基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的人肺炎支原體快速檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人 肺炎支原體抗原的快速檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒，以及該檢測(cè)試劑盒的制備及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎支原體（Mycoplasmapneumoniae,Mp)是人類支原體肺炎的病原體，主要經(jīng) 飛沫傳染，潛伏期2-3周，發(fā)病率以青少年最高。Mp感染在小兒肺炎病原的發(fā)生率高達(dá) 10-30%，近年來逐漸成為小兒感染呼吸道疾病的主要病原體之一。該病極易引發(fā)咽炎、扁 桃體炎等呼吸道感染，甚至可能同時(shí)繼發(fā)腦膜炎、肝炎、心肌炎等多臟器損傷，嚴(yán)重時(shí)也可 導(dǎo)致患兒死亡。
[0003] 由于Mp感染與其它病原體引起的呼吸道感染癥狀類似，不做病原學(xué)檢查，很難將 Mp與其它病原體引起的呼吸道感染相區(qū)別。Mp無細(xì)胞壁，常用的內(nèi)酰胺類藥物對(duì)其無 效，故其引起的感染的治療與其它細(xì)菌和病毒感染的治療方案完全不同，因此建立簡(jiǎn)便、快 速、可行、能早期診斷肺炎支原體感染的方法非常必要。
[0004] 目前Mp的檢測(cè)方法主要有3類：一是分離培養(yǎng)法，其是證實(shí)感染的"金標(biāo)準(zhǔn)"，但 由于Mp的生長(zhǎng)周期極為緩慢，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，導(dǎo)致該法在臨床上不能進(jìn)行快速診斷；二是血 清學(xué)方法，即采用酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫法、微量免疫熒光法和間接血凝試驗(yàn)等，檢測(cè)被 檢者血清中Mp抗體水平，可間接提示Mp感染的存在。然而，血清學(xué)試驗(yàn)只能提供一種回顧 性的診斷，而且有時(shí)需要雙份血清。另外，抗體出現(xiàn)的時(shí)機(jī)不易掌握，兒童、青少年與成人之 間又存在Mp特異性抗體的差異，并且，Mp細(xì)胞膜上的糖脂抗原與其他微生物及機(jī)體組織存 在非特異性交叉反應(yīng)，故現(xiàn)有血清學(xué)方法的檢測(cè)質(zhì)量受到一定限制；三是利用分子生物學(xué) 技術(shù)檢測(cè)MpDNA的存在，其中最常用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)，該方法快速、靈敏、特異， 是目前研究人肺炎支原體感染的重要手段，但由于PCR對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備以及操作要求較高，且 易出現(xiàn)假陽(yáng)性，在我國(guó)還不能作為常用的臨床診斷方法。因此，建立人肺炎支原體特異性抗 原診斷方法十分必要。目前，已公開報(bào)道的檢測(cè)人肺炎支原體抗原的方法主要為雙抗夾心 ELISA法、量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析法、間接免疫熒光法等，但這些方法雖然靈敏度較高，但是由 于人肺炎支原體在臨床標(biāo)本如咽拭子中的含量極低，導(dǎo)致其臨床檢測(cè)陽(yáng)性率還是較低，目 前均未進(jìn)行臨床實(shí)際應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)【背景技術(shù)】中存在的這些技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種基于磁性分離和量子點(diǎn) 標(biāo)記的能簡(jiǎn)便、快速、高靈敏度的檢測(cè)人肺炎支原體抗原的檢測(cè)方法和試劑盒，以及該試劑 盒的制備及使用方法。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人肺炎支原體抗原的方法，其特征在于： 所述該方法包括以下步驟：
[0008] 1)兔抗人肺炎支原體P1蛋白多克隆抗體的制備；
[0009] 2)鼠抗人肺炎支原體P1蛋白多克隆抗體的制備；
[0010] 3)將步驟1)制備得到的兔抗人肺炎支原體P1蛋白多克隆抗體與納米磁珠通過共 價(jià)偶聯(lián)，制備抗人肺炎支原體免疫納米磁珠；
[0011] 4)將步驟2)制備得到的鼠抗人肺炎支原體P1蛋白多克隆抗體與納米量子點(diǎn)通過 共價(jià)偶聯(lián)，制備量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎支原體納米探針；
[0012] 5)取人呼吸道分泌物樣本（包括但不限于咽拭子），用PBST緩沖液溶解后，加入 步驟3)制備得到的抗人肺炎支原體免疫納米磁珠，充分混合，反應(yīng)25-45min后進(jìn)行磁分 離，以PBST緩沖液洗滌2遍后，向磁分離得到的沉淀物中加入步驟4)制備得到的量子點(diǎn) 標(biāo)記的抗人肺炎支原體納米探針，反應(yīng)25-45min后進(jìn)行磁分離，以PBST緩沖液洗滌2遍 后，使用熒光酶標(biāo)儀讀取熒光值；所述PBST緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0. 2g/L KC1，0. 24g/LKH2P04,1. 44g/LNa2HP04,0. 5ml/LTween-20,所述PBST緩沖液的pH= 7. 4 ;
[0013] 6)根據(jù)步驟1)-步驟5)的方法分別檢測(cè)四份經(jīng)臨床確定為人肺炎支原體陰性的 人群的呼吸道分泌物樣品，讀取熒光值；所述人肺炎支原體陰性的人群的呼吸道分泌物樣 品簡(jiǎn)稱人肺炎支原體陰性對(duì)照樣品；所述四份人肺炎支原體陰性對(duì)照樣品的熒光值的平均 值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和即為⑶T-0FF值；若步驟5)中人呼吸道分泌物樣本的檢測(cè)熒光值大于 CUT-OFF值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本中人肺炎支原體抗原為陽(yáng)性；若步驟5)中人呼 吸道分泌物樣本的檢測(cè)熒光值小于⑶T-0FF值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本中人肺炎支 原體抗原為陰性。
[0014] 一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人肺炎支原體抗原的試劑盒，其特征在 于：所述試劑盒由具有富集人肺炎支原體抗原功能的抗人肺炎支原體免疫納米磁珠、量子 點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎支原體納米探針、質(zhì)控品以及PBST緩沖液所組成；所述質(zhì)控品包括陽(yáng)性 質(zhì)控品以及陰性質(zhì)控品；所述陽(yáng)性質(zhì)控品由滅活的人肺炎支原體干燥結(jié)合到拭子上而成； 所述陰性質(zhì)控品是經(jīng)臨床確定為人肺炎支原體陰性的人群的咽拭子。
[0015] -種用于制備基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人肺炎支原體抗原的試劑盒的 方法，其特征在于：所述制備方法包括以下步驟：
[0016] 1)抗人肺炎支原體免疫納米磁珠的制備：
[0017] 1. 1)兔及鼠抗人肺炎支原體P1蛋白多克隆抗體IgG的制備
[0018] 1. 1. 1)重組Pl-His融合蛋白的制備、純化：
[0019] 1. 1. 1. 1)對(duì)人肺炎支原體膜蛋白P1進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲取其胞外結(jié)構(gòu)域中 抗原表位最為豐富的肽段；
[0020] 1. 1. 1. 2)找到步驟1. 1. 1. 1)中所得到肽段對(duì)應(yīng)的基因編碼序列，根據(jù)大腸桿菌 中密碼子的偏好性，對(duì)步驟1. 1. 1. 1)中所得到基因編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化；
[0021] 1. 1. 1. 3)在步驟1. 1. 1. 2)中所得到的基因序列的5'端及3'端引入酶切位點(diǎn)并 化學(xué)合成全基因序列，同時(shí)標(biāo)記記為pl;其基因序列如序列表所示；
[0022] 1. 1. 1. 4)將步驟1. 1. 1. 3)中所得到的pl按分子生物學(xué)方法克隆入表達(dá)載體 pET-28a(+)后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)重組Pl-His融合蛋白；所述重組Pl-His融合蛋白以可 溶性表達(dá)方式存在于菌體中；
[0023] 1. 1. 1. 5)用鎳柱純化步驟1. 1. 1. 4)所得到的重組蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)其純度后， 以Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白濃度為0.2mg/mL后備用；
[0024] 1. 1. 2)兔及鼠抗人肺炎支原體P1蛋白多克隆抗體IgG的制備：
[0025] 1. 1. 2. 1)以步驟1. 1. 1. 5)中所得到的重組Pl-His融合蛋白為完全抗原，分別免 疫新西蘭大白兔及豚鼠；分別制備兔抗人肺炎支原體P1蛋白抗血清及鼠抗人肺炎支原體 P1蛋白抗血清；所述兔抗人肺炎支原體P1蛋白抗血清及鼠抗人肺炎支原體P1蛋白抗血清 的間接ELISA效價(jià)均大于1X105 ;
[0026] 1. 1. 2. 2)采用ProteinG親和層析柱分別純化兔抗人肺炎支原體P1蛋白抗血清 及鼠抗人肺炎支原體P1蛋白抗血清中的多克隆抗體IgG;
[0027] 1. 1. 2. 3)用凱基Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定步驟1. 1. 2. 2)所得到的二種 多克隆抗體IgG的濃度，將其蛋白濃度均調(diào)整為lmg/mL后備用；
[0028] 1. 2)免疫納米磁珠的包被：
[0029] 1. 2. 1)取5mg磁珠，用1mlMES緩沖液洗滌三次，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離 后移除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe304為內(nèi)核、粒徑為180nm的羧基磁珠；所述MES緩 沖液是質(zhì)量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代）乙磺酸；所述MES緩沖液的pH=6. 0 ;所述納米 磁分離器的磁性強(qiáng)度是〇.4T;
[0030] 1. 2. 2)依次加入用步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是8-12mg/ml的EDC 溶液以及用步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是6-10mg/ml的sulfo-NHS溶液各 0. 5ml，以10-40rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化lhr，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除 上清，用lml步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠；
[0031] 1. 2. 3)取5個(gè)離心管，在每個(gè)離心管中加入200iiL步驟1. 2. 2)所得到的活化后 的磁珠，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀 釋的濃度為50-200iig/ml的由步驟1.1)所制備的兔抗人肺炎支原體P1蛋白多克隆抗體 IgG溶液各lml，室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2-6h，置于納米磁分離器中進(jìn)行 磁分離后移除上清后，各加入lml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液，室溫下以15rpm/min 于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2h以封閉磁珠上未與抗體反應(yīng)的羧基；所述PBS緩沖液中各成分含量 如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HP04,所述 PBS緩沖液的 pH= 7.4；
[0032] 1. 2. 4)封閉反應(yīng)完成后，將該5個(gè)離心管置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移 除上清，各用lml洗滌緩沖液洗滌三遍；所述洗滌緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL， 0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HP04,0.5ml/LTween-20,所述洗滌緩沖液的pH= 7.4 ；
[0033] 1. 2. 5)向各個(gè)離心管中分別加入lml保存緩沖液重懸磁珠，置于4°C保存?zhèn)溆茫?所述保存緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/L Na2HP04,0. 3g/LNaN3,5g/L牛血清白蛋白（BSA)，所述保存緩沖液的pH= 7.4 ;
[0034] 2)量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎支原體納米探針的制備：
[0035] 其具體制備方法包括：
[0036] 2. 1)向微量離心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子點(diǎn)、300nmolN-羥基琥珀酰 亞胺sulfo-NHS以及300nmol碳二亞胺EDC，以磷酸鹽緩沖液定容為2ml，混合溶液，37°C反 應(yīng)30min后，透析去除過量的作為活化劑的sulfo-NHS及E：DC，得到活化后的量子點(diǎn)；所述 磷酸鹽緩沖液中各成分含量如下：2. 9g/L磷酸氫二鈉，0. 295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉； 所述磷酸鹽緩沖液的pH= 7. 4 ;
[0037] 2. 2)在步驟2. 1)所得到的活化的量子點(diǎn)中，加入4_12nmol的步驟1. 1)中所制 備的鼠抗人肺炎支原體P1蛋白多克隆抗體IgG，避光反應(yīng)2h，加入單端氨基化聚乙二醇 PEG2000-NH2至終濃度為1%，封閉未反應(yīng)的活化羧基位點(diǎn)，繼續(xù)避光反應(yīng)lh;
[0038] 2. 3)用0. 2iimPES濾器過濾除去步驟2. 2)中的抗體聚集物，然后將濾液轉(zhuǎn)移到 50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，除去未發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的抗體和 反應(yīng)中的副產(chǎn)物；
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