一種高效聯(lián)產(chǎn)α-氨基丁酸及葡萄糖酸的策略的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種構(gòu)建葡萄糖脫氫酶與L-氨基酸脫氫酶串聯(lián)到質(zhì)粒上并在大腸桿菌中共表達(dá)，利用該重組大腸桿菌進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化高效制備α-氨基丁酸和葡萄糖酸鹽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]α-氨基丁酸是一種可以抑制人體神經(jīng)信息傳遞的非天然氨基酸，具有加強(qiáng)葡萄糖磷酸酯酶的活性，促進(jìn)腦細(xì)胞代謝的作用。α -氨基丁酸作為一種重要的化工原料和醫(yī)藥中間體如抗結(jié)核藥物鹽酸乙胺丁醇和抗癲癇藥物左乙拉西坦的合成前體，具有廣闊的應(yīng)用市場。α -氨基丁酸主要通過化學(xué)合成法、酶拆分法及酶轉(zhuǎn)化法來制備，在這三種方法之中，微生物酶轉(zhuǎn)化法具有特異性較強(qiáng)，條件溫和，對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。微生物酶轉(zhuǎn)化法制備α -氨基丁酸主要是通過利用L-氨基酸脫氫酶對酮丁酸進(jìn)行轉(zhuǎn)氨催化作用完成，這之中需要輔因子NADH的參與，而輔因子NADH價(jià)格昂貴，顯然不適用于工業(yè)生產(chǎn)中。通過基因工程手段可以在細(xì)胞中構(gòu)建輔酶偶聯(lián)再生系統(tǒng)，Degussa公司首次利用甲酸脫氫酶提供輔因子NADH的再生并且將其應(yīng)用到L-叔亮氨酸的制備中，大大提高了產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。
[0003]葡萄糖酸是化工、醫(yī)藥及食品等產(chǎn)品的重要中間體，可被用來生產(chǎn)葡萄糖酸的衍生物如與鈉、鈣、鋅、亞鐵等金屬氧化物合成制得的葡萄糖酸鹽，也可直接作為一種產(chǎn)品，用在乳品工業(yè)上防止乳石沉淀，用在食品配方中作為酸味劑，也用來配制家用或工廠用清洗劑(替代多磷酸鹽)、織物加工和金屬加工的助劑、皮革礬鞣劑、去藻劑、金屬除銹劑、建筑工業(yè)上混凝土的塑化劑、生物降解的螯合劑及二次采油的防沉淀劑等。葡萄糖酸的生產(chǎn)主要包括微生物發(fā)酵法、電解法和催化氧化法，其中微生物發(fā)酵法因其環(huán)境友好且能耗較低被廣泛采用，但也存在發(fā)酵時(shí)間長，發(fā)酵條件控制嚴(yán)格等問題。
[0004]葡萄糖脫氫酶(Glucosedehydrogenase，縮寫GlcDH)作為短鏈乙醇脫氫酶家族的一員，在輔因子NAD (P) +等存在時(shí)能夠快速地催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸同時(shí)生成輔因子NAD (P) H。制備α-氨基丁酸過程所需的NADH可通過葡萄糖脫氫酶催化葡萄糖生成葡萄糖酸來獲取，α -氨基丁酸與葡萄糖酸的制備過程構(gòu)建了一個(gè)NAD+與NADH的輔因子循環(huán)過程，可以達(dá)到高效聯(lián)產(chǎn)α-氨基丁酸與葡萄糖酸的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的主要研究內(nèi)容:本發(fā)明在于將不同來源的葡萄糖脫氫酶基因與L-氨基酸脫氫酶基因構(gòu)建重組共表達(dá)載體pET-28a_Bsglcdh+Bcldh、pET-28a_Bsglcdh+Rjpdh及 pET-duet-Ppglcdh+Bsadh、pET-duet-Ppglcdh+Scvdh，并將其轉(zhuǎn)化 E.coli BL21，成功構(gòu)建了基因工程菌 pET-28a-Bsglcdh+Bcldh/BL21、pET-28a_Bsglcdh+Rjpdh/BL21、pET-duet-Ppglcdh+Bsadh/BL21、pET-duet_Ppglcdh+Scvdh/BL21。同時(shí)將 L-蘇氨酸脫氨酶(ltd)基因利用分子技術(shù)進(jìn)行克隆，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-Ecltd和pET-28a_Seltd，并將其轉(zhuǎn)化Ε.coli BL21，成功構(gòu)建了基因工程菌pET-28a-Ecltd/BL21及pET-28a-Ecltd/BL21。在不添加任何外源輔因子的條件下，利用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法對廉價(jià)底物L(fēng)-蘇氨酸及葡萄糖進(jìn)行轉(zhuǎn)化高效聯(lián)產(chǎn)α-氨基丁酸和葡萄糖酸，為α-氨基丁酸及葡萄糖酸的應(yīng)用提供了一種有效的策略。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:
[0007]1.引物的設(shè)計(jì)
[0008]根據(jù)不同來源的蘇氨酸脫氨酶的基因序列設(shè)計(jì)引物。
[0009]PEcltdF:5，-ACCGGGATCCATGGCTGACTCGCAACCCCT-3，(BamH I)
[0010]PEcltdR:5，-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAAAAAGAACCTG-3，(Hind III)
[0011]PSeltdF:5，-ACCGGGATCCATGGCGGAATCTCAACCTCT-3，(BamH I)
[0012]PSeltdR:5，-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAGAAAGAACC-3，(Hind III)
[0013]根據(jù)不同來源的葡萄糖脫氫酶的基因序列設(shè)計(jì)引物。
[0014]PBsglcdhF:5’-CGGGATCCATGTATCCGGATTTAAAAGG-3’ (BamH I)
[0015]PBsglcdhR:5，-CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGCCTGG-3’ (Hind III)
[0016]P28aPromoterF:5，-ACATGCATGCCGATCCCGCGAAATTAATAC-3，(Sph I)
[0017]PBsglcdhRBglI1:5，-GAAGATCTTTAACCGCGGCCTGCCTGG-3’ (Bgl II)
[0018]PPpglcdhF:5，-CGGGATCCATGAGCACTGAAGGTGCGAACC-3’ (BamH I)
[0019]PPpglcdhR:5，-CCCAAGCTTTTACTCGGCTAATTTGTAAG-3’ (Hind III)
[0020]根據(jù)不同來源的氨基酸脫氫酶的基因序列設(shè)計(jì)引物。
[0021]PBcldhF:5’-CGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCG-3’ (BamH I)
[0022]PBcldhR:5，-CGAGCTCTTAGCGACGGCTAATAATAT C-3’ (Sac I)
[0023]PRjpdhF:5’-CGGGATCCATGACTCTCACCGCGGAAC-3’ (BamH I)
[0024]PRjpdhR:5，-CGAGCTCCTACCTGGCTGCAGCGATG-3’ (Sac I)
[0025]PBsadhF:5，-GGGGTACCATGATCATAGGGGTTCCT-3，(Kpn I)
[0026]PBsadhR:5，-CCGCTCGAGTTAAGCACCCGCCACAGATG-3’ (Xho I)
[0027]PScvdhF:5’-GGAATTCCATATGGTGACCGACGTAAACGG-3’ (Nde I)
[0028]PScvdhR:5，-CGAGCTCTCACGGCCGGGGACGGGCCT-3，(Xho I)
[0029]2.重組菌的構(gòu)建
[0030]以染色體DNA作為模板，根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的引物、PCR擴(kuò)增條件和擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR0采用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度。采用相同的限制性內(nèi)切酶對載體pET-28a或者pET-Duet和純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，電泳檢驗(yàn)酶切產(chǎn)物，并用凝膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收。將載體和PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli BL21的感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆于加入氨芐霉素或卡那霉素的1mL的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確后，將菌液加入甘油于_40°C冰箱保存。
[0031]以pET_28a為葡萄糖脫氫酶及L-氨基酸脫氫酶的共表達(dá)載體時(shí)，以連上pET_28a的葡萄糖酸脫氫酶質(zhì)粒為模板，根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的帶啟動子的引物、PCR擴(kuò)增條件和擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR。采用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度。采用相同的限制性內(nèi)切酶對已經(jīng)連上L-氨基酸脫氫酶的載體pET-28a-ldh和純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，電泳檢驗(yàn)酶切產(chǎn)物，并用凝膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收。將載體和PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli BL21的感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆于加入卡那霉素的1mL的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確后，將菌液加入甘油于_40°C冰箱保存。
[0032]以pET-Duet為葡萄糖脫氫酶及L-氨基酸脫氫酶的共表達(dá)載體時(shí)。先以染色體DNA作為模板，根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的引物、PCR擴(kuò)增條件和擴(kuò)增體系進(jìn)行L-氨基酸脫氫酶的基因PCR，采用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度。采用相同的限制性內(nèi)切酶對已經(jīng)連上pET-Duet的葡萄糖脫氫酶質(zhì)粒載體和純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切以，電泳檢驗(yàn)酶切產(chǎn)物，并用凝膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收。將載體和PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli BL21的感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆于加入氨芐霉素的1mL的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確后，將菌液加入甘油于_40°C冰箱保存。
[0033]3.重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化聯(lián)產(chǎn)α -氨基丁酸和葡萄糖酸
[0034]將獲得的菌體用pH 7.5的50mM PB緩沖液洗滌兩次，再加入pH 6.0-8.0的50mMPB緩沖液重懸，然后于30-42°C不同溫度下加入底物L(fēng)-蘇氨酸及葡萄糖，以添加一定的化學(xué)試劑來控制PH