一種綿羊肺炎支原體體外培養(yǎng)基及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種綿羊肺炎支原體體外培養(yǎng)基，以及這種培養(yǎng)基的制備方法。本發(fā)明的綿羊肺炎支原體體外培養(yǎng)基制備方法是將：胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化鈉、乳糖、酵母浸出液和酚紅混合后高壓滅菌,待前述混合物晾涼至37℃以下后再在其中加入滅活健康豬血清100-200mL/L和經(jīng)過(guò)滅菌水溶解的青霉素20萬(wàn)U/L，然后再用NaOH調(diào)pH值到7.4-7.8，得到培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)綿羊肺炎支原體僅24小時(shí)即可生長(zhǎng)，生長(zhǎng)滴度可達(dá)到10-10ccu，而且培養(yǎng)基的組成相比現(xiàn)有技術(shù)簡(jiǎn)單，成本更加低廉。
【專利說(shuō)明】一種綿羊肺炎支原體體外培養(yǎng)基及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細(xì)菌培養(yǎng)基及其制備方法，確切講本發(fā)明涉及一種綿羊肺炎支原體體外培養(yǎng)基，以及這種培養(yǎng)基的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]綿羊肺炎支原體是一種介于細(xì)菌與病毒之間的無(wú)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的原核微生物，主要引起綿羊、山羊、尤其是羔羊增生性間質(zhì)性肺炎。最早由Mackay等人(1963)從患有肺腺癌的綿羊肺中分離得該病原，隨后Carmichael (1972)將它命名為綿羊肺炎支原體。此后在很多個(gè)國(guó)家和地區(qū)都報(bào)道有該病原的存在，如新西蘭、匈牙利、冰島、英國(guó)、澳大利亞、西班牙、土耳其、非洲及西亞的許多國(guó)家(Jonas et al, 1991;Linvingstonetal, 1979),給養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)最早由胡景韶等(1982)從發(fā)病綿羊上分離到了綿羊肺炎支原體，隨后甘肅、遼寧、四川、云南、江蘇和新疆等地都有從患肺炎的綿羊肺中分離到Mo的病例，并確定是引起當(dāng)?shù)鼐d羊增生性間質(zhì)性肺炎的病因(逯忠新等，1993 ;謝守棟等，1985)，證明中國(guó)確實(shí)存在該病原。近年來(lái)，隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，由Mo引起的疾病先后在我國(guó)很多地方都有報(bào)道，如甘肅、寧夏、四川、云南、江蘇、遼寧、內(nèi)蒙、山東、新疆、廣西、湖北等地(方疇鑫等，1998 ;侯明學(xué)等，2000 ;蔣玉雯等，2000 ;劉少華等，2000) ，說(shuō)明該病已在我國(guó)廣泛分布和流行，危害日趨嚴(yán)重。
[0003]在研究或制備用于防治因綿羊肺炎支原體弓丨起的疾病藥物工作中，或者在研究綿羊肺炎支原體的病理特征等工作中均需要對(duì)綿羊肺炎支原體進(jìn)行體外培養(yǎng)。綿羊肺炎支原體是一類特殊的微生物，無(wú)細(xì)胞壁，生長(zhǎng)條件嚴(yán)格，生長(zhǎng)緩慢，由于其基因組較小，生物合成及代謝能力有限，病原細(xì)胞需要的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需要從外界攝取，因此對(duì)培養(yǎng)基的要求較高?，F(xiàn)階段所使用的人工培養(yǎng)基中除基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)外，還需要牛心浸液、酵母液、輔酶1、氨基酸等成份，另外還需加入10%~20%的動(dòng)物血清，以及其它多種成分,其配置復(fù)雜,工藝繁瑣，而且成本較高(參考:支原體學(xué)第2版吳移謀，葉元康著)雖然經(jīng)過(guò)了很多次的改良，形成了改良的KM2培養(yǎng)基，在原來(lái)的基礎(chǔ)上減少了很多工序。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術(shù)不足的綿羊肺炎支原體體外培養(yǎng)基，同時(shí)提供這種培養(yǎng)基的制備方法。
[0005]本發(fā)明的綿羊肺炎支原體體外培養(yǎng)基制備方法是將胰蛋白胨15_20g/L，大豆蛋白胨5-8g/L，氯化鈉5g/L，乳糖8-12g/L，酵母浸出液80_100mL/L，4.5%的酚紅7-9 mL/L混合后高壓滅菌，待前述混合物晾涼至37°C以下后再在其中加入滅活健康豬血清100-200mL/L和經(jīng)過(guò)滅菌水溶解的青霉素20萬(wàn)U/ L，然后再用NaOH調(diào)pH值到7.4-7.8，得到培養(yǎng)基。酵母浸出液的配制方法為:先將鮮酵母膏500g，加入雙蒸水2000ml中，攪拌溶解，然后用濃鹽酸:水以=1:1 (體積比)調(diào)PH至4.5-5.0，再在80°C水浴處理，然后再離心處理，取上清液，將上清液用NaOH調(diào)PH至7.8-8.0,煮沸，置室溫放涼后過(guò)濾，再補(bǔ)水至2000ml，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0006]根據(jù)前述方法可制備出本發(fā)明的綿羊肺炎支原體體外培養(yǎng)基。
[0007]本發(fā)明的培養(yǎng)基生長(zhǎng)滴度和生長(zhǎng)速度都要比改良的KM2培養(yǎng)基效果好，采用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)綿羊肺炎支原體僅24小時(shí)即可生長(zhǎng)，生長(zhǎng)滴度可達(dá)到10_1(ICCU，而且培養(yǎng)基的組成相比現(xiàn)有技術(shù)簡(jiǎn)單，成本更加低廉。原有改良KM2培養(yǎng)基需要配置hanks液，需要加入MEM，配置復(fù)雜，繁瑣，且生長(zhǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一般3-5天生長(zhǎng)I代，相同菌種以及相同接種量生長(zhǎng)滴度最高達(dá)到10_7CCU，且配制本發(fā)明培養(yǎng)基比較容易，再不需要Hanks液體的配制和MEM
經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)表明，采用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)綿羊肺炎支原體僅24小時(shí)即可生長(zhǎng)，生長(zhǎng)滴度可達(dá)到10_1(ICCU，而且培養(yǎng)基的組成相比現(xiàn)有技術(shù)簡(jiǎn)單，成本更加低廉。原有改良KM2培養(yǎng)基需要配置hanks液，需要加入MEM，配置復(fù)雜，繁瑣，且生長(zhǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一般3_5天生長(zhǎng)I代，相同菌種以及相同接種量生長(zhǎng)滴度最高達(dá)到10_7CCU。
【具體實(shí)施方式】
[0008]以下是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例。
[0009]配置1000mL綿羊肺炎支原體培養(yǎng)基:首先量取500mL的雙蒸水，然后秤取胰蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，氯化鈉5g/L，，加入10.5g乳糖，酵母浸出液25% IOOmL, 4.5%的酚紅9mL，定容到900 mL，121°C高壓滅菌20分鐘，高壓后，取出晾涼至37°C以下，加無(wú)菌滅活健康豬血清100 mL，加經(jīng)過(guò)滅菌水溶解的青霉素20萬(wàn)U/L，用IM NaOH調(diào)pH值到7.5，搖勻。置4°C冰箱備用。
[0010]取相同體積的本培養(yǎng)基及KM2培養(yǎng)基進(jìn)行滴度培養(yǎng)，結(jié)果顯示，本發(fā)明培養(yǎng)基在24小時(shí)顏色就發(fā)生變化，而KM2培養(yǎng)基需要72小時(shí)顏色才發(fā)生變化，本發(fā)明培養(yǎng)基在接種第5天生長(zhǎng)滴度達(dá)到10_1(lCCu，KM2培養(yǎng)基第5天生長(zhǎng)滴度達(dá)到10_5ccu。
【權(quán)利要求】
1.一種綿羊肺炎支原體體外培養(yǎng)基制備方法，其特征在于將:胰蛋白胨15-20g/L，大豆蛋白胨5-8g/L，氯化鈉5g/L，乳糖8-12g/L，酵母浸出液80_100mL/L，4.5%的酚紅7-9mL/L混合后高壓滅菌，待前述混合物晾涼至37°C以下后再在其中加入滅活健康豬血清100-200 mL/L和經(jīng)過(guò)滅菌水溶解的青霉素20萬(wàn)U/ L，然后再用NaOH調(diào)pH值到7.4-7.8，得到培養(yǎng)基，酵母浸出液的配制方法為:先將鮮酵母膏500g，加入雙蒸水2000ml中，攪拌溶解，然后用濃鹽酸:水以=1:1 (體積比)調(diào)PH至4.5-5.0,再在80°C水浴處理,然后再離心處理，取上清液，將上清液用NaOH調(diào)PH至7.8-8.0,煮沸，置室溫放涼后過(guò)濾，再補(bǔ)水至2000ml,-200C 保存?zhèn)溆谩?br> 2.權(quán)利要求1 的方法制備的綿羊肺炎支原體體外培養(yǎng)基。
【文檔編號(hào)】C12R1/35GK103992974SQ201410217804
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月22日
【發(fā)明者】逯忠新, 賀英, 趙萍, 儲(chǔ)岳峰, 陳勝利, 張建軍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所