肺炎支原體23S rRNA 2064位點(diǎn)A:G突變檢測(cè)特異性引物和探針的制作方法
【專利說(shuō)明】肺炎支原體23S rRNA 2064位點(diǎn)A:G突變檢測(cè)特異性引物和探針
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明是一種用于檢測(cè)肺炎支原體23S rRNA 2064位點(diǎn)A:G突變的特異性引物和探針。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]肺炎支原體是一種常見(jiàn)的呼吸道病原體,通常導(dǎo)致輕微的上呼吸道感染，如喉嚨痛、咽喉炎和氣管炎，其引起的肺炎占非細(xì)菌性肺炎的50%，還可引起肺外并發(fā)癥，累及一個(gè)或多個(gè)系統(tǒng)、器官，如皮膚、胃腸道、心血管、骨骼肌肉和腎臟，嚴(yán)重時(shí)可致中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)病變，甚至死亡。通過(guò)飛沫以氣溶膠形式傳播，存留在鼻、喉、氣管和痰液中，密切接觸可能引起肺炎支原體的暴發(fā)。肺炎支原體無(wú)細(xì)胞壁，對(duì)影響細(xì)胞壁合成的抗生素如青霉素等不敏感，但是對(duì)影響細(xì)菌蛋白合成的抗生素如大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類等敏感。大環(huán)內(nèi)酯類是治療肺炎支原體感染的首選藥物，可結(jié)合于肺炎支原體核糖體50S亞基的轉(zhuǎn)肽酶中心與肽輸出通道之間的部分，通過(guò)機(jī)械阻塞通道而抑制肽鏈的延伸，從而達(dá)到抑制蛋白合成的目的，其結(jié)合位點(diǎn)由23S rRNA結(jié)構(gòu)域V的核苷酸構(gòu)成，其中2064位點(diǎn)是主要的組成部分。近年來(lái)，隨著大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的廣泛使用，臨床分離出了耐藥菌株，提示肺炎支原體耐藥現(xiàn)象的存在。國(guó)內(nèi)外的研究表明，產(chǎn)生耐藥的肺炎支原體在23S rRNA序列上發(fā)生點(diǎn)突變，其中最常見(jiàn)的是2064位點(diǎn)A到G的突變。
[0005]目前，臨床上對(duì)肺炎支原體耐藥性的檢查，主要是依靠肺炎支原體的分離及藥敏實(shí)驗(yàn)，由于肺炎支原體分離較為困難，所以靈敏度較低，而且耗時(shí)耗力，不利于及時(shí)指導(dǎo)用藥。本發(fā)明采用的熒光PCR技術(shù)，操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速、檢出率高，通過(guò)一次試驗(yàn)即可明確是否有耐藥肺炎支原體的感染，有利于對(duì)疾病進(jìn)行及時(shí)診斷及合理選擇治療方案，與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)相比，提高了檢出效率、降低了漏檢率?？蓪?duì)多種臨床樣本進(jìn)行高效可靠的篩查，以及對(duì)臨床病情和用藥效果進(jìn)行監(jiān)測(cè)，指導(dǎo)合理用藥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)肺炎支原體23S rRNA 2064位點(diǎn)A:G突變的引物和探針。
[0007]基于上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
用于檢測(cè)肺炎支原體23S rRNA 2064位點(diǎn)A:G突變的特異性引物和探針序列包括:上游引物MPF序列為5’ GGTGTAACCATCTCTTGA 3’，下游引物MPR序列為5’CCTGATCAATATTAAGCTACAG 3’ 和探針 2064P 序列為 5’ FAM CGGGGTCTCTCCGTCC BHQl 3’。
[0008]本發(fā)明的具體原理是利用一對(duì)靶核酸序列的特異性引物和探針，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，通過(guò)PCR實(shí)現(xiàn)靶核酸序列片斷的擴(kuò)增。所使用的探針為兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)(R)和熒光淬滅基團(tuán)(Q)的寡核苷酸。在探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)吸收，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性將特異結(jié)合在靶核苷酸片斷上的熒光探針酶切降解，使報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)可以被檢測(cè)，熒光信號(hào)量的變化與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，從而可以通過(guò)熒光強(qiáng)弱來(lái)判斷待測(cè)樣本中靶核苷酸序列的存在。
[0009]
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1是利用引物對(duì)MPF/MPR和探針2064P檢測(cè)肺炎支原體23S rRNA 2064位點(diǎn)A:G突變陽(yáng)性樣本的熒光PCR擴(kuò)增圖。
[0011]
【具體實(shí)施方式】
[0012]1.引物和探針的設(shè)計(jì):通過(guò)分別對(duì)所有已知的肺炎支原體23S rDNA序列進(jìn)行比較分析，選擇2064位點(diǎn)所在區(qū)段，設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針，引物長(zhǎng)度一般為20堿基左右。最優(yōu)引物探針序列組合如下:
上游引物 MPF: 5 ’ GGTGTAACCATCTCTTGA 3，
下游引物 MPR: 5’ CCTGATCAATATTAAGCTACAG 3’
探針 2064P: 5’ FAM CGGGGTCTCTCCGTCC BHQl 3’。
[0013]2.反應(yīng)體系的優(yōu)化:利用臨床分離的耐藥肺炎支原體滅活液作為待檢樣品，用磁珠裂解法抽提肺炎支原體核酸，分裝后貯存于一 80°C。
[0014]2.1引物濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將肺炎支原體引物濃度分別從0.1 μ mol/L至1.6 μ mol/L作倍比連續(xù)稀釋,通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較,確定最佳引物濃度是0.2 μ mol/L。
[0015]2.2探針濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將肺炎支原體突變檢測(cè)用探針濃度分別從0.1 μ mol/L至0.5 μ mol/L作倍比連續(xù)稀釋，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳探針濃度是0.2 μ mol/L。
[0016]利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的肺炎支原體23S rRNA2064位點(diǎn)A:G突變的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為25 μ L。按照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反應(yīng)液的配置。
[0017]3.儀器檢測(cè)通道的選擇
選擇的熒光檢測(cè)通道應(yīng)與探針?biāo)鶚?biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)一致，具體按照儀器使用說(shuō)明書進(jìn)行設(shè)置。
[0018]4.PCR反應(yīng)條件如下
500C 2min 進(jìn)行 UNG 酶反應(yīng)；95°C lmin, I 個(gè)循環(huán)；91 °C 15s，64°C lmin,40 個(gè)循環(huán)，在64°C Imin階段收集熒光。
[0019]5.檢測(cè)結(jié)果分析
如果待檢樣本中含有發(fā)生2064位點(diǎn)A:G突變的肺炎支原體，則顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000 copies/mL，如果待檢樣本中沒(méi)有2064位點(diǎn)A:G突變的肺炎支原體，則顯示陰性擴(kuò)增曲線，即無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，提示上述引物和探針具有良好的特異性和靈敏度。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
(I)本發(fā)明提供的引物和探針的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000 copies/mL，說(shuō)明其靈敏度良好。
[0021](2)本發(fā)明提供的引物和探針對(duì)不含2064位點(diǎn)A:G突變的肺炎支原體的樣本沒(méi)有檢測(cè)信號(hào)，說(shuō)明其特異性強(qiáng)。
[0022](3)由于本發(fā)明是針對(duì)2064A:G突變位點(diǎn)，進(jìn)行了程序和體系優(yōu)化，避免了假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于檢測(cè)和鑒定肺炎支原體23S rRNA 2064位點(diǎn)A:G突變的特異性引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物MPF序列為5’ GGTGTAACCATCTCTTGA 3’，下游弓 I 物 MPR 序列為 5 ’ CCTGATCAATATTAAGCTACAG 3 ’。
2.一種用于檢測(cè)和鑒定肺炎支原體23S rRNA 2064位點(diǎn)A:G突變的特異性探針序列，其特征在于所述的探針序列為5’FAM CGGGGTCTCTCCGTCC BHQl 3’。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種用于肺炎支原體23SrRNA2064位點(diǎn)A:G突變的特異性引物和探針，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，核苷酸序列包括上游引物MPF序列為5’GGTGTAACCATCTCTTGA3’，下游引物MPR序列為5’CCTGATCAATATTAAGCTACAG3’和探針2064P序列為5’FAMCGGGGTCTCTCCGTCCBHQ13’。
【IPC分類】C12N15-11, C12R1-35, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104630328
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310550193
【發(fā)明人】杜君卿, 李楊霞
【申請(qǐng)人】江蘇默樂(lè)生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2013年11月8日