本發(fā)明涉及醫(yī)療領(lǐng)域。更詳細(xì)地，本發(fā)明涉及能夠阻斷NMDA誘導(dǎo)的谷氨酸突觸前釋放的新的肽系統(tǒng)。本發(fā)明的肽系統(tǒng)適用于治療與谷氨酸興奮性毒性相關(guān)的病狀。

背景技術(shù)：

腦中最豐富的氨基酸之一是L-谷氨酸。其在神經(jīng)元水平上最重要的功能是控制興奮性神經(jīng)傳遞，這自20世紀(jì)50年代就已經(jīng)被描述，并且其生理拮抗劑是γ-氨基丁酸(GABA)。

L-谷氨酸被認(rèn)為是興奮性信號(hào)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中快速突觸傳遞的主要介質(zhì)。L-谷氨酸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的發(fā)育中，在突觸的形成和消除中以及在細(xì)胞遷移、分化和死亡中起重要作用。此外，L-谷氨酸還是外周器官和組織以及內(nèi)分泌細(xì)胞中傳遞信號(hào)的重要分子。

當(dāng)它在生理水平釋放時(shí)，L-谷氨酸在腦功能中具有基本作用，并且似乎參與正常腦功能的許多方面，包括認(rèn)知、記憶和學(xué)習(xí)。矛盾的是，當(dāng)L-谷氨酸在突觸空間中達(dá)到高水平時(shí)，它變得高度毒性。因此有必要保持作為神經(jīng)遞質(zhì)的游離L-谷氨酸和從突觸空間去除和降解的L-谷氨酸的平衡。如果這種平衡得到良好控制，它會(huì)保持突觸傳遞的正常生理。當(dāng)這種平衡由于某些原因朝著突觸空間中的L-谷氨酸持久性不平衡時(shí)，該事件導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞存活非常危險(xiǎn)的毒性狀態(tài)。這種病理狀態(tài)被定義為“谷氨酸興奮性毒性”，并且其專門涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，盡管該氨基酸具有普遍存在的性質(zhì)。

谷氨酸能突觸傳遞因CNS細(xì)胞上存在L-谷氨酸受體(GluR)的存在而發(fā)生。這些受體分為兩個(gè)主要類別：離子型(iGluR)和代謝型(mGluR)谷氨酸能受體。

這兩種受體類別功能不同。實(shí)際上，離子型受體是一組蛋白質(zhì)(亞基)，其在細(xì)胞膜上形成離子通道，并通過向外和向內(nèi)打開和流動(dòng)離子來轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。相反，代謝型受體是橫貫在細(xì)胞膜上，不允許分子通過膜但傳遞外部信號(hào)，開始一系列細(xì)胞內(nèi)事件(第二信使)的蛋白。

亞型NMDA、AMPA和紅藻氨酸鹽(KA)構(gòu)成離子型受體組的一部分。

代謝型受體組被標(biāo)記為mGluR，并且其中8種不同的蛋白是已知的。

許多研究已經(jīng)表明，谷氨酸的急性形式的神經(jīng)毒性主要由谷氨酸(iGluR)的離子型受體介導(dǎo)。這種形式的神經(jīng)毒性的特征在于iGluR突觸前和突觸后的過度活化，其涉及被動(dòng)跟隨Cl^-離子的大量Na⁺的神經(jīng)元內(nèi)的流入和K⁺離子的流出。離子的這種運(yùn)動(dòng)負(fù)責(zé)水的進(jìn)入，這引起神經(jīng)元“腫脹”，滲透性溶解和壞死。此外，大量的Ca²⁺流完成離子運(yùn)動(dòng)。

在負(fù)責(zé)谷氨酸突觸前釋放的谷氨酸能受體中，有被稱為NMDA的谷氨酸能受體。這種受體是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)和表征的谷氨酸能受體。

NMDA從以特定方式藥理活化它的化學(xué)物質(zhì)命名，即：N-甲基D-天冬氨酸。它是由4個(gè)亞基形成的配體激活的通道受體，其中4個(gè)亞基一起在細(xì)胞膜中產(chǎn)生孔。它在神經(jīng)元中的定位是突觸后和突觸前。

NMDA通道具有被鎂離子正常阻斷的特定特性。當(dāng)存在神經(jīng)元的去極化時(shí)，例如當(dāng)谷氨酸的其他受體(AMPA，代謝型)被激活時(shí)，這種“鎂阻斷”不會(huì)發(fā)生。

NMDA受體由多個(gè)亞單位的組裝體：GLUN1和GLUN2構(gòu)成。后者又相應(yīng)地分為其他同種型(2A-B-C-D)。亞基的組成在腦的各個(gè)部位和亞細(xì)胞定位中是可變的，但是GLUN1的存在對(duì)于正常受體功能是必需的。

NMDA受體復(fù)合物對(duì)于不同分子具有許多不同的鍵合位點(diǎn)——由于它們與谷氨酸一起是共激動(dòng)劑——可以調(diào)節(jié)通道的開放，并因此調(diào)節(jié)對(duì)該事件的細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)度。這些調(diào)節(jié)位點(diǎn)是谷氨酸的位點(diǎn)(也是NMDA的位點(diǎn))、甘氨酸的位點(diǎn)和多胺(精胺和亞精胺)的位點(diǎn)。

一旦突觸前NMDA通道開放，存在Na⁺，Ca²⁺離子的入口和K⁺離子的出口。這種離子運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致膜的去極化，并因此導(dǎo)致谷氨酸的釋放。NMDA的去極化誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)激活導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)釋放的所有系統(tǒng)的Ca²⁺的增加和遷移。

即使現(xiàn)在許多研究已經(jīng)描述了NMDA受體將外部信號(hào)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)部的模式，仍然需要許多努力來了解在這種機(jī)制中哪些是結(jié)合NMDA受體和釋放谷氨酸的蛋白。

這個(gè)論點(diǎn)的重要性在于許多病理學(xué)與興奮毒性相關(guān)，即使藥物存在試圖對(duì)抗它們，但是迫切需要找到更具體地可以作為創(chuàng)新藥物的目標(biāo)的新的藥理學(xué)靶點(diǎn)。

然而，除了對(duì)于神經(jīng)元的生命是必需的之外，谷氨酸也可以變得相當(dāng)有毒。在急性應(yīng)激事件例如缺血、顱腦損傷和癲癇危象期間GluR的過度活化導(dǎo)致腦神經(jīng)元的死亡。此外，谷氨酸的神經(jīng)毒性也可以參與在神經(jīng)變性和神經(jīng)炎癥的背景下分類的各種慢性疾病的發(fā)病機(jī)理。谷氨酸的神經(jīng)毒性可通過NMDA、AMPA、KA受體或谷氨酸代謝型受體的第I組的異常刺激而發(fā)生。這些不同類型的受體的相對(duì)貢獻(xiàn)根據(jù)所涉及的神經(jīng)元和各種其他情況而變化。

谷氨酸通過這種受體的過度激活似乎在各種攻擊后的細(xì)胞死亡中起重要作用，例如與癲癇狀態(tài)、腦缺血、圍產(chǎn)期窒息和顱外傷有關(guān)的那些。更具體地，似乎NMDA受體是更大程度地參與這些病理的受體；實(shí)際上，通過使用NMDA拮抗劑，可以緩解與這些病理相關(guān)的腦損傷程度。

當(dāng)應(yīng)激嚴(yán)重時(shí)，細(xì)胞死亡通過壞死發(fā)生，而如果其不太嚴(yán)重，則可觸發(fā)凋亡型過程。所涉及的主要機(jī)制是通過配體依賴和電壓依賴性通道連接到Na+和Ca²⁺的過量進(jìn)入有關(guān)的離子不平衡。細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺濃度的增加以級(jí)聯(lián)方式激活有助于細(xì)胞死亡的各種酶。離子穩(wěn)態(tài)的變化、改變的能量細(xì)胞代謝、線粒體的毒性和來自自由基的氧化應(yīng)激之間存在復(fù)雜的相互作用。

還已經(jīng)提出GluR受體的慢性活化也起到基本作用，因?yàn)檫@可以在多種遲發(fā)性神經(jīng)性障礙中誘導(dǎo)神經(jīng)變性的過程。至少部分地，過度和長(zhǎng)期活化受體如NMDA或AMPA的內(nèi)源性谷氨酸似乎是諸如肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、多發(fā)性硬化、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默氏病和帕金森病疾病的發(fā)病機(jī)制的原因。目前在市場(chǎng)上臨床藥物被用于急性和慢性病。它們的活性通常是NMDA受體拮抗劑的活性。這種受體阻斷劑一方面似乎有效并且在有些上述病狀中產(chǎn)生初步益處，另一方面產(chǎn)生甚至可能是嚴(yán)重的副作用。因此，醫(yī)學(xué)研究必須盡最大努力，繼續(xù)鑒定受體的細(xì)胞內(nèi)配偶體，在這種特定情況下是NMDA，以使得可能的藥物的作用越來越具有特異性和少毒性。

在老年人群中引起慢性癡呆的最常見疾病是阿爾茨海默病(AD)。

在這種病理學(xué)中，發(fā)作是進(jìn)行性的，并且從年輕時(shí)開始發(fā)展，那時(shí)認(rèn)知功能輕微下降。

然后，在偶發(fā)性記憶減少發(fā)作之后，在語言和現(xiàn)實(shí)感知以及執(zhí)行正常日?；顒?dòng)的能力方面存在認(rèn)知缺陷的增加。

現(xiàn)在已經(jīng)確定，該病理學(xué)是由于在分配給記憶的區(qū)域中的神經(jīng)炎斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的沉積。這些沉積物隨時(shí)間流逝導(dǎo)致進(jìn)行性神經(jīng)元死亡，從而誘導(dǎo)尤其是皮質(zhì)和海馬的腦萎縮。

已認(rèn)識(shí)到，通過淀粉樣前體蛋白(AβPP)的淀粉樣加工過量產(chǎn)生的β-淀粉樣蛋白(Aβ)肽的片段是AD原因的第一個(gè)因素。實(shí)際上，Aβ肽的胞外積累導(dǎo)致神經(jīng)炎斑的形成。正在討論關(guān)于神經(jīng)元毒性的物質(zhì)是循環(huán)的細(xì)胞外肽還是不溶性斑塊。

神經(jīng)原纖維纏結(jié)是病理學(xué)的另一種組織病理學(xué)特征。在這些纏結(jié)中最存在的蛋白質(zhì)是與其超磷酸化形式的微管(Tau)相關(guān)的蛋白質(zhì)。這些細(xì)胞間聚集體存在于各種神經(jīng)變性病理學(xué)中，其被稱為tau蛋白病。這種蛋白質(zhì)的過度磷酸化被指示為這些病理學(xué)中神經(jīng)元變性的原因。

帕金森病(PD)是一種神經(jīng)退行性病變，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特定區(qū)域主要由于嚴(yán)重的排尿問題擊中運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)而受到損傷。這種類型的缺陷歸因于投射到條紋體的黑色物質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性變性。在腦組織中的分子水平上，PD的特征在于Lewy體的積累，Lewy體是蛋白質(zhì)聚集體，其中α-突觸核蛋白和泛素也可以在其他元件中被識(shí)別。有各種導(dǎo)致該病的病理學(xué)遺傳突變體和蛋白質(zhì)；在目前已知的那些中，還有Parkin，其突變是大多數(shù)家族性PD形成的原因和涉及各種基因轉(zhuǎn)錄的多功能蛋白DJ-1，DJ-1的功能喪失是早期PD發(fā)病的原因之一。

肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)是影響腦運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和脊髓的高度失能的退行性神經(jīng)病理學(xué)。

該病起始于大量消耗，導(dǎo)致肌肉萎縮，并逐漸發(fā)展成肌肉癱瘓。

SLA通常是零星來源的，但一部分的遺傳形式被認(rèn)可。在遺傳形式的情況下，超氧化物歧化酶(SOD1)的突變是疾病的原因。SOD1參與通過發(fā)揮解毒作用保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受“氧化”。

突變的人SOD1導(dǎo)致對(duì)所討論的神經(jīng)元細(xì)胞有毒的聚集體的形成。

亨廷頓舞蹈病(HD)是具有遺傳特性的神經(jīng)變性病理學(xué)，其屬于來自多聚谷氨酰胺的病理學(xué)類別。紋狀體神經(jīng)元的逐漸萎縮是這種病理學(xué)的主要特征，其導(dǎo)致具有非常熟知的排尿缺陷。

HD是亨廷頓蛋白(HTT)的N末端鏈的polyQ延長(zhǎng)的結(jié)果，其不被這樣降解并積聚在神經(jīng)元中。

腦缺血不是具有退行性特征的病理學(xué)；然而，擊中注定要死亡的神經(jīng)細(xì)胞也可以在與其他神經(jīng)變性病理的病理性共病中具有重要作用，并且其存在于癲癇以及圍產(chǎn)期窒息和頭顱創(chuàng)傷中。它是一種高度致殘的疾病，會(huì)導(dǎo)致死亡或嚴(yán)重殘疾。當(dāng)由于心臟病發(fā)作，動(dòng)脈瘤、血管閉塞、出血、創(chuàng)傷等原因，正常血流不再提供大腦區(qū)域時(shí)，局部缺血以明顯突然的方式發(fā)生。由于受影響區(qū)域中的血液再灌注缺血期間氧和葡萄糖的喪失以及損傷導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)歷高代謝應(yīng)激。

在細(xì)胞水平上，缺血引起ATP的減少，細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，氧化損傷和線粒體功能障礙。所有這些事件導(dǎo)致高的谷氨酸能傳遞，其導(dǎo)致興奮性毒性并因此損害注定死亡的神經(jīng)元細(xì)胞。

多發(fā)性硬化(MS)是脫髓鞘性慢性自身免疫性疾病，其擊中中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起各種各樣的體征和癥狀。多發(fā)性硬化癥擊中神經(jīng)細(xì)胞，使得腦和脊髓之間的交流困難。神經(jīng)細(xì)胞通過軸突傳遞電信號(hào)，軸突被隔離物質(zhì)髓鞘覆蓋。在該疾病中，患者的免疫防御攻擊并損傷該鞘。當(dāng)這種情況發(fā)生時(shí)，軸突不再能夠有效地傳輸信號(hào)。其致病機(jī)制是復(fù)雜的，并由興奮毒性基礎(chǔ)上的炎癥和變性過程維持；確切的病因仍然未知。不同的理論提出遺傳和感染原因；此外，已經(jīng)指示了與環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素的相關(guān)性。該疾病可以表現(xiàn)為許多神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，并且可以發(fā)展為身體和認(rèn)知?dú)埣病６喟l(fā)性硬化可以呈現(xiàn)多種形式，包括復(fù)發(fā)和進(jìn)行性形式。

重性抑郁障礙是一種情緒障礙或病理學(xué)，其特征為抑郁情緒的發(fā)作伴隨著低自尊和在正常的愉悅活動(dòng)中的興趣或快樂的喪失。抑郁癥是一種復(fù)雜的疾病，由于遺傳和環(huán)境因素，涉及神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。最確認(rèn)的假說是“抑郁癥的單胺能理論”，根據(jù)該假說，臨床抑郁癥將源于使用單胺例如5-羥色胺、多巴胺或去甲腎上腺素的一種或多種類型的腦突觸的效率降低。新的研究表明抑郁癥和一些參與谷氨酸信號(hào)傳遞的基因的一些變體之間的關(guān)系。據(jù)此，已經(jīng)證明氯胺酮(已知用于阻斷NMDA受體的物質(zhì))具有比常規(guī)抗抑郁藥更快的抗抑郁作用，而常規(guī)抗抑郁藥在顯示結(jié)果之前需要許多周：氯胺酮能夠在很大程度上反對(duì)抑郁癥比目前用抗抑郁藥(其確實(shí)沒有有效地解決目前的問題)發(fā)生的方式更有效。

精神分裂癥是一種嚴(yán)重的精神障礙，是復(fù)雜的，往往是有病的。精神分裂癥的第一癥狀通常表現(xiàn)在青春期和早期成年期。受精神分裂癥影響的人難以表達(dá)他們的想法；這種情況導(dǎo)致他們有幻覺、妄想、不連貫的思想以及不尋常的行為和言語。由于這些癥狀，被這種疾病打擊的人們?cè)谂c他人交流中具有嚴(yán)重的困難，并且傾向于與外部世界隔離。已經(jīng)進(jìn)行了各種嘗試來解釋改變的腦功能和精神分裂癥之間的聯(lián)系。最經(jīng)典的假說之一是多巴胺的作用：多巴胺能神經(jīng)元的功能障礙可能是導(dǎo)致精神病的癥狀的原因。最近的結(jié)果支持物理受試者中多巴胺和谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)之間的異常關(guān)系的假說，并且表明能夠影響谷氨酸鹽傳遞途徑的藥物的開發(fā)可用于治療精神病。

焦慮癥是精神疾病的常見形式，其通常引起明顯的痛苦和問題并導(dǎo)致生活質(zhì)量下降。存在不同類型的焦慮障礙：例如，廣泛性焦慮障礙、社交焦慮障礙、恐慌障礙和強(qiáng)迫性強(qiáng)迫性障礙。焦慮癥的原因是未知的。然而，腦功能的一些改變似乎涉及各種焦慮癥。此外，社會(huì)和壓力條件可能有助于焦慮癥的發(fā)展。由于遺傳學(xué)、神經(jīng)化學(xué)、心理藥理學(xué)和神經(jīng)成像技術(shù)的發(fā)展，對(duì)涉及恐懼、焦慮和相關(guān)干擾的生物學(xué)基礎(chǔ)的理解-即使仍然不全面-已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展。特別地，關(guān)于焦慮的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)的知識(shí)的顯著增加源自對(duì)恐懼反應(yīng)的行為組分的研究，特別是與涉及神經(jīng)解剖學(xué)途徑(杏仁核、前額皮質(zhì)[PFC]、丘腦和海馬)，以及可以至少部分解釋個(gè)體對(duì)焦慮障礙的不同脆弱性的受體和遺傳方面。在涉及的神經(jīng)遞質(zhì)中，GABA、谷氨酸、5-羥色胺、神經(jīng)肽和內(nèi)源性大麻素發(fā)揮重要作用。

偏頭痛是一種高度禁用的局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)病理學(xué)，其在最嚴(yán)重的情況下也與自主神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀相關(guān)。通常，病理學(xué)表現(xiàn)為局限在頭部的疼痛，但也與惡心、嘔吐、畏光和恐懼癥有關(guān)。許多遭受偏頭痛的人會(huì)有預(yù)兆，其表現(xiàn)在頭痛之前的暫時(shí)視覺、運(yùn)動(dòng)和感覺障礙。目前，最確認(rèn)的分子原因是在神經(jīng)元，特別是皮質(zhì)中發(fā)生的異常興奮性興奮性喘振，然后是在整個(gè)皮層區(qū)域延伸的神經(jīng)元活動(dòng)的抑制。目前使用的藥物是在最嚴(yán)重的情況下與止吐藥物相關(guān)的經(jīng)典的鎮(zhèn)痛藥物。因此，在這種病理學(xué)中，谷氨酸鹽的過度釋放是器官紊亂的基礎(chǔ)。

另一種谷氨酸釋放是疼痛癥狀的原因之一的病理是慢性神經(jīng)性疼痛。這是自外周纖維和中心纖維之間的神經(jīng)信號(hào)的連接以異常方式起作用開始的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理學(xué)。通常，癥狀表現(xiàn)為持續(xù)的燒灼或電擊感，并且感覺異常也常常存在于主疼痛位置的周圍區(qū)域。痛覺過敏和異常性疼痛是這種病理的主要特征。

不幸的是，神經(jīng)性疼痛難以治愈；目前使用的唯一藥物是鎮(zhèn)痛藥，其通常導(dǎo)致無效。

本發(fā)明基于識(shí)別位于神經(jīng)元終止的突觸前區(qū)室上的NMDA受體的活化所誘導(dǎo)的谷氨酸釋放的非常特異性的機(jī)制。特別地，下文詳細(xì)描述的本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)c-Jun N-末端激酶(JNK)參與由NMDA受體活化觸發(fā)的細(xì)胞事件的級(jí)聯(lián)中的識(shí)別。這發(fā)生在第一次記錄在突觸前水平的JNK蛋白的存在時(shí)。在開始更詳細(xì)的描述之前，及時(shí)指出JNK是具有與涉及許多細(xì)胞功能的不同信號(hào)途徑相關(guān)的酶活性的普遍存在的細(xì)胞內(nèi)激酶。JNK是涵蓋在導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的信號(hào)中的核心作用的蛋白質(zhì)，其在各種病理?xiàng)l件下得到驗(yàn)證。JNK可以在刺激酪氨酸激酶受體、細(xì)胞因子受體，與G蛋白偶聯(lián)的受體和配體依賴性離子通道(包括NMDA受體)后被激活，并且它們表示信號(hào)細(xì)胞死亡的真正指標(biāo)。雖然JNK通常與突觸后NMDA受體相關(guān)，但其突觸前的作用仍然很大程度上未被發(fā)現(xiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及能夠特異性阻斷NMDA誘導(dǎo)的谷氨酸突觸前釋放的肽系統(tǒng)。特別地，本發(fā)明涉及適于制備用于抑制參與控制谷氨酸釋放的蛋白質(zhì)的相互作用的兩種細(xì)胞滲透性肽。在本發(fā)明肽系統(tǒng)的定義的上游，通過生物化學(xué)和電生理學(xué)方法，證實(shí)了JNK在突觸前水平的存在，參與NMDA誘發(fā)的谷氨酸釋放的控制。此外，通過使用敲除小鼠與JNK的單一同種型結(jié)合分子模型研究，在與本發(fā)明有關(guān)的研究過程中證明JNK的同種型2是介導(dǎo)該突觸前的必需蛋白事件。更詳細(xì)地，表明JNK2位于神經(jīng)元的突觸前部分，并且可能通過與稱為突觸融合蛋白1a(STX1a)的專有突觸蛋白的相互作用來執(zhí)行其對(duì)NMDA介導(dǎo)的釋放的控制的作用。由于STX1a是神經(jīng)遞質(zhì)釋放機(jī)制的必需蛋白，本發(fā)明是基于JNK2和STX1a之間相互作用的研究，以確定兩種蛋白質(zhì)相互作用的部位。因此，設(shè)計(jì)了兩種細(xì)胞可滲透的肽，其能夠阻斷這種JNK2-STX1a相互作用。以這樣的方式設(shè)計(jì)肽，使得它們可以通過細(xì)胞屏障并抑制位于突觸前水平的相互作用。因此，這兩種肽能夠特異性阻斷NMDA誘導(dǎo)的谷氨酸突觸前釋放。這兩種肽在下文中稱為JGRi1和JGRi2。

附圖說明

圖1表示JNK蛋白的抑制對(duì)谷氨酸的突觸前釋放的作用，并且還顯示了在不同刺激的作用下JNK蛋白的突觸活化。A)表示從野生型小鼠的皮質(zhì)制備的突觸體的相關(guān)結(jié)果，所述突觸體預(yù)先裝載有放射性神經(jīng)遞質(zhì)，然后如所示用不同的刺激孵育。結(jié)果表示為誘導(dǎo)釋放的百分比。數(shù)據(jù)表示為三個(gè)重復(fù)(每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件三個(gè)灌注室)的三個(gè)實(shí)驗(yàn)獲得的平均值±SEM(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。**p<0.01相對(duì)于基礎(chǔ)釋放。B)從野生型小鼠的皮質(zhì)制備的突觸體預(yù)先裝載放射性神經(jīng)遞質(zhì)，并在如所示的刺激之前與L-JNKi1(2μM)孵育30分鐘。結(jié)果表示為誘導(dǎo)釋放的百分比。數(shù)據(jù)表示為從三個(gè)重復(fù)的三個(gè)實(shí)驗(yàn)(每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件三個(gè)灌注室)獲得的平均值±SEM(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。L-JNKi1阻止NMDA刺激引起的釋放。**p<0.01相比于由NMDA誘發(fā)的100％釋放。C-D-E)具有相對(duì)定量的代表性蛋白質(zhì)印跡，顯示在KCl(B)刺激90秒，NMDA(C)10分鐘，AMPA(D)10分鐘后達(dá)到的p-JNK水平和用帶L-JNKi1的突觸體處理。結(jié)果表示為p-JNK/JNK比例相比對(duì)照(按100％計(jì))的增加百分率。數(shù)據(jù)表示每個(gè)條件4個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。用NMDA處理誘導(dǎo)JNK磷酸化增加**p<0.01相對(duì)于對(duì)照的100％)，而JNKi1不降低NMDA的作用(*p<0.05，相對(duì)于對(duì)照的100％)。

圖2表示JNK在依賴于NMDA的谷氨酸的釋放中的功能性作用。A)描述了來自菌株C57BL6/J的小鼠切片的7個(gè)神經(jīng)元記錄和與L-JNKi1(2μM)預(yù)孵育的小鼠C57BL6/J切片的10個(gè)神經(jīng)元記錄的誘發(fā)型EPSC的配對(duì)脈沖比(PPR)直方圖(平均值±SEM)。在左邊，在對(duì)照條件下，在施用D-AP5(50μM)期間和在洗滌D-AP5后，從相同的神經(jīng)元獲得代表性印跡。B)表示mEPSC(左)和從C57BL6/J的單個(gè)神經(jīng)元記錄的事件間間隔(右)或與D-AP5響應(yīng)的與L-JNKi1預(yù)孵育的C57BL6/J神經(jīng)元的振幅的累積分布。在對(duì)照條件下，在施用D-AP5和隨后的洗滌期間，從相同的神經(jīng)元獲得頂部印跡。C)描繪了從C57BL6/J株的小鼠切片的11個(gè)神經(jīng)元和回應(yīng)D-AP5與L-JNKi1預(yù)孵育的小鼠C57BL6/J神經(jīng)元切片的10個(gè)神經(jīng)元記錄的誘發(fā)EPSC的配對(duì)脈沖比(PPR)的直方圖(平均值±SEM)。**p<0.01(t-檢驗(yàn))。

圖3表示JNK控制Syntaxin 1a的磷酸化，并且JNK2/3與Syntaxin 1a一起免疫共沉淀。A)顯示了在所示的治療期間各自定量的STX1a的磷酸化的代表性的蛋白印跡結(jié)果。結(jié)果表示為百分比，并用對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)是5個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM，其中10分鐘的NMDA+L-JNKi1降低了pSTX1a/STX1a的比率(**p<0.01相對(duì)于對(duì)照的100％)，L-JNKi1自身也是如此(**p<0.01相對(duì)于對(duì)照的100％)。B)表示代表性的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，其中各自的定量顯示了在用D-AP5處理期間JNK的磷酸化水平。結(jié)果表示為相對(duì)于對(duì)照的百分比(100％)。數(shù)據(jù)是3次實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。C)顯示了代表性的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，其中各自的定量顯示了在用D-AP5處理期間STX1a的磷酸化水平。結(jié)果表示為百分比，并用對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)表示3個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。D)表示相對(duì)定量的免疫共沉淀(Co-IP)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖所示刺激野生型小鼠的皮質(zhì)突觸體，并用STX1a抗體進(jìn)行免疫沉淀。代表性的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示剝離程序后p-JNK的Co-Ip和JNK。將膜印跡為STX1a(作為免疫沉淀的對(duì)照)和SYT1(作為特異性的對(duì)照)。結(jié)果表示為相對(duì)于對(duì)照條件p-JNK/STX1a或JNK/STX1a比率增加的百分比。數(shù)據(jù)是每個(gè)處理的4個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM(*p<0.05，**p<0.01，相對(duì)于對(duì)照的100％)。

圖4表示NMDA-誘發(fā)的谷氨酸釋放和NMDA-誘導(dǎo)的JNK磷酸化在JNK2KO小鼠中如何被抑制。

A)表示在預(yù)裝有放射性示蹤劑的野生型和JNK-KO型小鼠的皮質(zhì)中的突觸體中通過NMDA刺激誘導(dǎo)的谷氨酸釋放的結(jié)果。結(jié)果表示為誘導(dǎo)釋放的百分比。數(shù)據(jù)是一次三個(gè)進(jìn)行的4個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM(每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件3個(gè)灌注室)。**p<0.01相對(duì)于WT；相對(duì)于JNK1-KO或JNK3-KO，p<0.05。B)表示定量的代表性蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，其顯示了在治療期間JNK2-KO或JNK3-KO小鼠中pJNK/JNK的比率。結(jié)果表示為相對(duì)于對(duì)照的百分比(100％)。數(shù)據(jù)表示3個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM(**p<0.01相對(duì)于100％的對(duì)照)。

圖5表示同種型JNK2如何參與NMDA介導(dǎo)的谷氨酸釋放。A)表示響應(yīng)于D-AP5(50μM)的同工型JNK KO小鼠的單個(gè)神經(jīng)元記錄的mEPSC的幅度(左)和事件間間隔(右)的累積分布。在對(duì)照條件下，在施用D-AP5和隨后的洗滌期間，從相同的神經(jīng)元獲得頂線。B)表示mEPSC(左)和事件間間隔(右)的振幅值的平均值的直方圖(平均值±SEM)，其中響應(yīng)D-AP5放的n＝8JNK1KO，n＝7JNK2KO和n＝6JNK3KO神經(jīng)元。**p<0.01t-檢驗(yàn)。

圖6表示蛋白質(zhì)相互作用JNK-STX1a的分子對(duì)接模型。A、B、C)代表從分別鑒定為模型1、2和3的STX1a和JNK2之間相互作用的研究中獲得的三個(gè)最佳對(duì)接可能性。JNK2蛋白由組100表示，而STX1a的N末端部分由組200表示。D)表示STX1a的N-末端部分的結(jié)構(gòu)：示出了300、400和500區(qū)段，其表示以最高概率與JNK2相互作用的部分。所有圖像的渲染是通過使用VMD軟件進(jìn)行的。

圖7表示用L-JNKi1處理不引起NMDA和AMPA受體亞單位(A)的改變，也不引起釋放機(jī)制(B)的蛋白質(zhì)的改變，不論在NMDA刺激條件期間還是它獨(dú)自施用。

圖8表示在電生理學(xué)膜片鉗實(shí)驗(yàn)中兩種肽JGRi1和JGRi2對(duì)野生型小鼠皮層切片中谷氨酸鹽的釋放的影響。更詳細(xì)地，所討論的圖表示具有n＝9個(gè)神經(jīng)元的事件間間隔的幅度值的平均值的直方圖(平均值±SEM)，其中JGRi1和JGRi2一起應(yīng)用或n＝4個(gè)神經(jīng)元用于JGRi1和n＝6個(gè)神經(jīng)元的JGRi2。**p<0.01t-檢驗(yàn)。

圖9表示肽的固相化學(xué)合成方法的實(shí)例。符號(hào)表示：小圈，氨基酸鏈保護(hù)基；R，氨基團(tuán)保護(hù)；X、Y、Z、L，官能團(tuán)。

循環(huán)重復(fù)該過程，直到獲得肽。

圖10表示從具有序列SEQ ID NO.5：GRKKRRQRRRPPIEQSIEQEEGLNRS的肽JGRi1的HPLC分析獲得的色譜圖。

圖11表示從具有序列SEQ ID NO.8：GRKKRRQRRRPPMSEYNATQSDYRER的肽JGRi2的HPLC分析獲得的色譜圖。

圖12表示具有序列SEQ ID NO:5：GRKKRRQRRRPPIEQSIEQEEGLNRS的肽JGRi1的質(zhì)譜。

圖13表示具有序列SEQ ID NO.8:GRKKRRQRRRPPMSEYNATQSDYRER的肽JGRi2的質(zhì)譜。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明基于在STX1a突觸前水平存在JNK同種型(JNK1、JNK2、JNK3)存在的證實(shí)。以這種蛋白質(zhì)相互作用為起點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩種肽：細(xì)胞可滲透的JGRi1和JGRi2，其能夠阻斷這種JNK2-STX1a相互作用并減少通過刺激NMDA受體誘導(dǎo)的谷氨酸的釋放。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

c-Jun N端激酶(JNK)調(diào)節(jié)谷氨酸的突觸前釋放

JNK在突觸前水平上的生理學(xué)存在通過進(jìn)行谷氨酸釋放實(shí)驗(yàn)來證明。由于該實(shí)驗(yàn)類型，可以研究JNK激酶在突觸前區(qū)室中的作用。使用小鼠品系C57/BL6的分離皮層末端(突觸體)。對(duì)預(yù)先裝載有氚化的D-天冬氨酸([³H]D-Asp)的這些突觸體進(jìn)行由不同刺激誘導(dǎo)的谷氨酸釋放。突觸體用已經(jīng)使用多年的方法即超表達(dá)進(jìn)行刺激，其中突觸體用連續(xù)的電流溶液不斷洗滌，并且在某一點(diǎn)進(jìn)行刺激。在該過程中釋放的氚化谷氨酸由于突觸前細(xì)胞內(nèi)事件而被排他地釋放，并且一旦收集，就被分配到β-發(fā)射輻射計(jì)數(shù)器中。突觸體對(duì)輕微去極化刺激(8mM KCl)的瞬時(shí)暴露(90秒)誘導(dǎo)[³H]D-Asp明顯地胞吐釋放(158±37％對(duì)比，**P<0.01)，其與暴露于100μMNMDA的10分鐘獲得的釋放相當(dāng)(202±21％相對(duì)于對(duì)照，**p<0.01)。在缺乏Mg²⁺的培養(yǎng)基中應(yīng)用NMDA刺激以確保突觸前NMDA受體的有效性。以相同的方式，10分鐘的50μM(S)-AMPA的刺激能夠顯著增加[³H]D-Asp的釋放(98±11％相對(duì)于對(duì)照，**P<0.01)(圖1A)。所有應(yīng)用的刺激已知用于以Ca²⁺依賴性方式觸發(fā)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。然后，為了研究JNK的可能的突觸前作用，使用阻斷JNK信號(hào)級(jí)聯(lián)的特異性抑制劑

(L-JNKi1)，阻止JNK與結(jié)合JNK結(jié)合域(JBD)的靶蛋白的相互作用。L-JNKi1是市售的細(xì)胞滲透性肽，皮質(zhì)突觸體與它在2μM濃度下處理30分鐘。有趣的是觀察到，僅NMDA-刺激的谷氨酸的釋放被L-JNKi1強(qiáng)烈抑制(-60±10％相對(duì)于對(duì)照＝100％**P<0.01)(圖1B)，這表明是JNK信號(hào)級(jí)聯(lián)在特異性調(diào)節(jié)NMDA誘發(fā)的谷氨酸釋放中存在特異性。

在突觸按鈕級(jí)別激活JNK

上述報(bào)告的結(jié)果首次說明JNK在突觸前按鈕中的存在以及相應(yīng)的功能。此外，很明顯JNK能夠調(diào)節(jié)由NMDA受體活化誘導(dǎo)的谷氨酸的釋放。為了證實(shí)JNK的突觸前位置及其它們可能的活化，對(duì)小鼠的皮質(zhì)突觸體進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)，測(cè)量由上述刺激誘導(dǎo)的磷酸化(圖1C-E)。在不含Mg²⁺的培養(yǎng)基中暴露于100μMNMDA 10分鐘后，JNK的磷酸化增加(+63±18％，相對(duì)于對(duì)照＝100％**P<0.01)。由于L-JNKi1不影響JNK的磷酸化，即使其已經(jīng)預(yù)孵育，所應(yīng)用的NMDA刺激繼續(xù)導(dǎo)致磷酸化JNK的增加(+49±10％相對(duì)于對(duì)照＝100％。*P<0.05)。相反，當(dāng)L-JNKi1單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，JNK基礎(chǔ)磷酸化保持不變，表明該物質(zhì)在基礎(chǔ)系統(tǒng)中沒有作用(圖1D)。另外兩種去極化刺激，AMPA和KCl，反而不能增加JNK的磷酸化，表明NMDA刺激是特異性調(diào)節(jié)JNK活性的(圖1C-E)。

JNK介導(dǎo)NMDA依賴性谷氨酸的突觸前釋放

谷氨酸能末端上的突觸前NMDA受體被自發(fā)釋放的谷氨酸激活，并且通過正反饋機(jī)制，確定谷氨酸的強(qiáng)直釋放。進(jìn)行電生理記錄以研究JNK在谷氨酸鹽釋放中的功能作用。為此，從與或不與JNK、L-JNKi1抑制劑(2μM，30min)一起孵育的成年小鼠C57BL6/J獲得的內(nèi)嗅皮質(zhì)(EC)的大腦切片的錐體神經(jīng)元測(cè)量稱為雙脈沖易化(PPF)的參數(shù)。這種雙脈沖易化是通過膜片鉗配置中電生理記錄技術(shù)進(jìn)行研究的模式。

在這種情況下，用NMDA受體拮抗劑D-AP5(50μM)的灌注不可逆地降低了以50ms間隔獲得的雙脈沖(PPR)關(guān)系(**p<0.01，Student t-檢驗(yàn)，對(duì)照相對(duì)于D-AP5，n＝7；**p<0.01，Student t-檢驗(yàn)，D-AP5相對(duì)于洗滌，n＝7；圖2A)。當(dāng)切片用L-JNKi1預(yù)孵育時(shí)，用D-AP5灌注不改變PPR(p>0.05，Student t-檢驗(yàn)，對(duì)照相對(duì)于D-AP5，n＝10；圖2A)。該數(shù)據(jù)表明，即使在更加整合的系統(tǒng)如大腦切片中，L-JNKi1也消除了NMDA依賴性突觸前釋放的概率，并且與突觸體的釋放數(shù)據(jù)一致。

隨后，根據(jù)已經(jīng)常用的方案，通過測(cè)量微型興奮性電流(mEPSC)，研究L-JNKi1對(duì)NMDA依賴性突觸前谷氨酸釋放的影響。當(dāng)在膜片電極下在存在細(xì)胞外河豚毒素(1mM)和微毒素(100μM)以及MK-801(10mM)、NMDA抑制劑(在記錄的細(xì)胞中為了阻斷突觸后NMDA通道)的存在下將D-AP5應(yīng)用，觀察到累積事件(IEI)之間的間隔分布的可逆增加(***p<0.001，KS測(cè)試，C57BL6/J相對(duì)于D-AP5，n＝11；圖2B)和其平均值(**p<0.01，Student t-檢驗(yàn)，對(duì)照相對(duì)于D-AP5，n＝11；圖2C)；另外，相同事件的累積幅度和平均值都沒有受到影響(p>0.05，KS測(cè)試，C57BL6/J相對(duì)于D-AP5，n＝11；圖2B，p>0.05，Student t-檢驗(yàn)，對(duì)照相對(duì)于D-AP5，n＝11；圖2C)。D-AP5引起的頻率降低是由于突觸前NMDA受體的阻斷，這有助于補(bǔ)充性谷氨酸鹽的釋放。在與L-JNKi1預(yù)孵育的切片中，D-AP5效應(yīng)丟失。實(shí)際上，發(fā)現(xiàn)用D-AP5灌注沒有導(dǎo)致事件間間隔的顯著變化(p>0.05，KS測(cè)試，C57BL6/J+L-JNKi1相對(duì)于D-AP5，n＝10；2B；p>0.05，學(xué)生t檢驗(yàn)，對(duì)照相對(duì)于D-AP5，n＝10；圖2C)，其振幅也沒有(p>0.05，KS檢驗(yàn)，C57BL6/J+L-D-AP5，n＝10；圖2B；p>0.05，Student t-檢驗(yàn)，對(duì)照相對(duì)于D-AP5，n＝10；圖2C)。這些結(jié)果表明JNK的抑制降低了由突觸前NMDA受體介導(dǎo)的谷氨酸的釋放。

總體而言，我們的電生理數(shù)據(jù)表明JNK在NMDA急性治療的腦切片中的谷氨酸的NMDA依賴性釋放中發(fā)揮功能性作用。

JNK調(diào)節(jié)STX1a的磷酸化

Syntaxin 1a是用于裝配SNARE復(fù)合物(可溶性NSF附著蛋白受體)的必需蛋白，其是釋放神經(jīng)遞質(zhì)的必要步驟。STX1a在ser14(pSTX1a)磷酸化在神經(jīng)遞質(zhì)釋放機(jī)制中的作用仍是一個(gè)有爭(zhēng)議的主題。已經(jīng)有一些報(bào)道，pSTX1a的減少具有降低神經(jīng)遞質(zhì)釋放的直接后果，而另一些實(shí)驗(yàn)證明pSTX1a的減少促進(jìn)了神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。

在暴露NMDA10分鐘后，JNK磷酸化增加(圖1D)，這引起STX1a(STX1a(S14))磷酸化的輕微但非顯著降低(圖3A)。有趣的是觀察到用L-JNKi1預(yù)處理30分鐘，然后NMDA刺激導(dǎo)致pSTX1a的顯著降低(-40±6.4％，相對(duì)于對(duì)照＝100％，**P<0.01)。即使其對(duì)JNK的磷酸化沒有影響(圖1D)，L-JNKi1自身的施用令人驚訝地引起STX1a的磷酸化的強(qiáng)烈降低(-45±6.4％，相對(duì)于對(duì)照＝100％，**P<0.01)。為了解釋這種現(xiàn)象，我們可以假設(shè)，由于突觸體與缺乏Mg²⁺的培養(yǎng)基分批保持，所以神經(jīng)遞質(zhì)(包括谷氨酸)可以積聚在細(xì)胞外區(qū)室中，因此即使在L-JNKi1單獨(dú)施用時(shí)。然后將NMDA拮抗劑D-AP5用于估計(jì)pJNK(+10±8.9％相對(duì)于對(duì)照)(圖3B)或pSTX1a(-10±7.2％相對(duì)于對(duì)照)相比對(duì)照條件(100％)下(圖3C)可能的變化，從而排除發(fā)生這種變化的可能性。由于已知其他蛋白質(zhì)是神經(jīng)遞質(zhì)釋放系統(tǒng)的一部分，所以分析了JNK與突觸蛋白磷酸化的可能相互作用。

突觸蛋白(SYN(S9))的磷酸化不受在所有實(shí)驗(yàn)條件下引起的刺激的影響(圖3A)。總的來說，這些結(jié)果讓我們可以假設(shè)JNK活性的抑制特異性地降低了STX1a的磷酸化。

JNK與STX1a相互作用

為了更好地理解在NMDA誘導(dǎo)的谷氨酸釋放中JNK和STX1a之間的協(xié)同相互作用，進(jìn)行了共免疫沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)(圖3D)。用針對(duì)STX1a的特異性抗體免疫沉淀從突觸體提取的蛋白質(zhì)，然后通過蛋白質(zhì)印跡用特異性抗體檢測(cè)pJNK和JNK。對(duì)照(非免疫沉淀樣品)給出具有較低條帶(JNK1，46kDa)和較高條帶(JNK2/3，54kDa)的典型JNK信號(hào)。令人驚訝的是，以JNK和磷酸化的pJNK形式的STX1a僅免疫沉淀JNK2和3同工型；事實(shí)上，抗體檢測(cè)到上帶。這個(gè)結(jié)果明顯地阻止了蛋白質(zhì)STX1a綁定到JNK1上，并表明STX1a和JNK2/3相互作用的形成已經(jīng)在基礎(chǔ)條件(Ctrl)下得到驗(yàn)證。此外，當(dāng)用NMDA施用到L-JNKi1上時(shí)，相對(duì)于對(duì)照條件，JNK和pJNK的免疫反應(yīng)性都顯著降低(圖3DA/KNK/STX1a：-42±2％對(duì)照＝100％；**p<0.01，比值pJNK/STX1a：-39±3％與對(duì)照＝100％；*p<0.05)，表明蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用被L-JNKi1擾亂。有趣的是觀察到，通過應(yīng)用L-JNKi1，在非刺激條件下STX1a-JNK2/3相互作用減少(圖3D，比率JNK/STX1a：-44±4％，相對(duì)于對(duì)照＝100％；**p<0.01和比率pJNK/STX1a：-46±8％，相對(duì)于對(duì)照＝100％；**p<0.01)，顯示相互作用是結(jié)構(gòu)性存在的。為了評(píng)價(jià)免疫沉淀物的特異性，還使用了抗突觸結(jié)合蛋白1抗體(Syt1)，其沒有免疫沉淀，這表明STX1a-JNK2/3相互作用是特異性的。

在敲除JNK2的小鼠中，谷氨酸的釋放和JNK的磷酸化不再受NMDA誘導(dǎo)

為了識(shí)別由突觸前區(qū)室中的NMDA刺激活化的JNK的特異性同種型，對(duì)從敲除JNK(KO)的小鼠獲得的皮質(zhì)突觸小體進(jìn)行谷氨酸釋放實(shí)驗(yàn)。通過NMDA施用10分鐘誘導(dǎo)出谷氨酸的釋放，測(cè)量[³H]D-Asp的流出量。有趣的是觀察到，相對(duì)于JNK1、JNK3-KO小鼠和野生型型小鼠(WT)，只有在JNK2-KO小鼠中NMDA誘導(dǎo)的釋放相對(duì)于對(duì)照顯著降低(相對(duì)于本底為28±19％)，(圖4A)。該結(jié)果表明突觸前JNK2同工型特異性控制NMDA誘發(fā)的釋放。

為了確認(rèn)釋放實(shí)驗(yàn)，如果不存在JNK2降低JNK的磷酸化，則對(duì)用NMDA刺激的突觸小體進(jìn)行研究。如所預(yù)期的，在JNK2-KO小鼠中，相對(duì)于對(duì)照，JNK的磷酸化被完全消除。相反，它仍保持在JNK3-KO小鼠中，其中NMDA誘導(dǎo)pJNK的增加(相對(duì)于對(duì)照＝100％為+76±10％；**p<0.01)(圖4B)與在WT小鼠中完全相當(dāng)(圖1D)。在這兩種情況下，L-JNKi1自身不能影響JNK的磷酸化。

膜片鉗實(shí)驗(yàn)中JNK2調(diào)節(jié)NMDA依賴性谷氨酸釋放

通過記錄mEPSC，使用相同的上述方案對(duì)JNK1 KO、JNK2-KO和JNK3-KO小鼠進(jìn)行電生理記錄。D-AP5的灌注誘導(dǎo)JNK1-KO中的事件間期的累積分布的增加(***p<0.001，KS測(cè)試，JNK1 KO相對(duì)于D-AP5，圖5A)和JNK3 KO(***p<0.001，KS測(cè)試，JNK3-KO相對(duì)于D-AP5，圖5A)和平均值的增加(**p<0.01，Student t-檢驗(yàn)，對(duì)照相對(duì)于JNK1或JNK3 KO；圖5B)。在兩種基因型中，mEPSC的振幅從未受D-AP5的影響(p>0.05，KS測(cè)試，JNK1或JNK3-KO相對(duì)于D-AP5，圖5A；P>0.05，Student t-檢驗(yàn)，JNK1或JNK3KO；圖5B)，而在JNK2-KO小鼠中由于施用D-AP5而導(dǎo)致谷氨酸鹽釋放的減少已被特異性降低。實(shí)際上，D-AP5在mEPSC中沒有產(chǎn)生顯著變化(p>0.05，KS測(cè)試，JNK2-KO相對(duì)于D-P5；圖5A；p>0.05，Student t-檢驗(yàn)，對(duì)照相對(duì)于JNK2KO，圖5B)，或幅度(p>0.05，KS測(cè)試，JNK2-KO相對(duì)于D-P5，圖5A；p>0.05，Student t-檢驗(yàn)，對(duì)照相對(duì)于JNK2KO，圖5B)?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)表明，在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，只有JNK2同種型介導(dǎo)谷氨酸的突觸前釋放。

JNK變種的對(duì)接結(jié)果

通過比較三個(gè)JNK的不同序列，觀察到JNK1提供18個(gè)特征性殘基，JNK245個(gè)，而JNK3僅有11個(gè)。特征殘基被定義為僅有一個(gè)同種型的特異性變體的殘基，與其他兩個(gè)JNK不同。

特征殘基在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中是重要的，尤其是如果Syntaxin 1a與JNK的僅一種變體特異性相互作用，則這種變體的特征殘基相對(duì)于其他JNK應(yīng)當(dāng)是不同的。JNK2明顯不同于JNK1和JNK3的事實(shí)可以是其與Syntaxin的特異性相互作用的第一個(gè)指示。

隨后，使用Rosetta軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對(duì)接的模擬，用于模擬Syntaxin 1a和JNK2之間的復(fù)合物。

觀察到從分析得到的三個(gè)主要結(jié)構(gòu)是基于界面得分的三個(gè)最佳分類結(jié)構(gòu)。這些中的每一個(gè)的渲染圖像在圖6中報(bào)告，其中JNK2用白色表示，而突觸融合蛋白1a的N端用紅色表示。

為了更好地評(píng)價(jià)這些結(jié)構(gòu)，計(jì)算了隱藏的表面積。在模型1(圖6a)和2(圖6b)中，存在約1700A2的隱藏表面積，而模型3(圖6c)呈現(xiàn)2680A2的表面積。然后分析界面殘基并與JNK2的特征殘基比較。該測(cè)試證明在模型3中，Syntaxin 1a的N-末端與八個(gè)特征殘基相互作用，在模型2中具有五個(gè)這樣的殘基，在模型1中僅具有兩個(gè)這樣的殘基。這些觀察促使我們將模型3解釋為獲得的最佳相互作用構(gòu)象。

然后獲得呈現(xiàn)圖像，其指示了突觸融合蛋白1a的N-末端部分(區(qū)段300和400)的可能的接觸位點(diǎn)。

在囊泡蛋白和NMDA或AMPA受體的亞基水平的機(jī)制下JNK的抑制沒有引起變化。

然后監(jiān)測(cè)幾種突觸前蛋白如Syntaxin 1a(STX1a)、突觸蛋白(SYN)、Munc18-1和突觸結(jié)合蛋白1(Syt1)的表達(dá)水平，因?yàn)樗鼈兊母淖兿魅趿松窠?jīng)遞質(zhì)的釋放機(jī)制。在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，L-JNKi1，如果單獨(dú)施用或與NMDA組合施用，沒有修改突觸體中STX1a、SYN、Munc18-1和Syt1的存在(圖7A)。以相同的方式，NMDA和AMPA受體亞基的表達(dá)(圖7B)保持不變，因此確保NMDA介導(dǎo)的對(duì)突觸前JNK的影響不依賴于其表達(dá)水平的特異性修飾。

分析和構(gòu)建抑制谷氨酸釋放的肽

分析突觸融合蛋白1a的N-末端部分的氨基酸序列，可鑒定形成特征性3α-螺旋的3個(gè)不同殘基；它們是Ha、Hb和Hc。氨基酸序列(總共288個(gè)氨基酸)表示如下：

SEQ ID NO.1:

MKDRTQELRTAKDSDDDDDVTVTVDRDR(28)FMDEFFEQVEEIRGFIDKIAENVEEVKRKHSAIL(62)ASPNPDEKT(71)KEELEELMSDIKKTANKVRSKLKSIEQSIEQEE(104)GLNRSSA(111)DLRIRKTQHSTLSRKFVEVMSEYNATQSDYRER(144)CKGRIQRQLEITGRTTTSEELEDMLESGNPAIFASGIIMDSSISKQALSEIETRHSEIIKLETSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHAVDYVERAVSDTKKAVKYQSKARRKKIMIIICCVILGIIIASTIGGIFG

Ha從氨基酸28到62

Hb從氨基酸71到104

Hc從氨基酸111到144

已經(jīng)鑒定為在Syntaxin 1a上JNK2的相互作用位點(diǎn)的兩個(gè)序列如下：

1)SEQ ID NO.2:IEQEEGLNRS

2)SEQ ID NO.3:MSEYNATQSDYRER

然后將這兩個(gè)序列用于構(gòu)建兩個(gè)細(xì)胞可滲透肽JGRi1和JGRi2。

所述肽的功能是基于中斷JNK2蛋白與突觸融合蛋白1a的N-末端部分的相互作用的原理。因此，如果細(xì)胞具有不同長(zhǎng)度的Syntaxin 1a的氨基酸序列，其從兩種蛋白質(zhì)之間的最小相互作用的位點(diǎn)或直到Syntaxin 1a的N末端的整個(gè)部分變化，那么這些肽將競(jìng)爭(zhēng)性地參與與JNK2的相互作用，從而抑制與內(nèi)源性Syntaxin 1a的鍵合。該事件能夠減少谷氨酸的釋放?？梢哉J(rèn)為有效的肽從Syntaxin 1a的整個(gè)N末端部分(288個(gè)氨基酸)至對(duì)應(yīng)于序列SEQ ID NO.2：IEQEEGLNRS的最少10個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度上變化?；?qū)?yīng)于序列SEQ ID NO.3：MSEYNATQSDYRER的14個(gè)氨基酸。

為了使肽具有細(xì)胞可滲透性，在本序列的N-末端部分之前插入HIV病毒的Tat蛋白(48-59)的序列，因此又增加了12個(gè)氨基酸。

Tat(48-59)具有以下12個(gè)氨基酸的序列：GRKKRRQRRRPP。

該序列是非常有效的，無論其是在每種可能的合成肽的N-或C-末端位置加入。肽的一個(gè)實(shí)例是以一種方式合成的具有26個(gè)氨基酸總長(zhǎng)度的肽。

兩個(gè)肽的序列如下：

JGRi1(SEQ ID NO.5):GRKKRRQRRRPPIEQSIEQEEGLNRS或(SEQ ID NO.6)IEQSIEQEEGLNRSGRKKRRQRRRPP或甚至關(guān)于Tat序列的相應(yīng)的鏡像序列例如(SEQ ID NO.7)PPRRRQRRKKRGIEQSIEQEEGLNRS

JGRi2(SEQ ID NO.8):GRKKRRQRRRPPMSEYNATQSDYRER或(SEQ ID NO.9)MSEYNATQSDYRERGRKKRRQRRRPP或甚至關(guān)于Tat序列的相應(yīng)的鏡像序列如(SEQ ID NO.10)PPRRRQRRKKRGMSEYNATQSDYRER

所述兩種肽由具有L對(duì)映體結(jié)構(gòu)的氨基酸合成，但也合成為D對(duì)映體，以提高其在活生物體中的穩(wěn)定性。

相同的序列可以作為相應(yīng)的DNA序列插入，也插入到用于在細(xì)胞系、細(xì)菌中以及在病毒生產(chǎn)的載體中表達(dá)的不同載體中。

表達(dá)載體中的插入可以是完整序列，因此是

JGRi1(SEQ ID NO：5)：GRKKRRQRRRPPIEQSIEQEEGLNRS或(SEQ ID NO.6)IEQSIEQEEGLNRSGRKKRRQRRRPP或關(guān)于Tat序列的相應(yīng)的鏡像序列例如(SEQ ID NO.7)PPRRRQRRKKRGIEQSIEQEEGLNRS

JGRi2(SEQ ID NO.8):GRKKRRQRRRPPMSEYNATQSDYRER或(SEQ ID NO.9)MSEYNATQSDYRERGRKKRRQRRRPP或關(guān)于Tat序列的相應(yīng)的鏡像序列如(SEQ ID NO.5)PPRRRQRRKKRGMSEYNATQSDYRER或通過添加不同的結(jié)構(gòu)域，因此首先是TAT的序列，然后是(SEQ ID NO.2)IEQEEGLNRS或(SEQ ID NO.3)MSEYNATQSDYRER，或反之亦然。此外，為了使最終蛋白在細(xì)胞系統(tǒng)中可識(shí)別，可以加入小片SNA，其編碼小(tag)肽，例如HA、GST、Myc、EGFP等。

例如：pGEX-4、pTAT、p-EGFP-C1、pc-DNA、商購(gòu)或還未用于基因治療的3代慢病毒載體、用于辛德比斯病毒的載體、用于感染(轉(zhuǎn)導(dǎo))神經(jīng)元的腺病毒。

在谷氨酸釋放實(shí)驗(yàn)(如上所述)和電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)(膜片鉗，如上所述)中測(cè)試兩種肽，以測(cè)試它們?cè)跍p少神經(jīng)遞質(zhì)的NMD誘發(fā)釋放中的有效性。

在膜片鉗實(shí)驗(yàn)中兩種肽都導(dǎo)致谷氨酸的NMDA依賴性釋放降低。將小鼠皮層切片處理30分鐘，然后記錄mEPSC與各種條件下肽的間期的累積分布。兩種肽(JGRi1和JGRi2)無論以5μM的濃度一起加入還是以10μM的濃度分別加入，降低了抑制劑D-AP5阻斷NMDA突觸前受體的功能(圖8)。該數(shù)據(jù)表明NMDA受體已經(jīng)被細(xì)胞內(nèi)通路中的兩種肽有效阻斷，因此作用于NMDA胞外部分的受體抑制劑不再具有作用。

這兩種肽證實(shí)了突觸體和腦切片上的有效性，表明假設(shè)它們?cè)诩?xì)胞外環(huán)境中施用，它們能夠滲透進(jìn)入細(xì)胞，也擴(kuò)散到完整的組織中。還預(yù)計(jì)所述肽能夠在生物體中完全擴(kuò)散。為了減少它們的降解，從而增加它們的半衰期，本發(fā)明的肽系統(tǒng)是通過使用屬于D立體化學(xué)系列的氨基酸合成的。

D-JGRi1:

dG-dR-dK-dK-dR-dR-dQ-dR-dR-dR-dP-dP-dI-dE-dQ-dS-dI-dE-dQ-dE-dE-dG-dL-dN-dR-dS

D-JGRi2:

d-G-dR-dK-dK-dR-dR-dQ-dR-dR-dR-dP-dP-dM-dS-dE-dY-dN-dA-dT-dQ-dS-dD-dY-dR-dE-dR

這些細(xì)胞可滲透肽的可能的給藥途徑包括所有已知的組合，其范圍從具有直接生物利用度的那些到隨著時(shí)間改變釋放的那些組合。

我們包括通過腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)注射(肽系統(tǒng)的生理溶液)，透皮吸收途徑(膏藥、軟膏、乳膏、油等)、舌下(糊劑或固體溶液)、鼻內(nèi)(各種生理溶液)和口服(口服制劑如懸浮液，片劑，膠囊等)途徑。

此外，所有納米技術(shù)制劑產(chǎn)生改性釋放，無論是經(jīng)皮或系統(tǒng)通過注射或口服給藥。

此外，考慮新的給藥途徑：神經(jīng)元干細(xì)胞的產(chǎn)生，工程改造使得它們以細(xì)胞可滲透形式(表達(dá)序列Tat)或非細(xì)胞可滲透形式產(chǎn)生肽系統(tǒng)。這些細(xì)胞一旦注射，一旦它們到達(dá)受退行性疾病襲擊的腦區(qū)，能夠增殖并原位釋放肽系統(tǒng)。

制備本發(fā)明肽系統(tǒng)的方法

這些肽的合成通過目前通常使用的化學(xué)方法進(jìn)行，其允許獲得高達(dá)甚至70個(gè)殘基的氨基酸鏈。使用固相化學(xué)合成儀，其中第一個(gè)氨基酸錨定于固體堿基(樹脂)下，然后通過氨基酸之間的異肽反應(yīng)，肽鏈通過重復(fù)循環(huán)延長(zhǎng)(圖9；改自Current Protocols in Molecular Biology(2002)11.15.1-11.15.9)。

合成后，使用HPLC(高效液相色譜)分析來從反應(yīng)廢物的污染物中純化肽。此外，進(jìn)行質(zhì)譜分析的循環(huán)以驗(yàn)證肽的身份。當(dāng)所獲得的產(chǎn)率(具有26個(gè)氨基酸的肽)超過95％時(shí)，認(rèn)為肽是良好的。

如果最終肽是L形式，則使用L立體化學(xué)形式的氨基酸形成肽鏈，如果最終肽是D形式，則使用D形式的肽。

質(zhì)粒載體合成。

關(guān)于質(zhì)粒系統(tǒng)，肽的核苷酸序列-無論它們是否都包含Syntaxin 1a的N-末端部分，或甚至更短的對(duì)應(yīng)于序列(SEQ ID NO.2)IEQEEGLNRS長(zhǎng)度為10個(gè)氨基酸的肽和對(duì)應(yīng)于序列(SEQ ID NO.3)MSEYNATQSDYRER的含有14個(gè)氨基酸的肽以及所有可能的長(zhǎng)度，也可在序列Tat＝(SEQ ID NO.4)GRKKRRQRRRPP的前(N末端)或后(C末端)端-插入在質(zhì)粒表達(dá)載體中。

例如，對(duì)應(yīng)于氨基酸序列(SEQ ID NO.2)IEQEEGLNRS或(SEQ ID NO.11)IEQSIEQEEGLNRS和(SEQ ID NO.3)MSEYNATQSDYRER插入核苷酸序列，并且還將Syntaxin 1a的整個(gè)N末端部分插入細(xì)菌表達(dá)載體pTAT中。該載體的特定性質(zhì)在于細(xì)菌合成的融合蛋白含有不同標(biāo)簽，其從N末端部分開始為：6xHis，序列Tat＝(SEQ ID NO.4)GRKKRRQRRRPP和標(biāo)簽人流感血凝素(HA)。除了用于使合成的蛋白質(zhì)細(xì)胞可滲透的序列Tat之外，其它標(biāo)簽可用于通過特異性抗體識(shí)別外源蛋白質(zhì)。

細(xì)胞表達(dá)的質(zhì)粒制備和質(zhì)粒細(xì)菌合成的蛋白純化

在下文中，描述了關(guān)于含有包含作為本說明書目標(biāo)的肽系統(tǒng)的質(zhì)粒載體的細(xì)菌菌株的制備的幾個(gè)實(shí)施例。下文指出的物質(zhì)的量?jī)H作為非限制性實(shí)例報(bào)道。因此，在本說明書的過程中，假設(shè)本領(lǐng)域技術(shù)人員理解使用甚至不同量的可能性，只要試劑之間的比例遵循以下實(shí)施例中所述。

含有上述序列的慢病毒質(zhì)粒pGEX-4或pTAT或p-EGFP-C1或pc-DNA被插入大腸桿菌，例如菌株DH5α或BL21和化學(xué)感受態(tài)衍生物(rosetta)。然后，根據(jù)需要將5μg質(zhì)粒DNA(p-EGFP-C1或pc-DNA)加入到20μL KCM 5X(含有0.5M KCl；0.15M CaCl₂；0.25M MgCl₂)，5μL MnCl₂，加水至100μL溶液。此時(shí)，加入等體積的化學(xué)感受態(tài)DH5α細(xì)菌細(xì)胞。將它們?cè)诒?4℃)上放置幾分鐘。將整個(gè)溶液在室溫下放置幾分鐘，產(chǎn)生熱沖擊。

然后，因?yàn)橘|(zhì)粒含有抗生素抗性，加入含有100μg/mL氨芐青霉素在37℃下加熱的600μL Luria Broth培養(yǎng)基(LB)(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，15g/L瓊脂)。然后將溶液鋪在具有相同濃度的氨芐青霉素的瓊脂上。然后，通過MAXI-prep商業(yè)試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒DNA的純化用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染或用文獻(xiàn)中經(jīng)典方法合成慢病毒顆粒。

細(xì)菌BL21和衍生物的轉(zhuǎn)化用不同的方案進(jìn)行。

將5μg載體(pGEX-4或pTAT)加入到100μL細(xì)菌中，然后將其在4℃下孵育30分鐘。然后，將溶液在42℃下放置45秒誘導(dǎo)熱沖擊。以這種方式，細(xì)菌摻入質(zhì)粒。然后將溶液在冰中放置5分鐘，接著加入4倍體積(400μl)LB。將整個(gè)溶液鋪在含有氨芐青霉素的瓊脂上，并使菌落在約37℃下生長(zhǎng)12小時(shí)。

MINI-PREP，用限制酶切割

由于目的序列被插入限制酶之間，因此測(cè)試細(xì)菌生長(zhǎng)以控制質(zhì)粒在細(xì)菌內(nèi)的實(shí)際摻入。

然后用無菌點(diǎn)提取生長(zhǎng)的菌落，并置于5mL含氨芐青霉素的LB中。在37℃細(xì)菌生長(zhǎng)5-6小時(shí)后，用商業(yè)試劑盒制備小量制備物。然后，將從每個(gè)菌落獲得的等分試樣DNA溶液進(jìn)行酶切，利用限制酶作為亞克隆(37℃，60分鐘)。

之后，讓DNA在瓊脂糖凝膠上運(yùn)行，并在光度計(jì)上控制切割的序列。

讓表達(dá)更多質(zhì)粒的幾微升菌落生長(zhǎng)，以便接下來制備在-80℃冷凍的甘油儲(chǔ)液。

生長(zhǎng)和誘導(dǎo)：

從甘油儲(chǔ)液中，來自單個(gè)菌落的細(xì)菌在37℃下在攪拌(250rpm)下作為預(yù)接種物接種在LB+氨芐青霉素(100μg/ml)中生長(zhǎng)。

用1/50的預(yù)接種物在37℃(250rpm)下在新鮮的LB+Amp中生長(zhǎng)(數(shù)量取決于預(yù)期產(chǎn)量的多少)，直至達(dá)到0.8-1的OD 600。

然后加入0.5mM IPTG以誘導(dǎo)外源蛋白的產(chǎn)生。

提取1mL的預(yù)接種物，并以5000rpm離心5分鐘。然后將沉淀儲(chǔ)存在-20℃下，以便隨后在SDS-PAGE凝膠上分析。

在37℃以250rpm的速度誘導(dǎo)持續(xù)4-5小時(shí)。然后，將細(xì)菌在4℃以8000rpm離心20分鐘。

傾析上清液稱重沉淀并在-20℃下儲(chǔ)存。

細(xì)菌團(tuán)塊的溶解

將具有以下組成(0.1M TRIS-HCl、1mM EDTA pH 7.5)的裂解緩沖液加入到沉淀中，每克沉淀物加2ml裂解緩沖液。

然后將沉淀重懸浮并加入1.5mg/g Lisozyme(來自10mg/ml儲(chǔ)液)以裂解細(xì)菌。將溶液在室溫下孵育2小時(shí)，并在200rpm下攪拌。

將裂解物在冰上孵育10分鐘，然后持續(xù)50秒的4個(gè)脈沖進(jìn)行超聲處理。在一個(gè)脈沖與下一個(gè)脈沖之間，將溶液在冰中放置1分鐘。

然后，在4℃下以12000rpm離心20分鐘。

儲(chǔ)存上清液并取出沉淀的薄片；將此片花破碎，使其變軟。

包涵體的分離

加入裂解物的體積(超聲處理后)是Triton緩沖液的體積的1/2。然后，將其在室溫下以200rpm攪拌孵育30分鐘。然后在4℃下以12000rpm的速度離心20分鐘。將沉淀重懸于裂解緩沖液中。然后，加入Triton緩沖液，其體積等于管中體積的一半。然后將其在室溫下以200rpm孵育。在4℃下12000rpm離心20分鐘。

將沉淀重懸浮于洗滌緩沖液中并在4℃下以12000rpm離心20分鐘。再次洗滌沉淀3或4次，總是用洗滌緩沖液。然后將沉淀儲(chǔ)存在-20℃下。

溶解和透析

沉淀用5mL/g含有6M胍和1mM DTT的增溶緩沖液溶解。

2-3小時(shí)后，用HCl將pH調(diào)節(jié)至3-4。然后在4℃下以12000rpm離心20分鐘。

然后將上清液用6M胍鹽在pH 3-4下透析。

將透析溶液改變3次：每次洗滌在3小時(shí)后進(jìn)行，第三次洗滌在4℃下保持整夜。

然后透析溶液變?yōu)閜H為7的50mM的磷酸鈉緩沖液**，用與胍鹽進(jìn)行透析所用的相同的模式更換透析溶液。

最后，在丙烯酰胺凝膠上使用透析物質(zhì)的等分試樣，用考馬斯染色，其中必須看到對(duì)應(yīng)于合成蛋白質(zhì)的條帶。

剩余的透析物質(zhì)在離子交換柱上純化。

**磷酸鹽緩沖液的制備：

制備1M的NaH2PO4溶液和1M Na₂HPO₄溶液。將兩種溶液一起加入，并確認(rèn)pH 7。

在離子交換柱上純化。

使用三種溶液：50mM pH 7磷酸鹽緩沖液；50mM pH 7磷酸鹽緩沖液+1M NaCl；20％乙醇+20％乙酸鈉的H₂O溶液。

將溶液過濾，脫氣并在+4℃下儲(chǔ)存，以便在使用時(shí)是冷卻的。

<110> 馬爾科?費(fèi)利焦尼

羅伯特?喬瓦尼?尼斯蒂科

<120> 用于治療由谷氨酸興奮性毒性引起的疾病的細(xì)胞可滲透肽系統(tǒng)

<130> A7718

<140> ITRM2014A000171

<141> 2014-04-04

<160> 13

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 288

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 1

Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu Arg Thr Ala Lys Asp Ser Asp Asp

1 5 10 15

Asp Asp Asp Val Thr Val Thr Val Asp Arg Asp Arg Phe Met Asp Glu

20 25 30

Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Phe Ile Asp Lys Ile Ala

35 40 45

Glu Asn Val Glu Glu Val Lys Arg Lys His Ser Ala Ile Leu Ala Ser

50 55 60

Pro Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser

65 70 75 80

Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ser Lys Leu Lys Ser Ile

85 90 95

Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp

100 105 110

Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val

115 120 125

Glu Val Met Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg

130 135 140

Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr

145 150 155 160

Thr Ser Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile

165 170 175

Phe Ala Ser Gly Ile Ile Met Asp Ser Ser Ile Ser Lys Gln Ala Leu

180 185 190

Ser Glu Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Thr Ser

195 200 205

Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu

210 215 220

Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala

225 230 235 240

Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys

245 250 255

Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys

260 265 270

Val Ile Leu Gly Ile Ile Ile Ala Ser Thr Ile Gly Gly Ile Phe Gly

275 280 285

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 2

Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser

1 5 10

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 3

Met Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 4

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro

1 5 10

<210> 5

<211> 26

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 5

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Ile Glu Gln Ser

1 5 10 15

Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser

20 25

<210> 6

<211> 26

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 6

Ile Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Gly Arg

1 5 10 15

Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro

20 25

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<211> 26

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 7

Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Ile Glu Gln Ser

1 5 10 15

Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser

20 25

<210> 8

<211> 26

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 8

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Met Ser Glu Tyr

1 5 10 15

Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg

20 25

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<211> 26

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 9

Met Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg Gly Arg

1 5 10 15

Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro

20 25

<210> 10

<211> 26

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 10

Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Met Ser Glu Tyr

1 5 10 15

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<213> 鼠科

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1 5 10

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<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 12

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Met Lys Asp Arg

1 5 10 15

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20 25 30

Thr Val Thr Val Asp Arg Asp Arg Phe Met Asp Glu Phe Phe Glu Gln

35 40 45

Val Glu Glu Ile Arg Gly Phe Ile Asp Lys Ile Ala Glu Asn Val Glu

50 55 60

Glu Val Lys Arg Lys His Ser Ala Ile Leu Ala Ser Pro Asn Pro Asp

65 70 75 80

Glu Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser Asp Ile Lys Lys

85 90 95

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100 105 110

Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp Leu Arg Ile Arg

115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala Val Asp Tyr Val

245 250 255

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<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 13

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Glu Gly Leu Asn Arg Ser

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