一種利用SUMO系統(tǒng)表達HMGB1 A-box蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用SUMO系統(tǒng)表達HMGB1A-box蛋白的方法，包括以下步驟：以包含HMGB1的質粒為模板，設計引物擴增A-Box結構域，將擴增后的目的基因A-Box亞克隆進pSumo-Mut表達載體的StuI和HindIII之間，獲得pSumo-Mut-A-Box質粒；使用重組質粒轉化ArcticExpressTM(DE3)原核宿主菌，使用IPTG誘導表達目的蛋白；sumo蛋白酶酶解，獲得高純度的A-Box蛋白。本發(fā)明優(yōu)點在于：應用SUMO表達系統(tǒng)高效穩(wěn)定、可溶性地表達了HMGB1A-box融合蛋白，經過SUMO蛋白酶I切割后可以獲得純度較高的成熟蛋白，且無氨基酸殘基殘留。
【專利說明】-種利用SUMO系統(tǒng)表達HMGB1 A-box蛋白的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白質工程領域，具體地說，是一種利用SUM0系統(tǒng)高效可溶性表達 HMGB1 A-box蛋白的技術。

【背景技術】
[0002] HMGB1 A-box的生產目前主要利用蛋白質工程技術和融合技術。
[0003] 1.利用蛋白質工程技術，使用大腸桿菌作為以重組技術工業(yè)生產蛋白質的優(yōu)選宿 主細胞生產HMGB1 A-box。盡管大腸桿菌表達系統(tǒng)具有表達量高、易于培養(yǎng)和操作以及生 產成本低等優(yōu)點，但是，使用該表達系統(tǒng)仍難以直接獲得大量可溶性的HMGB1 A-box，其原 因在于HMGB1 A-box分子量小，極容易形成"包涵體"，即無生物學活性的不溶性聚合體。此 夕卜，即使獲得大量的包涵體，為了得到有生物學活性的蛋白，還必須對包涵體進行變性一復 性處理，這個過程往往損失大量的蛋白。
[0004] 2.采用傳統(tǒng)的融合技術，將HMGB1 A-box基因與具有協助蛋白質正確折疊的融合 蛋白如谷胱甘肽硫轉移酶（GST)等進行融合表達。盡管蛋白的可溶性及收率有所提高，但 是，耗時、昂貴的蛋白酶費用以及存在的蛋白酶水解靶蛋白的風險，常常不能獲得令人滿意 的 HMGB1 A-box 產量。
[0005] 但是關于利用SUM0系統(tǒng)高效可溶性表達HMGB1 A-box蛋白的技術目前還未見報 道。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種用SUM0系統(tǒng)表達HMGB1 A-box 蛋白的方法。
[0007] 為實現上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是：一種利用SUM0系統(tǒng)表達HMGB1 A-box 蛋白的方法，包括以下步驟： a、 以包含HMGB1的質粒為模板，設計引物擴增A-Box結構域，將擴增后的目的基因 A-Box亞克隆進pSumo-Mut表達載體的Stu I和Hind III之間，目標基因 N端融合了 Sumo 標簽蛋白，獲得pSumo-Mut-A-Box質粒； b、 使用重組質粒轉化ArcticExpress? (DE3)原核宿主菌，使用IPTG誘導表達目的蛋 白，將誘導條件調整至11度，通過Ni親和純化獲得sumo-A-Box融合蛋白； c、 再通過sumo蛋白酶酶解，將sumo融合蛋白與A-Box分離，再進行Ni柱親和純化，去 除殘留的Sumo-A-Box融合蛋白、Sumo融合標簽以及sumo蛋白酶，最終獲得高純度的A-Box 蛋白。
[0008] 所述的步驟a中擴增A-Box結構域的引物序列為SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2。
[0009] 所述的步驟a中獲得的pSumo-Mut-A-Box序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0010] 本發(fā)明優(yōu)點在于： 1、通過在表達載體中引入SUM0融合標簽，顯著提高了外源蛋白的可溶性表達水平，促 進其正確折疊，保證其生物學活性； 2、通過SUMO蛋白酶I對目標蛋白和融合標簽進行分離，并且由于融合標簽和蛋白酶都 具有組氨酸標記，在通過層析柱時兩者均可被吸附，達到一次洗脫目的蛋白的效果，不僅得 到的蛋白純度較高，而且大大節(jié)約了研究的時間和成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖 1. pSumo-Mut-A-Box 測序驗證序列。
[0012] 圖2. pSumo-Mut-A-Box質粒酶切驗證結果。
[0013] 圖 3. pSumo-Mut-A-Box 質粒構建圖譜。
[0014] 圖4.融合蛋白A-B0X-SUM0的電泳分析。Lane M:蛋白分子質量標準；Lane 1:未 誘導菌體；Lane 2，3: IPTG誘導后菌體。
[0015] 圖5. A-B0X-SUM0融合蛋白純化電泳分析。Lane M:蛋白分子質量標準；Lane 1: 0· 2mM IPTG、11°C誘導后沉淀液；Lane 2: 0· 2mM IPTG、11°C誘導后上清液；Lane 3:流出液； Lane 4:洗脫液；Note:紅色箭頭指示目標蛋白。
[0016] 圖6. Ni柱親和純化A-B0X-SUM0蛋白電泳分析。Lane M:蛋白分子質量標準；Lane 1: sumo融合蛋白；Lane 2:酶解混合物；Lane 3:流出液：目標蛋白；Lane 4:洗脫液：sumo 標簽。

【具體實施方式】
[0017] 下面結合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0018] 實施例1 一、實驗設計 以包含HMGB1的質粒為模板，設計引物擴增A-Box結構域，將擴增后的目的基因 A-Box 亞克隆進pSumo-Mut表達載體的Stu I和Hind III之間，目標基因 N端融合了 Sumo標簽蛋 白，獲得pSumo-Mut-A-Box質粒。使用重組質粒轉化ArcticExpress? (DE3)原核宿主菌， 使用IPTG誘導表達目的蛋白。優(yōu)化表達條件，將誘導條件調整至11度，經檢測sumo-A-Box 融合蛋白分布于上清，通過Ni親和純化獲得sumo-A-Box融合蛋白，再通過sumo蛋白酶酶 解，將sumo融合蛋白與A-Box分離，再進行Ni柱親和純化，去除殘留的Sumo-A-Box融合蛋 白、Sumo融合標簽以及sumo蛋白酶，最終獲得高純度的A-Box蛋白。
[0019] 二、試劑和耗材 pSumo-Mut質粒(諾百生物改造構建)， DH5a菌株(諾百生物保種)， ArcticExpress? (DE3)(購自安捷倫公司，諾百實驗室保種)， Protein Marker (諾百生物自制）， Sumo蛋白酶（諾百生物)， IPTG、Acr、Bis、Tris (購自 Sigma 公司）， SDS (購自 Amresco 公司）， TEMED (購自 BI0-RAD 公司）， Tyrptone、Yeast Extract (購自 0X0ID 公司）， PCR反應管（購自Fisher公司）， 0· 22 μ m無菌濾器和透析袋（購自Millipore公司）， Ni2+IDA親和層析膠購買于Novagen公司， Agarose (購自上?；蚬荆?DNA膠純化試劑盒、質粒小提試劑盒（購自AXYGEN公司）， 其它試劑均為國產分析純。
[0020] 三、主要實驗儀器 Allegra 21R臺式高速冷凍離心機（美國BECKMAN公司）， 臺式高速離心機（德國S0RVAL公司）， Biologic LP層析系統(tǒng)、Mini Protean II垂直平板電泳系統(tǒng)、Gel Doc2000成像系統(tǒng)、水 平電泳系統(tǒng)（美國BI0-RAD公司）， PTC-200基因擴增儀（美國MJ Research公司）， 320-S pH 計（美國 Mettler Toledo 公司）， AR5120電子天平（美國AHOM S公司）， MultiTemp III 恒溫水浴鍋、Hofer MV-25 紫外透射儀（美國 Amersham Pharmacia 公 司）， 雪花狀制冰機（日本SANYO公司）， JY92-2D超聲波細胞粉碎機（中國新芝科器研究所）， 超凈工作臺（中國蘇凈集團）， NAN0DR0P2000 (Thermo 公司）。
[0021] 四、實驗方法及結果 1、以HMGB1質粒為模板設計如下引物 F>5' GGAGGTATGGGCAAAGGAGATCCTAAGAAG 3'（SEQIDN0.1); R>5' AAGCTTTGTTTCCCCTTTAGGAGGGATATAG 3'（SEQIDN0.2)。擴增條件見下表 1。
[0022] 表 1

【權利要求】
1. 一種利用SUMO系統(tǒng)表達HMGB1 A-box蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟： a、 以包含HMGB1的質粒為模板，設計引物擴增A-Box結構域，將擴增后的目的基因 A-Box亞克隆進pSumo-Mut表達載體的Stu I和Hind III之間，目標基因 N端融合了 Sumo 標簽蛋白，獲得pSumo-Mut-A-Box質粒； b、 使用重組質粒轉化ArcticExpress? (DE3)原核宿主菌，使用IPTG誘導表達目的蛋 白，將誘導條件調整至11度，通過Ni親和純化獲得sumo-A-Box融合蛋白； 再通過sumo蛋白酶酶解，將sumo融合蛋白與A-Box分離，再進行Ni柱親和純化，去除 殘留的Sumo-A-Box融合蛋白、Sumo融合標簽以及sumo蛋白酶，最終獲得高純度的A-Box蛋 白。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟a中擴增A-Box結構域的引物 序列為 SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步驟a中獲得的pSumo-Mut-A-Box 序列如SEQ ID NO. 3所示。
【文檔編號】C12N15/70GK104046646SQ201410271256
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權日:2014年6月18日
【發(fā)明者】葛文松, 陳穎偉, 范建高 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院