專利名稱：白細胞庫的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的白細胞單采形式(分離的白細胞單采)，實施分離的白細胞單采的方法和裝置，由此產生的白細胞庫(leukocyte cell bank)以及基于它們進行的各種形式的治療。
背景技術：
細胞庫細胞庫行業(yè)是一種服務行業(yè)，它將活細胞保存起來以備后用。這一行業(yè)已有數(shù)十年歷史，例如貯存牛的精子細胞以便對母牛進行人工受精。
隨著生物醫(yī)學研究和組織工程領域的技術進步，人們正在認識到，用人類干細胞進行多種替代療法有多種可能性。這些進展導致越來越需要可以對個體的干細胞進行分離并凍存?zhèn)溆?自體應用)的便利方法。例如，越來越多的人意識到了對貯存新生兒臍血干細胞的需求，結果私有細胞庫中這類干細胞保存物快速增多。
隨著對細胞和組織的需求不斷增加，細胞庫行業(yè)逐漸意識到實際問題。目前已知，旨在提供長期細胞來源的細胞庫很容易受隨機事件的影響，導致一部分或全部保存物失去活性，而且細胞庫越大，貯存時間越長，與這種隨機事件有關的風險就越大。保存物的完整性也至關重要保存物的制備、保存、操作和使用方式有可能對細胞庫的完整性起到關鍵的決定作用這一點，對于保存物的交叉污染可以引起疾病的傳播或引起不當?shù)幕蛭ｋU的生理后果(如，有可能是由于在自體移植時給予了異源細胞物質)的情況而言尤其重要。對較大的細胞庫而言，信息存儲、處理和保存物分類編目也是極其重要的。
這類問題使得許多國家出臺越來越多的法律法規(guī)，來管理細胞庫的生成、維持和應用目前在英國，細胞庫行業(yè)由一個綜合管理組織控制。
應急性自體移植(CAT)療法最近有文獻描述了一種療法(見WO 00/29551和WO 01/88099)，其從健康供血者取出各種組織(包括白細胞)，將它們貯存在組織或細胞庫中，將來某一天發(fā)生緊急事件需要進行自體移植時，可以用它們進行自體移植。這種療法在本文中稱為應急性自體移植(contingent autologous transplantation，CAT)療法。
對于任何具體組織或細胞類型而言，僅僅有一部分健康人群可能需要CAT療法。因此，CAT療法有效與否，關鍵取決于是否能產生全面型細胞組織庫，所述庫中包括來自該群體中大多數(shù)人的保存物。
因此有觀點認為，通過構建全面的組織庫將有利于CAT療法。但是，CAT療法本身的性質決定了它對任何這類組織庫有其獨特而嚴格的要求。特別是，CAT療法要求有大量的供血者參與(從而有大量保存物)、有相對較長的保存期、在長時間內良好維持組織的功能以及在最終治療應用中有很好的適應性。
對白細胞庫而言，這些問題尤其急迫，因為白細胞庫所能提供的細胞的絕對數(shù)量比較少，最終治療效力有可能關鍵取決于一小群細胞的功能，而由于不同的細胞以不同方式適應貯存，貯存的白細胞的活性有可能隨著時間推移發(fā)生變化。迄今為止，尚無人構建出適合CAT的白細胞庫。
通過白細胞單采分離可用于CAT療法的白細胞白細胞單采(Leukapheresis)是一種特殊形式的采血術(apheresis)，涉及從獲取的血液中選擇性分離并取出白細胞，然后將血液的剩余部分回輸給供血者。在白細胞單采過程中，使取出的血液流經細胞分離裝置，這種裝置在體外將有核白細胞與紅細胞和血漿分離。紅細胞和血漿被回輸給供血者，這也是分離過程的一部分。該過程連續(xù)進行，不斷地有血液被取出并幾乎是同時在進行了各種提取之后返回到體內。因此，白細胞單采使得有可能將供血者的全部血液分多次取出并回輸，在不傷害此人的情況下分離出并保存大量的白細胞。該技術因而依賴于能否建立一種靜脈到靜脈的體外血液循環(huán)，并從該循環(huán)的血液中提取白細胞。
白細胞單采一般都是自動的，用連續(xù)的或間斷的流體離心或過濾技術進行，可參見“Leukapheresis and Granulocyte Transfusions”，由AmericanAssociation of Blood Banks，Washington DC(1975)出版。
實施離心式白細胞單采的裝置在US 3489145和US 3655123中有所描述，實施過濾式白細胞單采的裝置在US 3802432和US 3892236中有所描述。重力式白細胞單采(gravity leukapheresis)僅利用重力實施白細胞分離和收集，這種方法在US 4111199中有所描述。
目前可以商購的自動白細胞單采裝置有多種不同類型，包括FenwalCS-3000(Baxter Healthcare，Chicago，IL)，Cobe 2997(Cobe BCT，Lakewood，CO)，Cobe Spectra，Cobe 2991，以及Haemonetics V50(Haemonetics Corp.，Braintree，MA)。這其中任一種都可以用于本發(fā)明，但優(yōu)選Cobe系統(tǒng)(CobeBCT，Lakewood，CO，USA)，它能從流經其分離器的全血中提取到白細胞總數(shù)的40％-50％，并且其每分鐘的流速可以達到40-60ml或更大。
近期有人提出，用白細胞單采創(chuàng)建CAT療法所用的淋巴細胞庫(見WO00/29551和WO 01/88099)。但用白細胞單采產生商業(yè)化的全面型淋巴細胞庫受到供血者方便性和舒適性的限制。例如，供血者通常能夠到訪血液采集機構進行供血的時間是有限的。因此，供血者一旦到達采血機構，其真正在采血室所花的時間是一個重要因素。但是，白細胞單采一般需要2-4小時(比提供一個單位的血液所需的時間長數(shù)倍)。由此帶來供血者舒適性的問題很多人在看到真實的采血過程時感到很害怕，并且在整個過程中供血者身上至少必須插入一個針頭(通常是兩個，用于引流和回輸血液)，由此帶來潛在危險。
因此，需要一種制備白細胞庫的方法，它能避免在使用白細胞單采時所出現(xiàn)的問題，還能使供血者更方便(而且不適感較少)，從而有可能創(chuàng)建適用于CAT療法的全面型白細胞庫。
發(fā)明概述本發(fā)明是基于(至少部分基于)以下發(fā)現(xiàn)用常規(guī)方法從供血者采集的血樣，經過可以商購的白細胞單采裝置的處理，可以為白細胞建庫提供方便的白細胞來源無需對供血者“連線”使用這些裝置。
由這種“分離的白細胞單采”方法制備的白細胞制劑，可以直接用于在各種疾病的治療中進行自體移植，或者在對白細胞進行各種處理后再用于所述自體移植。
因此，本發(fā)明第一方面提供了分離的白細胞單采，其中白細胞單采裝置與提供血樣的個體之間沒有流體聯(lián)通和/或剩余的血樣并未回輸至該個體。
白細胞單采裝置優(yōu)選是自動白細胞單采裝置。尤其優(yōu)選使用連續(xù)的或間斷的流體離心式白細胞單采裝置、或者連續(xù)的或間斷的流體過濾式白細胞單采裝置。
白細胞單采裝置可以包含(a)分離裝置(例如，離心轉子或濾器)；(b)白細胞單采管道系統(tǒng)(tubing set)；以及(c)一或多個泵，所述泵用于將血樣運輸通過所述管道裝置和將分離的白細胞運輸至收集容器。
所述方法優(yōu)選還包括以下步驟(a)使采集到的白細胞休眠(例如，通過深低溫保存(cryogenicpreservation)使之休眠)；和，可選地(b)使休眠的白細胞復蘇(例如，通過解凍和/或稀釋使之復蘇)。
如果使用深低溫保存，為方便起見，該深低溫保存包括冷凍至約-160℃或更低溫度，這可以用液氮來實現(xiàn)。如果需要長時間保存和/或更好地保留功能，可以用液氦冷凍至約-269℃或更低溫度。
廣泛多種適當?shù)纳畹蜏乇４娼橘|中，任何一種都可以用于本發(fā)明，優(yōu)選包含適當?shù)拇┩感岳鋬霰Ｗo劑的介質。特別適合用作穿透性冷凍保護劑的是DMSO，它的使用濃度，比如說，可以最高達10％。
深低溫保存介質還可以包含抗凝劑(如酸性檸檬酸葡萄糖，EDTA，肝素，或它們的混合物)、核酸酶(例如DNA酶和/或RNA酶)以及生理可接受的介質(例如，磷酸鹽緩沖液)。深低溫保存介質還可以包含蛋白質性質的組合物，如血清或血清成分和/或糖(sugar)和/或多糖(polysaccharide)(它們在采用潛水式冷凍(plunge freezing)的實施方案中是特別優(yōu)選的)。
在本發(fā)明深低溫保存介質中使用的特別優(yōu)選的蛋白質性質的組合物包含血液白蛋白(例如，牛血清白蛋白或人血清白蛋白)。尤其方便的是，使用從供血者血樣中分離的人血清。它可以作為白細胞分離的副產物與白細胞一起分離。
本發(fā)明第二方面提供了用于從血樣中選擇性分離并取出白細胞的白細胞單采裝置的用途，所述血樣與提供該血樣的個體的血液之間沒有流體聯(lián)通(即，是本文所述的分離的血樣)。
本發(fā)明第三方面提供了制備用于自體移植的白細胞組合物的方法，包括以下步驟(a)提供來自供血者個體的分離的血樣；和(b)用白細胞單采裝置從該血樣中選擇性分離并收集白細胞。
本發(fā)明第四方面提供了制備用于恢復性自體移植(restorativeautotransplantation)的白細胞組合物的方法，包括以下步驟(a)提供來自供血者個體的分離的血樣；(b)用白細胞單采裝置從該血樣中選擇性分離并收集白細胞；(c)使收集到的白細胞休眠(例如，通過深低溫保存(cryogenicpreservation)使之休眠)；和，可選地(d)使休眠的白細胞復蘇(例如，通過解凍和/或稀釋使之復蘇)。
本發(fā)明第五方面提供了制備用于治療性自體移植(remedialautotransplantation)的白細胞組合物的方法，包括以下步驟(a)提供來自供血者個體的分離的血樣；(b)用白細胞單采裝置從該血樣中選擇性分離并收集白細胞；(c)處理所收集到的白細胞；和，可選地(d)使經過處理的白細胞休眠(例如，通過深低溫保存使之休眠)。
本發(fā)明第六方面提供了制備白細胞庫的方法，包括以下步驟(a)提供來自供血者個體的分離的血樣；(b)用白細胞單采裝置從該血樣中選擇性分離并收集白細胞；和(c)使收集到的白細胞休眠(例如，通過深低溫保存使之休眠)，并且將這些步驟重復應用于來自不同供血者個體的一系列血樣，從而制備多份休眠(例如深低溫保存)的白細胞組合物，所述方法還包括以下步驟(d)將休眠的白細胞以可以復蘇的方式保存，以備日后自體移植。
本發(fā)明第七方面提供了用于從個體收集分離的血樣的系統(tǒng)(例如，封閉系統(tǒng))，所述系統(tǒng)包含樣品容器和白細胞單采管道系統(tǒng)。
因此，本發(fā)明提供了用于從個體收集分離的血樣的系統(tǒng)(例如，封閉系統(tǒng)或功能性封閉系統(tǒng))，所述系統(tǒng)包含(a)采樣裝置(例如，包含針頭)，以用于從所述個體收集血樣；(b)樣品容器，其與所述采樣裝置之間有流體聯(lián)通；(c)白細胞單采管道系統(tǒng)，其與所述樣品容器之間有流體聯(lián)通；其中所述管道系統(tǒng)是盲端，不包含用于將經過分級分離的樣品的任何一部分重新引回所述個體中的裝置。
本發(fā)明第八方面提供了用于從來自個體的分離的血樣中選擇性分離并取出白細胞的裝置，所述裝置包含帶有本發(fā)明收集系統(tǒng)的白細胞單采裝置。
本發(fā)明還涉及可以通過本發(fā)明的方法獲得(或已經獲得)的白細胞組合物和白細胞庫。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述方法、系統(tǒng)、裝置、組合物和細胞庫的各種治療用途。相應地，本發(fā)明涉及本發(fā)明所述白細胞組合物在治療中的用途，例如在自體移植(例如恢復性或治療性自體移植)中的用途。
發(fā)明詳述
I.定義以下術語在本文中使用時，除了這些術語在本領域可能具有的任何更寬(或更窄)含義以外，除非有特別說明，都意圖表示以下含義術語“白細胞單采”是本文使用的本領域術語，用于定義一種方法，其涉及從獲自供血者的血液中選擇性分離和取出白細胞、再將剩余的血液回輸給所述供血者。
術語“白細胞單采裝置”是本領域術語，用于定義任何能進行白細胞單采的裝置，不管這種裝置采用什么方式來分離和取出白細胞。
術語“分離的白細胞單采”用在本文中，是指對分離的血樣實施白細胞單采的一種新形式。
類似地，術語“分離的采血術”用在本文中，是指對分離的血樣實施采血術的一種新形式。
術語“分離的血樣”用在本文中，是指與提供該血樣的供血者的血液之間沒有流體聯(lián)通的血樣。因此，對分離的血樣進行分離的白細胞單采的過程中，白細胞單采裝置與提供該血樣的個體之間沒有流體聯(lián)通和/或剩余血樣未被回輸?shù)皆搨€體體內。
術語“自體移植”用在本文中，是指同基因移植或自我移植，其中術語“自體”用于表示，移植是向提供細胞物質(例如白細胞)的相同生物(即相同個體)進行的移植?！耙浦病笔侵溉魏紊婕皩⒓毎镔|(例如白細胞)引入生物中的過程，因此該術語包括本領域已知的任何形式的移植。
術語“休眠”用在本文中，是指任何暫停活動的狀態(tài)或靜止狀態(tài)，達到這種狀態(tài)的方法是本領域已知的，下文中有描述。任何已知的方法，包括深低溫保存，都可以使用。因此，白細胞可以維持在靜息狀態(tài)、無活性狀態(tài)或非增殖狀態(tài)。
術語“健康”在本文中與供血者個體一起使用，表示該個體不具有白細胞缺陷(按照本文的定義)。因此，術語“健康”在本文包括非疾病狀態(tài)的供血者個體，且該供血者個體處在未患有任何疾病或失調、或未表現(xiàn)出所述疾病或失調的任何癥狀(即，為無癥狀或亞臨床表現(xiàn))的狀態(tài)。尤其是，術語“健康”在本文中包括，未患有隨后想要通過自體移植方法進行治療的疾病、或未表現(xiàn)出所述疾病的癥狀的供血者個體。
II.血樣本發(fā)明可以應用于任何形式的血樣，只要(a)該血樣是按照上述定義的分離的血樣，且(b)該血樣包含供血者個體的至少一部分白細胞。
可以在將血樣應用于本發(fā)明的方法之前，在體外(ex vivo)對其進行各種處理。例如，通常在使用前將血樣冷藏(chill)。其它處理可以包括添加保存劑和/或抗凝劑。
也可以在采血前或采血期間，將各種制劑施用于供血者個體，從而在采血前處理血樣。
可以在體外和/或在體內應用的處理的實例詳見下文中題為“白細胞處理”的章節(jié)。
一般優(yōu)選從供血者個體采集至少450-500ml血，這相當于在英國輸血服務中(UK blood transfusion service)一個供血者所提供的一個單位的血量。如有可能，在一段時間內(例如，2-3周內，優(yōu)選2-3個月內或6個月內或一年內，2年內或3年內或更長時間內)多次采血(例如，多個450-500ml)?？梢詫⑦@些血樣中的一或多個分為或混合為多個白細胞庫保存物。僅在英國，每年從供血者采集到超過3百萬單位的血，從中取出一個單位的血用于同種異體移植是很平常的。
取出的血很快會被補充(replaced)，因此可以在一年內多次從一個供血者體中采集一單位的血，必要時，采集2-12個單位，且對被采血的個體無害。
III.選擇供血者個體一般考慮恢復性自體移植是一種有可能最終適用于任何個體的療法。因此，本發(fā)明可以有效用于制備包括盡可能多的不同個體的完整的白細胞庫，以便在有需要時可以對任何指定個體進行恢復性自體移植。
基于上述原因，考慮將本發(fā)明盡可能廣泛地應用，以便可以建立起完整的白細胞庫。但由于每一份保存物的質量取決于(至少在一定程度上取決于)該供血者個體在獻血當時的健康狀態(tài)，故優(yōu)選用于本發(fā)明方法中的血樣是從健康供血者個體采集的。
還有其它因素也影響對供血者的選擇例如，用于本發(fā)明方法中的血樣最好是在供血者個體尚年幼時采集較有利，優(yōu)選在青春期(adolescence)或成年早期(early adulthood)。對人而言，優(yōu)選在約12-30歲采血(優(yōu)選多次采血)，優(yōu)選15-25歲。尤其優(yōu)選在16或17歲以上時采血，例如，16-30歲，17-30歲，或18-30歲，或可以是18-35或40歲。因此，優(yōu)選在宿主生物成熟，或接近成熟期(maturity)，但未明顯進入老化(ageing)或衰老(senescence)過程之前獲得其細胞。尤其是，優(yōu)選宿主生物的免疫系統(tǒng)成熟或發(fā)育完全時較為有利。
但是，本發(fā)明也包括在上述年齡段以外的時間獲得細胞，可以在剛出生后(post-natal)的任何時間獲得細胞，例如從少年時期(juvenile)的宿主生物獲得細胞，例如從兒童期的中晚期(mid-to late childhood)、或甚至從嬰兒(infant)獲得細胞，或從老年(older)的個體獲得細胞。
從剛出生后或老年的宿主取樣允許收集多份樣品，從而增加了積存足夠數(shù)量的細胞的機會。另外，從少年宿主或老年宿主取樣可以越過道德要求(ethical requirements)，如需要告知并經同意才能取樣的要求。
優(yōu)選從青春期或成年宿主生物取樣，因為所獲取的細胞，尤其是從血液獲取的細胞，將包含較大比例的有價值的成熟T細胞，它們能識別異常細胞群體，如癌細胞或被病毒感染的細胞。故而，當使用血樣時，從具有成熟免疫系統(tǒng)的個體(即并非胎兒(foetal)或新生兒(neonatal))獲取的血樣較有利。
因此，本發(fā)明涉及從供血者個體收集的血樣在將來可能發(fā)生或意外發(fā)生或僅僅是偶然發(fā)生的事件中的用途，所述血樣是在供血者個體不存在可能罹患疾病的直接預示、暗示、或懷疑的時候獲取的，所述將來事件不是已經預見到或已經懷疑或已經預示的疾病。因此，本發(fā)明一些實施方案中，所述供血者個體不對任何具體疾病易感，或者是沒有患任何具體疾病的危險，例如不具有任何可預示隨后疾病的癥狀或表現(xiàn)。類似地，宿主生物優(yōu)選未遭受任何可能引起預知疾病的損傷。
事實上，對于一些應用而言(例如，為了隨后進行恢復性自體移植而制備白細胞庫)，優(yōu)選本發(fā)明用到的血樣是在供血者個體罹患任何疾病或出現(xiàn)相關癥狀之前從該個體獲取的，更優(yōu)選是在宿主生物處于總體上良好的健康水平、并優(yōu)選沒有任何形式的免疫受損(immunocompromise)時獲取的。在這些實施方案中，在供血者個體沒有事先出現(xiàn)疾病癥狀、或存在疾病、或已經被診斷為罹患疾病、而該疾病又是隨后將要接受治療的疾病時，也就是說在該宿主生物處在健康狀態(tài)、而且不是“病后恢復”狀態(tài)(例如，不處在從將要被治療的白細胞缺陷部分地或完全地恢復的狀態(tài))時，從該個體獲取血樣特別有利。
易感的(Predisposed)供血者個體治療手段不斷進步，對疾病過程的理解也越來越深入，這有助于我們調整治療方向，從而減輕疾病和痛苦。這樣的理解由于分子生物學領域的技術進步而被大大推進。我們現(xiàn)在能在分子水平上跟蹤疾病的發(fā)病機理，并且認識到，個體的基因構造在他們對某些疾病的易感性方面起重要作用。例如，我們已知，一些個體由于他們的基因組成的關系，很容易發(fā)生某些疾病。
對一些個體而言易感的疾病多數(shù)是白細胞缺陷，該術語在本文中表示需要施用自體白細胞的情況。這類情況因此包括個體已經罹患與白細胞功能失調有關的疾病、感染或生理失調，或者已經罹患需要增強或刺激內源白細胞活性的疾病、感染或生理失調。白細胞缺陷的具體實例可以參見下文中“實例說明(Exemplary indications)”章節(jié)。
目前通過基因檢測，可以鑒定那些易感于白細胞缺陷(例如癌癥、免疫功能失調或感染等各種形式中的任一種)的個體。
此外，我們對于機體免疫系統(tǒng)的認知，以及尤其是對于免疫系統(tǒng)識別并殺傷被病毒感染的細胞和腫瘤細胞的認知，在不斷進步。我們現(xiàn)在已知，為了激發(fā)細胞介導的免疫，不良細胞(offending cell)(例如被病毒感染的細胞或腫瘤細胞)必須同時呈遞HLA I類限制性腫瘤表位或病毒表位以及GM-CSF和/或TNF-α等危險信號，以便使免疫系統(tǒng)的抗原呈遞細胞(APC)將B7和IL-12等協(xié)同刺激信號與抗原一起呈遞給與之相互作用的細胞毒T-淋巴細胞(CTL)群。這種同時呈遞導致產生活化細胞克隆和記憶細胞克隆(綜述可參見Nature Medicine Vaccine Supplement 4(1998)525)。在缺乏這些額外的信號的情況下，識別不良細胞的HLA-I類抗原-限制性T-細胞經過加工后被破環(huán)或脫敏(機體的一種可能用于避免發(fā)生諸如自身免疫病等生理失調的過程)。這類耐受的誘導是由于不識別(ignorance)、無反應性(anergy)或生理性缺失(physical deletion)(Cold Spring Harbour Symp Quant Biol 2(1989)807；Nature 342(1989)564；Cell 65(1991)305；Nature Med 4(1998)525)。
目前已清楚，腫瘤細胞并不自動地同時呈遞危險信號和/或協(xié)同刺激信號。故而，腫瘤的大量繁殖(spawning)可能導致根除那些提供細胞介導的抗腫瘤免疫力的T細胞克隆。因此，表現(xiàn)出癌癥、白血病/淋巴瘤或肉瘤等的病人，可能已經通過這個機理失去了他們先天的消滅腫瘤的能力。
但是，如果在病人發(fā)生擴散性疾病之前將所需的T淋巴細胞或其樣品取出，那么在發(fā)病時可以將相關的T細胞群返回給該病人，在經過必須的T細胞協(xié)同刺激后，來緩解疾病。協(xié)同刺激可以在將細胞返回給病人的同時進行，也可以在通過對病人實施其它治療而將細胞返回給病人之后進行，或者除了該病人天然產生的刺激以外不再有其它刺激。細胞的活化/刺激也可以是在回輸給病人之前在體外誘導。
本發(fā)明因此特別適用在易感于白細胞缺陷生長的病例中。它因此代表了一種從健康供血者個體取出白細胞，以便在該個體后來有需要時，通過自體(自基因)移植方法移植給該個體的一種方法(means)。盡管該易感個體有可能因為從來沒有出現(xiàn)需要用這種方法進行治療的疾病而從來沒有接受這些細胞，本發(fā)明也可以用于提供一種保險形式，為該個體防范白細胞缺乏癥的高風險提供保障。
類似地，沒有診斷出易感性的個體也可以選擇，在他們出國旅行之前，抽取樣品，放入本發(fā)明的白細胞庫，以備后用。這類應用可以包括境外感染的治療。
除此之外，眾所周知，老化過程使個體更易患疾病。這種易感性的根本原因似乎在于老化過程中的T細胞和B細胞的數(shù)目/活性顯著降低，致使免疫功能喪失(Mech Ageing & Dev 91(1996)219；Science 273(1996)70；Mech Ageing & Dev 96(1997)1)。疾病易感性尤其可見于老年病人在醫(yī)院內接受諸如外科手術時，在這里，他們很容易發(fā)生機會感染，導致嚴重或者甚至是致命的后果。在這類個體較年輕的時候取血樣，按照本發(fā)明的方法處理，放入白細胞庫中，就可以在上述情況中提供恢復性自體移植的機會。
這種方法可以更廣泛地用于在手術后增強病人的免疫系統(tǒng)，從而減少機會感染引起術后并發(fā)癥的可能性。因此，本發(fā)明可以作為預防性治療，例如，用于當老年病人更易感于疾病之時。
IV.白細胞本發(fā)明涉及用分離的白細胞單采術從血樣中分離并收集白細胞。可以理解，在白細胞單采過程中并不需要把血樣中所有的白細胞都分離和/或取出來。在很多情況下，僅僅取出和/或分離出血樣中白細胞總數(shù)的一部分就足以。本領域技術人員很容易確定需要取出的白細胞的合適量，它基于所分離出的白細胞的用途、樣品量、供血者狀態(tài)、白細胞的特征以及所采用的具體白細胞單采裝置等因素而有不同。
本發(fā)明方法中收集到的白細胞在一定程度上是從原始血樣中分離得到的。術語“分離的”在本文中用于表示，所分離的白細胞處在不同于它們在人體內環(huán)境的一種物理環(huán)境，該術語并不表示任何具體的純度。事實上，純度絕對值并非關鍵，本領域技術人員很容易基于白細胞的用途來確定合適的純度。
本發(fā)明方法中對白細胞的分離和收集也并不必然表示，優(yōu)先分離和收集任何具體類型的白細胞。本發(fā)明的白細胞包括任何白細胞，諸如粒細胞，淋巴細胞和單核細胞等。
粒細胞包括髓細胞(myelocyte)，嗜堿性粒細胞，嗜酸性粒細胞和中性粒細胞。淋巴細胞包括B淋巴細胞，T淋巴細胞和自然殺傷細胞。單核細胞包括單核巨噬細胞和其它巨噬細胞。
但在一些實施方案中，所分離并收集的白細胞優(yōu)選包含一種或多種特定類型的白細胞。優(yōu)選的細胞類型是淋巴細胞，尤其是T-淋巴細胞(T-細胞)。特別要優(yōu)選成熟的T-淋巴細胞。
由于每升人血液中成熟T細胞總數(shù)為1-2.5×109，因此100ml血樣中通常包含1-2.5×108成熟T細胞，一般這就足以提供能代表整個成熟人T細胞群體中產生有益效果所需的量。但是，根據用白細胞單采裝置所分離并收集到的白細胞總數(shù)的級分，以及所采用的任何復蘇技術的效力，優(yōu)選使用至少100ml，115ml，200ml或300ml血樣，更優(yōu)選超過400或500ml的血樣，以便在個體發(fā)生疾病時，能獲得足夠數(shù)量的成熟T細胞，在返回該個體后產生有益的治療效果。
本領域已知有多種標準技術可以從包含混合淋巴細胞群的樣品中選出具體的淋巴細胞亞群。這類亞群的實例包括，CD3+，CD8+，CD4+和CD16/56+(自然殺傷)T細胞以及CD19+B細胞。例如，這類T細胞亞群中任何一群或任何混合或任何組合都可以用于本發(fā)明的方法、用途和組合物中，它們可以通過多種已知方法很容易地獲得，所述方法如FACS(熒光活化細胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorting))和血細胞計數(shù)系統(tǒng)(haemocytometrysystems)。
本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)了更廣泛的應用，并且除了白細胞單采術以外，也可以采用任何其它形式的分離式采血術。因此，本發(fā)明涉及用于制備干細胞組合物(并因此產生干細胞庫)的分離式采血方法。本發(fā)明因此還可以應用于干細胞或始祖細胞(progenitor cell)，包括多能干細胞和已經進入具體分化途徑的干細胞或始祖細胞。
V.白細胞處理可以對白細胞進行各種處理。這類處理導致，例如擴增(expansion)一部分或所有代表性細胞亞群，提高白細胞在休眠階段的長期活力，增強它們的治療潛力，彌補部分或所有白細胞的缺乏或缺陷(例如，象在治療性自體移植治療模式中那樣)和/或使它們在隨后用于自體移植時更為安全。
所述處理可以在白細胞休眠之前或之后(以及進行自體移植之前或之后)進行。此外，可以在取樣之后進行處理(即體外進行)，在使細胞休眠之前或復蘇之后都可以處理。例如，對白細胞的處理可以是，在自體移植過程中，將一種另外的組合物與白細胞組合物依次(sequentially)或同時施用。對白細胞的處理可以在即將開始自體移植前進行。
或者(或另外)，可以在取血之前，通過施用生長因子或細胞因子等，對仍然在體內的白細胞進行處理(見下文)。
移植前處理的實例包括各種遺傳修飾，如摻入陰性選擇標記(例如，參見W096/14401，其引入本文作為參考)。這類處理使得有可能進行移植后的白細胞清除(ablation)或滴定劑量反應曲線。其它遺傳干預可以包括，調節(jié)或修飾一或多個基因的表達(例如，增加或減少基因表達)，使一或多個基因失活，基因置換和/或使一或多個異源基因表達)。其它遺傳修飾包括，定向引導(targeting)具體的T-細胞(見W096/15238，其引入本文作為參考)，以及用抗體修飾T-細胞受體所有組成部分(receptor repertoire)/表達，從而產生T-細胞嵌合體。
本發(fā)明的其它處理包括，將白細胞暴露于一或多種刺激分子，例如抗原(如癌癥抗原或病毒抗原)、抗體、T細胞識別表位、肽、血液因子、激素、生長因子或細胞因子或其組合。
例如，白細胞可以在體外(或于取血之前在體內)用以下物質進行處理抗原(例如，前列腺特異性抗原1或前列腺特異性抗原2、her-2/new、MAGE-1、p53、Ha-ras和c-myc等癌癥抗原，或病毒抗原)、抗體、T細胞識別表位、肽、血液因子、激素、生長因子或細胞因子或其組合。刺激分子可以是合成的分子、重組分子，或者可以是從人體或動物體純化或分離的分子。這方面特別有用的刺激分子選自IFN-alpha，IFN-beta，IFN-gamma，II-1a，II-1b，II-2，II-3，II-4，II-5，II-6，II-7，II-8，II-9，II-10，II-11，II-12，II-13，II-14，II-15，GM-CSF，M-CSF，G-CSF，LT或上述兩種或更多種的組合。這樣的處理可以改變白細胞的生長和/或活性和/或分化狀態(tài)，和/或可以用于區(qū)分或選擇性分離或富集所需的白細胞類型或清除不想要的細胞。
最近有一些進展使得可以獲得用于隨后自體移植的細胞。例如，對造血調節(jié)因子的研究導致分離出一系列能影響淋巴細胞增殖和分化的因子。這些因子包括，細胞因子(如白細胞介素系列IL-1到IL-18，白三烯，腫瘤特異性抗原如前列腺特異性抗原1或前列腺特異性抗原2、her-2/new、MAGE-1、p53、Ha-ras和c-myc)，生長因子如TNF、TGF、FGF、EGF、GM-CSF、G-CSF，及其它。這其中有多種因子目前可以購買到臨床使用的商品，有一些已經顯示能大大增加外周血淋巴細胞，尤其是未成熟的T淋巴細胞的數(shù)量。將它們在取血前施用于供血者個體，可以控制質量和/或數(shù)量(指白細胞亞型的存在數(shù)量和特性而言)，并且有可能無需骨髓取樣，直接從供血者個體外周血收獲大量的所需細胞，如未成熟的T淋巴細胞。
移植前的其它處理包括培養(yǎng)白細胞(或其亞群)。例如，可以培養(yǎng)白細胞使得細胞數(shù)增加。例如，可以用本領域已知的方法使細胞傳代。這類培養(yǎng)可以在白細胞休眠之前和/或之后進行。
因此，在白細胞包括T細胞的情況下，可以在移植前對T細胞進行協(xié)同刺激和/或在自體移植之前使T細胞暴露于腫瘤抗原(任選與協(xié)同刺激因子一起)。
VI.白細胞裝置目前市面上可以購買到多種不同類型的白細胞單采裝置。這類裝置通常至少包含三個單獨的組件(1)分離裝置(例如包含膜或離心轉子，它們提供力量使白細胞與血液中其它各種成分分開；(2)一或多個泵，用于將血樣運輸?shù)缴鲜龇蛛x裝置，用于取出分離的白細胞以及用于維持灌輸(transfusion)和再灌輸(retransfusion)所必須的力量，和(3)管道系統(tǒng)(通常是一次性的)，它將血液及其各種級分以特定的幾何位置保持在分離裝置內，它限定出固定的血液流通通道(常常是從供血者，通過白細胞單采裝置又回到該供血者的一個回路)以及用于收集分離的白細胞和/或其它血液級分或流體的容器(一般是袋子)。
廣泛多種市售白細胞單采裝置中的任一種都可以用于本發(fā)明中。白細胞單采裝置的具體操作方式取決于多種因素，包括分離裝置(例如，離心機，濾器等)的特點、所需的白細胞樣品類型、需要處理的血樣體積、供血者個體的特征和狀態(tài)、白細胞組合物的最終用途、以及在進行本發(fā)明的處理之前施加于血樣的任何處理的特性。因此，本領域技術人員能很容易地確定合適的操作參數(shù)。
但是優(yōu)選地，選擇對操作者介入和/或培訓的需要最少的白細胞單采裝置。對多種市售白細胞單采系統(tǒng)而言，操作者進行準備和操作所需的時間和/或專業(yè)技能各不相同。例如，減少操作者裝卸管道系統(tǒng)所需的時間、以及降低這些操作的復雜程度，可以提高生產力和/或減少操作者失誤的可能性。而且，減少系統(tǒng)對操作者的依賴程度，則可以減少操作失誤和/或減少對這些系統(tǒng)的操作者所期望的/必需的資格。
性能-相關因素也是有關聯(lián)的，可以用白細胞單采系統(tǒng)的“收集效力”來評判。一個系統(tǒng)的“收集效力”當然可以用多種方式來衡量，諸如用所收集到的白細胞部分相對于樣品中自細胞總數(shù)的大小來衡量。性能也可以基于白細胞單采方法對各種類型血液成分的影響來評價。例如，一般希望減少采血法對至少白細胞的負面影響?？赡苓€希望減弱血小板活化作用，以避免處理過程中樣品質量的下降。
特別優(yōu)選的是Cobe系統(tǒng)(Cobe BCT，Lakewood，CO，USA)。
VII.本發(fā)明中用到的收集系統(tǒng)本發(fā)明用到的從個體收集分離的血樣的系統(tǒng)可以包含樣品容器(用于收集和容納血樣)以及白細胞單采管道系統(tǒng)。
術語“白細胞單采管道系統(tǒng)”在本文中用于定義在先章節(jié)中描述的管道系統(tǒng)。這種管道系統(tǒng)可以包含血液處理容器，在該容器中，白細胞受到分離裝置中的分離力(separation forces)的作用。
在與包含離心型分離裝置的白細胞單采裝置(見在先章節(jié))一起使用的管道系統(tǒng)中，血液處理容器可以包含離心環(huán)(centrifuge loop)，當裝備在分離裝置的離心轉子中時，該離心環(huán)限定了使血液受到離心分離力作用的容器空間。
本發(fā)明使用的系統(tǒng)可以是封閉系統(tǒng)，功能性封閉系統(tǒng)，或開放系統(tǒng)。
本文中術語“封閉系統(tǒng)”，當應用于白細胞單采管道系統(tǒng)時，是指一種無菌且通過無菌屏障與外界環(huán)境隔離的管道系統(tǒng)，在其內部所有組件都充分集成(integral)、相互連接(attached)和/或在生產地點裝配好的(assembled atthe manufacturing site)。
本文中術語“功能性封閉系統(tǒng)”，當應用于白細胞單采管道系統(tǒng)時，是指一種在裝置生產地點裝配好的管道系統(tǒng)，它利用無菌屏障濾器(如0.22微米濾器)由最終用戶將其與無菌連接裝置進行連接。
本文中術語“開放系統(tǒng)”，當應用于白細胞單采管道系統(tǒng)時，是指僅有一部分在裝置生產地點裝配、然后由最終用戶按照自己需要完成裝配的管道系統(tǒng)。
優(yōu)選地，所述系統(tǒng)還包含一或多個(例如3個)白細胞收集容器。優(yōu)選3個或更多個收集容器，以便有足夠的樣品以供取舍并且也有利于用一式雙份/一式三份的樣品創(chuàng)建細胞庫。這允許更靈活的自體移植方案。
所述系統(tǒng)還可以方便地包含能容納獲取白細胞后剩余的血液的容器。這剩余的血液可能在其它治療方案中有用，例如在異源(allogenous)方案中有用。所述系統(tǒng)還可以包含針頭或插管(cannula)，用于將血樣從個體導入樣品容器。
各種容器都可以方便地采用柔性(flexible)透明袋形式。部分(或全部)管道也可以方便地采用柔性透明材料(例如，塑料)。
VIII.休眠的誘導任何合適的手段都可以用于誘導休眠。
根據一種優(yōu)選的深低溫保存方法，細胞優(yōu)選在-160℃以下凍存。一種特別優(yōu)選的休眠手段是，將細胞凍存到氦(He)的沸點，即約-269℃或更低。
根據Freshney的觀點(Freshney′s Tissue Culture of Animal Cells(Cultureof Animal CellsA Manual of Basic Technique，Wiley Liss，1994))，可以將細胞懸浮在合適的培養(yǎng)基(例如，包含最高濃度達10％的DMSO)中，以受控制的速率冷卻(例如，每分鐘1℃，直到-70℃，然后放入液/氣N2)。這種方便的法可以適用于將細胞冷卻在He/N2混合體或He中。其它實現(xiàn)和/或維持細胞休眠的方法包括冷卻到4℃。
IX.復蘇休眠之后，在用于移植之前將細胞復蘇。同樣地，這可以通過本領域已知的任何方便的方式，以及任何使細胞復蘇或復活的方法來實現(xiàn)。
方便地講，這可以通過，例如，將細胞解凍和/或稀釋來實現(xiàn)。復蘇技術是本領域已知的。細胞解凍可以如下操作將容納細胞的容器在37℃水浴中溫和振蕩，然后用諸如培養(yǎng)基或血清將DMSO稀釋到1％更低濃度。
細胞可以立刻植入或經過在培養(yǎng)基中恢復的階段后植入。復蘇過程是為重新建立使細胞在諸如預防或治愈性治療中的用途來設計的。
X.細胞建庫本發(fā)明的白細胞組合物可以建庫，從而產生白細胞庫。優(yōu)選地，所述組合物在使白細胞休眠(如上述)后建庫。
任何合適的細胞建庫系統(tǒng)都可以采用，只要其中的保存物可以復蘇用于自體移植。這意味著使用一些標記形式，但這并不必須是用每份保存物的物理附加物(physical appendage)的形式。
因此，本發(fā)明的白細胞庫可以包含多組細胞貯存單元以便貯存白細胞組合物。通常，這樣的細胞貯存是通過深低溫保存法來進行的，但也可以采用其它保存技術。本發(fā)明的細胞庫還可以包括數(shù)字信息單元，用于存儲與供血者個體的身份(identity)、所在地(location)和醫(yī)療史有關的數(shù)字信息，和/或與一份具體的保存物有關的情況(例如，從供血者個體采集血樣的日期，對該保存物中所含白細胞進行任何處理的處理條件和細節(jié))。
數(shù)字信息單元優(yōu)選包含至少一個數(shù)字計算機，它具有足夠的數(shù)字存儲能力，可以存儲可能的與每一份保存物有關的大量信息。
本發(fā)明的白細胞庫優(yōu)選還包含數(shù)字數(shù)據檢索(digital data retrieval)裝置(arrangement)，它與數(shù)字信息單元相接(interfaced with)，可以檢索存儲在數(shù)字信息單元中的指定信息。這種數(shù)據檢索裝置可以整合在數(shù)字計算機中。還可以提供通過電話或互聯(lián)網進行的數(shù)字信息遠程訪問，并且可以在全球范圍內快速且方便地訪問這些信息。
XI.醫(yī)學應用本發(fā)明可適用在所有希望施用(經處理或未經處理的)自體白細胞的治療和預防形式中(即，預期有治療前景)。
為了本發(fā)明的目的，在這些適用情況中，認為出現(xiàn)了白細胞缺陷。
因此，可以理解，本發(fā)明醫(yī)療應用中的白細胞缺陷(leukocyte deficiency)涵蓋多種疾病(disease)、綜合征(syndrome)、失調(disorder)、生理失調(condition)和感染。例如，可以理解，當個體罹患與白細胞功能失調有關的疾病、綜合征、失調、生理失調或感染時，以及當個體罹患內源白細胞成分表面看似乎正常、但正常的內源白細胞活性希望/需要改變、增大、或獲得刺激的那些疾病、綜合征、失調、生理失調或感染時，可以發(fā)生如上述特別廣義的白細胞缺陷。具體地說，本文所述白細胞缺陷可以視為T細胞和/或B細胞非特異性損失的結果，或者視為具體的T細胞克隆群和/或B細胞克隆群損失或缺陷的結果。
為方便起見，這些疾病、綜合征、失調、生理失調或感染在本文中統(tǒng)稱白細胞缺陷。
適用本發(fā)明的治療可以分為兩大類。一類是利用本發(fā)明的方法從健康個體供血者的血樣創(chuàng)建白細胞組合物(即形成白細胞庫的一部分)。在這種應用中，本發(fā)明被用于創(chuàng)建源自個體供血者的健康白細胞組織的細胞來源，只要該個體在以后發(fā)生白細胞缺陷時，可以將細胞返回該供血者個體。
在這種療法(本文稱恢復性自體移植)中，本發(fā)明利用了以下事實多種白細胞缺陷的發(fā)生是一系列暫時性事件(它們彼此有或沒有因果關系)的一部分，故而在發(fā)生白細胞缺陷之前的一個時間點創(chuàng)建白細胞庫，就構成了后來可以進行恢復性治療的一個治療源。
第二大類是利用本發(fā)明的方法從罹患白細胞缺陷的個體供血者的血樣創(chuàng)建白細胞組合物。然后在體外對白細胞組合物進行處理，將處理過的組合物再移植到該個體體內。對白細胞組合物進行的處理使這些白細胞組合物返回供血者體內后，可以緩解或消除白細胞缺陷。該方法的一個變換方法涉及在采血步驟之前在體內處理個體的白細胞，這些方法可以涉及在采血步驟之后在體外的進一步處理。
在這些治療(本文中稱治療性自體移植)中，本發(fā)明利用了以下事實多種白細胞缺陷可以通過對個體白細胞總群體中一小部分進行處理而克服。這類處理將在下文中詳述，包括基因修改，細胞擴增(cellular expansion)，選擇性消除具體細胞類型和用具體分子(如細胞因子)進行刺激。
上述恢復性自體移植的概念可以應用于所有個體，不管是否健康，也不管有沒有可被疑為白細胞缺陷指標的因素(例如年齡、醫(yī)療史、遺傳背景和生活方式)。但是，它確實允許鑒別一類特別適于應用本發(fā)明方法的具體群體，詳見第III節(jié)(題為“選擇供血者個體”)。而且，由于如上述定義并可以用本發(fā)明恢復性或治療性自體移植進行治療的白細胞缺陷包括廣泛多種已知疾病，因此，它們將在下面的第XII節(jié)(題為“實例說明”)中更詳細描述。
XII.實例說明(Exemplary indications)如前文中所述，本發(fā)明的治療性應用和預防性應用涉及廣泛多種疾病、綜合征、失調、生理失調和感染。
感染本發(fā)明可以用于治療各種感染。在這種情況中，內源性白細胞活性可以是正常的(或具有正常反應)，但是仍希望改變、增大或刺激它。在其它情況(如HIV感染)中，內源性白細胞活性因感染直接導致功能失調。
可以根據本發(fā)明進行治療或預防的感染包括，細菌性感染，真菌性感染或病毒性感染，或者由任何其它生物，例如原生動物，線蟲、昆蟲或其它寄生蟲引起的感染。
優(yōu)選的應用是治療由HIV感染導致的AIDS。在這種情況中，可以在個體健康或未受感染的時候收集其CD4+細胞并貯存，當該個體出現(xiàn)HIV感染或者當AIDS發(fā)病或CD4+細胞計數(shù)降低時，將貯存的細胞移植到該個體中。這種方法對于那些生活方式使之面臨HIV感染風險的個體具有吸引力。
癌癥、白血病和肉瘤本發(fā)明還可以用于治療和預防各種惡性病(malignancies)通常是指，任何惡性或惡性前兆(pre-malignant)，擴散或過度擴散(hyper-proliferative)生理失調或者任何由于機體細胞或組織中的功能失調(disturbance)或異?；蛘咂渌д{或異常所引起的疾病或與它們有關的疾病。
治療或預防各種形式的癌癥是本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，其包括治療或預防機體的任何癌性細胞或組織。
因此，本發(fā)明不限于任一種擴散性疾病(例如，白血病、淋巴瘤、癌(carcinomas)或肉瘤)，也不限于具體的癌基因或腫瘤抑制基因表位如前列腺特異性抗原1或前列腺特異性抗原2，her-2/new，ras，myc，myb，fos，fas，視網膜母細胞瘤，p53等，或以HLAI類抗原限制性方式或其它類似方式呈遞、從而能被白細胞識別的其它腫瘤細胞標志表位。所有癌癥，如白血病，淋巴瘤，乳腺癌，胃癌，結腸癌，直腸癌，肺癌，肝癌，子宮癌，睪丸癌，卵巢癌，前列腺癌和腦腫瘤如神經膠質瘤、星形細胞瘤和神經母細胞瘤，肉瘤如橫紋肌肉瘤和纖維肉瘤，都可以用本發(fā)明進行治療或預防。
因此，本發(fā)明可以用于治療或預防乳腺癌、結腸癌、肺癌和前列腺癌。本發(fā)明還可以用于治療或預防血液系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)的癌癥(包括何杰金氏病(Hodgkin′s Disease)、白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、Waldenstrm氏病)，皮膚癌癥(包括惡性黑素瘤)，消化道癌癥(包括頭頸部癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、結直腸癌、肛門癌)，泌尿生殖道癌癥(包括腎癌、膀胱癌、睪丸癌、前列腺癌)，女性的癌癥(包括乳腺癌、卵巢癌、婦科癌癥和絨膜癌)以及腦、骨中的類癌，鼻咽癌，腹膜后腔(retroperitoneal)腫瘤，甲狀腺腫瘤，和軟組織腫瘤。本發(fā)明還可以用于治療或預防未知的原發(fā)部位的癌癥。
XIII.劑量學(Posology)本領域技術人員很容易確定本發(fā)明醫(yī)學應用中進行自體移植的白細胞組合物用量。要注意，只要0.01×108(例如，1-10×108)成熟淋巴細胞(可以從單一一份約100ml的正常人血液樣品中獲得)就足以增強(boost)受試者的免疫系統(tǒng)，并因此具有本發(fā)明自體移植方法的有益效果。要注意，僅在英國，每年從供血者采集到超過3百萬單位的血，從中取出一個單位的血用于同種異體移植是很平常的。
所施用的白細胞組合物可以來自單一一份血樣，或者可以是將同一供血者個體在不同時間點采集的多份不同血樣混合而成的白細胞組合物混合群(pool)。所施用的白細胞組合物可以是保存物的全部或一部分，優(yōu)選是其一部分，以便可以多次(multiple dosing)施用，也可以選擇在將剩余的細胞進行擴增后再施用(例如，T細胞數(shù)可以用標準方法體外擴增)。
在基于T細胞活性的應用中，成熟T細胞用量是至少0.01×108，更優(yōu)選至少0.1×108，更優(yōu)選至少1×108(如至少1-10×108)。優(yōu)選的范圍是0.01×108-1010成熟T淋巴細胞，如0.1×108-1010，1×108-1010或1×109-1010成熟T淋巴細胞。
因此，自體移植所需的成熟T細胞樣品是至少0.01×108，通常在108-1010CD3+成熟T細胞的范圍，優(yōu)選2×108-1010，更優(yōu)選3×108-1010CD3+，還更優(yōu)選4-5×108-1010CD3+成熟T細胞。
方便地，每份用于自體移植的樣品包含3×108CD3+成熟T細胞，更優(yōu)選5×108，還更優(yōu)選1×109CD3+成熟T細胞。當個體能提供充足的血液來源時，還更優(yōu)選使用4-5×109CD3+成熟T細胞或1010CD3+成熟T細胞。
優(yōu)選地，自體移植所需CD3+和CD8+成熟T細胞亞群的樣品是至少0.01×108，通常在0.25×108-0.25×1010的范圍，更優(yōu)選0.5×108-0.25×1010，還更優(yōu)選0.75×108-0.25×1010，還更優(yōu)選0.75×108-0.25×1010或1.00-1.25×108-0.25×1010。方便地，用于移植的每份樣品中CD3+和CD8+的細胞數(shù)是0.2×108的水平，優(yōu)選0.4×108，或更優(yōu)選1×108，或還更優(yōu)選2×108，或更優(yōu)選3×108，或更優(yōu)選5×108。當個體能提供充足的血液來源時，可以使用1×109，優(yōu)選2×109，4×109，或更優(yōu)選1×1010CD3+和CD8+細胞。
優(yōu)選地，自體移植所需CD3+和CD4+成熟T細胞亞群的樣品是至少0.01×108，通常在0.1×108-0.5×1010的范圍，更優(yōu)選0.65×108-0.5×1010，還更優(yōu)選0.85×108-0.5×1010，還更優(yōu)選1×108-0.5×1010或1.8-3.6×108-0.5×1010。方便地，用于移植的每份樣品中CD3+和CD4+的細胞數(shù)是0.2×1010的水平，優(yōu)選0.3×108，或更優(yōu)選0.4×108，0.5×108，1×108，2×108，3×108，4×108，或更優(yōu)選5×108。當個體能提供充足的血液來源時，可以使用1×109，或更優(yōu)選2×109，或更優(yōu)選1×1010CD3+和CD4+細胞。
優(yōu)選地，自體移植所需CD3+和CD16/56+成熟T細胞自然殺傷細胞亞群的樣品是至少0.01×108，通常在0.01×108-0.5×1010的范圍，優(yōu)選0.02×108-0.5×1010，更優(yōu)選0.03×108-0.5×1010，還更優(yōu)選0.5×108-0.5×1010或0.5-2×108-0.5×1010。方便地，用于移植的每份樣品中CD3+和CD16/56+的細胞數(shù)是0.01×108，0.2×108，0.3×108，0.5×108，1×108，2×108，3×108，5×108的水平，或更優(yōu)選，當個體能提供充足的血液來源時，可以使用1×109，或更優(yōu)選2×109，或更優(yōu)選1×1010CD3+和CD16/56+細胞。
此外，成熟淋巴細胞樣品優(yōu)選包括B細胞，如CD19+B淋巴細胞。包括在T細胞樣品中的成熟B細胞樣品可以是至少107，108或109，通常在107-1010成熟B細胞的水平，優(yōu)選2×107-1010成熟B細胞，更優(yōu)選3×107-1010成熟B細胞，還更優(yōu)選4-5×107-1010成熟B細胞。
方便地，自體移植物中B細胞的具體數(shù)目在3×107的水平，優(yōu)選5×108，更優(yōu)選1×109成熟B細胞，還更優(yōu)選4-5×109或1010成熟B細胞。
此外，淋巴細胞樣品可以優(yōu)選包括樹突細胞。樹突細胞樣品可以是至少107，108或109的數(shù)量，通常在107-1010樹突細胞的范圍，優(yōu)選2×107-1010細胞，更優(yōu)選3×107-1010細胞，還更優(yōu)選4-5×107-1010細胞。
自體移植物中樹突細胞的具體數(shù)目在3×107的水平，優(yōu)選5×108，更優(yōu)選1×108，還更優(yōu)選4-5×109或1010成熟B細胞。
XIV.等效方案上文中詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，它們因此被視為對本發(fā)明各個方面的舉例說明而非限制。本領域技術人員了解或者可以認識到，利用常規(guī)實驗，可以獲得本文所述具體實施方案的多種等效方案(equivalent)，改良方案(modification)或變化方案(variation)。這些等效方案，改良方案或變化方案都包括在權利要求所述的發(fā)明范圍內。
權利要求
1.制備用于自體移植的白細胞組合物的方法，包括以下步驟(a)提供來自供血者個體的分離的血樣；(b)用白細胞單采裝置從該血樣中選擇性分離并收集白細胞。
2.權利要求1的方法，其中所述白細胞單采裝置是自動白細胞單采裝置。
3.權利要求1或2的方法，其中所述白細胞單采裝置包含封閉系統(tǒng)或功能性封閉系統(tǒng)。
4.權利要求2或3的方法，其中所述白細胞單采裝置是連續(xù)的或間斷的流體離心式白細胞單采裝置，或者是連續(xù)的或間斷的流體過濾式白細胞單采裝置。
5.在先任一權利要求的方法，其中所述自細胞單采裝置包含(a)分離裝置(例如，離心轉子或濾器)；(b)白細胞單采管道裝置；以及(c)一或多個泵，所述泵用于將樣品運輸通過所述管道裝置和將分離的白細胞運輸至采集容器。
6.在先任一權利要求的方法，所述方法用于制備恢復性自體移植所用的白細胞組合物，該方法還包括以下步驟(c)使收集到的白細胞休眠(例如，通過深低溫保存使之休眠)；和，可選地(d)使休眠的白細胞復蘇(例如，通過解凍和/或稀釋使之復蘇)。
7.權利要求1-5中之任一方法，所述方法用于制備治療性自體移植所用的白細胞組合物，該方法還包括以下步驟(c)處理所收集到的白細胞；和，可選地(d)使經過處理的白細胞休眠(例如，通過深低溫保存使之休眠)。
8.權利要求7的方法，還包括以下步驟(e)使經過處理且已休眠的白細胞復蘇(例如，通過解凍和/或稀釋使之復蘇)。
9.權利要求6的方法，所述方法用于制備白細胞庫，其中將所述方法重復應用于來自不同供血者個體的一系列血樣，從而制備多份休眠(例如深低溫保存)的白細胞組合物，所述方法還包括，將休眠的白細胞以可以復蘇的方式保存、以備日后自體移植的步驟。
10.一種用于從個體收集分離的血樣的系統(tǒng)(例如，封閉系統(tǒng)或功能性封閉系統(tǒng))，所述系統(tǒng)包含(a)采樣裝置(例如，包含針頭)，以用于從所述個體收集血樣；(b)樣品容器，其與所述采樣裝置之間有流體聯(lián)通；(c)白細胞單采管道系統(tǒng)，其與所述樣品容器之間有流體聯(lián)通，其中所述管道系統(tǒng)是盲端，它不包含用于將經過分級分離的樣品的任何一部分引回所述個體中的裝置。
11.權利要求10的系統(tǒng)，其中所述管道系統(tǒng)包含一或多個(例如3個)白細胞收集容器。
12.權利要求10或11的系統(tǒng)，其中所述管道系統(tǒng)還包含血液處理容器(例如，離心環(huán))。
13.權利要求6-8中之任一系統(tǒng)，其中所述管道系統(tǒng)還包含用于容納獲取白細胞以后剩余的血液的容器。
14.權利要求10-13中之任一系統(tǒng)，還包含用于將來自個體的血樣導入樣品容器的針。
15.用于從來自個體的分離的血樣中選擇性分離和取出白細胞的裝置，所述裝置包含帶有權利要求10-14中之任一收集系統(tǒng)的白細胞單采裝置。
16.權利要求15的裝置，其中所述白細胞單采裝置是權利要求2-5中之任一所述的裝置。
17.白細胞組合物，其可以(或已經)用權利要求1-9中之任一方法獲得。
18.白細胞庫，其可以(或已經)用權利要求9的方法獲得。
19.權利要求17的白細胞組合物，是在治療或預防中應用的白細胞組合物。
20.權利要求17的白細胞組合物在制備用于自體移植(例如，CAT療法，或者恢復性或治療性自體移植)的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的白細胞單采形式(分離的白細胞單采)，實施分離的白細胞單采的方法和裝置，由此產生的白細胞庫以及基于它們進行的各種形式的治療。
文檔編號A61B5/155GK1761475SQ200480007085
公開日2006年4月19日 申請日期2004年6月17日 優(yōu)先權日2003年6月21日
發(fā)明者威廉·A·施皮爾斯 申請人:英國生命力集團公司