部分同一性，其在氨基酸水平上為大約90% (圖 2)。令人吃驚的是，為了確定在Ulkenia sp. SAM 2179中的這種PUFA-PKS，僅須實(shí)施單次 PCR實(shí)驗(yàn)。
[0042] 實(shí)施例2:
[0043] 由來自Schizochytrium sp. SR21的分離DNA擴(kuò)增PUFA-PKS特異性序列
[0044] 2. 1基因組DNA的分離
[0045] 在 250ml 帶有阻流板的 Erlenmeyer 燒瓶中用 Schizochytrium sp. SR21 (Schizochytrium spec.，MYA-1381 ;EP0823475)接種 50ml DHl 培養(yǎng)基（50g/l 葡萄 糖；12.5g/l 酵母提取物；16.65g/l Tropic Marin; ρΗ6·0)并于 28°C 和 150rpm 培養(yǎng) 48h。 隨后用自來水將細(xì)胞洗滌兩次，離心下去并將細(xì)胞沉淀物冷凍于_85°C中。獲得大約I. 4g 干重的細(xì)胞質(zhì)量。隨后，為了進(jìn)一步的檢查，隨后將細(xì)胞沉淀物轉(zhuǎn)移入研缽中并如先前所述 (實(shí)施例1)進(jìn)行處理來分離基因組DNA。
[0046] 2. 2利用靶標(biāo)特異性寡核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)
[0047] 將PCR引物MOFl和MORl (見實(shí)施例1)用作靶標(biāo)特異性寡核苷酸。
[0048] 如L 2中所述以2 μ 1來自Schizochytrium sp. SR21的基因組DNA進(jìn)行PCR。
[0049] 將獲得的序列數(shù)據(jù)（SEQ ID No. 2)與官方EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(http:// WWW, ebi. ac. uk/embl/)相比較并進(jìn)行評估。用FASTAX獲得的序列比較對于來自 Schizochytrium sp. SR21 的 PCR 主要產(chǎn)物與來自 Schizochytrium sp.ATCC20888 的 PUFA-PKS(ORF A ;0RF:開放閱讀框）的?；d體蛋白產(chǎn)生大約90%的部分同一性。令人吃 驚的是，對于確定在Schizochytrium sp. SR21中的這種PUFA-PKS也僅須進(jìn)行單次PCR實(shí) 驗(yàn)。
[0050] 實(shí)施例3:
[0051] 直接由Schizochytrium sp. SR21的生物質(zhì)量擴(kuò)增PUFA-PKS特異性序列
[0052] 3. 1生物質(zhì)量（biomass)的獲得
[0053] 在 250ml 帶有阻流板的 Erlenmeyer 燒瓶中用 Schizochytrium sp. SR21 接種 50ml DHl 培養(yǎng)基（50g/l 葡萄糖；12. 5g/l 酵母提取物；16. 65g/l Tropic Marin ;ρΗ6· 0)并于 28°C和150rpm培養(yǎng)48h。隨后用自來水將細(xì)胞洗滌兩次并離心下去。隨后將以此方式獲得 的生物質(zhì)量直接加入到相應(yīng)的PCR反應(yīng)中。
[0054] 3. 2利用靶標(biāo)特異性寡核苷酸進(jìn)行的PCR反應(yīng)
[0055] 將PCR引物MOFl和MORl (見實(shí)施例1)用作靶標(biāo)特異性寡核苷酸。
[0056] 用無菌牙簽取等份的在3. 1中獲得的來自Schizochytrium sp. SR21的生物質(zhì) 量（biomass)并轉(zhuǎn)移入50 μ 1體積的PCR反應(yīng)混合物中（Ix緩沖液（Sigma) ;dNTPs (每種 200μΜ) ;M0Fl(20pmol)，M0Rl(20pmol)和 2.5U Taq DNA 聚合酶（Sigma))。如 1.2 中所述 進(jìn)行PCR。
[0057] 將獲得的序列數(shù)據(jù)（SEQ ID No. 2)與官方可使用的EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫 (http://www. ebi. ac. uk/embl/)相比較并進(jìn)行評估。用FASTAX獲得的序列比較對于來 自 Schizochytrium sp.SR21 的 PCR 主要產(chǎn)物與來自 Schizochytrium sp.ATCC20888 的 PUFA-PKS(ORF A ;0RF:開放閱讀框）的?；d體蛋白產(chǎn)生大約90%的部分同一性。獲自 Schizochytrium的生物質(zhì)量的PCR產(chǎn)物的序列與實(shí)施例2中的序列相同。
[0058] 令人吃驚的是，即使是此處對于確定來自Schizochytrium sp. SR21的生物質(zhì)量 的PUFA-PKS也僅須進(jìn)行單次PCR實(shí)驗(yàn)。
[0059] 實(shí)施例4:
[0060] 直接由不同ulkenias的生物質(zhì)量擴(kuò)增PUFA-PKS特異性序列
[0061] 4.1生物質(zhì)量的獲得
[0062] 在 250ml 帶有阻流板的 Erlenmeyer 燒瓶中用 Ulkenia sp. SAM2179 或 Ulkenia visurgensis 或另一種 Ulkenia sp.接種 50ml DHl 培養(yǎng)基（50g/l 葡萄糖；12. 5g/l 酵母提 取物；16. 65g/l Tropic Marin ;ρΗ6· 0)并于28°C和150rpm培養(yǎng)48h。隨后用自來水將細(xì) 胞洗滌兩次并離心下去。隨后將以此方式獲得的生物質(zhì)量直接加入到適當(dāng)?shù)腜CR反應(yīng)中。
[0063] 4. 2利用靶標(biāo)特異性寡核苷酸進(jìn)行的PCR反應(yīng)
[0064] 將PCR引物MOFl和MORl (見實(shí)施例1)用作靶標(biāo)特異性寡核苷酸。
[0065] 用無菌牙簽取等份的在4. 1中獲得的來自不同ulkenias的生物質(zhì)量并轉(zhuǎn) 移入50 μ 1體積的PCR反應(yīng)混合物中（lx緩沖液（Sigma) ;dNTPs (每種200 μ Μ); MOFl (20pmol)，MORl (20pmol)和 2. 5U Taq DNA 聚合酶（Sigma))。如 I. 2 中所述進(jìn)行 PCR。
[0066] 將獲得的序列數(shù)據(jù)（SEQ ID No. 1，3和4)與官方EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫 (http://www. ebi. ac. uk/embl/)相比較并進(jìn)行評估。用FASTAX獲得的序列比較與來自 Schizochytrium sp.ATCC20888 的 PUFA-PKS(ORF A ;0RF:開放閱讀框）的酰基載體蛋白產(chǎn) 生高度部分同一性。獲自Ulkenia sp. SAM2179的生物質(zhì)量的PCR產(chǎn)物序列與實(shí)施例1中 的序列相同。
[0067] 令人吃驚的是，即使在此處對于確定來自不同ulkenias的生物質(zhì)量的特定 PUFA-PKS，每次也僅須實(shí)施單次PCR實(shí)驗(yàn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種鑒定樣品中PUFA-PKS基因特異性核酸序列的方法，其中 (a) 利用特異性寡核苷酸并以小部分的樣品作為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)，和 (b) 對獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序并將獲得的序列信息與數(shù)據(jù)庫相比較以便通過與已知 序列的部分一致來鑒定新的PUFA-PKS序列信息， 其特征是所用的寡核苷酸源自氨基酸序列LGIDSIKRVEIL。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征是所述寡核苷酸是簡并性的。
3. 根據(jù)任一項(xiàng)在前權(quán)利要求的方法，其特征是所述寡核苷酸的長度為10_36bp，優(yōu)選 15-25bp并且特別優(yōu)選18bp。
4. 根據(jù)任一項(xiàng)在前權(quán)利要求的方法，其特征是所用寡核苷酸的量優(yōu)選為大約20pmol。
5. 根據(jù)任一項(xiàng)在前權(quán)利要求的方法，其特征是退火溫度為大約45-65°C，優(yōu)選為大約 50-60°C并且特別優(yōu)選為大約53-57°C。
6. 根據(jù)任一項(xiàng)在前權(quán)利要求的方法，其特征是循環(huán)數(shù)為大約20-40,優(yōu)選為大約25-35 并且特別優(yōu)選為30。
7. 根據(jù)任一項(xiàng)在前權(quán)利要求的方法，其特征是分離自生物質(zhì)量的核酸或生物質(zhì)量本身 被用作PCR的模板。 8. SEQ ID No. 5中所示的氨基酸序列LGIDSIKRVEIL。
9. 可衍生自SEQ ID No. 5的核酸序列，優(yōu)選在SEQ ID No. 6, 7和8中所示的核酸。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的核酸，用作雜交探針。
11. 以權(quán)利要求1-7的方法或者通過使用根據(jù)權(quán)利要求9的核酸序列作為雜交探針可 以獲得的(可以鑒定的）核酸。
12. 包含根據(jù)權(quán)利要求11的核酸的微生物。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104263814SQ201410155367
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2005年4月8日 優(yōu)先權(quán)日:2004年4月8日
【發(fā)明者】馬爾庫什·盧伊, 馬西亞斯·魯辛 申請人:努特諾瓦營養(yǎng)產(chǎn)品及食品成分有限公司