一種骨髓去分化間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種骨髓去分化間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。其中包括：從人骨髓中經(jīng)Ficcol分離培養(yǎng)獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，待細(xì)胞處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，直至細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)，棄去間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)3-7天后，棄去誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并以PBS清洗3次將誘導(dǎo)培養(yǎng)基殘夜清除干凈，將細(xì)胞重新置于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，其中每隔2-3天更新新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿后，進(jìn)行正常消化傳代處理，以胰酶消化，消化時(shí)間不超過(guò)1分鐘，細(xì)胞傳代后繼續(xù)培養(yǎng)直到第12-14天結(jié)束。通過(guò)更換培養(yǎng)基的方法獲得的去分化間充質(zhì)干細(xì)胞與傳統(tǒng)的人骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞相比，增殖效率提高，成骨分化能力增強(qiáng)。
【專利說(shuō)明】一種骨髓去分化間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種人骨髓去分化間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng) 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymalstemcells,MSCs)
[0003] 來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，最初在骨髓中被Friendenstein等發(fā)現(xiàn)為非 造血組織干細(xì)胞，由于其具有可分化為間充質(zhì)組織細(xì)胞的能力，故稱之為間充質(zhì)干細(xì)胞。以 后陸續(xù)在許多組織中分離到，包括脂肪、滑膜、軟骨、骨膜、胎盤和臍血。間充質(zhì)干細(xì)胞在合 適的條件下可以分化成為內(nèi)胚層、中胚層和外胚層細(xì)胞等，并且易于分離培養(yǎng)。以其獨(dú)特 的低免疫原性和多向分化和自我更新功能得到了普遍的認(rèn)可，間充質(zhì)干細(xì)胞并廣泛的應(yīng)用 于組織工程和再生醫(yī)學(xué)中。
[0004] 1?間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性
[0005] 間充質(zhì)干細(xì)胞具備以下共同屬性：（1)，間充質(zhì)干細(xì)胞是具有自我維持和自我更新 的細(xì)胞群體，其細(xì)胞數(shù)目是相對(duì)恒定的，即間充質(zhì)干細(xì)胞具有自穩(wěn)定性。（2)，在生物體總的 細(xì)胞構(gòu)成比上，間充質(zhì)干細(xì)胞只占有其中很小的一部分。（3)，間充質(zhì)干細(xì)胞可在適宜環(huán)境 中向不同方向分化，即其為相對(duì)未分化類細(xì)胞。
[0006] LlMSCs具有強(qiáng)大的自我更新和多向分化能力。
[0007] MSCs可以分化為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下不 僅可分化為造血細(xì)胞，還具有分化為肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞的能力。間充質(zhì) 干細(xì)胞可以經(jīng)誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞方向分化，也可以經(jīng)誘導(dǎo)后向脂肪細(xì)胞方向分化，其雙向分 化特性在骨質(zhì)疏松發(fā)生時(shí)的骨量減少和骨髓中的脂肪組織增多相伴行的現(xiàn)象中發(fā)揮重要 作用。研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞在經(jīng)定向誘導(dǎo)成骨分化成熟后，通過(guò)改變誘導(dǎo)培養(yǎng)基的方 法，將成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，可見(jiàn)明顯脂肪細(xì)胞形成。從已分化成熟的 細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)換成另一種細(xì)胞形態(tài)，是間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的特點(diǎn)。MSCs在適宜的外界刺激 作用下可以分化成非中胚層細(xì)胞，包括功能性神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞等。將MSCs 注射到囊胚層后，一部分細(xì)胞分化為多種組織和器官的體細(xì)胞，如大腦，肝臟，腎臟，肺，脾， 血液和皮膚等。間充質(zhì)干細(xì)胞在被誘導(dǎo)后仍然維持其多向分化潛能。
[0008] 1.2MSCS具有獨(dú)特的免疫原性。
[0009] MSCs通過(guò)與細(xì)胞的直接接觸、旁分泌細(xì)胞因子抑制T細(xì)胞的增殖、自身免疫反應(yīng) 的微環(huán)境等多種途徑負(fù)性調(diào)控免疫應(yīng)答，發(fā)揮其免疫重建功能。一些文獻(xiàn)報(bào)道MSCs可以分 泌多種細(xì)胞因子，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，前列腺素，N0,以及通過(guò)細(xì)胞之間的 直接接觸作用參與了H)-l信號(hào)通路。Krampera等證明MSCs在與IFN-Y共培養(yǎng)的時(shí)候 可以抑制B細(xì)胞的增殖。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)在移植前或者移植后多次注射MSCs可下調(diào)免疫 排斥反應(yīng)。Schatton等證實(shí)MSCs可以延長(zhǎng)移植物在體內(nèi)存活時(shí)間。目前大量的文獻(xiàn)報(bào)道 顯示MSCs可以在注射到動(dòng)物體內(nèi)后，發(fā)揮其低免疫原性作用而大大降低移植物引起的免 疫排斥作用。
[0010] 1. 3MSCs來(lái)源廣泛，易于體外分離，擴(kuò)增和培養(yǎng)，多次培養(yǎng)傳代后仍具有干細(xì)胞特 性，在體外可較長(zhǎng)時(shí)間保持相對(duì)未分化狀態(tài)。
[0011] 1.4MSCS間充質(zhì)干細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染率高，并且異體移植排異較輕，配型要求不嚴(yán)格， 能高效穩(wěn)定表達(dá)多種治療性外源目的基因。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞不僅是組織工程中的具有 前景的種子細(xì)胞，還是理想的細(xì)胞增殖分化模型，被認(rèn)為是在治療學(xué)和生物技術(shù)方面有優(yōu) 質(zhì)潛能的種子細(xì)胞，為器官、組織損傷后的再生修復(fù)和自身免疫性疾病治療帶來(lái)新的曙光。
[0012] 2.間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化
[0013] 理想的成骨種子細(xì)胞應(yīng)該具備以下特點(diǎn)：⑴容易取材，對(duì)機(jī)體的傷害小。⑵在 體外的定向培養(yǎng)中可以分化為成骨細(xì)胞，具有較強(qiáng)的增殖傳代能力。（3)細(xì)胞移植入體內(nèi)后 能夠適應(yīng)機(jī)體的生理、病理和應(yīng)力等環(huán)境的影響并能保持成骨的活性。而間充質(zhì)干細(xì)胞作 為組織工程中重要的種子細(xì)胞具備了上述成骨種子細(xì)胞的特點(diǎn)，成為骨組織工程研究中的 具有潛力的優(yōu)勢(shì)種子細(xì)胞。
[0014] 在體外分化培養(yǎng)過(guò)程中，間充質(zhì)干細(xì)胞需要在特定的成骨誘導(dǎo)環(huán)境中培養(yǎng)，才能 分化成骨，形成鈣化骨樣組織。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的過(guò)程分為四個(gè)時(shí)期：（1)細(xì)胞轉(zhuǎn)化期。（2) 細(xì)胞增殖期。（3)細(xì)胞聚集分泌期。（4)細(xì)胞外基質(zhì)礦化期。間充質(zhì)干細(xì)胞在體外成骨誘 導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞形態(tài)由貼壁的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，體積變大。轉(zhuǎn)化后發(fā)生增 殖現(xiàn)象，細(xì)胞呈現(xiàn)出集落、融合、復(fù)層生長(zhǎng)，形成肉眼可見(jiàn)的團(tuán)塊狀。其中是以DNA的復(fù)制和 組蛋白的合成為主要特征。而細(xì)胞聚集分泌期則是以堿性磷酸酶（ALP)的活性增高，I型 膠原分泌增多為主要特點(diǎn)。最后的礦化期有骨鈣素（BGP)分泌和鈣離子增多，一些與細(xì)胞 外基質(zhì)相關(guān)的基因也在這一時(shí)期的表達(dá)達(dá)到高峰，如骨橋蛋白（0PN)，骨鈣素（BGP)，骨唾 液蛋白（BSP)等。間充質(zhì)干細(xì)胞在向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中，一些特異性的骨特征標(biāo)志陸 續(xù)表達(dá)，這些基質(zhì)蛋白相互之間的協(xié)同作用保證了細(xì)胞外基質(zhì)的正常與成熟。細(xì)胞外基質(zhì) 的正常成熟后可將成骨細(xì)胞包埋其中，使其形成正常的骨組織。
[0015] 間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨分化過(guò)程，是一些細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)蛋白，還有信號(hào)調(diào)節(jié)通路 的共同參與和相互作用的結(jié)果，這些調(diào)節(jié)因子在骨形成，骨修復(fù)和骨再生過(guò)程中發(fā)揮重要 的直接或間接的調(diào)控作用，從而保證骨形成過(guò)程正常和順利的進(jìn)行。
[0016] 2. 1骨形成蛋白（BMP)
[0017] BMP是一組在誘導(dǎo)成骨和成軟骨過(guò)程中分泌的重要信號(hào)分子。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 BMP分子有20多種。BMP與細(xì)胞表面的受體結(jié)合從而激活BMP相關(guān)的信號(hào)通路，這些信號(hào) 通路參與了心肌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和軟骨等的形成和發(fā)展過(guò)程。在間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化 過(guò)程中，BMP誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖速度減慢，移植干細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)而向成骨細(xì)胞分 化。是調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的重要的初始信號(hào)分子，具有跨種屬誘導(dǎo)成骨的 特點(diǎn)與能力。
[0018] BMP是在1971年被Urist等在骨基質(zhì)中首先發(fā)現(xiàn)的，由于其存在骨基質(zhì)中能使未 分化的間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，并且形成骨組織的活性蛋白質(zhì)，故被定義 為骨形成蛋白。BMP是不含膠原的低分子量蛋白，在血清中含量很低，促進(jìn)MSCs成骨分化， 以及ALP活性增高，鈣鹽沉積形成新骨，還可刺激血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子合成，增加新生血管形 成，促進(jìn)骨行成和修復(fù)。
[0019] 2. 2成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（Runx2)
[0020] Runx2是轉(zhuǎn)錄因子Runx家族中的一員，是成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)骨形成和 修復(fù)重建起著重要作用，可以調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄。Runx2能激活和啟動(dòng)間充質(zhì)干細(xì)胞向成 骨細(xì)胞分化的信號(hào)分子通路。調(diào)查表明Runx2亞型I主要在成骨細(xì)胞早期增殖過(guò)程中起作 用，Runx2亞型II主要在成骨階段后期對(duì)成骨細(xì)胞的成熟過(guò)程發(fā)揮作用，并且Runx2基因 與成骨細(xì)胞異性順式作用元件結(jié)合后，可激活骨鈣素，骨橋素和膠原蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，說(shuō) 明Runx2在成骨分化后期仍能控制其功能。Runx2決定著多能干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，促 進(jìn)軟骨形成和軟骨血管化，而且與細(xì)胞外基質(zhì)的形成有關(guān)。
[0021] 2. 30sterix
[0022] Osterix是繼Runx2之后發(fā)現(xiàn)的成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，屬于新指結(jié)構(gòu)DNA 蛋白，處于Runx2下游，與Runx2相互作用于成骨分化過(guò)程。
[0023] 體外分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，其成骨分化過(guò)程受到多種因素 的共同影響和調(diào)控。鑒于間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化潛能，以及自體的MSCs移植沒(méi)有免疫反 應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，將間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于骨組織工程具有廣闊的臨床應(yīng)用前景和潛能。對(duì)于滿足 骨組織工程的種子細(xì)胞質(zhì)和量的要求，對(duì)于滿足臨床細(xì)胞治療的需求具有重要而深遠(yuǎn)的意 義。
[0024] 去分化細(xì)胞
[0025] 轉(zhuǎn)分化（Transdifferentiation)是指一種已分化的形態(tài)轉(zhuǎn)變成另一種細(xì)胞形態(tài)， 是間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能特點(diǎn)之一。在細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，從一種細(xì)胞形態(tài)到另一種 細(xì)胞形態(tài)的過(guò)程中，細(xì)胞不是直接發(fā)生轉(zhuǎn)換的，研究表明其中有過(guò)渡階段。在改變間充質(zhì)干 細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)條件后，細(xì)胞從已分化的形態(tài)首先回復(fù)到較為原始的細(xì)胞形態(tài)，即未分化的 間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)，后接受外界已改變的誘導(dǎo)因素刺激，定向分化為另一種細(xì)胞形態(tài)，這個(gè) 過(guò)渡階段也稱之為去分化過(guò)程。去分化Oedifferentiation)又稱脫分化，是指分化細(xì)胞 失去特有的結(jié)構(gòu)和功能變?yōu)榫哂性嘉捶只?xì)胞特性的過(guò)程。去分化往往隨之又發(fā)生再分 化（Redifferentiation)〇
[0026] 兩棲類動(dòng)物在其一生中通過(guò)去分化保證復(fù)雜機(jī)體結(jié)構(gòu)的功能性再生；在哺乳動(dòng)物 中分化是細(xì)胞正常逆轉(zhuǎn)，提高內(nèi)源性再生能力的一種方式。最近的研究表明終末分化的哺 乳細(xì)胞在損傷或一定培養(yǎng)條件下均可發(fā)生去分化。腎臟疾病中腎小管上皮細(xì)胞的修復(fù)首 先需要近曲小管上皮細(xì)胞的去分化，然后去分化的細(xì)胞移行到損傷部位，進(jìn)而再分化恢復(fù) 腎小管的結(jié)構(gòu)和功能。人軟骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞、脂肪基質(zhì)細(xì)胞均可在一定條件下 去分化，具備了某些原始干細(xì)胞特性，在再分化中的分化速度和效率均有提高。Li等在頭 皮移植手術(shù)患者中證實(shí)移植的上皮細(xì)胞去分化后可成為干細(xì)胞或類干細(xì)胞細(xì)胞。人關(guān)節(jié) 軟骨細(xì)胞在體外單層細(xì)胞培養(yǎng)2周后成為去分化，細(xì)胞表型與骨髓MSCs接近，甚至表達(dá)某 些人胚胎干細(xì)胞表型SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60和TRA1-81等，同時(shí)具有分化為軟骨、骨、月旨 肪、心肌和神經(jīng)元細(xì)胞的潛能；體外單層培養(yǎng)6次傳代后的去分化軟骨細(xì)胞在增殖動(dòng)力學(xué) 和細(xì)胞周期都與MSCs相似，高表達(dá)成軟骨相關(guān)基因。人胰島0細(xì)胞用基因細(xì)胞譜系示蹤 (genetic6cell_lineagetracing)的方法去分化后表達(dá)MSCs的表面標(biāo)志，雖然未能誘導(dǎo) 出明顯的中胚層系細(xì)胞，但在體外可擴(kuò)增至16倍以上，并可再分化為胰島細(xì)胞。Zhang等分 離大鼠心肌細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)4-5天后去分化，此時(shí)去分化的心肌細(xì)胞增殖有利增殖，表現(xiàn) 一定程度的干細(xì)胞特性，包括C-kit的表達(dá)和具備多項(xiàng)分化潛能。
[0027] 目前最為典型的去分化細(xì)胞是多能誘導(dǎo)干細(xì)胞（inducedpluripotentstem cells,iPS)，通過(guò)向皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)入0ct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4等轉(zhuǎn)錄 因子基因，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為類多能胚胎干細(xì)胞。iPS解決了再生醫(yī)學(xué)中自體種子細(xì) 胞數(shù)量不足和免疫學(xué)問(wèn)題，Chan等的研究結(jié)果表明MSCs源的神經(jīng)元細(xì)胞撤除神經(jīng)元誘導(dǎo) 因子繼續(xù)培養(yǎng)2周后去分化間充質(zhì)干細(xì)胞（De-MSCs)可重新回到MSCs樣的狀態(tài)，表達(dá)MSCs 的某些標(biāo)志；與未分化的MSCs相比，抗凋亡相關(guān)基因和神經(jīng)元細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)增多，生 存期延長(zhǎng)，再次分化為神經(jīng)元細(xì)胞的速度更快、效率更高，并可轉(zhuǎn)分化為上皮細(xì)胞。人骨髓 MSCs源血管平滑肌細(xì)胞去分化后仍保留血管平滑肌細(xì)胞特有的L型CaVl. 2鈣離子通道，有 利于血管平滑肌的再次分化。并且De-MSCs既保留了間充質(zhì)干細(xì)胞的自我更新和多向分化 能力，而且在再次進(jìn)行定向分化的分化效率是高于未分化MSCs，克服了間充質(zhì)干細(xì)胞在移 植體內(nèi)后的存活率低和分化率低的缺點(diǎn)，可以成為更具有優(yōu)勢(shì)的種子細(xì)胞。目前已開(kāi)始用 間充質(zhì)干細(xì)胞治療臨床上一些難治性疾病，如脊髓損傷、腦癱、肌萎縮側(cè)索硬化癥、系統(tǒng)性 紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、克隆氏病、中風(fēng)、糖尿病、糖尿病足、肝硬化等，根據(jù)初步的臨床報(bào) 告，間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)這些疾病的治療都取得可觀的療效。
[0028] 但是，近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，盡管間充質(zhì)干細(xì)胞顯示出了良好的治療效果，但大多數(shù)的 研究發(fā)現(xiàn)表明MSCs在體內(nèi)的生存期和分化效率都處于較低水平；特別是當(dāng)間充質(zhì)干細(xì)胞 直接注射到損傷部位時(shí)，可觀察到移植細(xì)胞大量死亡，有效細(xì)胞數(shù)目不多，且容易向周圍多 種組織分化，而并不是分化為目的細(xì)胞。這種間充質(zhì)干細(xì)胞在移植體內(nèi)后存在著定向分化 效率差和存活率低的問(wèn)題極大的限制了其在組織工程研究以及臨床上的應(yīng)用前景。并且， 間充質(zhì)干細(xì)胞具有強(qiáng)大的免疫抑制功能，但是越來(lái)越多的研究表明MSCs在分化過(guò)程中免 疫原性上調(diào)，導(dǎo)致機(jī)體的免疫應(yīng)答和移植失敗。因此尋找生存期更長(zhǎng)、分化效率更高的種子 細(xì)胞仍然是組織工程學(xué)中亟待解決的問(wèn)題。
[0029] 而目前現(xiàn)有技術(shù)中常見(jiàn)的獲得去分化細(xì)胞的技術(shù)，主要是采用對(duì)于去分化細(xì)胞的 人工誘導(dǎo)方法，如：轉(zhuǎn)基因、細(xì)胞融合、化學(xué)小分子誘導(dǎo)等。但這些方法存在實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間周 期長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程也極為復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)成本高等問(wèn)題。此外，雖然Chan等研究了使用神經(jīng)元誘導(dǎo) 因子誘導(dǎo)的鼠De-MSCs具有更強(qiáng)的神經(jīng)分化能力，但是該方法僅特異的針對(duì)神經(jīng)元誘導(dǎo)進(jìn) 行研究，目前并沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道利用更簡(jiǎn)便易于操作又節(jié)約的可行的培養(yǎng)方法，以誘導(dǎo)獲得 定向分化效率高存活率高的骨髓去分化間充質(zhì)干細(xì)胞。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0030] 為了解決上述存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出一種骨髓去分化間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng) 方法。通過(guò)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行節(jié)約且短暫的誘導(dǎo)培養(yǎng)后去除誘導(dǎo)條件，繼續(xù)初始的干細(xì) 胞培養(yǎng)而將細(xì)胞培養(yǎng)成為去分化間充質(zhì)干細(xì)胞，該培養(yǎng)方法包括以下步驟：
[0031] 一種骨髓去分化間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0032] 第一步，從骨髓中分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0033] 第二步，將間充質(zhì)干細(xì)胞在間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；
[0034] 其中，第二步所述的細(xì)胞培養(yǎng)的步驟中，還包括更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)的 步驟。
[0035] 其中，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)為將所述的間充質(zhì)干細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-10天，優(yōu) 選的為5-7天。
[0036] 其中，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，從人骨髓分離獲得，優(yōu)選的為 3-5代的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0037] 其中，所述的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有能分化為成骨的能力。
[0038] 其中，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
[0039] 其中，所述第二步的細(xì)胞培養(yǎng)為將細(xì)胞培養(yǎng)至處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，優(yōu)選的，培養(yǎng)至細(xì) 胞密度達(dá)到70%_90%時(shí)，棄去所述間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培 養(yǎng)。
[0040] 其中，在所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)的步驟之后，棄去誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將細(xì)胞重新置于間充質(zhì)干 細(xì)胞完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)并傳代得到De-MSCs細(xì)胞，優(yōu)選的，培養(yǎng)并傳代12-14天。
[0041] 其中，在更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基的之前和之后還包括將培養(yǎng)基殘液清除的步驟。
[0042] 其中，所述的清除的步驟為用PBS進(jìn)行清洗，優(yōu)選的PBS清洗2-3次。
[0043] 其中，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下成分配制而成：DMEM_L培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青 霉素100U/mL、鏈霉素100mg/L、L_抗壞血酸50ug/ml、0 -磷酸甘油鈉10mmol/ml、地塞米松 108mmol/ml。
[0044] 本發(fā)明所述的從骨髓中分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞是從健康的人骨髓中分離采集獲 得的間充質(zhì)干細(xì)胞，并且將細(xì)胞置于間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，通常為使培養(yǎng) 基給細(xì)胞提供充分的生長(zhǎng)所需物質(zhì)，每隔一段時(shí)間更換新鮮的完全培養(yǎng)基，優(yōu)選的每2-4 天更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)(至細(xì)胞密度達(dá)到約70%_90%)，棄去間充質(zhì)干細(xì)胞 完全培養(yǎng)基，以PBS清洗將間充質(zhì)培養(yǎng)基清除干凈，優(yōu)選的，通常采用PBS清洗2-3次。更 換誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行短暫的培養(yǎng)，優(yōu)選地，培養(yǎng)3-10天，更優(yōu)選地，培養(yǎng)5-7天，誘導(dǎo)培養(yǎng)后棄 去誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以PBS清洗將誘導(dǎo)培養(yǎng)基殘液清除干凈，優(yōu)選的PBS清洗2-3次，將清洗后 的細(xì)胞重新置于間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，每隔一段時(shí)間更新新鮮培養(yǎng)基，優(yōu)選的，通常每 隔2-4天更換完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿后進(jìn)行正常消化傳代處理，以胰酶消化，消化 時(shí)間不超過(guò)1分鐘，否則消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，細(xì)胞傳代后繼續(xù)培養(yǎng)直到第12-14 天獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的De-MSCs細(xì)胞。
[0045] 本發(fā)明在以往間充質(zhì)干細(xì)胞正常培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用更換細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，獲 得去分化間充質(zhì)干細(xì)胞，本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法采用本領(lǐng)域常規(guī)使用的完全培養(yǎng)基（間充 質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基）和誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在特定條件和特定劑量配比的培養(yǎng)基培養(yǎng)下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行 短暫誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)易便捷，實(shí)驗(yàn)成本非常低，實(shí)驗(yàn)周期短，僅需經(jīng)短暫誘導(dǎo)時(shí)間便可以 高效的獲得去分化間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法獲得的去分化間充質(zhì)干細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0047] 1)獲得的去分化間充質(zhì)干細(xì)胞其形態(tài)回復(fù)到干細(xì)胞長(zhǎng)梭形，單層，扁平貼壁的狀 態(tài)，表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志。
[0048] 2)保留和維持了部分干細(xì)胞特性，可發(fā)生多向分化，在一定條件下可以分化為成 骨、脂肪、軟骨等，具有修復(fù)與再生的功能。
[0049] 3)在細(xì)胞生物學(xué)特性方面，去分化間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖速率提高，移植體內(nèi)之 后，抗凋亡能力增強(qiáng)，使存活力增強(qiáng)。
[0050] 4)在定向分化能力方面，去分化間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)、外成骨分化效率提高。
[0051] 上述優(yōu)點(diǎn)使本發(fā)明的方法培養(yǎng)的去分化間充質(zhì)細(xì)胞能夠在組織工程中以及臨床 上被廣泛應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0052] 圖1.A光鏡下觀察未分化間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs形態(tài)圖；
[0053] 圖1.B光鏡下觀察去分化間充質(zhì)干細(xì)胞De-MSCs形態(tài)圖；
[0054] 圖2未分化和去分化間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞檢測(cè)圖；
[0055] 圖3光鏡下觀察未分化MSCs和去分化間充質(zhì)干細(xì)胞De-MSCs成脂肪誘導(dǎo)；
[0056] 圖4CCK8檢測(cè)未分化和去分化間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)（n=5,p〈0. 01);
[0057] 圖5.A間充質(zhì)干細(xì)胞成骨再分化7天形態(tài)圖；
[0058] 圖5.B去分化間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化7天形態(tài)圖；
[0059] 圖6.qPCR檢測(cè)未分化和去分化間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨誘導(dǎo)7天成骨相關(guān)基因檢 測(cè)（n=3;**，P〈0. 01);
[0060] 圖7未分化和去分化間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨誘導(dǎo)14天堿性磷酸酶ALP活性檢測(cè) (n=4;**，P〈0. 01);
[0061] 圖8未分化和去分化間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨誘導(dǎo)28天茜素紅染色圖；
[0062] 圖9未分化和去分化間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)成骨誘導(dǎo)7天堿性磷酸酶ALP活性檢測(cè)體 內(nèi)活性檢測(cè)（n=6，P〈0.01);
[0063] 圖10.qPCR分析未分化和去分化間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)成骨誘導(dǎo)7天成骨相關(guān)基 (n=3,P<0. 05)；
[0064] 圖11未分化MSCs和去分化間充質(zhì)干細(xì)胞De-MSCs體內(nèi)成骨誘導(dǎo)30天H&E染色 圖；
[0065] 圖12未分化MSCs和去分化間充質(zhì)干細(xì)胞De-MSCs體內(nèi)成骨誘導(dǎo)30天collagen I型膠原圖。

【具體實(shí)施方式】
[0066] 實(shí)施例1 :誘導(dǎo)培養(yǎng)的成骨去分化間充質(zhì)干細(xì)胞及其生物學(xué)特性分析實(shí)驗(yàn)
[0067] 1 ?材料
[0068] 1. 1 試劑
[0069] 1640完全培養(yǎng)基：Hyclone公司（美國(guó)）;胎牛血清、胰酶、青鏈霉素：Gibco公司（美 國(guó)）；PBS:S〇larbi〇公司（美國(guó)）；DMS0、胰蛋白酶、地塞米松、磷酸甘油、2-磷酸一左旋 VitC、均購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)），試驗(yàn)涉及流式抗體均購(gòu)自eBioscience公司（美國(guó)），細(xì)胞 培養(yǎng)皿及48、96孔板：Corning(美國(guó)），cck8試劑盒（Dojindo日本）。其余試劑均為國(guó)產(chǎn) 分析純。
[0070]1.2?儀器
[0071] C02孵育箱，Thermo(美國(guó)）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；生物安全柜(北京五 洲科技發(fā)展有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫烤箱(八八金實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；酶聯(lián)免疫 檢測(cè)儀（BioTek公司（美國(guó)））；流式細(xì)胞儀（BD公司（美國(guó)））；倒置顯微鏡（Axiovert(德 國(guó)））；正置顯微鏡及照相系統(tǒng)（CarlZeiss(德國(guó)））；超純水過(guò)濾機(jī)（Millipore(美國(guó)））；溫 控離心機(jī)（ThermoFisherScientific(美國(guó)））；離心機(jī)（ThermoFisherScientific(美 國(guó)））;4°C冰箱（Panasonic公司（日本)）;水浴鍋(江蘇榮華儀器制造有限公司）;微量移液槍 (0；118〇11(法國(guó)）） ；超低溫冰箱（1^￥(3〇)。
[0072] 2?實(shí)驗(yàn)方法
[0073] 2. 1骨髓MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定
[0074] 無(wú)菌條件下采集健康成人骨髓3ml(按醫(yī)院規(guī)定，并經(jīng)家屬同意），經(jīng)生理鹽水 稀釋后，在華氏管中加入Ficoll分離液（1. 077g/L)4ml，以2000rpm, 20°C，30min離心， 收集單個(gè)核細(xì)胞，用PBS液洗滌3遍，棄上清，重懸于完全培養(yǎng)基（含L-DMEM，10%FBS)，按 1X105/ml的密度接種于六孔板中，置于37°C、5%C02、飽和濕度的C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，原代細(xì)胞 接種48小時(shí)后進(jìn)行首次全量換液,此后每2-4天進(jìn)行換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿至瓶底70%-90°/〇 時(shí)，傳代，以后按常規(guī)方法傳代、凍存。培養(yǎng)三代以后的細(xì)胞進(jìn)行流式鑒定和分化能力的鑒 定，包括成脂肪誘導(dǎo)和成軟骨誘導(dǎo)，鑒定結(jié)果符合MSCs特點(diǎn)后用于實(shí)驗(yàn)，記為MSCs。
[0075] 2. 2De_MSCs(De-MSCs)誘導(dǎo)和細(xì)胞培養(yǎng)
[0076] 將前述傳代3-5代的MSCs細(xì)胞常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，約長(zhǎng)滿75cm2培養(yǎng)皿約80%，roS洗 3次后加入成骨培養(yǎng)基（低糖DMEM、10%FBS、L-抗壞血酸50ug/ml、0 -磷酸甘油鈉lOmmol/ ml、地塞米松l(T8mmol/ml、青霉素100U/mL、鏈霉素100mg/L)進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，7天后PBS 沖洗3次，加入MSCs完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2-4天換液，正常情況傳代，2周成為去分化干 細(xì)胞，記為De-MSCs。
[0077] 2. 3MSCs和De-MSCs的細(xì)胞表型分析比較
[0078] 細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞，去除培養(yǎng)基，PBS漂洗2次，胰酶消化，待細(xì)胞將要從培養(yǎng) 瓶壁脫落時(shí)，加入培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上吹落并分散成單細(xì)胞懸液。將獲得的 MSCs和De-MSCs調(diào)整細(xì)胞濃度為 1X106/ 孔，分別加入CD29、CD34、CD45、CD90、CD105 和 HLA-DR抗體，lug/孔，置4°C孵育30min，PBS洗2遍，直至單抗可直接上流式細(xì)胞儀檢測(cè)， 間標(biāo)則再加相應(yīng)二抗，再置4°C孵育30min，PBS洗2遍后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。
[0079] 2. 4MSCs和De-MSCs的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
[0080] 細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。倒去培養(yǎng)基，PBS漂洗2 次，胰酶消化，待細(xì)胞將要從培養(yǎng)瓶壁脫落時(shí)，加入培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上吹 落并分散成單細(xì)胞懸液。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并進(jìn)一步稀釋成IX104/mL。將細(xì)胞分種于96板 (MSCs組和De-MSCs組)，每孔加200ill細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板置于5%C02、37°C培養(yǎng)箱中，培 養(yǎng)24小時(shí)（h)細(xì)胞完全貼壁后，分別培養(yǎng)ld，3d，5d和7d。每組每個(gè)時(shí)間段均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。 于培養(yǎng)終止前3h每孔加入20iUCCK8試劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)于酶標(biāo)儀上450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸 光度A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以時(shí)間為橫軸、0D值為縱軸繪制不同組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，進(jìn)行 比較。
[0081] 2. 5MSCs和De-MSCs的脂肪誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)
[0082] 將獲得的MSCs和De-MSCs以相同濃度接種于六孔板中，待生長(zhǎng)至50%滿時(shí)，細(xì) 胞培養(yǎng)液更換為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液（DMEM+10%FBS+IBMX50mmol/L+胰島素lmg/L+地塞米松 0? 1ymol/L+吲哚美辛200ymol/L)進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，約15天后出現(xiàn)脂肪細(xì)胞形態(tài)，油紅 染色鑒定
[0083] 2. 6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0084] 所有數(shù)據(jù)采用均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS17. 0進(jìn)行方差分析，*表示P〈0. 05, **表 不P〈0. 01，為差異有顯著意義。
[0085] 3?結(jié)果
[0086] 3. 1.MSCs和De-MSCs形態(tài)觀察
[0087] 光鏡下見(jiàn)MSCs呈長(zhǎng)梭形，經(jīng)7天成骨誘導(dǎo)后MSCs形成明顯結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)，撤除誘導(dǎo) 繼續(xù)培養(yǎng)2周后的De-MSCs結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)消失，回復(fù)到長(zhǎng)梭樣狀態(tài)，形態(tài)近似MSCs(見(jiàn)圖1A和圖1B)。從細(xì)胞形態(tài)方面說(shuō)明了已分化的MSCs在撤除誘導(dǎo)因素后可以回復(fù)到較為初始的 狀態(tài)，De-MSCs形態(tài)類似MSCs。
[0088] 3. 2?細(xì)胞表型分析
[0089] 目前尚無(wú)MSCs的特異性標(biāo)志，大家公認(rèn)的是不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原，泛白細(xì)胞 表面抗原。如⑶45、⑶34陰性，⑶90、⑶105陽(yáng)性表達(dá)等。我們實(shí)驗(yàn)中所分離的MSCs的表 型鑒定結(jié)果符合這一標(biāo)準(zhǔn)，而De-MSCs流式表型鑒定結(jié)果顯示⑶29,⑶90,⑶105表達(dá)陽(yáng)性， CD34,CD45,HLA-DR表達(dá)陰性，與MSCs的結(jié)果保持一致。提示De-MSCs仍保留MSCs細(xì)胞表 型，具有MSCs部分特性。（見(jiàn)圖2)。
[0090] 3. 3.MSCs和De-MSCs成脂肪誘導(dǎo)
[0091] 將MSCs與De-MSCs以相同細(xì)胞濃度種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)14d后進(jìn)行油紅染 色，兩組細(xì)胞鏡下均可見(jiàn)脂滴形成，提示兩組細(xì)胞成脂肪誘導(dǎo)成功(見(jiàn)圖3)。
[0092] 3. 4.MSCs和De-MSCs的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
[0093] MSCs與De-MSCs組在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察Id, 3d，5d，7d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組細(xì) 胞增殖能力的差別情況，結(jié)果顯示De-MSCs在ld，3d，5d，7d的增殖力均高于同一時(shí)間點(diǎn) 的MSCs。提示De-MSCs在對(duì)其進(jìn)行成骨誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)胞增殖速度快于MSCs，增殖能力更強(qiáng) (p〈0.01，見(jiàn)圖 4)。
[0094] 4?結(jié)果分析
[0095] 本領(lǐng)域已知的MSCs具有的多向分化潛能和獨(dú)特的低免疫原性使其成為理想的異 基因移植首選，和再生醫(yī)學(xué)的種子細(xì)胞，也是組織工程的研究重點(diǎn)。本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)中采用操 作簡(jiǎn)便，周期較短的更換培養(yǎng)基的方法來(lái)誘導(dǎo)去分化細(xì)胞(將MSCs定向誘導(dǎo)一定時(shí)間后重 新置于MSC培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)De-MSCs)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了去分化間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá) 間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志，說(shuō)明De-MSCs仍具有間充質(zhì)干細(xì)胞的分化潛能的可能性。在去 分化培養(yǎng)過(guò)程中，撤除成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件繼續(xù)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)后，培養(yǎng)皿中聚集的細(xì)胞 團(tuán)塊消散，細(xì)胞又恢復(fù)到單層結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)，說(shuō)明De-MSCs具有自我更新的能力。細(xì)胞增殖效率 的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)中，De-MSCs的增殖效率較MSCs更強(qiáng)，說(shuō)明De-MSCs的生長(zhǎng)能力更 好。從細(xì)胞生長(zhǎng)能力的角度可得出本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)出來(lái)的De-MSCs更優(yōu)于MSCs，是更理 想的種子細(xì)胞。并且本發(fā)明方法培養(yǎng)獲得的De-MSCs表達(dá)與MSCs-致的表面標(biāo)志，也具有 自我更新的能力，但是卻不完全相同與MSCs的生物學(xué)特性，具有更強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力。 [0096] 實(shí)施例2 :誘導(dǎo)培養(yǎng)的去分化間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨潛能分析實(shí)驗(yàn)
[0097] 1 ?材料
[0098] 1. 1 試劑
[0099] 1640培養(yǎng)基：Hyclone公司（美國(guó)）;胎牛血清、胰酶、青鏈霉素：Gibco公司（美國(guó)）； PBS:solarbio公司（美國(guó)）;DMSO、胰蛋白酶、地塞米松、P-磷酸甘油、2-磷酸一左旋VitC、 茜素紅均購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)），試驗(yàn)涉及流式抗體均購(gòu)自eBioscience公司（美國(guó)），細(xì) 胞培養(yǎng)皿及48、96孔板：Corning(美國(guó)），cck8試劑盒（Dojindo日本），逆轉(zhuǎn)錄試劑及qPCR 試劑均購(gòu)自Takara公司（日本），ALP試劑盒（南京基天公司）。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0100] 1.2 儀器
[0101] 0)2孵育箱，Thermo(美國(guó)）;超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠；生物安全柜：北京五洲 科技發(fā)展有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫烤箱：八八金實(shí)驗(yàn)器材有限公司；酶聯(lián)免疫檢測(cè) 儀：BioTek公司（美國(guó)）；流式細(xì)胞儀：BD公司（美國(guó)）；倒置顯微鏡：Axiovert(德國(guó)）；正 置顯微鏡及照相系統(tǒng)：CarlZeiss(德國(guó)）；超純水過(guò)濾機(jī)：Millipore(美國(guó)）；溫控離心機(jī)： ThermoFisherScientific(美國(guó)）;離心機(jī)：ThermoFisherScientific(美國(guó)）;4°C冰箱： Panasonic公司（日本);水浴鍋：江蘇榮華儀器制造有限公司；微量移液槍：Gilson(法國(guó)）； 超低溫冰箱：Revco;普通逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增（RT-PCR擴(kuò)增儀）--德國(guó)Biometra公司；實(shí)時(shí) 定量PCR儀：Bio-RadCFX96 (美國(guó)）。
[0102] 2?實(shí)驗(yàn)方法
[0103] 將MSCs和De-MSCs(細(xì)胞培養(yǎng)方法同實(shí)施例1中2. 1和2. 2的操作步驟）分別進(jìn) 行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)7天后分別記為間充干細(xì)胞成骨（0B)和去分化成骨（Re-〇B)。
[0104] 將MSCs和De-MSCs，0B和Re-〇B四種細(xì)胞以相同的細(xì)胞濃度收集起來(lái)，用于實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)。
[0105] 2. 1實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MSCs和De-MSCs，0B和Re-〇B成骨相關(guān)基因表達(dá)
[0106] ①器材準(zhǔn)備
[0107] (1)，滅菌消毒：所有塑料器具經(jīng)濃鹽酸浸泡過(guò)夜，充分洗滌，依次用單蒸水及雙蒸 水沖洗后于37°C烘干，然后輻照滅菌；所用玻璃器具經(jīng)潔消精浸泡30min，依次用單蒸水及 雙蒸水沖洗后高溫烘干，120°C高壓滅菌。
[0108](2)，去RNA酶處理：所用的EP管、槍頭等塑料器材均經(jīng)0. 1%DEPC水浸泡過(guò)夜，烘 干后120°C高壓滅菌處理；試劑需未拆封或DEPC水配制。
[0109] ②引物的設(shè)計(jì)和合成
[0110] 所用引物由上海生工合成。見(jiàn)表.1
[0111] ③MSCs和De-MSCs, 0B和Re-〇B總RNA提取
[0112] 所用器材及試劑經(jīng)去RNA酶處理，依據(jù)Trizol試劑盒，收集細(xì)胞加入1mlTrizol 液，漩渦震蕩，室溫靜置l〇_15min，使細(xì)胞完全破壁。取溶解細(xì)胞轉(zhuǎn)入Eppendorf管中；力口 入氯仿0. 2ml，上下翻轉(zhuǎn)震蕩15s，室溫靜置2-3min;4°C離心，12,000gX20min;轉(zhuǎn)移上層無(wú) 色水相至另一Eppendorf管中，加入與上層水相相同體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10min; 4°C離心，12, 000gX10min;棄上清,75%乙醇洗漆沉淀一次，4°C離心，7, 500gX5min;放在 操作臺(tái)中至沉淀干燥，取適量的DEPC水溶解沉淀，并在室溫靜置10min，使沉淀完全溶解， 分裝后_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0113] ④逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0114] 每個(gè)樣本各取5iURNA提取物加入200iU反應(yīng)管中，隨后加入〇lig〇(dT)liil， DEPC水6ill至12iil，混勻離心3秒，以上操作均在冰盒上進(jìn)行，置于PCR儀反 應(yīng)：65°C5min;然后立刻置冰上 5min，以此加入 5XRT-buffer4iil，10XdNTP2iil， Ribonucleaseinhibiterlii1，Reversetranscriptaselii1，DEPC水至 20ii1，PCR儀進(jìn)行 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：42°C60min，70°C5min。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物保存于-20°C備用。見(jiàn)表.2
[0115] ⑤Real-timePCR反應(yīng)一相對(duì)定量分析
[0116] 操作程序按照SYBR?PrimeScriptRT-PCRKitII(TaKaRa)進(jìn)行（見(jiàn)表.3):取 ④所得的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA2iil加到96孔PCR反應(yīng)管中，加入TakaraSYBRGreenlOiil， Primer1 及Primer2 各 0? 8u1，RoxReferenceDye(50X) 0? 4ul,DEPC水 6u1，上述過(guò)程均在 冰盒上操作。Real-timePCR擴(kuò)增儀反應(yīng)，反應(yīng)條件：40cyclesat95°C30sec，60°C34sec， 72°C30sec(見(jiàn)表.4)。以GAPDH作為內(nèi)參。擴(kuò)增產(chǎn)物由LightCycler軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析。
[0117] MSCs和De-MSCs成骨相關(guān)基因BMP2,Runx2,Osterix,DLX5,Beta-cmRNA擴(kuò)增倍數(shù) 的影響按下列公式計(jì)算：

【權(quán)利要求】
1. 一種骨髓去分化間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟： 第一步，從骨髓中分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞； 第二步，將間充質(zhì)干細(xì)胞在間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)； 其特征在于，第二步所述的細(xì)胞培養(yǎng)的步驟中，還包括更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng) 的步驟。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)為將所述的間充質(zhì) 干細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-10天，優(yōu)選的為5-7天。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為人骨髓間充 質(zhì)干細(xì)胞，優(yōu)選的為3-5代的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有能 分化為成骨的能力。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 基。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述第二步的細(xì)胞培養(yǎng)為將細(xì)胞培 養(yǎng)至處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，優(yōu)選的，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到70%-90%時(shí)，棄去所述間充質(zhì)干細(xì)胞完 全培養(yǎng)基，更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，在所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)的步驟之后，棄去 誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將細(xì)胞重新置于間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)并傳代得到De-MSCs細(xì)胞， 優(yōu)選的，培養(yǎng)并傳代12-14天。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，在更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基的之前 和之后還包括將培養(yǎng)基殘液清除的步驟。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的清除的步驟為用PBS 進(jìn)行清洗，優(yōu)選的PBS清洗2-3次。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下 成分配制而成：DMEM-L培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青霉素100U/mL、鏈霉素100mg/L、L-抗壞血 酸 50ug/ml、0 -憐酸甘油鈉 10mmol/ml、地塞米松 10_8mmol/ml。
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK104342402SQ201410155438
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月30日
【發(fā)明者】施勤, 楊惠林, 張慧 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)