一種太湖新銀魚微衛(wèi)星dna分子標記的引物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種太湖新銀魚微衛(wèi)星DNA分子標記的引物及其制備方法。所述太湖新銀魚微衛(wèi)星DNA分子標記的引物包括：如序列表中SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.38所示的引物。所述制備方法包括：將太湖新銀魚的基因組的酶切片段經(jīng)第一次PCR擴增后與生物素重復探針雜交，將雜交產(chǎn)物通過磁珠富集法篩選出微衛(wèi)星片段，將微衛(wèi)星片段經(jīng)過克隆和陽性鑒定后進行測序，得到相應的微衛(wèi)星位點序列；設(shè)計引物，引物與太湖新銀魚的基因組進行PCR擴增；將擴增產(chǎn)物采用電泳分離，再經(jīng)過固定、銀染處理；挑選出多態(tài)性位點的微衛(wèi)星引物。利用該制備方法得到的19對引物能在太湖新銀魚的樣本中擴增出條帶清晰、多態(tài)性高的微衛(wèi)星條帶，有助于對太湖新銀魚從遺傳學的角度去分析其入侵適應機制。
【專利說明】—種太湖新銀魚微衛(wèi)星DNA分子標記的引物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，特別涉及一種太湖新銀魚微衛(wèi)星DNA分子標記的引物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]太湖新銀魚(Neosalanxtaihuensis)屬鮭形目，銀魚科,新銀魚屬，是長江中下游及其附屬湖泊重要的小型經(jīng)濟魚類，主要生活在敞水區(qū)的中上層，其終生以浮游動物中的枝角類和撓足類為主要食物。由于銀魚便于冷凍、曬干、儲藏、運銷，在國內(nèi)外具有廣闊的市場，是優(yōu)良的綠色食品。
[0003]太湖新銀魚作為我國最廣泛的移植對象，移植到我國不同大小湖泊和水庫中，由于其自身的生物學特性快速適應當?shù)丨h(huán)境成為外來入侵種。
[0004]在實現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問題:
[0005]太湖新銀魚入侵機制的研究主要是在遺傳學方面，但是，現(xiàn)有技術(shù)中對于太湖新銀魚從遺傳學的角度去分析其入侵成功的研究還未開展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中對太湖新銀魚的入侵機制的研究還未開展的問題，本發(fā)明實施例提供了一種太湖新銀魚微衛(wèi)星DNA分子標記的引物及其制備方法。所述技術(shù)方案如下:
[0007]一方面，本發(fā)明提供了一種太湖新銀魚微衛(wèi)星DNA分子標記的引物，包括:
[0008]Nt38正向引物如序列表中SEQ ID N0.1所示；
[0009]Nt38反向引物如序列表中SEQ ID N0.2所示；
[0010]Nt39正向引物如序列表中SEQ ID N0.3所示；
[0011]Nt39反向引物如序列表中SEQ ID N0.4所示；
[0012]Nt43正向引物如序列表中SEQ ID N0.5所示；
[0013]Nt43反向引物如序列表中SEQ ID N0.6所示；
[0014]Nt45正向引物如序列表中SEQ ID N0.7所示；
[0015]Nt45反向引物如序列表中SEQ ID N0.8所示；
[0016]Nt49正向引物如序列表中SEQ ID N0.9所示；
[0017]Nt49反向引物如序列表中SEQ ID N0.10所示；
[0018]Nt50正向引物如序列表中SEQ ID N0.11所示；
[0019]Nt50反向引物如序列表中SEQ ID N0.12所示；
[0020]Nt52正向引物如序列表中SEQ ID N0.12所示；
[0021]Nt52反向引物如序列表中SEQ ID N0.14所示；
[0022]Nt54正向引物如序列表中SEQ ID N0.15所示；
[0023] Nt54反向引物如序列表中SEQ ID N0.16所示；[0024]Nt55正向引物如序列表中SEQ ID N0.17所示；
[0025]Nt55反向引物如序列表中SEQ ID N0.18所示；
[0026]Nt56正向引物如序列表中SEQ ID N0.19所示；
[0027]Nt56反向引物如序列表中SEQ ID N0.20所示；
[0028]Nt57正向引物如序列表中SEQ ID N0.21所示；
[0029]Nt57反向引物如序列表中SEQ ID N0.22所示；
[0030]Nt59正向引物如序列表中SEQ ID N0.23所示；
[0031]Nt59反向引物如序列表中SEQ ID N0.24所示；
[0032]Nt61正向引物如序列表中SEQ ID N0.25所示；
[0033]Nt61反向引物如序列表中SEQ ID N0.26所示；
[0034]Nt63正向引物如序列表中SEQ ID N0.27所示；
[0035]Nt63反向引物如序列表中SEQ ID N0.28所示；
[0036]Nt67正向引物如序列表中SEQ ID N0.29所示；
[0037]Nt67反向引物如序列表中SEQ ID N0.30所示；
[0038]Nt70正向引物如序列表中SEQ ID N0.31所示；
[0039]Nt70反向引物如序列表中SEQ ID N0.32所示；
[0040]Nt71正向引物如序列表中SEQ ID N0.33所示；
[0041]Nt71反向引物如序列表中SEQ ID N0.34所示；
[0042]Nt74正向引物如序列表中SEQ ID N0.35所示；
[0043]Nt74反向引物如序列表中SEQ ID N0.36所示；
[0044]Nt79正向引物如序列表中SEQ ID N0.37所示；
[0045]Nt79反向引物如序列表中SEQ ID N0.38所示。
[0046]另一方面，本發(fā)明提供了一種上述的引物的制備方法，所述方法包括:
[0047]將太湖新銀魚的基因組的酶切片段經(jīng)第一次PCR擴增后，得到第一次擴增產(chǎn)物，所述第一次擴增產(chǎn)物與生物素重復探針雜交，獲得雜交產(chǎn)物，將所述雜交產(chǎn)物通過磁珠富集法篩選出所述太湖新銀魚的基因組中的微衛(wèi)星片段，將所述微衛(wèi)星片段經(jīng)過克隆和陽性鑒定后進行測序，得到相應的微衛(wèi)星位點序列；
[0048]針對所述微衛(wèi)星位點序列設(shè)計引物，將所述引物與所述太湖新銀魚的基因組進行第二次PCR擴增，得到第二次擴增產(chǎn)物，設(shè)計所述引物的參數(shù)為:所述引物的長度為18-25bp，鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比率為30-70%，退火溫度大于50_65°C，預期經(jīng)所述第二次PCR擴增后的擴增片段的長度為100-350bp ；
[0049]將所述擴增產(chǎn)物采用質(zhì)量分數(shù)為8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將分離后的擴增產(chǎn)物經(jīng)過固定、銀染處理并記錄結(jié)果；
[0050]觀察結(jié)果，挑選出能擴增出條帶清晰的且多態(tài)性高的所述擴增產(chǎn)物對應的引物，所述引物序列如序列表中SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.38所示的引物。
[0051 ] 具體地，所述第一次PCR擴增條件為:預變性94 V 5min ；94 V 45S，53 V 45S，720C lmin，循環(huán) 20 次；最后延伸 72°C IOmin0
[0052]具體地，所述第二次PCR擴增的程序為:94°C預變性5分鐘，94°C變性40秒；59°C退火30秒，72°C延伸40秒，共35個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。[0053]具體地，所述第二次PCR擴增的反應體系為:如序列表中SEQ ID N0.1-SEQID N0.38所示的引物各 0.2 μ M，0.2mM dNTP, I XPCR Buffer, 2.0mM Mg2+，Taq 酶 0.5U, 10_50ngDNA 模板，用滅菌蒸餾水補足到總體積到10 μ L。
[0054]進一步地，所述DNA模板為隨機挑選的所述太湖新銀魚的樣本。
[0055]具體地，所述電泳分離條件為:電壓1000V，電泳時間90-120min。
[0056]具體地，所述生物素重復探針如序列表中SEQ ID N0.39-SEQ ID N0.41所示。
[0057]具體地，采用酚氯仿抽提所述太湖新銀魚的基因組，將抽提出的所述太湖新銀魚的基因組通過MseI酶進行酶切，獲得所述太湖新銀魚的基因組的酶切片段。
[0058]具體地，所述通過磁珠富集法篩選出所述太湖新銀魚的基因組中的微衛(wèi)星片段的方法為:將重量為l_2mg的磁珠用300μ1 TENlOObuffer洗滌3次；再用40 μ ITENlOObuffer重懸所述磁珠，將所述雜交產(chǎn)物加入重懸后的所述磁珠中，在室溫下反應30min并輕輕攪動，使所述磁珠與所述太湖新銀魚的基因組中的微衛(wèi)星片段特異性結(jié)合；使用400 μ I TENlOOObuffer室溫洗滌所述磁珠3次，再用400 μ 10.2 X SSC/0.1 % SDS緩沖液室溫洗滌所述磁珠3次；向所述磁珠中加入50 μ I滅菌蒸餾水，混勻，將混均后的所述反應液放置于95°C水中水浴5min,用磁架固定所述磁珠后，吸取所述反應液中的上清液,所述上清液中含有所述太湖新銀魚的基因組中的微衛(wèi)星片段。
[0059]本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是:本發(fā)明實施例提供了一種太湖新銀魚微衛(wèi)星DNA分子標記的引物及其制備方法，該引物能在太湖新銀魚的樣本中擴增出條帶清晰、多態(tài)性高的 微衛(wèi)星條帶，使得本發(fā)明提供的引物能夠應用于太湖新銀魚的種群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳變異水平等方面的研究，采用微衛(wèi)星分子標記可以對太湖新銀魚的種群遺傳學研究提供較為豐富的遺傳基礎(chǔ)信息，同時能夠?qū)μ裸y魚從遺傳學的角度去分析其入侵適應機制。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0060]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0061]圖1為本發(fā)明實施例中Nt38位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0062]圖2為本發(fā)明實施例中Nt39位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0063]圖3為本發(fā)明實施例中Nt43位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0064]圖4為本發(fā)明實施例中Nt45位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0065]圖5為本發(fā)明實施例中Nt49位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0066]圖6為本發(fā)明實施例中Nt50位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0067]圖7為本發(fā)明實施例中Nt52位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0068]圖8為本發(fā)明實施例中Nt54位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0069]圖9為本發(fā)明實施例中Nt55位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0070]圖10為本發(fā)明實施例中Nt56位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0071]圖11為本發(fā)明實施例中Nt57位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0072]圖12為本發(fā)明實施例中Nt59位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0073]圖13為本發(fā)明實施例中Nt61位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0074]圖14為本發(fā)明實施例中Nt63位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0075]圖15為本發(fā)明實施例中Nt67位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0076]圖16為本發(fā)明實施例中Nt70位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0077]圖17為本發(fā)明實施例中Nt71位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0078]圖18為本發(fā)明實施例中Nt74位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖；
[0079]圖19為本發(fā)明實施例中Nt79位點的微衛(wèi)星DNA分子標記的引物擴增24個太湖新銀魚的DNA的銀染圖。
【具體實施方式】
[0080]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明實施方式作進一步地詳細描述。
[0081]實施例
[0082]1、太湖新銀魚的基因組中的微衛(wèi)星序列的獲得:
[0083]將生物素重復探針和太湖新銀魚的基因組的酶切片段經(jīng)第一次PCR擴增后，得到第一次擴增產(chǎn)物，該第一次擴增產(chǎn)物與生物素重復探針雜交，獲得雜交產(chǎn)物，將雜交產(chǎn)物通過磁珠富集法篩選出太湖新銀魚的基因組中的微衛(wèi)星目的片段，將微衛(wèi)星片段經(jīng)過克隆和陽性鑒定后進行測序，得到相應的微衛(wèi)星位點序列。
[0084] 具體地，采用酚氯仿抽提太湖新銀魚的基因組，將抽提出的太湖新銀魚的基因組通過MseI酶進行酶切，獲得太湖新銀魚的基因組的酶切片段。[0085]具體地，第一次PCR擴增條件為:預變性94°C 5min ；94°C 45S，53°C 45S，72°C lmin,循環(huán)20次；最后延伸72°C IOmin0
[0086]具體地，通過磁珠富集法篩選出太湖新銀魚的基因組中的微衛(wèi)星片段的方法為:將重量為l_2mg的磁珠用300 μ I TENlOObuffer洗滌3次；再用40 μ ITENlOObuffer重懸磁珠，將雜交產(chǎn)物加入重懸后的磁珠中，在室溫下反應30min并輕輕攪動，使磁珠與太湖新銀魚的基因組中的微衛(wèi)星片段特異性結(jié)合；使用400 μ I TENlOOObuffer室溫洗滌磁珠3次，再用400 μ 10.2 X SSC/0.1 % SDS緩沖液室溫洗滌磁珠3次；向磁珠中加入50 μ I滅菌蒸餾水，混勻，將混均后的反應液放置于95 °C水中水浴5min,用磁架固定磁珠后,吸取反應液中的上清液，該上清液中含有太湖新銀魚的基因組中的微衛(wèi)星片段。
[0087]得到相應的微衛(wèi)星位點序列具體如下:
[0088]> Nt38 如序列表中 SEQ ID N0.42 所示:
[0089]TAACACTGTGATTGGCTCTCTGGAGCTCTGAGGAGATTCTAATGACGATGCACAATCAGGCAGTGTTTTGTTGGCCAATCCTGTCTCTGCTGTTTTGTTATTGTTGTTGATGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTCTTGTGGCCTCAGGTACAACCAAAGATATGAGTTCTTGAAGGCACAAAGGAGAGGTTTTGATGGTTGAGCTGGACTGGTCAGAGACCTTCCCTCCCCTCATGCTGATCTGCAGCATGTGGATCTGGTCTCCATTCTTACGCTT
[0090]編號:1，重復元件:TGT，重復次數(shù):7，起始位置:111。
[0091]> Nt39 如序列表中 SEQ ID N0.43 所示:
[0092]TAAGTGGATCTGGGTGAAGCTGTATGTTAGACGGAGGTCAGTGAGTTCGCACACCATGGTGATGGTGGCGTGGGGGGAGGATTGGAAAGACCCTCTGTGGATGTCACGCTAACATGCATACAGGAGTGGCTTTCTACCAACTGCTTTGTACCAAAGTCTACATCAAATTGTCTTTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGAAGGGAATACATTGATTGTGGTTCTGTTAGATTCTGTTAGAACAATTGGATAGGTGGGAATTATACTAGGTAGAAAAACACTCAACATATATAAGGTGGTTGTGT
[0093]編號:1，重復元件:TTG，重復次數(shù):8，起始位置:175。
[0094]> Nt43 如序列表中 SEQ ID N0.44 所示:
[0095]TAAGGGTTACCTCCACTATAAACAATCTGATTCATGCCATTCACAAACCCAACGGTTCTTGTTTGTAAGATCGTTGACTAGCTGCCTTTGTGTTGATACCCAAAGCCAAGTGTGTCTGAATGACGTGTTTTGACGGGTTTGTTCCACCACACAGGAGCAGAGAGACTGAGGAGGCCAGGATGGAGGAAGAGGAAGATTATTATTGATCTGCGGTCACAGCACGCCTGACTCACTATCAATTACAATACAGCTTAGCGGCTGGGATCACGGTGCTCTCATACAGCTGCGAAACGTGACAACAACAACAACAACAACAACAACAACCACCACAACAACAACTACAACAATAACAACAGTTGTGTTTGCAGCTCGCAATGCAAAAATCCAATCAACAAGGAAGTTCAGCCACCGAGCATTAGATAACCTCTGGACGTCAAGAGCAAAGTCACGCTAACAGACAGGTCTGT
[0096]編號:1，重復元件:ACA，重復次數(shù):9，起始位置:296。
[0097]> Nt45 如序列表中 SEQ ID N0.45 所示:
[0098]TAAGGGTGCCACTGAGTCCATTGCACTTGGTCAGAAGCTCATGCTGTGATGCAGCCGTCAGTCTCTCTGTTTCCTTGGAAACGGTCCTCGGCGTCGTTCAGTGGTTATAATCGCAAGTTTTCATCAACAACAACAACAACAACAACAATAAGGTTGGGGTCGAGGAGGGGGGGGGGTCGAGAGGCCTTCACTTGCTGTTGTCGTTCCCTTGTGTTATCTAAGGCTGATTGGT
[0099]編號:1，重復元件:CAA，重復次數(shù):8，起始位置:125。
[0100]> Nt49 如序列表中 SEQ ID N0.46 所示:[0101]TAATTGGACATTGTGGAAAAATTGTCCCTAGTGTATGACTGTGTGAGTGAATGGTTGTCTCTATGTTGTCTGTCAATGTCTGTGTGATAGCCGTGCGACTAGCTGGCCCCAGTCCAGGGTGTACCCTGCCTACGGCCCGGAAGTAACTGGGATAGTCTCCAGTCACCCGTGACCCCTAACTGGAATAAGCGGTAGAAAATGAATGAATGAATGAATAGTATGGCACTCAGAAATATCACTTGTTGTTGCTGTTGTGGTTCAGAAACTCGCTATTGTTGTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGCTGCTGTAATACTCGTGCCACAGACTACTGTCTGGCAGAGGCTCACCT
[0102]編號:1，重復元件:GTT，重復次數(shù):10，起始位置:280。
[0103]> Nt50 如序列表中 SEQ ID N0.47 所示:
[0104]TAAGGTGGTCCAGTTTTCAGCAAGATAAGTTTGGTTTTGTGCAACAAAAAAATGAAAAGATTTCAACAACAACAACAACAACAACAAACAAGACGGAAAAACAAACAAACAAAAACAACGAACAAAAAGAGAAATCAGTGAACATCTTTAGGTTTCAGTGCATCAGGTGTGACTTGGACTGGCTTGAAGTTTCCCTTCTGCATCCAGGTGATTGTGACCCATAAAGTGCTGCCTGAGTCTGGGTAGAATTCCTCCAGGCCTGGCCAGGGGTCCTCCCAGTCCACAGGCCCGTGGTCGGTGGAGGGATATGGGGGT
[0105]編號:1，重復元件:CAA，重復次數(shù):8，起始位置:64。
[0106]> Nt52 如序列表中 SEQ ID N0.48 所示:
[0107]TAAGGCAAGCATCTCCGACGGGTGATAGTGCACATGTAGGAAGCAGACAACAAAGCAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAGGGCACCTGGCTGCGACTTGAAGACAATCCTTCATTAGTTCCCCAGGGGTGAATTCCAGTTCATTACAGCAGCAGTGTAGACTCCTGGTCTAGCATGCATGTCAGCTGTCAGCTAAGACGCTTTCTCACCGGTCAGTTTCCTTGTCTTTCAGAAGCTGGGCTGTGATCCTGAGGAGGACGGCTTCTTTGACCTCCTCAGCAGGTTCCAGAGCAGCCGTATGGATGACCAGCGCTGCAACTTACATGACACACAGAATGGAGACAAGAATGGCCTTGATGCAGCGGACATCTTATCCTTCAGTGAAATGCTTGGTACAGGCAGATAACAGCTGGCCTCTACACTGGTGCAAAGCTACTGACACTTTCAGTGTTTTCCATTCACTAGATTCGATTTTCCATTCACTATGGACAT
[0108]編號:1，重復元件:CAA，重復次數(shù):19，起始位置:56。
[0109]> Nt54 如序列表中 SEQ ID N0.49 所示:
[0110]TAAGTAAGTGGTCAGGCTACGCGGTATAAATCATTTTGATCATTCTACACTTGGGACCGTGATGGGGGGGCGTGAGGATTTTACGACAGTCGCCCCCCACGTGAAACTTCACAAACGACCCCCCTTGATTGATCCCTTCAACGTTAGCCAACCGAATGAMACACCAGTTGATCCACTCCTTCAAATGAGCAAACAAACCGTTCGGACTGTGAGATAATCTGTGCCGAGTCATCCGCAGGGTGACCTACAGTTAGACCGAGCTCTCCGTGACTAACAACAAGAGGATCACAGGTGCTGGAGGCTAAAACAGGAACGTGGCAGCGTCAGAAGTGACGAGGCACTACGACACCCAGCAGCCATCTGTGCCCTGAAGATCCAGCTGCTGAACCTGCCAGCCTGTACTCACTGCCTGTCAAGACAGCAACTGCACAATAGTATTTCTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTATGTGATTATGCAACATACACTAAGAGAGAGGCTTCCATGCAGGAATCCCTTCAGGACTATCCATGGATAGTCGCAGGTTCGGAAGATGCTTCGATCCGAAACCGAAGCGATCGCCGGCTGTACTCACTGAGAGGCATGAGGATGTTGGGGGGCGGCGTCGTCCGCATTCTCTCCGTCCGACTTGTCTCCGCCCTCCACGTTCGGCTCCACCCTCTCCCGCTTCTCCTTGTGGCCGGACTTGCGTCGGTGGCGTCGCCGGCGGTGGTAGCTCTTGGGCACATGCACGCCGATGTACACCGTGTGGTGACCTATCACAGCCCAGGAGAAGGCGGGTCAGAT
[0111]編號:1，重復元件:TGT，重復次數(shù):8，起始位置:443。
[0112]> Nt55 如序列表中 SEQ ID N0.50 所示:
[0113]TAAGTTCAGGGCGTCCACACTTCTCTTCTGTGTGTTCCATTTCTACGCTCGCTTCCTCGTTCTTCTCTTTCCTCTTGGTGTCATGTGACAAAGGCGGGAGCCAGTCTGTTTGTCTGCCAGCTGGCTCCTCCCCCATACCTGTCAGACAGGTGGGAGCATGATGGGGCTTGGTCACACTCCCAGGCGCTCCTCTCCCCCGCTCACACTAGGAGCTGAAGAGTGCTCGCTACCACAGTAAGACCCTGTGACGGGATTCCACTGTGCTGGTGTAGAGACAGAAAGCTGCTGCTGCTG
TTGTTATTGCTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTACTGTTTTTGAACTGAAGCGGTGGCAAAGTTGACGCTA
TCGCTGCTGAAGTTAGGAATAAGCTCTCTCTGTTTGCTGTTGTCTGAACACCTGTCCTCTCTTCCCTTTGTCAGA
AAGCAGAGATGGAGGAGT
[0114]編號:1，重復元件:TGT，重復次數(shù):9，起始位置:305。
[0115]> Nt56 如序列表中 SEQ ID N0.51 所示:
[0116]TAAGTATTCTGTCTCGCTTTTTCATTGTGTCCTGCAGAAGTGTGTGCATAGTGTGGTAAACAGGAAGAGAAGAGGGGGGACTTCTTTGGTTTGTCTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGGAGTGAGGTTTTGTTATCCTAAGGACATATAAACAGAAACATACTTATCTGGACATCGGTGTTCACTGAAATCAGTGCAAGGCTCATACTATTATGGAAATAGCAAGACTTGCAATGCAATGATGACCCTCGATCGTCAATGGGCTATATCTGTGTGTAGGACATATTTTTGTGACCCATGAATCTCATACACCCTGTTCATATGCTCCATCAGGTTCTTTTTAGATCTCATAGAATGAAAGTCATGTAATGTTGTGTAAGCTGTGT
[0117]編號:1，重復元件:TGT，重復次數(shù):12，起始位置:96
[0118]> Nt57 如序列表中 SEQ ID N0.52 所示:
[0119]TAATGGTGAGGGTGGAATGGAGGGGAAAAACAGCACCTCTGGGCGGATTCTCATTCTAAATTAGAAATTTCCAGAAGAACATGAGTTCAACAGCTGCATATTCAACATGTCACAGTGACCTGCTTCTTCTTCTCTCTGGCCCTCAGGATGACTCTTCATCAGACAGTGACGATGACAAAAAGAAGAAGAAGAAAAAGAAGAAGAAGAAAAAACAGATGAAGAAGAAAAAGGTTTGGCGTCTAAGAGCAAATCTCTGCCCTGGGTCTCCTAAAGACATACACAGGTTGTGTCATGGTGTTTAGTTTTTACTGTATTTCATCAAAGTTTGTCTGTCTCAGGATTCAGATGATGATTCAGACAGCGAGAAGGAAAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAAATGAAGAAGAGGAAGGTGTGTGACCAAAGCAAACATGGGATGAAGGTCTCCTTTGGGACATGCATGGGTTTTGATGTTGTTC
[0120]編號:1，重復元件:AAG，重復次數(shù):6，起始位置:372
[0121]> Nt59 如序列表中 SEQ ID N0.53 所示:
[0122]TAACTACAGGGCCTGGCTGTGTTCCATCACATGACCCTCTAGTCATGTGCTGCCTCTTGCTACACGTCACATGACAGGTGTTTCTGTGTCCAGGCAGCAGCTCCAAGCTTTAGGGCTCTACACTGGACACTGTCCTGAGACAGAGAGAGGAAGAGAGAAGAAGAAGAAGAAGAGGCACTTCCTGCCTGGAGTGGGCCGAGGAGAGTACAGGCACCATGTGACCAGATCACAGCCTCAGCACATCACTGCCACGTTTCTCTCTCACACACACTCTCAATTCATAAAACAGAAAGCAGTGTCACAGCACAGGCCTGTGAGAGTCCTGACCAGGTGCGACTCAGGAACATGATATTACCAGGATGCACAGAAACAAGGTCAACTGATGAATTAGTGAAGTGTGACTTGGAATATAATATCCATTTTGATGGCTCCATTATGATGAAGTCATGTGATTCTGAAGACCCTTATCTCATTGGCTTATCAAAGCACCATATCAAGTTATAAATATTTGTGTGATGAGTCAGGTAAGGGCTGACAGTCCTGTTCCATCAGTGTGTTTATGGAACAGAACCAGTCAACAAACATGATAGAGACTTATTGTATTTGAGACCTTGAGGAAACAGACAAATATAAAATCCTGTGATT
[0123]編號:1，重復元件:AGA，重復次數(shù):6，起始位置:152
[0124]> Nt61 如序列表中 SEQ ID N0.54 所示: [0125]TAACGCCACAGGTTTTCCAAATGAAAGCACAATTGAACCGCTTGCGTACGCCAACCCCATTTTCTCTCTTCAGCGCGGGATGTCAAGATTCGATGTGCCATTTCATCCGAGAGGATGTTCCAACGGTAATCTTCAACAACAACAACAACAACAACAACAAAAAAACGACATGCTCGAGTCAGCAAAGACATTGCTCTGTAAACCTCGTTTGTTATTTGAGTATAGACGTGTTTGGTTCCGAATGGCATCGCGTGTCTCGTTTTGACTGAGTACGCTGGGGAGACGGGTTCGAAAACAGACTTGTCGTGTGTGTGTGTGTGTGGGGGGGGGGGGTATACTTCTACTCTCACGGTCGTCACTGTCGAAGAAAAACCCCTGCAGCCGCAAATACACTATT
[0126]編號:1，重復元件:CAA，重復次數(shù):9，起始位置:134 ；
[0127]編號:2，重復元件:GT，重復次數(shù):8，起始位置:306。
[0128]> Nt63 如序列表中 SEQ ID N0.55 所示:
[0129]TAAGCTACCAAAACCTGACCGAGACTGAGAACGCCCATCTGTATCCTAGCAGCAACAACAACAACAACAGCAACAACAACAACAACAACACAGTTGAACTTGACAAACATGCGTAGATCAAGTTCAGCTTGGTGTCAGACCCCTCACCATCCTCTCGAAGGGGTCGTCCGTGTGGTTAGCGATGTCCAGCAGCTCGGAGTACTCCAGCTCCTCGCTGACCCTCTGCAGCAGGCAGAGAGGCTCGTTCAGAGCGACCGGCATGGACACGCGGGACAGGTCCTTGCCGATGTTGTTGTACAGGATGGTCATGATGCCGATGTGGCTGTTGTCCAAGCAGTGGGCAGGCAGGGTGGTCCGACGGCCTGTGTTGGTGGGCACGGCGCTGGGCATGTCTGTTGCTTTGGAAAGGCTTGCGCGATACTGGCTGGTGGCTGTAACTGGTGGTACAGAGAAGAGGTCAGTAAGGAGGGCTAAAGTGT
[0130]編號:1，重復元件:CAA，重復次數(shù):5，起始位置:53 ；
[0131]編號:2，重復元件:CAA，重復次數(shù):6，起始位置:71。
[0132]> Nt67 如序列表中 SEQ ID N0.56 所示:
[0133]TAAGCACATGTAGCCTACTATATAAAAGCCCTTTTACCAAATTGAGTTATATTACAATTACGATTGAATACAAGATACAATCCTGCCAACAAAGCTAGCTGCTTGTACGAAATGAATCCACCTAAAAATGTACTGTTTTGAAAGAAAGGCATTTTTATATTTTGGTCACACAGGGTACAAGAAGGCCCAACTTCAAAGAGCTGGCTAATGACCAGGTGCGCTACCAGCGCTGGCTTCTGAGGAATGAGACCAAGGCCTTCTACACAGCAGTGTACGCTGAGGACATCCGTCAGGGTACCCAGTACCTGCTCCAGGTGAGATATATCCAGTGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATGGATGTCATTACACTTCATGCAACAAAATTCGGATGATAATTCATCATCACCATCAACTCCTAACATTTCAAGTGTACTGGAATAGCATTCGAAATGTTGGAATTCCAAGGTAGTAAAGTCCGCAGTTACAAGAAACGACCCTGTTTTATGTTGAAACAAATCCTACAGCAGGCACTGAGTACTTCCTGT
[0134]編號:1，重復元件:GATA，重復次數(shù):7，起始位置:331。
[0135]> Nt70 如序列表中 SEQ ID N0.57 所示:
[0136]TAAGCCTCCGTGTTTTATATGTTTGGGGGATTTGGAGCTGTGATATCGAAGTGTCTATTATTTTTCCCAGCAGACAGGCTGTTAGTTGTGCTGAGCGGAAGCCAGAGAGCCTGTGCTGTCTGTCTGTCAGAGCCAGCCGCGTAGAGATGCTGGGGTCTTGTTTGATCTCTAATGAGACTTAGGGAGTCACAGATAAAAATATACGGATAGATGGATGGATAGATAGATAGATACATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATGGATAGAGTATGTGTTTGTTTGTGCGAGTGGTCTGATTTGAACCTGCAATGACCAAAATAGGTGAACAGCTTTGGAACAGGATCGTGATAGTTCAGACCAACAACAT
[0137]編號:1，重復元件:ATAG，重復次數(shù):7，起始位置:235。
[0138]> Nt71 如序列表中 SEQ ID N0.58 所示:
[0139] TAACCCACTTCGTTGTTCCGTTCCATTCTATGTAGTTATTATCCAGTTATCCTGTCAGACAGTGTCAAAAGGCCATGTGCTCTTAGCCCAGCTGTTAGAAGAAATATAAACATTTCCTTTTATGTATTTCTTTTCTTCAGCTTTCTTTTGGCATTGCCCTCTGGATGTTACTTCAGGTCTTGACTCCCCTGCTTTTCCCTCCTCCTTGGTCATCTTCCCCCCACACTCAAACCCTCTGTGGATAGATAGTACAGCTTTAGCTTTGCCTTTGTCAGAGTGTAAACTTTCCTTTAGCCAGTGCGTCGATAGTGTTTACTATATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATACTGAACTACTAGCTTGGGAGTCAGATTAATCTGTGAGTTCATGTTTATTTTCTCTAGTATACTGGCCTGGCAACCCTCTCATTCCCCCCGGCATGAAAAGTGTCGGGACAATCACAACCATTTATGTGATACGGGGCAGGGTTGATACGATGACTACGCAGAGGAGTGCCAT[0140]編號:1，重復元件:ATAG，重復次數(shù):12，起始位置:320
[0141]> Nt74 如序列表中 SEQ ID N0.59 所示:
[0142]TAAGGAGAGTGACAGATTCACCGATGACCTCTGAATGATTTATCTCCGGACACATTCCTGTTTATCAGAGCATCAGATGGCATCAGCATCAGAAAACCAGGGGGGAAGTGTATGAGGGCAGGCAGACAGACAGACAGACAAACAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGAATGACAGTGAGGTAGGCATGTGGGCAGACAGACAGGTAGACAGACAGACATACCAACACTGACAGGCAGGTAGGCTGGGAGAAAACAGAAACCCAGAAGTGGACCTACAGTGAATCTTCCAGACACCTTCGGACTTCCAGT
[0143]編號:1，重復元件:ACAG，重復次數(shù):9，起始位置:142。
[0144]> Nt79 如序列表中 SEQ ID N0.60 所示:
[0145]TAAGGCAACAAGACCGCTTTTCCTTTCTGCCCATTTCAGTTCGTTGGAATCTTTGACGAATATTGTTTTCGGTTGAAGTCGGCGTGTTGTTGTTGTTTGTTTGTTTGTTTGTTTTTCTCCTCCTCGACAACAACAAGTGTTTTATTTCTTCTTGCCGAAGAAGCTGAACCTCTTCTCACGGTCCTTCTCCTTGCCGTCTTTGTTCCGCATGGTGACGCCCCCGGCCTCGGCCGAGCTGGGGGAGATGGGGGGCATGGTCATGGCTCGGCTGAGGGCCCGGGGTCCCCCGGGGGAGTGGTCCCCTGACCCCACCGGGGGGATGATGGCCTGGATGGAGCGGATCCAGGAGCTCATCTCCCCCTG
[0146]編號:1，重復元件:TTGT，重復次數(shù):5，起始位置:93。
[0147]針對微衛(wèi)星位點序列采用軟件Primerf.0設(shè)計引物，將引物與太湖新銀魚的基因組進行第二次PCR擴增，得到第二次擴增產(chǎn)物。 [0148]具體地，設(shè)計引物的參數(shù)為:引物的長度為18_25bp，鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比率為(GC含量)30-70 %，退火溫度大于50-65 V，預期經(jīng)PCR擴增后的擴增片段的長度為100-350bp。
[0149]具體地，第二次PCR擴增反應在MJ-100PCR儀上進行，且第二次PCR擴增的程序為:94°C預變性5分鐘，94 °C變性40秒；59°C退火30秒，72 °C延伸40秒，共35個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘；第二次PCR擴增的反應體系為:如序列表中SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.38所示的引物各 0.2 μ M，0.2mM dNTP, I XPCR Buffer, 2.0mM Mg2+，Taq 酶 0.5U, 10_50ngDNA 模板，用滅菌蒸餾水補足到總體積到10 μ L。
[0150]進一步地，第二次PCR擴增的反應體系中的DNA模板為隨機挑選的24個太湖新銀魚的樣本。
[0151]將擴增產(chǎn)物采用質(zhì)量分數(shù)為8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將分離后的擴增產(chǎn)物經(jīng)過固定、銀染處理并記錄結(jié)果。其中電泳分離條件為:電壓1000V，電泳時間90-120min。根據(jù)擴增產(chǎn)物的不同遷移距離確定每個太湖新銀魚的基因型，獲得如序列表中SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.38所示的引物，參見表1，且19對引物能在太湖新銀魚樣本中擴增出條帶清晰、多態(tài)性高的微衛(wèi)星條帶，其結(jié)果參見圖1至圖19。
[0152]表1為19對引物序列
【權(quán)利要求】
1.一種太湖新銀魚微衛(wèi)星DNA分子標記的引物，其特征在于，包括:Nt38正向引物如序列表中SEQ ID N0.1所示；Nt38反向引物如序列表中SEQ ID N0.2所示；Nt39正向引物如序列表中SEQ ID N0.3所示；Nt39反向引物如序列表中SEQ ID N0.4所示；Nt43正向引物如序列表中SEQ ID N0.5所示；Nt43反向引物如序列表中SEQ ID N0.6所示；Nt45正向引物如序列表中SEQ ID N0.7所示；Nt45反向引物如序 列表中SEQ ID N0.8所示；Nt49正向引物如序列表中SEQ ID N0.9所示；Nt49反向引物如序列表中SEQ ID N0.10所示；Nt50正向引物如序列表中SEQ ID N0.11所示；Nt50反向引物如序列表中SEQ ID N0.12所示；Nt52正向引物如序列表中SEQ ID N0.12所示；Nt52反向引物如序列表中SEQ ID N0.14所示；Nt54正向引物如序列表中SEQ ID N0.15所示；Nt54反向引物如序列表中SEQ ID N0.16所示；Nt55正向引物如序列表中SEQ ID N0.17所示；Nt55反向引物如序列表中SEQ ID N0.18所示；Nt56正向引物如序列表中SEQ ID N0.19所示；Nt56反向引物如序列表中SEQ ID N0.20所示；Nt57正向引物如序列表中SEQ ID N0.21所示；Nt57反向引物如序列表中SEQ ID N0.22所示；Nt59正向引物如序列表中SEQ ID N0.23所示；Nt59反向引物如序列表中SEQ ID N0.24所示；Nt61正向引物如序列表中SEQ ID N0.25所示；Nt61反向引物如序列表中SEQ ID N0.26所示；Nt63正向引物如序列表中SEQ ID N0.27所示；Nt63反向引物如序列表中SEQ ID N0.28所示；Nt67正向引物如序列表中SEQ ID N0.29所示；Nt67反向引物如序列表中SEQ ID N0.30所示；Nt70正向引物如序列表中SEQ ID N0.31所示；Nt70反向引物如序列表中SEQ ID N0.32所示；Nt71正向引物如序列表中SEQ ID N0.33所示；Nt71反向引物如序列表中SEQ ID N0.34所示；Nt74正向引物如序列表中SEQ ID N0.35所示；Nt74反向引物如序列表中SEQ ID N0.36所示；Nt79正向引物如序列表中SEQ ID N0.37所示；Nt79反向引物如序列表中SEQ ID N0.38所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述的引物的制備方法，其特征在于，所述方法包括: 將太湖新銀魚的基因組的酶切片段經(jīng)第一次PCR擴增后，得到第一次擴增產(chǎn)物，所述第一次擴增產(chǎn)物與生物素重復探針雜交，獲得雜交產(chǎn)物，將所述雜交產(chǎn)物通過磁珠富集法篩選出所述太湖新銀魚的基因組中的微衛(wèi)星片段，將所述微衛(wèi)星片段經(jīng)過克隆和陽性鑒定后進行測序，得到相應的微衛(wèi)星位點序列； 針對所述微衛(wèi)星位點序列設(shè)計引物，將所述引物和所述太湖新銀魚的基因組進行第二次PCR擴增，得到第二次擴增產(chǎn)物，設(shè)計所述引物的參數(shù)為:所述引物的長度為18-25bp，鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比率為30-70 %，退火溫度大于50-65°C，預期經(jīng)所述第二次PCR擴增后的擴增片段的長度為100-350bp ； 將所述擴增產(chǎn)物采用質(zhì)量分數(shù)為8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將分離后的擴增產(chǎn)物經(jīng)過固定、銀染處理并記錄結(jié)果； 觀察結(jié)果，挑選出能擴增出條帶清晰的且多態(tài)性高的所述第二次擴增產(chǎn)物對應的引物，所述引物序列如序列表中SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.38所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一次PCR擴增條件為:預變性.940C 5min ；94°C 45S，53°C 45S，72°C lmin，循環(huán) 20 次；最后延伸 72°C IOmin0
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二次PCR擴增的程序為:94°C預變性5分鐘，94°C變性40秒；59°C退火30秒，72°C延伸40秒，共35個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二次PCR擴增的反應體系為:如序列表中 SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.38 所示的引物各 0.2μΜ,0.2mMdNTP, I XPCR Buffer, 2.0mMMg2+, Taq酶0.5U, 10_50ngDNA模板,用滅菌蒸懼水補足到總體積到10 μ L。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述DNA模板為隨機挑選的所述太湖新銀魚的樣本。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述電泳分離條件為:電壓1000V，電泳時間 90-120min。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述生物素重復探針如序列表中SEQIDN0.39-SEQ ID N0.41 所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，采用酚氯仿抽提所述太湖新銀魚的基因組，將抽提出的所述太湖新銀魚的基因組通過MseI酶進行酶切，獲得所述太湖新銀魚的基因組的酶切片段。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述通過磁珠富集法篩選出所述太湖新銀魚的基因組中的微衛(wèi)星片段的方法為:將重量為l_2mg的磁珠用300 μ I TENlOObuffer洗滌3次；再用40 μ I TENlOObuffer重懸所述磁珠，將所述雜交產(chǎn)物放入重懸后的所述磁珠中，在室溫下反應30min并輕輕攪動，使所述磁珠與所述太湖新銀魚的基因組中的微衛(wèi)星片段特異性結(jié)合；使用400 μ ITENlOOObuffer室溫洗滌所述磁珠3次，再用.400 μ 10.2 X SSC/0.1 % SDS緩沖液室溫洗滌所述磁珠3次；向所述磁珠中加入50 μ I滅菌蒸懼水，混勻，將混均后的所述反應液放置于95°C水中水浴5min,用磁架固定所述磁珠后，吸取所述反應液中的上清液，所述上清液中含有所述太湖新銀魚的基因組中的微衛(wèi)星片段。
【文檔編號】C12Q1/68GK104004752SQ201410164363
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】劉紅艷, 李存耀, 熊飛 申請人:江漢大學