專(zhuān)利名稱(chēng)：可抑制惡性瘧原蟲(chóng)侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寄生蟲(chóng)學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種可抑制惡性瘧原蟲(chóng)侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體及惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽
背景技術(shù)：
瘧原蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生和擴(kuò)散已使全球瘧疾疫情嚴(yán)重惡化,每年瘧疾死亡人數(shù)自上世紀(jì)七十年代的約50萬(wàn)上升至目前約100萬(wàn)，藥物防治瘧疾的措施亦面臨嚴(yán)重的困難和挑戰(zhàn)。因此新的瘧疾控制措施的實(shí)施已成為當(dāng)務(wù)之急。疫苗接種已使許多種傳染病得到有效的控制乃至根除，因此研制有效的瘧疾疫苗成為防止瘧原蟲(chóng)感染的重要手段。Pf332蛋白是由瘧原蟲(chóng)合成，通過(guò)典型的高爾基體分泌途徑運(yùn)輸?shù)礁腥镜募t細(xì)胞表面，由于它是在紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)發(fā)育晚期時(shí)分布到感染紅細(xì)胞表面的，推測(cè)其可能通過(guò)影響紅細(xì)胞的通透性，可塑性及有關(guān)功能的改變，促進(jìn)紅細(xì)胞膜的裂解和裂殖子的釋放。Pf332基因編碼大量富含谷氨酸的重復(fù)片段，其中五肽分子VTEEI (V)是可被中和抗體識(shí)別的表位。Pf332蛋白存在多個(gè)B、T細(xì)胞表位，可廣泛地被人體識(shí)別，并誘導(dǎo)人體產(chǎn)生較高的抗體滴度。最近，有研究證明并鑒定Pf332基因由兩個(gè)外顯子組成。外顯子I編碼的富含半胱氨酸多肽段與惡性瘧原蟲(chóng)EBL家族的Duffy-binding-like區(qū)具有高度相似性。分布在感染紅細(xì)胞膜外的這段Pf332-DBL區(qū)不僅非常保守，而且在諸如3D7AH1、FCR3S1. 2、7G8的各種惡性瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)株中均有表達(dá)。除此之外，體外培養(yǎng)中Pf332蛋白的表達(dá)量與蟲(chóng)體增殖率呈正比，而且抗Pf332-DBL區(qū)的多克隆抗體可以顯著降低各種蟲(chóng)株的侵入率。作為潛在輔助惡性瘧原蟲(chóng)裂殖子侵入紅細(xì)胞的重要分子Pf332，由于其膜外DBL區(qū)與其他膜外區(qū)蛋白質(zhì)相比高度的保守性，使其成為了發(fā)展新的抗瘧藥物和疫苗的候選分子，因此對(duì)其功能及生物學(xué)作用的研究變得尤為重要。單克隆抗體的特點(diǎn)是理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)、便于人為處理和質(zhì)量控制，并且來(lái)源容易。這些優(yōu)點(diǎn)使它一問(wèn)世就受到高度重視，并成為解決生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等許多重大問(wèn)題的主要手段。通過(guò)制備單克隆抗體并分析其功能，不僅可以研究蛋白質(zhì)的主要生物學(xué)作用，還可以結(jié)合肽掃描技術(shù)篩選蛋白質(zhì)實(shí)施功能的關(guān)鍵區(qū)域?？箰盒辕懺x(chóng)蛋白質(zhì)的單克隆抗體被廣泛應(yīng)用在功能蛋白質(zhì)生物學(xué)作用的研究中。而目前關(guān)于抗惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)的單克隆抗體的制備及可抑制蟲(chóng)體侵入紅細(xì)胞的單抗的篩選并未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示；
本發(fā)明又一個(gè)目的是提供一種可抑制惡性瘧原蟲(chóng)侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體，它能與，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽特異性結(jié)合；
本發(fā)明一種可抑制惡性瘧原蟲(chóng)侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟
1)將Pf332-DBL區(qū)基因插入帶His標(biāo)簽的載體pQE70中，構(gòu)建質(zhì)粒pQE-DBL，并轉(zhuǎn)染至工程菌M15中，表達(dá)帶His標(biāo)簽的DBL重組蛋白；
2)用帶His標(biāo)簽的DBL重組蛋白免疫小鼠，無(wú)菌摘取小鼠脾臟，在PEG1450的作用下將脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞融合，得雜交瘤細(xì)胞株；
3)將DBL片段連接到帶GST標(biāo)簽的pGEX-4T-l載體上，并轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)中，表達(dá)帶GST標(biāo)簽的DBL重組蛋白；步驟2)獲得的雜交瘤細(xì)胞株用帶GST標(biāo)簽的DBL重組蛋白進(jìn)行陽(yáng)性篩選，篩選出能夠分泌抗Pf332-DBL區(qū)單抗的雜交瘤細(xì)胞株； 4)篩選出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，再用上述的惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽進(jìn)行陽(yáng)性篩選，陽(yáng)性即為一種可抑制惡性瘧原蟲(chóng)侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體。一種可抑制惡性瘧原蟲(chóng)侵入的抗Pf332_DBL區(qū)單克隆抗體，是編號(hào)為Anti-332-mAb8或Anti- 332_mAb7的雜交瘤細(xì)胞株分沁的。本發(fā)明惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽，在生產(chǎn)瘧疾的治療性多肽藥物及防治性多肽疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明以惡性瘧原蟲(chóng)cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增，獲得Pf332_DBL基因片段，將其分別連接到His標(biāo)簽融合表達(dá)載體pQE-70和GST標(biāo)簽融合表達(dá)載體pGEX_4T_l中，再分別轉(zhuǎn)化相應(yīng)宿主菌，進(jìn)行His標(biāo)簽重組蛋白和GST標(biāo)簽重組蛋白的表達(dá)和純化，分別命名為DBL-His和DBL-GST，為避免在單抗制備過(guò)程中篩選到假陽(yáng)性單抗(即抗His標(biāo)簽抗體)，使用DBL-His作免疫抗原，DBL-GST作篩選用的檢測(cè)抗原。用DBL-His免疫小鼠，DBL-GST包被ELISA板檢測(cè)抗體效價(jià)，通過(guò)常規(guī)單抗制備技術(shù)獲取抗惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)的單克隆抗體。按照Pf332-DBL區(qū)氨基酸序列順序合成9段多肽，將多肽包被ELISA板，通過(guò)肽掃描技術(shù)對(duì)獲得的單克隆抗體識(shí)別的區(qū)域進(jìn)行分析，再分別選取識(shí)別不同區(qū)域的單克隆抗體各一株進(jìn)行體外抑制惡性瘧原蟲(chóng)侵入紅細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。篩選到了具有較強(qiáng)抑制蟲(chóng)體侵入功能的單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)了 Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)的主要功能區(qū)多肽段。本發(fā)明一種可抑制惡性瘧原蟲(chóng)侵入的抗Pf332_DBL區(qū)單克隆抗體，能與惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，特異性結(jié)合；它是通過(guò)用帶His標(biāo)簽的DBL重組蛋白免疫小鼠，在PEG1450的作用下將脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞融合，用帶GST標(biāo)簽的DBL重組蛋白初選，再用惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽進(jìn)行陽(yáng)性篩選的方法獲得；具有較強(qiáng)抑制蟲(chóng)體侵入功能，并且高于從感染有惡性瘧原蟲(chóng)的Mali人血清中提純的MP抗體；不能與其特異性結(jié)合的單抗，抑制蟲(chóng)體侵入功能較低或沒(méi)有此功能。在0. 5mg/mL單抗作用下，能與第I段(其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示)特異性結(jié)合的mAb8分泌的單克隆抗體，蟲(chóng)體侵入率為18% ;能與第4段多肽(其氨基酸序列如SEQID No. 2所示)結(jié)合的mAb7分泌的單克隆抗體為30%，而從感染有惡性瘧原蟲(chóng)的Mali人血清中提純的MP抗體只有35%，表明這兩株單抗具有非常強(qiáng)的抑制蟲(chóng)體侵入紅細(xì)胞的功能；惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽，可以應(yīng)用于瘧疾的治療性多肽藥物的研發(fā)及防治性多肽疫苗的研制。


圖I純化的重組抗原SDS-PAGE分析，M:預(yù)染marker ； I :DBL_His重組蛋白；2: DBL-GST重組蛋白。圖2純化的重組抗原Western bloting分析,A:DBL_GST重組蛋白；B:DBL_His重組蛋白；
I:Anti-GST 單抗作一抗；2: Anti-Pf332_DBL 多抗作一抗；3:Anti-His 單抗作一抗；4:Anti-Pf332-DBL 多抗作一抗。圖3單克隆抗體特異性識(shí)別重組抗原DBL-GST的Western bloting分析,M:預(yù)染marker ； 1-12: Anti- 332-mAb 1,2,3,4, 5,6,7,8,9, 10, 11, 12 作一抗。圖4單克隆抗體特異性識(shí)別天然蛋白Pf332的Western bloting分析，M:預(yù)染marker “ + ” :蟲(chóng)體蛋白；“一”正常紅細(xì)胞蛋白。圖5單克隆抗體特異性識(shí)別天然蛋白Pf332的間接免疫熒光分析，(A) :Anti-GST·單抗及 Anti- 332-mAb 1，2，3，4，5，6 作一抗；(B) : Anti- 332-mAb 7，8，9，10，11，12 作一抗。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍之內(nèi)。實(shí)施例I
重組表達(dá)載體pQE-DBL和pGEX-4T-l-DBL的構(gòu)建
在該實(shí)施例中，根據(jù)Pf332-DBL區(qū)核苷酸序列，合成下列PCR引物
上游引物為5' - GCGAATTCAGCAACATCAACAACAAGG-3'；
下游引物為5' - GCGCGGCCGCTTAGGCGTACTTCTTCTCGA -3'
以惡性瘧原蟲(chóng)cDNA為模板，通過(guò)上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得Pf332-DBL基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，將其連接到His標(biāo)簽融合表達(dá)載體pQE_70中，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體pQE-DBL，以進(jìn)行含His標(biāo)簽的重組蛋白DBL-His的表達(dá)。以惡性瘧原蟲(chóng)cDNA為模板，通過(guò)上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得Pf332_DBL基因片段，將其連接到GST標(biāo)簽融合表達(dá)載體pGEX-4T-l中，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體pGEX-4T-1-DBL,以進(jìn)行含GST標(biāo)簽的重組蛋白DBL-GST的表達(dá)。為避免在單抗制備過(guò)程中篩選到假陽(yáng)性單抗(即抗His標(biāo)簽抗體)，使用DBL-His作免疫抗原，DBL-GST作篩選用的檢測(cè)抗原。實(shí)施例2
重組抗原DBL-His和DBL-GST的表達(dá)及純化
將實(shí)施例I中的重組表達(dá)載體pQE-DBL和pGEX -4T-1-DBL分別轉(zhuǎn)化入M15和BL21 (DE3)宿主菌中，分別進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，通過(guò)親和層析法分別純化DBL-His和DBL-GST重組抗原，進(jìn)行SDS-PAGE分析(如圖I)。以抗His標(biāo)簽單抗或抗GST標(biāo)簽單抗及抗Pf332-DBL的鼠源多抗作一抗對(duì)重組蛋白進(jìn)行Western bloting鑒定，在28kDa和52kDa處分別具有特異性條帶(如圖2)。DBL-His其氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示，DBL-GST其氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示。實(shí)施例3
抗惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)單克隆抗體的制備 (1)動(dòng)物免疫
免疫方案采用長(zhǎng)周期大劑量的方法進(jìn)行。取5只61周齡雌性BALB/c小鼠，首免采用實(shí)施例2中純化的免疫抗原DBL-His與等量弗氏完全佐劑混合，乳化完全后腹腔注射，劑量為每只小鼠50 yg免疫抗原。之后每隔3周免疫一次，劑量不變，佐劑換為弗氏不完全佐齊U。每次免疫之后1(T14天尾靜脈采血，分離血清通過(guò)間接ELISA法(實(shí)施例2中純化的檢測(cè)抗原DBL-GST包被ELISA板)檢測(cè)特異性抗體效價(jià)，直至抗體效價(jià)滿(mǎn)足細(xì)胞融合要求(15X104以上)。融合前3天，腹腔注射小鼠25 Ug純抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫；融合前24h，小鼠禁食；
(2)雜交瘤細(xì)胞株的制備
在免疫小鼠的同時(shí)準(zhǔn)備小鼠骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞，取加強(qiáng)免疫后的小鼠脾臟并制備脾細(xì)胞。將脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞按5:廣10:1的比例混合放入玻璃離心管，IOOOXg離心5min，棄上清，用手指輕彈離心管混勻；逐滴滴入0. 8mL 50% PEG溶液,用滴管輕輕吹吸5 6次，30s后，700 Xg離心3min ;逐滴緩慢加入20mL不完全培養(yǎng)基，稀釋PEG，使其失去促融作用，然后使離心管底部做劃圓運(yùn)動(dòng)，2min后，IOOOXg離心5min,棄上清，同法再洗一次；緩慢加入50mL HAT培養(yǎng)基，輕輕混勻，加入到已鋪制好飼養(yǎng)層細(xì)胞(小鼠腹腔巨噬細(xì)胞)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔加入0. ImL細(xì)胞融合懸液，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24小時(shí)后，每孔補(bǔ)加0.05mL HAT培養(yǎng)基，并分別在第4天、7天和10天，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況更換HAT培養(yǎng)基；
(3)雜交瘤細(xì)胞株的篩選
100倍鏡下觀察，待融合細(xì)胞集落生長(zhǎng)至1/2視野以上時(shí)，通過(guò)間接ELISA法(檢測(cè)抗原DBL-GST包被ELISA板)對(duì)培養(yǎng)孔中出現(xiàn)的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行陽(yáng)性篩選，即篩選出能夠分泌抗Pf332-DBL區(qū)單抗的雜交瘤細(xì)胞株；
(4)雜交瘤細(xì)胞株的克隆
用HT培養(yǎng)基將檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的融合細(xì)胞輕輕吹起轉(zhuǎn)移至24孔板，10倍稀釋?zhuān)?xì)胞計(jì)數(shù)；再進(jìn)行10倍稀釋后取100個(gè)細(xì)胞加入IOmL HT培養(yǎng)基中混勻，將此細(xì)胞懸液滴入到已鋪制飼養(yǎng)層細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔0. lmL，置于5% CO2溫箱，37°C培養(yǎng)；前3天不要移動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板，以免使細(xì)胞離散，第4天時(shí)觀察每孔細(xì)胞集落，對(duì)單個(gè)、多個(gè)細(xì)胞克隆的孔分別作出標(biāo)記并換液一次，第7、10天時(shí)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況再更換HT培養(yǎng)基；100倍鏡下觀察，待單克隆的細(xì)胞集落生長(zhǎng)至1/2視野以上時(shí)，檢測(cè)上清抗體效價(jià)，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞再次克隆，直到所有的克隆細(xì)胞孔都為陽(yáng)性時(shí)為止，最終獲得12株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞分別命名為 Anti- 332-mAb 1，2，3，4，5,6, 7,8,9, 10，11，12。(5)單克隆抗體的大量制備
將高壓滅菌的石蠟油注射到小鼠腹腔，0. 5mL/只，I周后每只小鼠腹腔注射2X IO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射細(xì)胞8 10天后，當(dāng)小鼠腹部膨脹且行動(dòng)遲緩時(shí)抽取腹水，37°C溫箱孵育I小時(shí)后，4°C過(guò)夜，4000 Xg離心lOmin，棄掉脂肪，收集中間澄清腹水，分裝凍存?zhèn)溆谩?br> (6)單克隆抗體的純化
采用ProteinA親和層析法從小鼠腹水中純化得到單克隆抗體。(7)單克隆抗體的亞型分類(lèi)
通過(guò)間接ELISA法用單抗亞型分類(lèi)鑒定試劑盒(SIGMA)鑒定單克隆抗體的免疫球蛋白 類(lèi)型及亞型，12株單抗均為IgGl型。實(shí)施例4
抗惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)單克隆抗體的鑒定用實(shí)施例3中制備的Anti-332-mAbl，2，3,4, 5,6, 7,8,9, 10，11，12單抗，通過(guò)常規(guī)Western bloting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組抗原DBL-GST。結(jié)果顯示，12株單抗作用下,在52kDa處,均有一條明顯的條帶(如圖3)，表明制得的單抗均可以與重組抗原DBL-GST特異性結(jié)合。 用Anti-332-mAbl, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 單抗，通過(guò)常規(guī) Western bloting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)惡性瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)體天然蛋白質(zhì)Pf332的表達(dá)。結(jié)果顯示，12株單抗作用下，蟲(chóng)體蛋白為上樣液的泳道上出現(xiàn)了大于250kDa的特異性條帶，而在以正常人紅細(xì)胞為上樣液的泳道上卻沒(méi)有條帶(如圖4)，表明制得的單抗均可以與蟲(chóng)體天然蛋白質(zhì)Pf332特異性結(jié)合。用Anti-332-mAbl, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 單抗，通過(guò)常規(guī)間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)惡性痕原蟲(chóng)蟲(chóng)體天然蛋白質(zhì)Pf332的表達(dá)。經(jīng)Hoechst染料復(fù)染過(guò)的紅細(xì)胞,如感染蟲(chóng)體，在胞內(nèi)蟲(chóng)體就呈藍(lán)色熒光，由于紅細(xì)胞沒(méi)有核酸物質(zhì)，因此，正常紅細(xì)胞不呈現(xiàn)熒光。結(jié)果顯示，染蟲(chóng)紅細(xì)胞內(nèi)蟲(chóng)體呈藍(lán)色熒光，并且以12株單抗為一抗作用的染蟲(chóng)紅細(xì)胞，在蟲(chóng)體表面或紅細(xì)胞表面均不同程度的呈現(xiàn)綠色熒光，而抗GST單抗作用的染蟲(chóng)紅細(xì)胞卻沒(méi)有呈現(xiàn)綠色熒光(如圖5)，表明這12株單抗均可以蟲(chóng)體天然蛋白質(zhì)Pf332特異性結(jié)合。實(shí)施例5
抗惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)單克隆抗體識(shí)別區(qū)域的確定根據(jù)Pf332-DBL區(qū)氨基酸序列，以25個(gè)氨基酸為一段多肽，順序分成9段多肽，其中最后一段肽為16個(gè)氨基酸，由上海生工生物公司合成并偶聯(lián)BSA。通過(guò)間接ELISA法進(jìn)行肽掃描，進(jìn)而確定單克隆抗體識(shí)別表位所在的肽段。將9段合成的多肽稀釋?zhuān)謩e以5 y g/mL, 50 u L每孔包被ELISA板，加入1000倍稀釋的抗Pf332_DBL區(qū)單抗作為一抗，進(jìn)行反應(yīng)并測(cè)定OD4tl5值，值最大的孔即為對(duì)應(yīng)的單抗結(jié)合肽段。所有的孔OD4tl5值均小于0. 2時(shí)，此單抗不結(jié)合任何肽段。結(jié)果顯示，有9株單抗可以結(jié)合4段多肽，分別是結(jié)合第I段多肽的單抗為mAb3、mAb4、mAb8 ;結(jié)合第4段多肽的單抗為mAb7 ;結(jié)合第6段多肽的單抗為mAb5、mAblO、mAbll、mAbl2 ;結(jié)合第7段多肽的單抗為mAbl ;mAb2、mAb6、mAb9不結(jié)合任何肽段，可能是由于它們所結(jié)合的區(qū)域?yàn)槎嚯亩蔚你暯訁^(qū)。實(shí)施例6
具有抑蟲(chóng)作用的抗惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)單克隆抗體的篩選
(1)對(duì)同步化培養(yǎng)后的惡性瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)體進(jìn)行鏡檢，如大部分處于晚期滋養(yǎng)體期，便計(jì)算染蟲(chóng)率，并取蟲(chóng)體培養(yǎng)物1000r/min離心5min，棄上清，再用正常紅細(xì)胞懸液和完全培養(yǎng)基稀釋至染蟲(chóng)率為I0/?！t細(xì)胞壓積為2% ；
(2)將上述稀釋好的蟲(chóng)體培養(yǎng)物加入到96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔75ii L ;
(3)選取結(jié)合第1、4、6、7段多肽和不結(jié)合多肽的單克隆抗體各一株，分別為mAb8、mAb7、mAb5、mAbl及mAb9，用完全培養(yǎng)基進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋?zhuān)瑢⑵浼尤氲骄哂邢x(chóng)體培養(yǎng)物的孔內(nèi)，每孔25 il L,每株單抗加入孔中后終濃度為0. 5mg/mL、0. 13 mg/mL、0. 03 mg/mL,每株單抗的每個(gè)濃度均設(shè)兩個(gè)重復(fù)孔，以終濃度為0. 5mg/mL的MP抗體(從感染有惡性瘧原蟲(chóng)的Mali人血清中提純的抗體)為陽(yáng)性對(duì)照，以未免疫小鼠血清中的IgG為陰性對(duì)照，終濃度也為0. 5mg/mL、0. 13 mg/mL,0. 03 mg/mL,陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均設(shè)重復(fù)孔，同時(shí)，其他孔加入25 ii L完全培養(yǎng)基作為對(duì)照組；
(4)培養(yǎng)24h后，取蟲(chóng)體培養(yǎng)物用吖啶橙染色并通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，每次測(cè)定5 X IO4個(gè)細(xì)胞；
(5)此實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，測(cè)得的染蟲(chóng)率通過(guò)以下公式計(jì)算相對(duì)侵入率。相對(duì)侵入率=檢測(cè)組染蟲(chóng)率/對(duì)照組染蟲(chóng)率
結(jié)果顯示，分別結(jié)合第I段和第4段多肽的mAb8和mAb7作用下的蟲(chóng)體相對(duì)侵入率最低，具體為0. 5mg/mL單抗作用下mAb8 :18% ；mAb7 :30%,低于0. 5mg/mL MP抗體作用下的35%，表明這兩株單抗具有非常強(qiáng)的抑制蟲(chóng)體侵入紅細(xì)胞的功能，對(duì)應(yīng)的這兩段多肽區(qū)是Pf332-DBL實(shí)施生物學(xué)功能的關(guān)鍵區(qū)。實(shí)施例7
一種可抑制惡性瘧原蟲(chóng)侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體的制備方法
1)將Pf332-DBL區(qū)基因插入帶His標(biāo)簽的載體pQE70中，構(gòu)建質(zhì)粒pQE-DBL，并轉(zhuǎn)染至工程菌M15中，表達(dá)帶His標(biāo)簽的DBL重組蛋白；
2)用帶His標(biāo)簽的DBL重組蛋白免疫小鼠，無(wú)菌摘取小鼠脾臟，在PEG1450的作用下將脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞融合，得雜交瘤細(xì)胞株；
3)將DBL片段通過(guò)PCR亞克隆到帶GST標(biāo)簽的pGEX_4T_l載體上，并轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)中，表達(dá)帶GST標(biāo)簽的DBL重組蛋白；步驟2)獲得的雜交瘤細(xì)胞株用帶GST標(biāo)簽的DBL重組蛋白進(jìn)行陽(yáng)性篩選，篩選出能夠分泌抗Pf332-DBL區(qū)單抗的雜交瘤細(xì)胞株；
4)篩選出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，再用上述的惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽，第I段(其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示)或第4段多肽(其氨基酸序列如SEQ IDNo. 2所示)進(jìn)行陽(yáng)性篩選，陽(yáng)性既為一種可抑制惡性瘧原蟲(chóng)侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體。
權(quán)利要求
1.惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽，其氨基酸序列如SEQID No. 2所示。
2.可抑制惡性瘧原蟲(chóng)侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體，其特征在于它能與權(quán)利要求I所述的惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽特異性結(jié)合。
3.可抑制惡性瘧原蟲(chóng)侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟 1)將Pf332-DBL區(qū)基因插入帶His標(biāo)簽的載體pQE70中，構(gòu)建質(zhì)粒pQE-DBL，并轉(zhuǎn)化至工程菌M15中，表達(dá)帶His標(biāo)簽的DBL重組蛋白； 2)用帶His標(biāo)簽的DBL重組蛋白免疫小鼠，在PEG1450的作用下將脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞融合，得雜交瘤細(xì)胞株； 3)將DBL片段連接到帶GST標(biāo)簽的pGEX-4T-l載體上，并轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)中，表達(dá)帶GST標(biāo)簽的DBL重組蛋白；步驟2)獲得的雜交瘤細(xì)胞株用帶GST標(biāo)簽的DBL重組蛋白進(jìn)行陽(yáng)性篩選，篩選出能夠分泌抗Pf332-DBL區(qū)單抗的雜交瘤細(xì)胞株； 4)篩選出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，再用權(quán)利要求I所述的惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽進(jìn)行陽(yáng)性篩選，陽(yáng)性即為可抑制惡性瘧原蟲(chóng)侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體。
4.權(quán)利要求2所述的可抑制惡性瘧原蟲(chóng)侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體在生產(chǎn)瘧疾的治療性多肽藥物及防治性多肽疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了可抑制惡性瘧原蟲(chóng)侵入的抗Pf332-DBL區(qū)單克隆抗體，能與惡性瘧原蟲(chóng)Pf332膜蛋白質(zhì)DBL區(qū)功能性多肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，特異性結(jié)合；它可以通過(guò)用帶His標(biāo)簽的DBL重組蛋白免疫小鼠，將脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞融合，用帶GST標(biāo)簽的DBL重組蛋白初選，再用功能性多肽進(jìn)行陽(yáng)性篩選的方法獲得；具有較強(qiáng)抑制蟲(chóng)體侵入功能，并且高于從感染有惡性瘧原蟲(chóng)的Mali人血清中提純的MP抗體；不能與功能性多肽特異性結(jié)合的單抗，抑制蟲(chóng)體侵入功能較低或沒(méi)有此功能；DBL區(qū)功能性多肽，可以應(yīng)用于瘧疾的治療性多肽藥物的研發(fā)及防治性多肽疫苗的研制。
文檔編號(hào)C07K16/20GK102718855SQ201210176879
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者姜寧, 尹繼剛, 杜承, 陸慧君, 陳啟軍 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)