專利名稱：一種可抑制惡性瘧原蟲侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寄生蟲學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種可抑制惡性瘧原 蟲侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體及惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽
背景技術(shù)：
瘧原蟲抗藥性的產(chǎn)生和擴(kuò)散已使全球瘧疾疫情嚴(yán)重惡化，每年瘧疾死亡人數(shù)自上 世紀(jì)七十年代的約50萬上升至目前約100萬，藥物防治瘧疾的措施亦面臨嚴(yán)重的困難和挑 戰(zhàn)。因此新的瘧疾控制措施的實(shí)施已成為當(dāng)務(wù)之急。疫苗接種已使許多種傳染病得到有效 的控制乃至根除，因此研制有效的瘧疾疫苗成為防止瘧原蟲感染的重要手段。Pf332蛋白 是由瘧原蟲合成，通過典型的高爾基體分泌途徑運(yùn)輸?shù)礁腥镜募t細(xì)胞表面，由于它是在紅 內(nèi)期瘧原蟲發(fā)育晚期時(shí)分布到感染紅細(xì)胞表面的，推測(cè)其可能通過影響紅細(xì)胞的通透性， 可塑性及有關(guān)功能的改變，促進(jìn)紅細(xì)胞膜的裂解和裂殖子的釋放。Pf332基因編碼大量富 含谷氨酸的重復(fù)片段，其中五肽分子VTEEI(V)是可被中和抗體識(shí)別的表位。Pf332蛋白存 在多個(gè)B、T細(xì)胞表位，可廣泛地被人體識(shí)別，并誘導(dǎo)人體產(chǎn)生較高的抗體滴度。最近，有研 究證明并鑒定Pf332基因由兩個(gè)外顯子組成。外顯子I編碼的富含半胱氨酸多肽段與惡 性瘧原蟲EBL家族的Duffy-binding-like區(qū)具有高度相似性。分布在感染紅細(xì)胞膜外的 這段Pf332-DBL區(qū)不僅非常保守，而且在諸如3D7AH1、FCR3S1. 2、7G8的各種惡性瘧原蟲蟲 株中均有表達(dá)。除此之外，體外培養(yǎng)中Pf332蛋白的表達(dá)量與蟲體增殖率呈正比，而且抗 Pf332-DBL區(qū)的多克隆抗體可以顯著降低各種蟲株的侵入率。作為潛在輔助惡性瘧原蟲裂 殖子侵入紅細(xì)胞的重要分子Pf332，由于其膜外DBL區(qū)與其他膜外區(qū)蛋白質(zhì)相比高度的保 守性，使其成為了發(fā)展新的抗瘧藥物和疫苗的候選分子，因此對(duì)其功能及生物學(xué)作用的研 究變得尤為重要。單克隆抗體的特點(diǎn)是理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性 強(qiáng)、便于人為處理和質(zhì)量控制，并且來源容易。這些優(yōu)點(diǎn)使它一問世就受到高度重視，并成 為解決生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等許多重大問題的主要手段。通過制備單克隆抗體并分析其功能，不 僅可以研究蛋白質(zhì)的主要生物學(xué)作用，還可以結(jié)合肽掃描技術(shù)篩選蛋白質(zhì)實(shí)施功能的關(guān)鍵 區(qū)域。抗惡性瘧原蟲蛋白質(zhì)的單克隆抗體被廣泛應(yīng)用在功能蛋白質(zhì)生物學(xué)作用的研究 中。而目前關(guān)于抗惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)的單克隆抗體的制備及可抑制蟲體侵 入紅細(xì)胞的單抗的篩選并未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽，其氨基酸序 列如SEQ ID No. 1所示或SEQ ID No. 2所示；本發(fā)明又一個(gè)目的是提供一種可抑制惡性瘧原蟲侵入的抗Pf332_DBL區(qū)單克隆 抗體，它能與所述的惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽特異性結(jié)合；
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本發(fā)明一種可抑制惡性瘧原蟲侵入的抗Pf332_DBL區(qū)單克隆抗體的制備方法，包 括以下步驟1)將Pf332-DBL區(qū)基因插入帶His標(biāo)簽的載體pQE70中，構(gòu)建質(zhì)粒pQE-DBL，并轉(zhuǎn) 染至工程菌M15中，表達(dá)帶His標(biāo)簽的DBL重組蛋白；2)用帶His標(biāo)簽的DBL重組蛋白免疫小鼠，無菌摘取小鼠脾臟，在PEG1450的作用 下將脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞融合，得雜交瘤細(xì)胞株；3)將DBL片段連接到帶GST標(biāo)簽的PGEX-4T-1載體上，并轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)中，表 達(dá)帶GST標(biāo)簽的DBL重組蛋白；步驟2)獲得的雜交瘤細(xì)胞株用帶GST標(biāo)簽的DBL重組蛋白 進(jìn)行陽性篩選，篩選出能夠分泌抗Pf332-DBL區(qū)單抗的雜交瘤細(xì)胞株；4)篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞株，再用上述的惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功 能性多肽進(jìn)行陽性篩選，陽性即為一種可抑制惡性瘧原蟲侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗 體。一種可抑制惡性瘧原蟲侵入的抗Pf332_DBL區(qū)單克隆抗體，是編號(hào)為 Anti-332-mAb8或Anti-332-mAb7的雜交瘤細(xì)胞株分沁的。本發(fā)明惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽，在生產(chǎn)瘧疾的治療性多肽 藥物及防治性多肽疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明以惡性瘧原蟲cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增，獲得Pf332_DBL基因片段，將其 分別連接到His標(biāo)簽融合表達(dá)載體pQE-70和GST標(biāo)簽融合表達(dá)載體pGEX_4T_l中，再分別 轉(zhuǎn)化相應(yīng)宿主菌，進(jìn)行His標(biāo)簽重組蛋白和GST標(biāo)簽重組蛋白的表達(dá)和純化，分別命名為 DBL-His和DBL-GST，為避免在單抗制備過程中篩選到假陽性單抗(即抗His標(biāo)簽抗體)，使 用DBL-His作免疫抗原，DBL-GST作篩選用的檢測(cè)抗原。用DBL-His免疫小鼠，DBL-GST包 被ELISA板檢測(cè)抗體效價(jià)，通過常規(guī)單抗制備技術(shù)獲取抗惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL 區(qū)的單克隆抗體。按照Pf332-DBL區(qū)氨基酸序列順序合成9段多肽，將多肽包被ELISA板， 通過肽掃描技術(shù)對(duì)獲得的單克隆抗體識(shí)別的區(qū)域進(jìn)行分析，再分別選取識(shí)別不同區(qū)域的單 克隆抗體各一株進(jìn)行體外抑制惡性瘧原蟲侵入紅細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。篩選到了具有較強(qiáng)抑制蟲體 侵入功能的單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)了 Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)的主要功能區(qū)多肽段。本發(fā)明一種可抑制惡性瘧原蟲侵入的抗Pf332_DBL區(qū)單克隆抗體，能與惡性瘧原 蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示或SEQ ID No. 2 所示，特異性結(jié)合；它是通過用帶His標(biāo)簽的DBL重組蛋白免疫小鼠，在PEG1450的作用下 將脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞融合，用帶GST標(biāo)簽的DBL重組蛋白初選，再用惡性瘧原蟲Pf332膜 蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽進(jìn)行陽性篩選的方法獲得；具有較強(qiáng)抑制蟲體侵入功能，并且高 于從感染有惡性瘧原蟲的Mali人血清中提純的MP抗體；不能與其特異性結(jié)合的單抗，抑制 蟲體侵入功能較低或沒有此功能。在0. 5mg/mL單抗作用下，能與第1段(其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示)特異 性結(jié)合的mAb8分泌的單克隆抗體，蟲體侵入率為18% ；能與第4段多肽(其氨基酸序列如 SEQ IDNo. 2所示)結(jié)合的mAb7分泌的單克隆抗體為30%，而從感染有惡性瘧原蟲的Mali 人血清中提純的MP抗體只有35%，表明這兩株單抗具有非常強(qiáng)的抑制蟲體侵入紅細(xì)胞的 功能；惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽，可以應(yīng)用于瘧疾的治療性多肽藥物的 研發(fā)及防治性多肽疫苗的研制。


圖1純化的重組抗原SDS-PAGE分析，M 預(yù)染marker ；1 :DBL_His重組蛋白；2 DBL-GST重組蛋白。圖2純化的重組抗原Western bloting分析，A DBL-GST重組蛋白；B :DBL_His重 組蛋白；1 Anti-GST單抗作一抗；2 :Anti-Pf332_DBL多抗作一抗；3 :Anti_His單抗作一 抗；4 :Anti-Pf332-DBL 多抗作一抗。圖3單克隆抗體特異性識(shí)別重組抗原DBL-GST的Western bloting分析，M 預(yù)染 marker ；1-12 :Anti-332_mAb 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 作一抗。圖4單克隆抗體特異性識(shí)別天然蛋白Pf332的Western bloting分析，M 預(yù)染 marker “ + ”蟲體蛋白；“_” 正常紅細(xì)胞蛋白。圖5單克隆抗體特異性識(shí)別天然蛋白Pf332的間接免疫熒光分析，(A) Anti-GST 單抗及 Anti-332-mAb 1，2，3，4，5，6 作一抗；(B) :Anti-332_mAb 7，8，9，10，11，12 作一抗。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。在不背 離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改 動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍之內(nèi)。實(shí)施例1重組表達(dá)載體pQE-DBL和pGEX-4T-l_DBL的構(gòu)建在該實(shí)施例中，根據(jù)Pf332_DBL區(qū)核苷酸序列，合成下列PCR引物上游引物為5‘ -GCGAATTCAGCAACATCAACAACAAGG-3 ‘；下游引物為5'-GCGCGGCCGCTTAGGCGTACTTCTTCTCGA-3'以惡性瘧原蟲cDNA為模板，通過上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得Pf332_DBL基因片 段，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，將其連接到His標(biāo)簽融合表達(dá)載體pQE-70中，構(gòu)建 得到重組表達(dá)載體pQE-DBL，以進(jìn)行含His標(biāo)簽的重組蛋白DBL-His的表達(dá)。以惡性瘧原蟲cDNA為模板，通過上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得Pf332-DBL基 因片段，將其連接到GST標(biāo)簽融合表達(dá)載體pGEX-4T-l中，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體 PGEX-4T-1-DBL,以進(jìn)行含GST標(biāo)簽的重組蛋白DBL-GST的表達(dá)。為避免在單抗制備過程中篩選到假陽性單抗(即抗His標(biāo)簽抗體)，使用DBL-His 作免疫抗原，DBL-GST作篩選用的檢測(cè)抗原。實(shí)施例2重組抗原DBL-His和DBL-GST的表達(dá)及純化將實(shí)施例1中的重組表達(dá)載體pQE-DBL和pGEX_4T-l_DBL分別轉(zhuǎn)化入M15和 BL21 (DE3)宿主菌中，分別進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，通過親和層析法分別純化DBL-His和DBL-GST 重組抗原，進(jìn)行SDS-PAGE分析(如圖1)。以抗His標(biāo)簽單抗或抗GST標(biāo)簽單抗及抗 Pf332-DBL的鼠源多抗作一抗對(duì)重組蛋白進(jìn)行Western bloting鑒定，在28kDa和52kDa處 分別具有特異性條帶(如圖2)。DBL-His其氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示，DBL-GST其 氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示。
實(shí)施例3抗惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)單克隆抗體的制備(1)動(dòng)物免疫免疫方案采用長(zhǎng)周期大劑量的方法進(jìn)行。取5只6 8周齡雌性BALB/c小鼠，首 免采用實(shí)施例2中純化的免疫抗原DBL-His與等量弗氏完全佐劑混合，乳化完全后腹腔注 射，劑量為每只小鼠50 y g免疫抗原。之后每隔3周免疫一次，劑量不變，佐劑換為弗氏不 完全佐劑。每次免疫之后10 14天尾靜脈采血，分離血清通過間接ELISA法(實(shí)施例2 中純化的檢測(cè)抗原DBL-GST包被ELISA板)檢測(cè)特異性抗體效價(jià)，直至抗體效價(jià)滿足細(xì)胞 融合要求(1 5X104以上)。融合前3天，腹腔注射小鼠25 yg純抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫；融 合前24h，小鼠禁食；(2)雜交瘤細(xì)胞株的制備在免疫小鼠的同時(shí)準(zhǔn)備小鼠骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞，取加強(qiáng)免疫后的小鼠脾臟并制備 脾細(xì)胞。將脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞按5 1 10 1的比例混合放入玻璃離心管，lOOOXg 離心5min，棄上清，用手指輕彈離心管混勻；逐滴滴入0. 8mL 50% PEG溶液，用滴管輕輕吹 吸5 6次，30s后，700 X g離心3min ；逐滴緩慢加入20mL不完全培養(yǎng)基，稀釋PEG，使其失 去促融作用，然后使離心管底部做劃圓運(yùn)動(dòng)，2min后，lOOOXg離心5min，棄上清，同法再洗 一次；緩慢加入50mL HAT培養(yǎng)基，輕輕混勻，加入到已鋪制好飼養(yǎng)層細(xì)胞(小鼠腹腔巨噬細(xì) 胞)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔加入0. lmL細(xì)胞融合懸液，置于37°C，5 % C02培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)；24小時(shí)后，每孔補(bǔ)加0. 05mL HAT培養(yǎng)基，并分別在第4天、7天和10天，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng) 情況更換HAT培養(yǎng)基；(3)雜交瘤細(xì)胞株的篩選100倍鏡下觀察，待融合細(xì)胞集落生長(zhǎng)至1/2視野以上時(shí)，通過間接ELISA法(檢 測(cè)抗原DBL-GST包被ELISA板)對(duì)培養(yǎng)孔中出現(xiàn)的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行陽性篩選，即篩選出 能夠分泌抗Pf332-DBL區(qū)單抗的雜交瘤細(xì)胞株；(4)雜交瘤細(xì)胞株的克隆用HT培養(yǎng)基將檢測(cè)結(jié)果為陽性的融合細(xì)胞輕輕吹起轉(zhuǎn)移至24孔板，10倍稀釋，細(xì) 胞計(jì)數(shù)；再進(jìn)行10倍稀釋后取100個(gè)細(xì)胞加入10mL HT培養(yǎng)基中混勻，將此細(xì)胞懸液滴入 到已鋪制飼養(yǎng)層細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔0. lmL,置于5% C02溫箱，37°C培養(yǎng)；前3天不 要移動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板，以免使細(xì)胞離散，第4天時(shí)觀察每孔細(xì)胞集落，對(duì)單個(gè)、多個(gè)細(xì)胞克隆 的孔分別作出標(biāo)記并換液一次，第7、10天時(shí)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況再更換HT培養(yǎng)基；100倍鏡 下觀察，待單克隆的細(xì)胞集落生長(zhǎng)至1/2視野以上時(shí)，檢測(cè)上清抗體效價(jià)，對(duì)陽性細(xì)胞再次 克隆，直到所有的克隆細(xì)胞孔都為陽性時(shí)為止，最終獲得12株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜 交瘤細(xì)胞分別命名為 Anti-332-mAb 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12。(5)單克隆抗體的大量制備將高壓滅菌的石蠟油注射到小鼠腹腔，0.5mL/只，1周后每只小鼠腹腔注射2X106 個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射細(xì)胞8 10天后，當(dāng)小鼠腹部膨脹且行動(dòng)遲緩時(shí)抽取腹水，37°C溫箱孵 育1小時(shí)后，4°C過夜，4000Xg離心lOmin，棄掉脂肪，收集中間澄清腹水，分裝凍存?zhèn)溆谩?6)單克隆抗體的純化采用ProteinA親和層析法從小鼠腹水中純化得到單克隆抗體。
(7)單克隆抗體的亞型分類通過間接ELISA法用單抗亞型分類鑒定試劑盒(SIGMA)鑒定單克隆抗體的免疫球 蛋白類型及亞型，12株單抗均為IgGl型。實(shí)施例4抗惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)單克隆抗體的鑒定用實(shí)施例3中制備的六11衍-332-11^131，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12單抗，通過常規(guī) Western bloting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組抗原DBL-GST。結(jié)果顯示，12株單抗作用下，在52kDa處，均 有一條明顯的條帶(如圖3)，表明制得的單抗均可以與重組抗原DBL-GST特異性結(jié)合。用nti-332-mAbl，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 單抗，通過常規(guī) Western bloting 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)惡性瘧原蟲蟲體天然蛋白質(zhì)Pf332的表達(dá)。結(jié)果顯示，12株單抗作用下，蟲體蛋白 為上樣液的泳道上出現(xiàn)了大于250kDa的特異性條帶，而在以正常人紅細(xì)胞為上樣液的泳 道上卻沒有條帶(如圖4)，表明制得的單抗均可以與蟲體天然蛋白質(zhì)Pf332特異性結(jié)合。用Anti-332-mAbl，2，3，4，5，6，7，8，9，10，ll，12 單抗，通過常規(guī)間接免疫熒光實(shí) 驗(yàn)檢測(cè)惡性瘧原蟲蟲體天然蛋白質(zhì)Pf332的表達(dá)。經(jīng)Hoechst染料復(fù)染過的紅細(xì)胞，如感 染蟲體，在胞內(nèi)蟲體就呈藍(lán)色熒光，由于紅細(xì)胞沒有核酸物質(zhì)，因此，正常紅細(xì)胞不呈現(xiàn)熒 光。結(jié)果顯示，染蟲紅細(xì)胞內(nèi)蟲體呈藍(lán)色熒光，并且以12株單抗為一抗作用的染蟲紅細(xì)胞， 在蟲體表面或紅細(xì)胞表面均不同程度的呈現(xiàn)綠色熒光，而抗GST單抗作用的染蟲紅細(xì)胞卻 沒有呈現(xiàn)綠色熒光(如圖5)，表明這12株單抗均可以蟲體天然蛋白質(zhì)Pf332特異性結(jié)合。實(shí)施例5抗惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)單克隆抗體識(shí)別區(qū)域的確定根據(jù)Pf332_DBL區(qū)氨基酸序列，以25個(gè)氨基酸為一段多肽，順序分成9段多肽，其 中最后一段肽為16個(gè)氨基酸，由上海生工生物公司合成并偶聯(lián)BSA。通過間接ELISA法進(jìn)行 肽掃描，進(jìn)而確定單克隆抗體識(shí)別表位所在的肽段。將9段合成的多肽稀釋，分別以5 y g/ mL, 50 uL每孔包被ELISA板，加入1000倍稀釋的抗Pf332_DBL區(qū)單抗作為一抗，進(jìn)行反應(yīng) 并測(cè)定0D4(I5值，值最大的孔即為對(duì)應(yīng)的單抗結(jié)合肽段。所有的孔0D4(I5值均小于0. 2時(shí)，此 單抗不結(jié)合任何肽段。結(jié)果顯示，有9株單抗可以結(jié)合4段多肽，分別是結(jié)合第1段多肽的 單抗為mAb3、mAb4、mAb8 ；結(jié)合第4段多肽的單抗為mAb7 ；結(jié)合第6段多肽的單抗為mAb5、 mAblO、mAbll、mAbl2 ；結(jié)合第7段多肽的單抗為mAbl ；mAb2、mAb6、mAb9不結(jié)合任何肽段，可 能是由于它們所結(jié)合的區(qū)域?yàn)槎嚯亩蔚你暯訁^(qū)。實(shí)施例6具有抑蟲作用的抗惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)單克隆抗體的篩選(1)對(duì)同步化培養(yǎng)后的惡性瘧原蟲蟲體進(jìn)行鏡檢，如大部分處于晚期滋養(yǎng)體期，便 計(jì)算染蟲率，并取蟲體培養(yǎng)物lOOOr/min離心5min，棄上清，再用正常紅細(xì)胞懸液和完全培 養(yǎng)基稀釋至染蟲率為1%，紅細(xì)胞壓積為2% ；(2)將上述稀釋好的蟲體培養(yǎng)物加入到96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔75y L ；(3)選取結(jié)合第1、4、6、7段多肽和不結(jié)合多肽的單克隆抗體各一株，分別為mAb8、 mAb7、mAb5、mAbl及mAb9，用完全培養(yǎng)基進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋，將其加入到具有蟲體培養(yǎng)物的 孔內(nèi)，每孔25 iiL，每株單抗加入孔中后終濃度為0. 5mg/mL、0. 13mg/mL、0. 03mg/mL，每株 單抗的每個(gè)濃度均設(shè)兩個(gè)重復(fù)孔，以終濃度為0. 5mg/mL的MP抗體(從感染有惡性瘧原蟲的Mali人血清中提純的抗體)為陽性對(duì)照，以未免疫小鼠血清中的IgG為陰性對(duì)照，終濃 度也為0. 5mg/mL、0. 13mg/mL、0. 03mg/mL,陽性對(duì)照和陰性對(duì)照均設(shè)重復(fù)孔，同時(shí)，其他孔 加入25 y L完全培養(yǎng)基作為對(duì)照組；(4)培養(yǎng)24h后，取蟲體培養(yǎng)物用吖啶橙染色并通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，每次測(cè) 定5X104個(gè)細(xì)胞；(5)此實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，測(cè)得的染蟲率通過以下公式計(jì)算相對(duì)侵入率。相對(duì)侵入率=檢測(cè)組染蟲率/對(duì)照組染蟲率結(jié)果顯示，分別結(jié)合第1段和第4段多肽的mAb8和mAb7作用下的蟲體相對(duì)侵入 率最低，具體為0. 5mg/mL單抗作用下mAb8 :18%;mAb7 :30%，低于0. 5mg/mL MP抗體作用 下的35%，表明這兩株單抗具有非常強(qiáng)的抑制蟲體侵入紅細(xì)胞的功能，對(duì)應(yīng)的這兩段多肽 區(qū)是Pf332-DBL實(shí)施生物學(xué)功能的關(guān)鍵區(qū)。實(shí)施例7一種可抑制惡性瘧原蟲侵入的抗Pf332_DBL區(qū)單克隆抗體的制備方法1)將Pf332-DBL區(qū)基因插入帶His標(biāo)簽的載體pQE70中，構(gòu)建質(zhì)粒pQE-DBL，并轉(zhuǎn) 染至工程菌M15中，表達(dá)帶His標(biāo)簽的DBL重組蛋白；2)用帶His標(biāo)簽的DBL重組蛋白免疫小鼠，無菌摘取小鼠脾臟，在PEG1450的作用 下將脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞融合，得雜交瘤細(xì)胞株；3)將DBL片段通過PCR亞克隆到帶GST標(biāo)簽的pGEX-4T-l載體上，并轉(zhuǎn)化入 BL21(DE3)中，表達(dá)帶GST標(biāo)簽的DBL重組蛋白；步驟2)獲得的雜交瘤細(xì)胞株用帶GST標(biāo) 簽的DBL重組蛋白進(jìn)行陽性篩選，篩選出能夠分泌抗Pf332-DBL區(qū)單抗的雜交瘤細(xì)胞株；4)篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞株，再用上述的惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功 能性多肽，第1段(其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示)或第4段多肽(其氨基酸序列如 SEQ IDNo. 2所示)進(jìn)行陽性篩選，陽性既為一種可抑制惡性瘧原蟲侵入的抗Pf332-DBL區(qū) 單克隆抗體。
權(quán)利要求
惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示或SEQ ID No.2所示。
2.—種可抑制惡性瘧原蟲侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體，其特征在于它能與權(quán) 利要求1所述的惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽特異性結(jié)合。
3.—種可抑制惡性瘧原蟲侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟1)將Pf332-DBL區(qū)基因插入帶His標(biāo)簽的載體pQE70中，構(gòu)建質(zhì)粒pQE_DBL，并轉(zhuǎn)化至 工程菌M15中，表達(dá)帶His標(biāo)簽的DBL重組蛋白；2)用帶His標(biāo)簽的DBL重組蛋白免疫小鼠，無菌摘取小鼠脾臟，在PEG1450的作用下將 脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞融合，得雜交瘤細(xì)胞株；3)將DBL片段連接到帶GST標(biāo)簽的pGEX-4T-l載體上，并轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)中，表達(dá)帶 GST標(biāo)簽的DBL重組蛋白；步驟2)獲得的雜交瘤細(xì)胞株用帶GST標(biāo)簽的DBL重組蛋白進(jìn)行 陽性篩選，篩選出能夠分泌抗Pf332-DBL區(qū)單抗的雜交瘤細(xì)胞株；4)篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞株，再用上述的惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性 多肽進(jìn)行陽性篩選，陽性即為一種可抑制惡性瘧原蟲侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體。
4.惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽，在生產(chǎn)瘧疾的治療性多肽藥物及防 治性多肽疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可抑制惡性瘧原蟲侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體，能與惡性瘧原蟲Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或2所示，特異性結(jié)合；它可以通過用帶His標(biāo)簽的DBL重組蛋白免疫小鼠，將脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞融合，用帶GST標(biāo)簽的DBL重組蛋白初選，再用功能性多肽進(jìn)行陽性篩選的方法獲得；具有較強(qiáng)抑制蟲體侵入功能，并且高于從感染有惡性瘧原蟲的Mali人血清中提純的MP抗體；不能與功能性多肽特異性結(jié)合的單抗，抑制蟲體侵入功能較低或沒有此功能；DBL區(qū)功能性多肽，可以應(yīng)用于瘧疾的治療性多肽藥物的研發(fā)及防治性多肽疫苗的研制。
文檔編號(hào)A61P33/06GK101863970SQ20101017486
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者姜寧, 尹繼剛, 杜承, 陸慧君, 陳啟軍 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)