一種體外快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種體外快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法，具體步驟為：將液氮凍存的瘧原蟲解凍復(fù)蘇，離心，沉淀用瘧原蟲培養(yǎng)基重懸后再用瘧原蟲培養(yǎng)基洗滌，離心收集沉淀，然后加入瘧原蟲培養(yǎng)基重懸，重懸后通入N2、CO2和O2的混合氣體，再在37℃、100r/min的條件下過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)液用體積分?jǐn)?shù)為72％Percoll分離液進(jìn)行梯度離心，離心完畢，取中間層液體，然后用瘧原蟲培養(yǎng)基清洗，離心收集沉淀，得瘧原蟲成熟裂殖體；該方法操作簡(jiǎn)單，不需要在小鼠體內(nèi)增殖，并且獲得的瘧原蟲成熟裂殖體的數(shù)量多，可達(dá)到107～108，能夠滿足轉(zhuǎn)基因需求，為瘧原蟲功能基因組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】一種體外快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種體外快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]瘧原蟲(Plasmodium)是一類單細(xì)胞、寄生性的原生動(dòng)物，是人體瘧疾的病原體。瘧疾是一種嚴(yán)重危害人體健康的寄生蟲病，全世界約二分之一人口受威脅。隨著各瘧原蟲基因組測(cè)序的相繼完成，瘧原蟲研究已經(jīng)進(jìn)入后基因組時(shí)代。目前，許多與瘧原蟲入侵、發(fā)育增殖、致病以及免疫逃避有關(guān)的重要基因的功能都尚未得以闡明，致使瘧疾防治和疫苗研制工作進(jìn)展緩慢，而對(duì)瘧原蟲各種基因及其產(chǎn)物的功能研究是制備有效疫苗和抗瘧藥物的前提。基因敲除技術(shù)是功能基因組學(xué)研究中最直接和最有效的方法，建立一種快速獲得基因敲除瘧原蟲的方法可以加快瘧原蟲基因功能的研究。但是，基因敲除技術(shù)需要使用成熟裂殖體，而成熟裂殖體需要在小鼠體內(nèi)增殖，步驟繁瑣費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，急需一種體外培養(yǎng)快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供體外培養(yǎng)快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法，其操作簡(jiǎn)單，不需要在小鼠體內(nèi)繁殖，并且繁殖后的成熟裂殖體能夠用于轉(zhuǎn)染。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0005]體外快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法，包括如下步驟:
[0006](I)選擇原蟲率為25~30%的液氮凍存瘧原蟲，將其置于37°C恒溫水浴鍋內(nèi)迅速解凍，離心，沉淀用瘧原蟲培養(yǎng)基重懸后再加入瘧原蟲培養(yǎng)基洗滌，離心收集沉淀，所述瘧原蟲培養(yǎng)基為含有胎牛血清、紅細(xì)胞、肝素、青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基；
[0007](2)將步驟(1)所得沉淀用所述瘧原蟲培養(yǎng)基重懸，再加入所述瘧原蟲培養(yǎng)基混勻，在培養(yǎng)液中灌輸N2XO2和O2的混合氣體，灌輸完畢立即封閉瓶口，然后置于37°C、IOOr/min的條件下培養(yǎng)12~14小時(shí)；
[0008](3)取新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)為72% Percoll分離液，然后向分離液中加入步驟(2)的培養(yǎng)液，并用水平式離心機(jī)在350g條件下離心25min，離心完畢，取中間層液體，然后用所述瘧原蟲培養(yǎng)基清洗，離心棄上清，得瘧原蟲成熟裂殖體。
[0009]優(yōu)選的，所述瘧原蟲培養(yǎng)基中胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)為20%，紅細(xì)胞的體積分?jǐn)?shù)為10%,肝素的濃度為75000單位/L,青霉素的濃度為IO5單位/L,鏈霉素的濃度為100mg/L。
[0010]優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述混合氣體中N2、CO2和O2的體積分?jǐn)?shù)分別為90%、5%和 5%。
[0011]優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述混合氣體的灌輸時(shí)間為90s。
[0012]更優(yōu)選的，所述體積分?jǐn)?shù)為72% Percoll分離液的制備方法為取Percoll原液與濃度為1.5M的NaCl按體積比為1:9混合，然后濃度為0.15M的NaCl稀釋至Percoll體積分?jǐn)?shù)為72%。
[0013]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開了一種體外快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法，無需在小鼠體內(nèi)增殖的步驟，利用此方法可以體外培養(yǎng)快速增殖獲得大量的瘧原蟲成熟裂殖體，時(shí)間短，效率高，裂殖體數(shù)量多，數(shù)量可達(dá)到IO7~108，多于傳統(tǒng)在小鼠體內(nèi)增殖方法獲得瘧原蟲成熟裂殖體的數(shù)量，此外獲得的成熟裂殖體可用于轉(zhuǎn)基因，如基因敲除等，具有經(jīng)濟(jì)高效、省時(shí)省力且成功率高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0015]圖1為兩種方法分離后的裂殖體染色結(jié)果圖(A:實(shí)施例1方法分離的瘧原蟲成熟裂殖體；B:傳統(tǒng)方法分離的瘧原蟲成熟裂殖體)。
[0016]圖2為兩種方法獲得的裂殖體數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖(1:實(shí)施例1方法分離的瘧原蟲成熟裂殖體數(shù)量；2:傳統(tǒng)方法分離的瘧原蟲成熟裂殖體數(shù)量)。
[0017]圖3為基因敲除質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。
[0018]圖4為基因敲除質(zhì)粒對(duì)痕原蟲基因的敲除原理圖。
[0019]圖5為基因敲除瘧原蟲凝膠電泳鑒定圖(A:野生型瘧原蟲和轉(zhuǎn)染瘧原蟲的nS3基因檢測(cè)結(jié)果；B:5’端插入序列和3’端插入序列檢測(cè)結(jié)果)。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0021]實(shí)施例1
[0022]體外快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法，包括如下步驟:
[0023](I)選擇原蟲率在25~30%的液氮凍存瘧原蟲，將其置于37°C恒溫水浴鍋內(nèi)迅速解凍，然后在2000rpm條件下離心3min,去除上清,用ImL痕原蟲培養(yǎng)基重懸后轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，加入40mL瘧原蟲培養(yǎng)基洗滌，再在2000rpm條件下離心3min ;其中瘧原蟲培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基，并含有體積分?jǐn)?shù)為20%的胎牛血清，體積分?jǐn)?shù)為10%的紅細(xì)胞，75000單位/L的肝素，IO5單位/L的青霉素和100mg/L的鏈霉素；
[0024](2)將步驟(1)離心后的沉淀用ImL瘧原蟲培養(yǎng)基重懸后轉(zhuǎn)移至500mL的廣口培養(yǎng)瓶中，然后加入IOOmL瘧原蟲培養(yǎng)基并混勻，再向廣口瓶中灌輸N2、CO2和O2體積分?jǐn)?shù)分別為和5%的混合氣體，灌輸時(shí)間為90s，灌輸完畢立即封閉瓶口，然后置于37°C、100r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12~14小時(shí)；
[0025](3)取新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)為72% Percoll分離液加至50mL離心管中，然后加入步驟(2)的培養(yǎng)液中，并用水平式離心機(jī)在350g條件下離心25min，離心完畢后液相分為三層，中間層棕色，成熟裂殖體位于該層，小心吸取成熟裂殖體并用50mL瘧原蟲培養(yǎng)基清洗一次，然后在450g條件下離心8min，棄上清，沉淀即為瘧原蟲成熟裂殖體。
[0026]本實(shí)施例中體積分?jǐn)?shù)為72% Percoll分離液的制備方法為:取3.24mL Percoll原液與0.36mL濃度為1.5M的NaCl混勻，然后加入1.4mL濃度為0.15M的NaCl稀釋至工作濃度。
[0027]同時(shí)按照傳統(tǒng)方法培養(yǎng)分離痕原蟲成熟裂殖體:將原蟲率在25~30%的液氮凍存瘧原蟲于37°C恒溫水浴鍋內(nèi)迅速解凍，然后腹腔注射至小鼠體內(nèi)增殖，3~4天后麻醉感染小鼠并心臟穿刺取血約400~800 μ L,加入至ImL PBS中清洗,2000rpm離心3min,重復(fù)洗滌2次，然后將沉淀用ImL PBS重懸并混勻，加入至5mL72% Percoll分離液表面進(jìn)行分離，將其作為對(duì)照。將傳統(tǒng)方法分離的瘧原蟲成熟裂殖體與本實(shí)施例分離的瘧原蟲成熟裂殖體進(jìn)行染色，然后進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，光鏡下觀察可見利用本發(fā)明的方法培養(yǎng)分離的成熟裂殖體布滿整個(gè)視野，而傳統(tǒng)方法僅幾個(gè)局部可見較多裂殖體，表明利用本發(fā)明的方法分離的瘧原蟲成熟裂殖體的數(shù)量更多。為了更清楚兩種方法獲得瘧原蟲數(shù)量的不同，統(tǒng)計(jì)兩種方法分離的瘧原蟲成熟裂殖體數(shù)量，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，利用本發(fā)明的方法分離的瘧原蟲成熟裂殖體數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于傳統(tǒng)方法分離的瘧原蟲成熟裂殖體數(shù)量。
[0028]實(shí)施例2
[0029]構(gòu)建用于基因敲除的質(zhì)粒，包括如下步驟:
[0030](I)根據(jù)瘧原蟲基因組序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增瘧原蟲基因nS3的引物，上游引物為:5’_atgggtaccaacaccctcaatgtct-3，(SEQ ID N0.1),黑體表示 KpnI 酶切位點(diǎn)，下游引物為:5，_taaggcgcctataaaattataatat-3’ (SEQ ID N0.2),黑體表示NarI酶切位點(diǎn)，然后以痕原蟲基因組為模板，SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示核苷酸為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性2min ;95°C變性10s、54°C退火20s、68°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)；最后68°C后延伸5min，得UIS3基因；
[0031](2)根據(jù)pEGFP-Nl (GenBank:U55762.1)載體上的GFP的核苷酸序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增GFP的引物，上游引物為 5' -cgggatccggacgagctgtacaagtaa-31 , (SEQ ID N0.3),黑體表示BamHI 酶切位點(diǎn)，下游引物為 5' -gctctagaatggtgagcaagggcgagg-31 (SEQ ID N0.4),黑體表示XbaI酶切位點(diǎn)，然后以pEGFP-Nl載體為模板，以SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示核苷酸序列為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性2min ;95°C變性10s、55°C退火20s、68°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)；最后68°C后延伸5min，得GFP基因；
[0032](3)將步驟(1)擴(kuò)增的nS3基因用KpnI和NarI進(jìn)行雙酶切，然后將酶切產(chǎn)物與經(jīng)相同酶酶切的 pL0003 載體(pL0003 載體來源于 The Malaria Research and ReferenceReagent Resource Center:MRA-772pL0003Plasmodium berghei)連接，再將步驟(2)所得GFP基因用BamHI和XbaI進(jìn)行雙酶切，然后與經(jīng)相同酶切的含WS3基因的pL1003載體連接，得基因敲除質(zhì)粒，基因敲除質(zhì)粒的圖譜如圖3所示。
[0033]從_70°C取出感受態(tài)菌DH5a于冰上放置5min，按100 μ L感受態(tài)菌加IOOpg基因敲出質(zhì)粒，混勻，冰上放置30~40min，42°C熱激45s后立即放置冰上2min進(jìn)行熱休克，然后加入0.35mL TB培養(yǎng)液，并于37°C、225r/min條件下培養(yǎng)I小時(shí)，4000rpm條件離心5min，棄去大部分上清，留約60 μ L鋪含氨芐青霉素(100 μ g/mL)的TB培養(yǎng)基平板，37°C過夜培養(yǎng)。取單克隆至含50mL TB培養(yǎng)基的錐形瓶中，在37°C、300r/min條件下震蕩培養(yǎng)過夜，菌液用Qiagen質(zhì)粒大抽試劑盒進(jìn)行抽提，測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度及純度；然后用限制性內(nèi)切酶SacII將質(zhì)粒線性化，通過凝膠電泳進(jìn)行膠回收，將終濃度稀釋至2 μ g/μ L，_20°C保存?zhèn)溆谩0034]實(shí)施例3
[0035]瘧原蟲成熟裂殖體的轉(zhuǎn)染，包括如下步驟:
[0036](I)將實(shí)施例分離獲得的瘧原蟲成熟裂殖體沉淀用ImL瘧原蟲培養(yǎng)基重懸，再加入9mL瘧原蟲培養(yǎng)基充分混勻，然后將IOmL的瘧原蟲成熟裂殖體懸液加入至10個(gè)1.5mL的EP管中，每管ImL,可同時(shí)滿足10次敲除；
[0037](2)將步驟(1)分裝的含有裂殖體的EP管在16000g條件下離心5s，去除上清，沉淀用100 μ L含有實(shí)施例2制得的線性化基因敲除質(zhì)粒的寄生蟲電轉(zhuǎn)液重懸，然后將轉(zhuǎn)移懸液轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn) 杯中，選擇程序U33進(jìn)行電轉(zhuǎn)，完畢后將產(chǎn)物通過尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)，24h后開始飼喂乙胺嘧啶藥水進(jìn)行篩選5~6天；乙胺嘧啶藥物水的配制方法為:首先用二甲基亞砜將乙胺嘧啶配制成7mg/mL的原液，然后用pH3.5~5的自來水稀釋100倍；
[0038](3)取感染小鼠尾靜脈血涂片觀察原蟲率，當(dāng)原蟲率達(dá)到2%~5%時(shí)，摘除眼球取血,收集紅內(nèi)期瘧原蟲,然后提取瘧原蟲基因組DNA ；
[0039](4)設(shè)計(jì)引物檢測(cè)判斷敲除是否成功，基因敲除質(zhì)粒的敲除原理圖如圖4所示。根據(jù)敲除原理設(shè)計(jì)擴(kuò)增nS3基因的引物，上游引物為5’ -aacaccctcaatgtcttt-3’ (SEQ IDN0.5)，5’ -atccctactttcatctaa-3’ (SEQ ID N0.6)，然后以轉(zhuǎn)染后瘧原蟲基因組 DNA 為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以野生型瘧原蟲基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，作為對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖5A所示。由圖5A可知，野生型瘧原蟲能夠擴(kuò)增出條帶，而轉(zhuǎn)染組不能擴(kuò)增出目的條帶，表明轉(zhuǎn)染組瘧原蟲nS3基因被成功敲除。然后設(shè)計(jì)檢測(cè)5’端插入序列(5，int)和3’端插入序列(3’ int)的引物，檢測(cè)5’端插入序列的上游引物為5，-gtaagcctacaaataaaaatg-3，(SEQ ID N0.7)和 5，-cactaaatataagctaattatg-3J (SEQID N0.8),檢測(cè) 3’端插入序列的上游引物為 5’-gaatttatgaccatattaaa-3’ (SEQ ID N0.9)和5’-ttttaatgtgttattttatt-3’ (SEQ ID N0.10)，然后分別以轉(zhuǎn)染后瘧原蟲基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性2min ;95°C變性10s，54°C退火20s，68°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)；68°C后延伸3min，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖5B所示。由圖5B可知，擴(kuò)增出現(xiàn)了目的條帶，表明基因敲除質(zhì)粒在瘧原蟲中發(fā)生了同源重組，將載體序列整合入了瘧原蟲基因組中。
[0040]最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.體外快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)選擇原蟲率為25~30%的液氮凍存瘧原蟲，將其置于37°C恒溫水浴鍋內(nèi)迅速解凍，離心，沉淀用瘧原蟲培養(yǎng)基重懸后再加入瘧原蟲培養(yǎng)基洗滌，離心收集沉淀，所述瘧原蟲培養(yǎng)基為含有胎牛血清、紅細(xì)胞、肝素、青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基； (2)將步驟(1)所得沉淀用所述瘧原蟲培養(yǎng)基重懸，再加入所述瘧原蟲培養(yǎng)基混勻，在培養(yǎng)液中灌輸N2、CO2和O2的混合氣體，灌輸完畢立即封閉瓶口，然后置于37°C、100r/min的條件下培養(yǎng)12~14小時(shí)； (3)取新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)為72%Percoll分離液，然后向分離液中加入步驟(2)的培養(yǎng)液，并用水平式離心機(jī)在350g條件下離心25min，離心完畢，取中間層液體，然后用所述瘧原蟲培養(yǎng)基清洗,離心棄上清,得瘧原蟲成熟裂殖體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述體外培養(yǎng)快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法，其特征在于:所述瘧原蟲培養(yǎng)基中胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)為20%，紅細(xì)胞的體積分?jǐn)?shù)為10%，肝素的濃度為75000單位/L，青霉素的濃度為IO5單位/L，鏈霉素的濃度為100mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述體外培養(yǎng)快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法，其特征在于:所述步驟(2)中， 所述混合氣體中N2、C02和O2的體積分?jǐn)?shù)分別為90%、5%和5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述體外培養(yǎng)快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，所述混合氣體的灌輸時(shí)間為90s。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述體外培養(yǎng)快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法，其特征在于:所述體積分?jǐn)?shù)為72% Percoll分離液的制備方法為取Percoll原液與濃度為1.5M的NaCl按體積比為1:9混合，然后濃度為0.15M的NaCl稀釋至Percoll體積分?jǐn)?shù)為72%。
【文檔編號(hào)】C12N1/10GK103923837SQ201410186288
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年5月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月5日
【發(fā)明者】付雍, 徐文岳, 丁艷 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)