四川泡菜中一種高產(chǎn)γ-氨基丁酸的短乳桿菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明為四川泡菜中一種高產(chǎn)γ-氨基丁酸的短乳桿菌，解決己有短乳桿菌產(chǎn)GABA能力不高的問(wèn)題。該菌分離于四川泡菜，具有在含谷氨酸鈉的培養(yǎng)基中產(chǎn)生γ-氨基丁酸的能力，屬于短乳桿菌（Lactobacillusbrevis），菌株保藏號(hào)：CGMCC?NO.9029。接種于輻照滅菌的糙米粉中，使糙米粉中γ-氨基丁酸含量提高了5倍。
【專利說(shuō)明】四川泡菜中一種高產(chǎn)Y-氨基丁酸的短乳桿菌
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明本發(fā)明屬于食品生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及泡菜中一種高產(chǎn)Y-氨基丁酸的短乳桿菌。
[0002]【背景技術(shù)】:
Y-氨基丁酸(Y- aminobutyric acid,簡(jiǎn)稱GABA)是一種具有生物活性的非蛋白質(zhì)氨基酸，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。臨床研究表明攝入GABA或者類似物可以降血壓，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、刺激癌細(xì)胞凋亡，還可以鎮(zhèn)靜安神，利尿。攝入富含GABA的食品可以有效的改善抑郁、失眠、精神分裂和長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致的相關(guān)疾病。
[0003]乳酸菌是一類能利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的總稱。乳酸菌被廣泛用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。其在食品發(fā)酵過(guò)程中可以賦予食品特殊的風(fēng)味，改進(jìn)食品的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)的特性。乳酸菌是益生菌的主要來(lái)源，經(jīng)科學(xué)研究證實(shí)許多乳酸菌是人體腸道固有的益生菌，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、降低血清膽固醇、調(diào)節(jié)血壓、抗氧化、抗癌和增強(qiáng)宿主免疫力等多種生理功能特性。天然食品中GABA含量比較低，傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜含有豐富的乳酸菌資源。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
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本發(fā)明的目的是提供 一種從四川自然發(fā)酵泡菜水中分離出的具有高產(chǎn)GABA能力的短乳桿菌。
[0005]四川泡菜中一種高產(chǎn)Y-氨基丁酸的短乳桿菌，該菌分離于四川泡菜，具有在含谷氨酸鈉的液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生Y-氨基丁酸的能力，屬于短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)。
[0006]工藝操作步驟為:
本發(fā)明短乳桿菌的獲得:取回實(shí)驗(yàn)室的泡菜水用無(wú)菌生理鹽水稀釋到合適梯度，取ImL稀釋液于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，傾倒固體培養(yǎng)基混勻，培養(yǎng)至出現(xiàn)大量單菌落，挑取菌落，反復(fù)劃線培養(yǎng)，進(jìn)行純化。
[0007]本發(fā)明提供的短乳桿菌自編號(hào):p-14，保藏編號(hào)為CGMCC N0.9029,2014年4月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0008]本發(fā)明短乳桿菌具有產(chǎn)GABA能力:短乳桿菌P —14接種在液體培養(yǎng)基中，30°C發(fā)酵，采用薄層層析定性檢測(cè)，其具有產(chǎn)GABA能力，用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定發(fā)酵液中GABA含量達(dá)到了 501mg/100g。
[0009]本發(fā)明短乳桿菌接種在經(jīng)輻照滅菌的糙米粉中，30°C發(fā)酵3天，使糙米粉中GABA含量達(dá)到64.7mg/100g,比未發(fā)酵糙米粉提高了 5倍。
[0010]本發(fā)明產(chǎn)GABA短乳桿菌具有良好穩(wěn)定性，連續(xù)20次培養(yǎng)，性狀穩(wěn)定，仍具有高產(chǎn)GABA能力。
[0011]本發(fā)明的短乳桿菌P— 4分離自四川傳統(tǒng)自然發(fā)酵泡菜水，未經(jīng)過(guò)人工誘變處理，屬于公認(rèn)安全(Generally Recognized As Safe, GRAS)菌種，可用于食品加工。
[0012]【具體實(shí)施方式】:下面對(duì)本發(fā)明【具體實(shí)施方式】做一個(gè)詳細(xì)的說(shuō)明。
[0013]本發(fā)明高產(chǎn)GABA短乳桿菌的分離方法，采用梯度稀釋混菌法從四川自然發(fā)酵泡菜水中分離。包括以下步驟:將ImL泡菜水用9mL無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，稀釋到泡菜水濃度為10_6-10_8mL/mL,取ImL稀釋液于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，傾倒固體培養(yǎng)基并混勻，待培養(yǎng)基凝固后，置于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48— 96小時(shí)，出現(xiàn)大量細(xì)菌菌落，挑取具有不同特征的單菌落，在分離培養(yǎng)基上劃線純化，并進(jìn)一步培養(yǎng)，得到純菌株。純化的菌株采用2種方式保藏，①用液體培養(yǎng)基在30°C培養(yǎng)24— 36小時(shí)后，在培養(yǎng)好的液體培養(yǎng)基中添加甘油，使甘油終濃度為20% (W/V)，-20°C凍存，每隔I年轉(zhuǎn)接一次;?將菌種穿刺接種在半固體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)48小時(shí)后，放于4°C冷藏，每隔4個(gè)月轉(zhuǎn)接一次。
[0014]本發(fā)明的短乳桿菌接種在固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)48小時(shí)后，觀察菌落特征，菌落較大、圓形、突起，乳白色，表面濕潤(rùn)光滑，邊緣整齊，與短乳桿菌形態(tài)相似；通過(guò)革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察細(xì)胞特征，革蘭氏染色陽(yáng)性，細(xì)胞呈短桿狀，無(wú)芽孢。過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性，在15°C生長(zhǎng)，45°C不生長(zhǎng)，氯化鈉耐受范圍為O — 6%(v/w)，能利用阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、木糖發(fā)酵產(chǎn)酸，能緩慢利用蜜二糖產(chǎn)酸，不能發(fā)酵苦杏仁苷、纖維二糖、七葉靈、乳糖、甘露醇、甘露糖、松三糖、棉子糖、鼠李糖、核糖、水楊苷、山梨醇、蔗糖、海藻糖。其生理生化特征與短乳桿菌(Lbrevis)最相似，但也存在一定差異，其不能利用七葉靈、核糖、棉子糖產(chǎn)酸，而短乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株L.brevis DSM20054能發(fā)酵以上三類糖產(chǎn)酸。本發(fā)明中短乳桿菌P-14 不能利用核糖產(chǎn)酸，這一性質(zhì)與產(chǎn)GABA短乳桿菌L.brevis CCTCCM208054不同。本發(fā)明中短乳桿菌不能利用甘露糖發(fā)酵，與高產(chǎn)GABA短乳桿菌L2保藏號(hào)為CCTCCM 209132不同。提取DNA后，用細(xì)菌通用引物27F，1492R擴(kuò)增出其16S rDNA，送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序，序列長(zhǎng)度為1434bp，與短乳桿菌(L.brevis)相似性高達(dá)99%以上。鑒定該菌株為短乳桿菌(L.brevis)。本發(fā)明短乳桿菌與Genbank中短乳桿菌相似性為99%以上，而短乳桿菌L.brevis CCTCCM 208054和短乳桿菌CCTCCM 209132與短乳桿菌相似性為97%。
[0015]本發(fā)明的高產(chǎn)GABA短乳桿菌產(chǎn)GABA定性檢測(cè)，采用薄層層析法，具體步驟包括:挑取適量冷藏的菌體接種到5mL液體培養(yǎng)基中，30°C靜置發(fā)酵48小時(shí)，取I μ L發(fā)酵液在硅膠薄層層析板上點(diǎn)樣，以濃度為0.2% (w/w)的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液、添加有2% (w/w) GABA的液體培養(yǎng)基為對(duì)照。展層后于105°C顯色5min，拍照。觀察薄層層析結(jié)果，本發(fā)明的高產(chǎn)GABA短乳桿菌發(fā)酵液具有與GABA標(biāo)品相同層析距離的條帶。
[0016]本發(fā)明的高產(chǎn)GABA短乳桿菌產(chǎn)GABA定量檢測(cè)，采用氨基酸自動(dòng)分析儀(塞卡姆
S-433D型)。挑取適量冷藏的菌體劃線接種到固體培養(yǎng)基上，待長(zhǎng)出單菌落，挑取一個(gè)單菌落菌體接種到IOOmL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10小時(shí)，制成活菌體數(shù)約為IO8個(gè)的種子發(fā)酵液，將種子發(fā)酵液以2% (v/v)的接種量接種在250mL裝有IOOmL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30°C靜置發(fā)酵72小時(shí)，所得發(fā)酵液于10000 Xg離心10min，取上清液經(jīng)0.22 μ m膜過(guò)濾后用氨基酸自動(dòng)分析儀分析其氨基酸組成，以未接種的液體培養(yǎng)基為對(duì)照。結(jié)果表明本發(fā)明的短乳桿菌發(fā)酵液中GABA含量達(dá)到了 501mg/100g
本發(fā)明的短乳桿菌活化后接種到液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)，0D600為1.1—1.2,6000Xg離心5min收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水洗滌后制成0D600為10左右的濃菌懸液，添加3mL到20g輻照滅菌糙米粉中(糙米粉:無(wú)菌水=1: 2;W/V)，30°C靜置發(fā)酵3三天，以未接種輻照糙米粉作對(duì)照，凍干后用氨基酸自動(dòng)分析儀分析其GABA含量變化，接種發(fā)酵糙米粉中GABA含量為65mg/100g，未接種糙米粉中GABA含量為llmg/100g，GABA含量提高了 5倍。
[0017]上述發(fā)明中的短乳桿菌保藏編號(hào)為=CGMCC N0.9029，保藏單位:保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期:2014年4月9日。
[0018]本發(fā)明中的液體培養(yǎng)基配方為:蛋白胨IOg,牛肉粉5g,酵母粉4g,葡萄糖20g,谷氨酸鈉10g，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸三銨2g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g,吐溫80ImL,蒸餾水 1000mL, ρΗ6.2 左右。
[0019]本發(fā)明中的固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基添加1.7 — 2.0% (w/v)瓊脂。
[0020]本發(fā)明中半固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基添加I (w/v)瓊脂。
[0021]本發(fā)明中薄層層析展層劑組成:正丁醇:冰醋酸:水(V: V: v=4:1: 3)，展層劑中含0.4%茚 三酮。
【權(quán)利要求】
1.四川泡菜中一種高產(chǎn)Y-氨基丁酸的短乳桿菌，其特征在于該菌分離于四川泡菜，具有在含谷氨酸鈉的培養(yǎng)基中產(chǎn)生Y-氨基丁酸的能力，屬于短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，菌株保藏號(hào):CGMCC N0.9029。
【文檔編號(hào)】C12R1/24GK103966139SQ201410205013
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月15日
【發(fā)明者】朱宇, 董玲, 姚英政 申請(qǐng)人:四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所