一種人類嗅粘膜間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人類嗅粘膜間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)方法。包括以下步驟：1、配制由DMEM和F12以1∶1混合而成的基礎培養(yǎng)液；2、即時采集病員AS；3、將采集的AS加入配制出的人嗅粘膜間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中，在35℃～38℃、加3～7％的CO2。本發(fā)明可以高效快速的獲得高純度的嗅粘膜間充質(zhì)干細胞，這群細胞具有較強的克隆形成能力、自我更新能力和多向分化潛能，本發(fā)明方法獲得的嗅粘膜細胞具有較強的成脂能力、成骨能力、成神經(jīng)干細胞能力和成神經(jīng)元的能力，為在體外獲取大量的具有干細胞運用于細胞和組織再生提供了新的方法。
【專利說明】一種人類嗅粘膜間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)【技術領域】，涉及一種人類嗅粘膜間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002]間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一類來源于發(fā)育早期中胚層及外胚層的多能干細胞，具有能自我更新、多向分化的能力。目前研究的MSCs主要來源于成人骨髓以及臍帶血。對于成人骨髓來源的間充質(zhì)干細胞，由于其數(shù)量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，且病毒感染率較高，加之供者的骨髓采集需進行骨髓穿刺術，故其獲取受到一定的限制。
[0003]嗅粘膜間充質(zhì)干細胞(olfactorymucosa mesenchymal stem cells, OM-MSCs)也稱為外胚間充質(zhì)干細胞(ectomesenchymal stem cells, 0E-MSC)。又因為定位于嗅粘膜固有層中，所以也稱嗅粘膜固有層間充質(zhì)干細胞(lamina propria mesenchymal stem cell,LP-MSCs)。1998年Huard JM等人首次發(fā)現(xiàn)在人嗅粘膜中存在干細胞且能夠向神經(jīng)元與非神經(jīng)元細胞分化。大量研究證明=OM-MSCs具有與骨髓間充質(zhì)干細胞相似的生物學特性及類似的免疫表型，而且在體外能夠向脂肪細胞、成骨細胞、神經(jīng)細胞、平滑肌細胞等分化，將嗅粘膜細胞植入雞胚中，還能分化出典型的心臟，肌肉，肝臟，腦，脊髓等組織。OM-MSCs具有以下優(yōu)點:①具有更強大的增殖效率和更短的傳代時間；②位于鼻腔中，易于取材；③來源穩(wěn)定，嗅粘膜終生可更新；④可自體移植，無免疫排斥反應；⑤安全性高，染色體核組分析和腫瘤基因分析顯示體外 無限傳代后沒有基因變異；⑥無倫理道德問題。因此OM-MSCs在組織工程、細胞移植和基因治療中將具有廣闊的應用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種人類嗅粘膜間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)方法，本發(fā)明的有益效果是提取和培養(yǎng)的人類嗅粘膜間充質(zhì)干細胞在傳至10代后仍能維持干細胞的活性，保持干細胞的增殖和多項分化潛能。
[0005]本發(fā)明所采用的技術方案是按照以下步驟進行:
[0006]步驟1:配制人嗅粘膜間充質(zhì)干細胞基礎培養(yǎng)基；
[0007]步驟2:米集病員本人 AS (autologous serum)；
[0008]步驟3:將病員本人AS加入到人嗅粘膜間充質(zhì)干細胞基礎培養(yǎng)基中；
[0009]步驟4:鼻嗅粘膜獲取；
[0010]步驟5:鼻粘膜放入培養(yǎng)皿中，用青霉素與生理鹽水配比1:1清洗3遍，清洗殘余血跡；
[0011]步驟6:在培養(yǎng)皿中用無菌剪刀將步驟中洗浄的嗅粘膜剪成面積為1mm3組織塊；
[0012]步驟7:將組織塊置于離心管中與培養(yǎng)基充分混合振蕩種植于細胞培養(yǎng)瓶中，并置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；[0013]步驟8:細胞爬出之后換液，之后每隔3天更換一次培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0014]進一步，所述步驟I中配制人嗅粘膜間充質(zhì)干細胞基礎培養(yǎng)基的步驟為:a:取DMEM和F12按1:1混合而成的培養(yǎng)粉末，加純凈水至濃度為10~25g/L，并充分攪拌溶解，制得細胞的一般基礎培養(yǎng)液，b:以I~10當量濃度的氫氧化鈉調(diào)pH為7.0~7.5，c:層流細胞培養(yǎng)室抽濾消毒，4°C儲存?zhèn)溆谩?br> [0015]進一步，所述步驟2采集過程為:a、準備玻璃離心管、一次性無菌注射器、酒精棉；b、常規(guī)消毒、前臂靜脈取血，不加任何抗凝劑；c、將靜脈血置于無菌玻璃離心管中，室溫或4°C條件下,離心1800~2000rmp,15分鐘,可得到病員AS,并收集。
[0016]進一步，所述步驟4鼻嗅粘膜獲取，a:獲取嗅粘膜組織前三天，病員準備，鼻毛清理滴加氯霉素；b:獲取前鼻內(nèi)麻醉，丁卡因與生理鹽水的比值1.2% -1.5%的紗棉片用槍狀鑷塞入病員鼻腔中，麻醉2次，每次5-8min ；c:使用篩竇咬鉗取中鼻甲靠上部外側粘膜組織；d:用注射器針頭將組織塊撥入試管內(nèi)；e:將試管放入冰盒中，立即帶回培養(yǎng)室培養(yǎng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1嗅粘膜間充質(zhì)干細胞的流式細胞結果示意圖；
[0018]圖2嗅粘膜間充質(zhì)干細胞光鏡圖片(40X)；
[0019]圖3嗅粘膜間充質(zhì)干細胞成骨圖片(100X)；
[0020]圖4嗅粘膜間充 質(zhì)干細胞成脂圖片(100X)。
【具體實施方式】
[0021]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明。
[0022]本發(fā)明采用的技術方案包括如下步驟:
[0023]1、配制人嗅粘膜間充質(zhì)干細胞基礎培養(yǎng)基，a:取DMEM和F12按1:1混合而成的培養(yǎng)粉末，加純凈水至濃度為10~25g/L，并充分攪拌溶解，制得細胞的一般基礎培養(yǎng)液，b:以I~10當量濃度的氫氧化鈉調(diào)pH為7.0~7.5 ;c:層流細胞培養(yǎng)室抽濾消毒，4°C儲存?zhèn)溆谩?br> [0024]2、采集病員本人AS，采集步驟為:a、準備玻璃離心管、一次性無菌注射器、酒精棉；b、常規(guī)消毒、前臂靜脈取血，不加任何抗凝劑；c、將靜脈血置于無菌玻璃離心管中，室溫或4°C條件下,離心1800~2000rmp, 15分鐘,可得到病員AS,并收集；
[0025]3、取步驟I配制出的人嗅粘膜間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基，取步驟2即時采集病員本人AS加入到人嗅粘膜間充質(zhì)干細胞基礎培養(yǎng)基中，AS的含量為培養(yǎng)基的10~15% ;將加人嗅粘膜間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基置于4°C冰箱中保存。
[0026]4、鼻嗅粘膜獲取，a:獲取嗅粘膜組織前三天，病員準備，鼻毛清理滴加氯霉素；b:獲取前鼻內(nèi)麻醉，丁卡因與生理鹽水的比值1.2% -1.5%的紗棉片用槍狀鑷塞入病員鼻腔中，麻醉2次，每次5-8min，c:使用篩竇咬鉗取中鼻甲靠上部外側粘膜組織；d:用注射器針頭將組織塊撥入試管內(nèi):將試管放入冰盒中，立即帶回培養(yǎng)室培養(yǎng)。
[0027]5、鼻粘膜從試管中取出放入培養(yǎng)皿中，用青霉素與生理鹽水配比1:1清洗3遍，清洗殘余血跡。
[0028]6、在培養(yǎng)皿中用無菌剪刀將步驟中洗浄的嗅粘膜剪成面積為1mm3組織塊。[0029]7、將步驟(6)中的組織塊置于離心管中與培養(yǎng)基充分混合振蕩種植于細胞培養(yǎng)瓶中，并置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0030]8、細胞爬出之后換液，之后每隔3天更換一次培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0031]當細胞融合面積達80%即可傳代或繼續(xù)其他實驗。
[0032]本發(fā)明優(yōu)點是提供的人嗅粘膜間充質(zhì)干細胞的提取和培養(yǎng)方法能快速獲得大量嗅粘膜間充質(zhì)干細胞，并且能長時間維持嗅粘膜間充質(zhì)干細胞的增殖和分化能力，在傳代至第10代后獲得的細胞仍然具有干細胞活性，本發(fā)明方法簡單，可重復性強，操作簡便易行，為嗅粘膜間充質(zhì)干細胞的應用于臨床治療，起到不可估量的作用。
[0033]下面列舉具體實施例對本發(fā)明進行說明:
[0034]實施例1:
[0035]獲取嗅黏膜組織塊(大小2 X 3mm) 2塊，無菌條件下用I %青霉素反復沖洗3遍，去除殘留血跡。在完全培養(yǎng)基中用無菌眼科剪將其剪成長約Imm3的組織塊，組織塊置于15ml離心管與完全培養(yǎng)基混合震蕩均勻種植于細胞培養(yǎng)皿中，并置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)第7天，細 胞爬出顯微鏡下觀察到貼壁的梭形或多邊形的細胞，之后每隔3天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)第15天，細胞約80%融合，按1: 3傳代，之后可達到每1.5-2天傳一代，最終得到充足的間充質(zhì)干細胞。
[0036]實施例2:
[0037]獲取嗅黏膜組織塊(大小2X2mm)3±；fe，無菌條件下用1%青霉素反復沖洗，去除殘留血跡。在完全培養(yǎng)基中用無菌眼科剪將其剪成長約Imm3的組織塊，組織塊置于15ml離心管中與完全培養(yǎng)基混合震蕩均勻種植于細胞培養(yǎng)皿中，并置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)第8天，顯微鏡下觀察到貼壁的梭形或多邊形的細胞，之后每隔3天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)第14天，細胞約80%融合，按1: 3傳代，之后每3天傳一代，最終得到充足的間充質(zhì)干細胞。
[0038]實施例3:
[0039]獲取嗅黏膜組織塊(大小2X2mm)2±；fe，無菌條件下用1%青霉素反復沖洗，去除殘留血跡。在完全培養(yǎng)基中用無菌眼科剪將其剪成長約Imm3的組織塊，組織塊置于15ml離心管中與完全培養(yǎng)基混合震蕩均勻種植于細胞培養(yǎng)皿中，并置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)第6天，顯微鏡下觀察到貼壁的梭形或多邊形的細胞，之后每隔3天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)第14天，細胞約80%融合，按1: 3傳代，之后每3天傳一代，最終得到充足的間充質(zhì)干細胞。
[0040]將培養(yǎng)出的嗅黏膜間充質(zhì)干細胞進行鏡檢、流式細胞儀檢測特征表面標記及成骨成脂誘導并染色，圖1為特征表面標記的流式圖，細胞高表達間充質(zhì)干細胞陽性標記物⑶105、⑶90、⑶73，不表達造血干細胞標記物⑶34、⑶45。檢測結果顯示為(1)^34-，(2)⑶45-，(3)⑶105+，(4)⑶73+，(5)⑶90+，證明所獲得的細胞為間充質(zhì)干細胞。圖2為鏡檢照片。圖3為骨組織誘導后茜素紅染色鈣鹽沉積。圖4為脂肪組織誘導后油紅O染色脂滴。
[0041]以上對本發(fā)明結合實施例做了具體說明，但本發(fā)明并不限于上述實施例，在本領域普通技術人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本發(fā)明宗旨的前提下做出各種變化。
【權利要求】
1.一種人類嗅粘膜間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于按照以下步驟進行: 步驟1:配制人嗅粘膜間充質(zhì)干細胞基礎培養(yǎng)基； 步驟2:采集病員本人AS ； 步驟3:將病員本人AS加入到人嗅粘膜間充質(zhì)干細胞基礎培養(yǎng)基； 步驟4:鼻嗅粘膜獲?。? 步驟5:鼻粘膜放入培養(yǎng)皿中，用青霉素與生理鹽水配比1:1清洗3遍，清洗殘余血跡； 步驟6:在培養(yǎng)皿中用無菌剪刀將步驟中洗浄的嗅粘膜剪成面積為1mm3組織塊； 步驟7:將組織塊置于離心管中與培養(yǎng)基充分混合振蕩種植于細胞培養(yǎng)瓶中，并置于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 步驟8:細胞爬出之后換液，之后每隔3天更換一次培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
2.按照權利要求1所述一種人類嗅粘膜間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟I中配制人嗅粘膜間充質(zhì)干細胞基礎培養(yǎng)基的步驟為:a:取DMEM和F12按1:1混合而成的培養(yǎng)粉末，加純凈水至濃度為10~25g/L，并充分攪拌溶解，制得細胞的一般基礎培養(yǎng)液，b:以I~10當量濃度的氫氧化鈉調(diào)pH為7.0~7.5，c:層流細胞培養(yǎng)室抽濾消毒，4°C儲存?zhèn)溆谩?br> 3.按照權利要求1所述一種人類嗅粘膜間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟2采集過程為:a、準備玻璃離心管、一次性無菌注射器、酒精棉；b、常規(guī)消毒、前臂靜脈取血，不加任何抗凝劑；c、將靜脈血置于無菌玻璃離心管中，室溫或4°C條件下，離心1800~2000rmp，15分鐘，可得到病員AS，并收集。
4.按照權利要求1所述一種人類嗅粘膜間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟4鼻嗅粘膜獲取，a:獲取嗅粘膜組織前三天，病員準備，鼻毛清理滴加氯霉素；b:獲取前鼻內(nèi)麻醉，丁卡因與生理鹽水的比值1.2% -1.5%的紗棉片用槍狀鑷塞入病員鼻腔中，麻醉2次，每次5-8min ；c:使用篩竇咬鉗取中鼻甲靠上部外側粘膜組織；d:用注射器針頭將組織塊撥入試管內(nèi):將試管放入冰盒中，立即帶回培養(yǎng)室培養(yǎng)。
【文檔編號】C12N5/0775GK104031881SQ201410228728
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月28日 優(yōu)先權日:2014年5月28日
【發(fā)明者】盧明, 葛麗特, 段答 申請人:盧明