一種微生物發(fā)酵產(chǎn)苯丙氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高效、安全的微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。通過硫酸銨濃度和有機(jī)氮源種類優(yōu)化，以及多階段L-酪氨酸指數(shù)補(bǔ)料方法，顯著提高發(fā)酵液中L-苯丙氨酸的濃度。L-苯丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到56g/L左右。同時(shí)，硫酸銨、酵母粉和L-酪氨酸用量較普通發(fā)酵方法相比明顯減少，大大降低了L-苯丙氨酸的生產(chǎn)成本。
【專利說(shuō)明】一種微生物發(fā)酵產(chǎn)苯丙氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種發(fā)酵制備L-苯丙氨酸的新方法，具體是對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸的過程，進(jìn)行了氮源的優(yōu)化以及多階段指數(shù)L-酪氨酸補(bǔ)料策略的提出。
【背景技術(shù)】
[0002]L-苯丙氨酸，又稱L-苯基丙氨酸，是人體必需的但無(wú)法自行合成的八種必需氨基酸之一，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療藥品、化妝品、食品及其添加劑領(lǐng)域，特別的，作為合成甜味劑阿斯巴甜的原料之一。L-苯丙氨酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是化學(xué)合成法和酶法，但是化學(xué)合成法具有環(huán)境污染、產(chǎn)物大多是消旋體，后續(xù)加工工藝復(fù)雜；酶法具有原料昂貴等缺點(diǎn)?？紤]到環(huán)境和生產(chǎn)成本問題，最經(jīng)濟(jì)的同樣也是被人們廣泛使用的是微生物發(fā)酵法。
[0003]L-苯丙氨酸的生產(chǎn)菌株，大多數(shù)是L-酪氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的。發(fā)酵過程中過量添加L-酪氨酸，則會(huì)造成細(xì)胞的大量生長(zhǎng)，從而使得更少的碳流流向L-苯丙氨酸的合成；添加的L-酪氨酸過少，則會(huì)引起細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢甚至過少，從而沒有足夠的菌體產(chǎn)生更多的L-苯丙氨酸。目前，L-酪氨酸補(bǔ)料有進(jìn)行恒定速度流加，有根據(jù)L-酪氨酸消耗速率流加，有根據(jù)發(fā)酵過程的OUR的相關(guān)公式流加，也有L-酪氨酸指數(shù)補(bǔ)料的。中國(guó)專利CN102212569A公開了一種提高L-苯丙氨酸生產(chǎn)強(qiáng)度的L-酪氨酸流加的方法。在初始培養(yǎng)基中L-酪氨酸消耗完畢后，其以25mg/h-100m g/h恒速流加至發(fā)酵結(jié)束。由此，本發(fā)明提出了多階段指數(shù)流加L-酪氨酸的策略，從而達(dá)到提高L-苯丙氨酸，降低生物制備L-苯丙氨酸的生產(chǎn)成本，提聞經(jīng)濟(jì)效益的目的。
[0004]另外，發(fā)酵過程的氮源，不僅維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，而且在產(chǎn)L-苯丙氨酸的過程中起著重要的作用。由此，微生物發(fā)酵產(chǎn)L-苯丙氨酸過程中，進(jìn)行氮源的優(yōu)化，包括硫酸銨濃度和有機(jī)氮源種類的優(yōu)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸的方法，以達(dá)到產(chǎn)量提高，以及原料的減少。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0006]一種生產(chǎn)L-苯丙氨酸的發(fā)酵方法,包括菌種活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng),其特征在于，還包括多階段指數(shù)L-酪氨酸補(bǔ)料策略。
[0007]進(jìn)一步的，所述的方法還包括發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的優(yōu)化。
[0008]進(jìn)一步的，所述的發(fā)酵的菌株為大腸桿菌BL21 (pET/P-aspC)。
[0009]進(jìn)一步的，所述的多階段指數(shù)L-酪氨酸補(bǔ)料策略具體步驟如下:發(fā)酵12h后開始補(bǔ)加L-酪氨酸；12-32h維持菌體比生長(zhǎng)速率在0.08h-1 ;32_52h，維持菌體比生長(zhǎng)速率為0.05h-1 ；52-72h,維持菌體比生長(zhǎng)速率為0.02h'
[0010]進(jìn)一步的，初始L-酪氨酸濃度為0-2.4g/L，優(yōu)選的為0.3_lg/L。
[0011]進(jìn)一步的，所述的氮源優(yōu)化包括對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中硫酸銨濃度和有機(jī)氮源種類的優(yōu)化。
[0012]進(jìn)一步的，所述的硫酸銨的濃度為0_30g/L，優(yōu)選的在5g/L以下。
[0013]進(jìn)一步的，所述的有機(jī)氮氮源的優(yōu)化為單一有機(jī)氮源優(yōu)化，其種類及其濃度為酵母粉10g/L、玉米漿干粉11.5g/L、棉籽餅粉10g/L、豆餅浸粉7.9g/L、蛋白胨9.2g/L。
[0014]進(jìn)一步的，所述的有機(jī)氮氮源的優(yōu)化為復(fù)合有機(jī)氮源優(yōu)化，其種類及其濃度為酵母粉5g/L和玉米漿干粉5.75g/L，蛋白胨4.6g/L和玉米漿干粉5.75g/L，酵母粉5g/L和蛋白胨4.6g/L，優(yōu)選的，為酵母粉和玉米漿干粉復(fù)合有機(jī)氮源。
[0015]進(jìn)一步的，所述有機(jī)氮源的總氮量是相當(dāng)，并且復(fù)合有機(jī)氮源中兩個(gè)單一有機(jī)氮源是按其含氮量1:1添加
[0016]本發(fā)明的有益效果在于:
[0017]本發(fā)明通過對(duì)氮源的優(yōu)化設(shè)計(jì)，減少硫酸銨用量和利用一些廉價(jià)的有機(jī)氮源替代一些昂貴的有機(jī)氮源，同時(shí)通過多階段指數(shù)L-酪氨酸補(bǔ)料策略的提出減少了 L-酪氨酸的流加量，從而達(dá)到提高L-苯丙氨酸產(chǎn)量，降低生物制備L-苯丙氨酸的生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，有利于L-苯丙氨酸生物法的工業(yè)制備。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為不同濃度的硫酸銨條件下大腸桿菌BL21 (pET/P-aspC)發(fā)酵制備L-苯丙氨酸的趨勢(shì)圖圖2為不同種類的有機(jī)氮源條件下大腸桿菌BL21 (pET/P-aspC)發(fā)酵制備L-苯丙氨酸的趨勢(shì)圖(注:YE酵母粉，CSP玉米漿干粉，CP棉籽餅粉，SP豆餅浸粉，T蛋白胨，CSPYE酵母粉和玉米漿干粉，CSPT蛋白胨和玉米漿干粉，YET酵母粉和蛋白胨)。
[0019]圖3為不同初始酪氨酸條件下，大腸桿菌BL21 (pET/P-aspC)的不同比生長(zhǎng)速率對(duì)應(yīng)的比合成L-苯丙氨酸的合成速率的趨勢(shì)圖
[0020]圖4 (a)和(b)為大腸桿菌BL21 (pET/P-aspC)采用多階段指數(shù)L-酪氨酸補(bǔ)料策略，(a)是不同L-酪氨酸流加速率、設(shè)定的比生長(zhǎng)速率和真實(shí)的比生長(zhǎng)速率的時(shí)間趨勢(shì)，(b)細(xì)胞干重、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸濃度的時(shí)間趨勢(shì)。注:FtK為酪氨酸流加速度，μ為比生長(zhǎng)速率，Uset為設(shè)定的比生長(zhǎng)速率
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明，但對(duì)本發(fā)明沒有限制。
[0022]本實(shí)施例采用菌株為大腸桿菌BL21 (pET/P-aspC)，(宮長(zhǎng)斌等，過程工程學(xué)報(bào)，2007年第7卷第3期，254-258)。該出發(fā)菌株系 申請(qǐng)人:擁有的在先公開文獻(xiàn)公開的菌株，由 申請(qǐng)人:自行保藏， 申請(qǐng)人:在此聲明從本專利申請(qǐng)日起免費(fèi)發(fā)送該出發(fā)菌株。
[0023]實(shí)施例1本實(shí)施例說(shuō)明利用大腸桿菌BL21產(chǎn)L-苯丙氨酸的方法，由本實(shí)驗(yàn)室保存。(大腸桿菌BL21購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)
[0024]具體包括以下步驟:
[0025](I)菌種活化:斜面培養(yǎng)時(shí)，菌株在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行平板劃線后，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度30-40°C，活化培養(yǎng)時(shí)間l-2d，用于種子培養(yǎng)基接種和菌株保存；
[0026] (2)種子培養(yǎng):向500mL三角瓶中加入種子培養(yǎng)基50mL，高壓蒸汽121°C滅菌20min,冷卻后接入斜面培養(yǎng)基菌株，培養(yǎng)溫度30-40°C，搖床轉(zhuǎn)速培養(yǎng)時(shí)間l_2d ;[0027](3)發(fā)酵培養(yǎng):1L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積0.5-0.8L,接種量5% -10% (v/v)，溫度30-40°C，攪拌速度200-500rpm，通氣量是0.5-0.8vvm。發(fā)酵過程中通過添加氨水和2mol/L鹽酸控制pH在7.0左右，發(fā)酵時(shí)間72h。
[0028]所述斜面培養(yǎng)基/種子培養(yǎng)基配方為蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaC15g/L,pH7.0,固體培養(yǎng)基加瓊脂15g/L ；
[0029]所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖25g/L、(NH4)2S045g/L、KH2P043g/L、MgS043g/L、NaCllg/L、檸檬酸鈉 1.5g/L, CaCl2.2Η200.015g/L、FeSO4.7Η200.1125g/L、L-Tyr0.3g/L、酵母粉 10g/L、維生素 10.0758/1、TESL 5mL/L ;其中 TES 組成為:Al2 (SO4)3.18H202g/L、CoSO4.7H200.75g/L、CuSO4.5H200.25g/L、H3BO30.5g/L、MnSO4.7H2024g/L、Na2MoO4.2H203g/L、NiSO4.6H202.5g/L、ZnSO4.7H2015g/L ;當(dāng)葡萄糖耗完后，補(bǔ)加700g/L的葡萄糖，并控制葡萄糖濃度在5g/L左右；當(dāng)發(fā)酵12-18h后，以0.06g/h的速度進(jìn)行L-酪氨酸補(bǔ)料，
[0030]產(chǎn)L-苯丙氨酸含量在2.8g/L左右。
[0031]實(shí)施例2本實(shí)施例說(shuō)明大腸桿菌BL21 (pET/P-aspC)制備L-苯丙氨酸的優(yōu)化方法，主要涉及硫酸銨濃度的優(yōu)化
[0032]本實(shí)施例采用菌株為大腸桿菌BL21 (pET/P-aspC)，發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫酸銨濃度(g/L)分別為0、5、10、20、30，其他的培養(yǎng)和發(fā)酵方法與實(shí)施例1相同。
[0033]本實(shí)施例中，采用不同濃度的硫酸銨發(fā)酵制備L-苯丙氨酸，結(jié)果如圖1所示。硫酸銨含有菌體生長(zhǎng)和氨基酸生產(chǎn)所需的氮，但是銨根離子的過量供應(yīng)會(huì)導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)性抑制問題。有研究表明，超過3-5g/L的銨濃度往往會(huì)引起抑制作用。如圖1所示初始10g/L的硫酸銨就對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)L-苯丙氨酸起抑制作用。在產(chǎn)L-苯丙氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加硫酸銨的最優(yōu)濃度是0-5g/L，此時(shí)產(chǎn)L-苯丙氨酸含量在20g/L左右。
[0034]實(shí)施例3本實(shí)施例說(shuō)明大腸桿菌BL21 (pET/P-aspC)制備L-苯丙氨酸的優(yōu)化方法，主要涉及有機(jī)氮源種類的優(yōu)化
[0035]本實(shí)施例采用菌株為大腸桿菌BL21 (pET/P-aspC)，發(fā)酵培養(yǎng)基中的有機(jī)氮源的種類改變，其他的培養(yǎng)和發(fā)酵方法與實(shí)施例1相同。
[0036]上述的有機(jī)氮源分別為單一的有機(jī)氮源和復(fù)合的有機(jī)氮源，并且添加的有機(jī)氮源的總氮量是相當(dāng)；復(fù)合的有機(jī)氮源中兩個(gè)單一有機(jī)氮源是按其含氮量1:1添加的；單一的有機(jī)氮源的種類及其濃度為酵母粉10g/L、玉米漿干粉11.5g/L、棉籽餅粉10g/L、豆餅浸粉
7.9g/L、蛋白胨9.2g/L ;復(fù)合的有機(jī)氮源及其濃度為酵母粉5g/L和玉米漿干粉5.75g/L，蛋白胨4.6g/L和玉米漿干粉5.75g/L，酵母粉5g/L和蛋白胨4.6g/L。
[0037]本實(shí)施例中，采用不同種類的有機(jī)氮源發(fā)酵制備L-苯丙氨酸，結(jié)果如圖2所示。有機(jī)氮源中含有多種氨基酸、核酸、微量元素等，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和L-苯丙氨酸的發(fā)酵。如圖2所示，玉米漿和酵母粉混合氮源是最優(yōu)的有機(jī)氮源，對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)L-苯丙氨酸起著重要的作用，此時(shí)產(chǎn)L-苯丙氨酸達(dá)28.lg/L。
[0038]實(shí)施例4本實(shí)施例說(shuō)明大腸桿菌BL21 (pET/P-aspC)制備L-苯丙氨酸的優(yōu)化方法，主要涉及初始酪氨酸濃度的優(yōu)化
[0039]本實(shí)施例采用菌株為大腸桿菌BL21 (pET/P-aspC)，發(fā)酵培養(yǎng)基的初糖濃度和初始L-酪氨酸濃度改變以及不進(jìn)行葡萄糖和L-酪氨酸的補(bǔ)料，其他的培養(yǎng)和發(fā)酵方法與實(shí)施例I相同；初始L-酪氨酸的濃度分別為O, 0.3，I, 1.7，2.4g/L ；以及初糖濃度為65g/L。[0040]本實(shí)施例中，采用不同初始L-酪氨酸濃度發(fā)酵制備L-苯丙氨酸，結(jié)果如表1所示。采用在不同初始酪氨酸濃度條件下，不同比生長(zhǎng)速率對(duì)應(yīng)的比合成L-苯丙氨酸的合成速率的趨勢(shì)如圖3所示。如表1所示，隨著L-酪氨酸濃度的上升，L-苯丙氨酸含量緩慢上升，但是平均L-苯丙氨酸比合成速率是逐漸下降的，平均比生長(zhǎng)速率是逐步上升的，于是得出L-酪氨酸初始濃度在0.3左右最佳以及L-酪氨酸對(duì)酪氨酸缺陷型菌株起著重要的作用:L-酪氨酸添加過少，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)L-苯丙氨酸也不多，L-酪氨酸添加過多，細(xì)胞生長(zhǎng)過快，相對(duì)少的碳流向L-苯丙氨酸的合成。由圖3得出，在0.3、1、2.4g/L初始酪氨酸濃度下，得到其對(duì)應(yīng)的最大L-苯丙氨酸比合成速率；當(dāng)比生長(zhǎng)速率高于對(duì)應(yīng)最大L-苯丙氨酸比合成速率的比生長(zhǎng)速率，L-苯丙氨酸比合成速率隨著比生長(zhǎng)速率的減小而下降。這可能是當(dāng)比生長(zhǎng)速率降到特定的值，碳流可能逐漸的從細(xì)胞生長(zhǎng)流向L-苯丙氨酸的積累。又由圖3得出，當(dāng)比生長(zhǎng)速率低于0.0Sh-1,曲線的斜率代表L-苯丙氨酸對(duì)細(xì)胞的得率；這是個(gè)常數(shù)，并隨著L-酪氨酸濃度的上升而下降。由此得出，可以通過控制比生長(zhǎng)速率來(lái)控制L-苯丙氨酸比合成速率，而比生長(zhǎng)速率可以通過L-酪氨酸的補(bǔ)料來(lái)控制。
[0041]表1不同初始L-酪氨酸濃度發(fā)酵制備L-苯丙氨酸
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)L-苯丙氨酸的發(fā)酵方法,包括菌種活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng),其特征在于，還包括多階段指數(shù)L-酪氨酸補(bǔ)料策略。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的優(yōu)化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的方法，其特征在于，發(fā)酵的菌株為大腸桿菌BL21(pET/P-aspC)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多階段指數(shù)L-酪氨酸補(bǔ)料策略具體步驟如下:發(fā)酵12 h后開始補(bǔ)加L-酪氨酸；12-32 h維持菌體比生長(zhǎng)速率在0.08 ；32-52 h，維持菌體比生長(zhǎng)速率為0.05 ；52-72 h,維持菌體比生長(zhǎng)速率為0.02 h'
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，初始L-酪氨酸濃度為0-2.4 g/L，優(yōu)選的為 0.3-1 g/Lο
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的氮源優(yōu)化包括對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中硫酸銨濃度和有機(jī)氮源種類的優(yōu)化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的硫酸銨的濃度為0-30g/L，優(yōu)選的在5 g/L以下。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的有機(jī)氮氮源的優(yōu)化為單一有機(jī)氮源優(yōu)化，其種類及其濃度為酵母粉10g/L、玉米漿干粉11.5g/L、棉籽餅粉10g/L、豆餅浸粉7.9 g/L、蛋白胨 9.2g/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的有機(jī)氮氮源的優(yōu)化為復(fù)合有機(jī)氮源優(yōu)化，其種類及其濃度為酵母粉5g/L和玉米漿干粉5.75g/L，蛋白胨4.6g/L和玉米漿干粉5.75g/L，酵母粉5g/L和蛋白胨4.6g/L，優(yōu)選的，為酵母粉和玉米漿干粉復(fù)合有機(jī)氮源。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述有機(jī)氮源的總氮量是相當(dāng)，并且復(fù)合有機(jī)氮源中兩個(gè)單一有機(jī)氮源是按其含氮量1:1添加。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK104004798SQ201410277338
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】陳可泉, 袁佩佩, 何珣, 曹偉佳, 王震, 肖文, 趙艷, 歐陽(yáng)平凱 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)