一種生產(chǎn)高光學(xué)純度d-苯丙氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)高光學(xué)純度D-苯丙氨酸的方法，屬于酶學(xué)與酶工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用介孔材料MCM-41為載體固定苯丙氨酸脫氨酶，不對稱拆分DL-苯丙氨酸生產(chǎn)高光學(xué)純度的D-苯丙氨酸。通過構(gòu)建重組菌，高效表達(dá)，獲得大量的重組酶，將重組酶進(jìn)行固定化，制備高穩(wěn)定性的酶催化劑，搭建填充床反應(yīng)器，半連續(xù)生產(chǎn)D-苯丙氨酸。采用本方法可以獲得高純度的D-苯丙氨酸，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。
【專利說明】一種生產(chǎn)高光學(xué)純度D-苯丙氨酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)高光學(xué)純度D-苯丙氨酸的方法，尤其是一種利用重組苯丙 氨酸脫氨酶不對稱拆分DL-苯丙氨酸生產(chǎn)高光學(xué)純度D-苯丙氨酸的方法，屬于酶學(xué)與酶工 程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] D-苯丙氨酸廣泛應(yīng)用于制藥工業(yè)，如用于生產(chǎn)治療2型糖尿病"那格列奈的"。 D-苯丙氨酸的生產(chǎn)主要是化學(xué)合成，由于化學(xué)合成路線復(fù)雜，反應(yīng)步驟多，副產(chǎn)物多，導(dǎo)致 生產(chǎn)成本高昂。酶學(xué)方法由于其專一性高，副產(chǎn)物少，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，是一種 綠色生產(chǎn)工藝。工業(yè)上采用轉(zhuǎn)氨酶不對稱轉(zhuǎn)化對消旋的DL-苯丙氨酸中的L-苯丙氨酸，生 成α-酮酸，提純獲得D-苯丙氨酸。由于轉(zhuǎn)氨酶催化需要輔因子NADH，在催化過程中，輔 因子需要多批次添加以維持酶的活性，而且轉(zhuǎn)氨酶的穩(wěn)定性差，半衰期短，生產(chǎn)過程控制復(fù) 雜，導(dǎo)致D-苯丙氨酸生產(chǎn)的成本高。為此，需要尋找新的不對稱轉(zhuǎn)化DL-苯丙氨酸的新方 法。苯丙氨酸脫氨酶能立體選擇性催化L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化生成反式肉桂酸，肉桂酸的溶解度 較低，容易通過調(diào)節(jié)pH沉淀除去肉桂酸，從而獲得高純度的D-苯丙氨酸。
[0003] 本方法是通過構(gòu)建重組大腸桿菌，異源高效表達(dá)粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶，獲得 工業(yè)級應(yīng)用的酶，然后將酶固定化，構(gòu)建填充床酶反應(yīng)器，用于D-苯丙氨酸的生產(chǎn)。目前固 定化酶采用的載體有海藻酸鈉、殼聚糖、樹脂等材料，這些固定化材料由于機(jī)械強(qiáng)度低，高 度擴(kuò)散限制，固定化酶的重復(fù)利用次數(shù)低。
[0004] 本發(fā)明采用酵母來源的苯丙氨酸脫氨酶具有高活性、高穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，一步催化 獲得D-苯丙氨酸，生產(chǎn)過程與轉(zhuǎn)氨酶相比更加簡單。以介孔二氧化硅材料MCM-41作為固 定化材料，采用化學(xué)修飾，將氨基嫁接在MCM-41的表面上，提供酶固定化的錨定位點(diǎn)，與酶 進(jìn)行共價(jià)連接，提高酶的穩(wěn)定性、重復(fù)利用次數(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用固定化苯丙氨酸脫氨酶（PAL)生產(chǎn) D-苯丙氨酸的方法，主要是以DL-苯丙氨酸溶液為底物，將固定化苯丙氨酸脫氨酶填裝入 固定床得到固定床酶反應(yīng)器，催化L-苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸和氨，最終得到高光學(xué) 純的D-苯丙氨酸。
[0006] 所述固定床酶反應(yīng)器優(yōu)選將固定化酶與硅藻土混勻后填充玻璃柱得到。
[0007] 所述固定床酶反應(yīng)器進(jìn)一步優(yōu)選將100-200個(gè)酶活單位的固定化苯丙氨酸脫 氨酶（MCM-41-NH-GA-RgPAL)與100-120g的硅藻土充分混合，裝進(jìn)徑高比為5:1，體積為 450mL的玻璃柱中。所述固定化苯丙氨酸脫氨酶與娃藻土的用量分別優(yōu)選100U和100g。
[0008] 所述固定床酶反應(yīng)器的溫度優(yōu)選以循環(huán)夾套控制。
[0009] 所述固定化苯丙氨酸脫氨酶的獲得方法，主要包括以下步驟：（1)MCM-41載體的 修飾：以介孔二氧化硅MCM-41為載體，將氨基嫁接在MCM-41材料孔道中硅羥基上得到 MCM-41-NH2，提供共價(jià)固定的錨定位點(diǎn)；（2)制備MCM-41-NH-GA :取適量的載體MCM-41-NH2 與0. 5%戊二醛在室溫下反應(yīng)lh，然后用雙蒸水洗滌，盡可能洗去多余的戊二醛，室溫下干 燥，制備成MCM-41-NH-GA ; (3)固定化酶：lg MCM-41-NH-GA與含有50mg酶活為4. 2U/mg的 酶溶液進(jìn)行混合，在室溫下反應(yīng)2h，獲得共價(jià)固定化酶MCM-41-NH-GA-RgPAL。
[0010] 所述MCM-41載體的修飾優(yōu)選以下步驟：將lg MCM-41、50mL無水甲苯、2mL3-氨基 丙基三甲氧基硅烷180°C回流12h后用無水甲醇洗滌三次，真空干燥后備用，獲得修飾的載 體 MCM-41-NH2。
[0011] 所述制備MCM-41-NH-GA優(yōu)選以下步驟：取lg MCM-41-NH2載體與0. 5%戊二醛 (GA)在室溫下反應(yīng)lh，然后用雙蒸水洗滌三次，盡可能洗去多余的戊二醛，室溫下干燥，制 備成 MCM-41-NH-GA。
[0012] 所述固定化酶優(yōu)選以下步驟：取lg MCM-41-NH-GA與50mg的酶活性為3-5U/mg的 酶溶液（Tis-HIC緩沖液溶液，50mM，pH8. 5)進(jìn)行混合，在室溫下反應(yīng)2h，獲得共價(jià)固定化酶 MCM-41-NH-GA-RgPAL〇
[0013] 所述催化生產(chǎn)高光學(xué)純度D-苯丙氨酸的方法優(yōu)選以下步驟：以12mL/min的流速 往固定床酶反應(yīng)器中泵入100mM的DL-苯丙氨酸，溫度控制在50°C，當(dāng)L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化率 達(dá)到80%時(shí)，調(diào)整反應(yīng)液的pH至5,沉淀產(chǎn)物肉桂酸后再調(diào)整至初始pH8. 5,反應(yīng)液泵入反 應(yīng)器繼續(xù)反應(yīng)，直至光學(xué)純度超過99%時(shí)，反應(yīng)結(jié)束。
[0014] 所述苯丙氨酸脫氨酶（PAL)的獲得方法是將來源于紅粘酵母的苯丙氨酸脫氨酶 在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。
[0015] 所述苯丙氨酸脫氨酶的獲得方法優(yōu)選將核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的序列以 pET-28a(+)為表達(dá)載體，在E. coli BL21中進(jìn)行表達(dá)得到。
[0016] 所述苯丙氨酸脫氨酶的獲得方法還包括對酶進(jìn)行純化的步驟：（1)收集重組菌， 破碎菌體后，離心取上清，上清液中加入硫酸銨粉末，至飽和度為35%，緩慢攪拌使其完全 溶解；（2)調(diào)節(jié)pH值使酶液的pH保持在8. 7,靜置半小時(shí)后低溫離心收集上清液，繼續(xù)加 入硫酸銨至飽和度為55%，4°C靜置數(shù)小時(shí)后，低溫離心收集蛋白沉淀；（3)將沉淀溶解在 25mMTris-HCl pH8. 7的緩沖液中并且4°C透析數(shù)小時(shí)。
[0017] 本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)高光學(xué)純的D-苯丙氨酸的生產(chǎn)工藝，通過分離粘紅酵母 苯丙氨酸脫氨酶基因，構(gòu)建高效表達(dá)的大腸重組菌，大量表達(dá)重組酶。采用硫酸銨一步提 純重組酶，獲得工業(yè)純的苯丙氨酸脫氨酶，將其固定在介孔材料MCM-41上，制備固定化酶 催化劑，將制備的固定化酶填裝入固定床，搭建高效催化的固定床酶反應(yīng)器應(yīng)用于DL-苯 丙氨酸的拆分，生產(chǎn)高光學(xué)純的D-苯丙氨酸。固定化酶的最適反應(yīng)溫度為55°C，最適反應(yīng) pH為8. 5,重復(fù)催化反應(yīng)30次后，固定化酶的酶活僅損失15%。D-苯丙氨酸的產(chǎn)率達(dá)到 0. 32817^光學(xué)純度超過99%，與化學(xué)合成和轉(zhuǎn)氨酶催化相比，光學(xué)純度、產(chǎn)率更高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1 :重組酶的高效表達(dá)，M，蛋白marker ;1，空白對照；2,重組菌未添加誘導(dǎo)劑； 3,重組菌加入IPTG誘導(dǎo)
[0019] 圖2:固定化酶的流程圖
[0020] 圖3 :紅外光譜分析MCM-41氨基的嫁接；上方曲線：載體MCM-41 ;下方曲線：載體 MCM-41-NH2。
[0021] 圖4 :重復(fù)利用次數(shù)對固定化酶活性的影響
[0022] 圖5 :填充床反應(yīng)器
[0023] 圖6 :填充床拆分DL-苯丙氨酸生產(chǎn)D-苯丙氨酸的過程

【具體實(shí)施方式】
[0024] 肉桂酸測定方法：采用HPLC測定產(chǎn)物肉桂酸，色譜柱C18, 5μπι，250mmX4. 6mm ;流 動相為5%的甲醇；流速lmL/min ;檢測波長290nm ;柱溫為室溫。
[0025] 苯丙氨酸脫氨酶酶活定義：40°C，每分鐘轉(zhuǎn)化L-Phe生成1 μ mol反式肉桂酸所需 酶量為1U。
[0026] D-苯丙氨酸的光學(xué)純度（eeD)計(jì)算公式如下：
[0027] eeD = [ ([Dphe，Wt-Lphe，QUt]) ADphe，QUt+Lphe，QUt) ] X 100 % ;Lphe，in 表示泵入反應(yīng)器中底物 中L-苯丙氨酸的濃度（mM) ;Lphe;()Ut反應(yīng)過程中流出反應(yīng)器的產(chǎn)物中殘余的L-苯丙氨酸的 濃度（mM) ;Dph^ut是泵入反應(yīng)器中底物中D-苯丙氨酸的濃度。
[0028] 實(shí)施例1構(gòu)建高效表達(dá)粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶的工程菌；
[0029] 1、獲得粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶的基因序列（pal)
[0030] (1)裝有50mL培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中接入粘紅酵母，30°C培養(yǎng)18-20h至生長 對數(shù)期（〇D_ = 1. 0)，采用酸性酚提取總RNA
[0031] ⑵RNA的提取按照分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊（第三版）方法進(jìn)行；
[0032] (3)反轉(zhuǎn)錄克隆粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶（pal)的基因
[0033] 以引物 primer F :5，-GGAATTCCATATGATGGCCCCCTCCGTCGACTCGATC-3，；primer R : 5' -CGGAATTCCTAGTATGGTCTACGTCCAAAGG-3'，PCR 擴(kuò)增目的基因 ，PCR 的條件是：94°C預(yù)變性 4min，94°C變性lmin，58°C退火30sec，72°C延伸2min，25個(gè)循環(huán)，瓊脂糖凝膠電泳檢測。所 得苯丙氨酸脫氨酶的基因（pal)序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0034] 2、構(gòu)建克隆載體pUCm-T-pal
[0035] 0· 25mL離心管中加入 5μ L上述PCR產(chǎn)物，1 μ L lOXTaqbuffer，1 μ L dATP(2mM)， 1 μ L Taq酶（5U/ μ L)加水至10 μ L，70°C反應(yīng)30min采用磁珠法提純，10 μ L無菌水重懸。 取 5yL，加入 lyL連接buffer，lyL 50%PEG，lyL pUCm-T載體，lyL T4連接酶，加去 離子水至 10yL，于 16°C過夜連接。然后加入 10yL 5XKCM(0.5M KC1，0. 15Μ CaCl2,0.25M MgCl2)，去離子水30 μ L混勻后加入至50 μ L的E. coli JM109感受態(tài)中，冰浴30min，42°C熱 擊90sec，冰上2min，加入100μ L的新鮮LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)30-60min，取100μ L涂布含 有氨芐青霉素（50ug/mL)的LB平板，37°C培養(yǎng)10h，挑取單菌落，接入5mL含50ug/mL的氨 芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)10h，取2mL菌液，提質(zhì)粒，PCR驗(yàn)證構(gòu)建的pUCm-T-pal， 樣品進(jìn)行測序。
[0036] 3、構(gòu)建表達(dá)載體 pET_28a(+)_pal
[0037] Ndel和EcoRl分別對pUCm-T-pal和空載體pET_28a(+)進(jìn)行雙酶切，膠回收后于 16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化E. coli JM109,在含有卡那霉素抗性的LB平板挑陽性重組子，提取重 組質(zhì)粒并進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證，陽性克隆即pET-28a (+)-pal。
[0038] 實(shí)施例2苯丙氨酸脫氨酶的生產(chǎn)
[0039] 1、誘導(dǎo)表達(dá)
[0040] 取lyL pET-28a(+)-pal，轉(zhuǎn)入E.coli BL21，取100yL涂布含有卡那霉素（50ug/ mL)的LB平板，37°C培養(yǎng)10h，挑取單菌落至5mL的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)10h，取lmL培養(yǎng) 液至100mL的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至0D 6QQ為0. 6時(shí)加入至終濃度為0. 4mM的IPTG，26°C 誘導(dǎo)表達(dá)12h后離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE檢測和酶活性測定（圖1)。
[0041] 2、工業(yè)純酶的制備
[0042] 重組菌發(fā)酵液離心去上清后，菌體洗滌2次，菌體采用超聲波破碎，10000g離心 5min，取上清，上清液中加入硫酸銨粉末，至飽和度為35%，緩慢攪拌使其完全溶解。調(diào)節(jié) pH值，使酶液的pH保持在8. 7,靜置半小時(shí)后10000 X g低溫離心10min，收集上清液繼續(xù)加 入硫酸銨至飽和度為55%，4°C靜置數(shù)小時(shí)后，低溫離心收集蛋白沉淀。將沉淀溶解在25mM Tris-HCl pH8. 7的緩沖液中并且4°C透析數(shù)小時(shí)后檢測酶的活性，活性達(dá)到4. 2U/mg。
[0043] 實(shí)施例3固定化酶的制備
[0044] 1、載體的化學(xué)修飾
[0045] 以介孔二氧化硅MCM-41為載體，將氨基嫁接在MCM-41材料孔道中硅羥基上，提供 共價(jià)固定的錨定位點(diǎn)。具體地，將lg MCM-41、50mL無水甲苯、2mL 3-氨基丙基三甲氧基硅 烷180°C回流12h后用無水甲醇洗滌三次，真空干燥后備用。獲得修飾的載體MCM-41-NH 2， 采用紅外光譜進(jìn)行分析，確定氨基的嫁接（圖2, 3)，由圖3可知，氨基成功嫁接在介孔材料 MCM-41 上。
[0046] 2、固定化酶的制備
[0047] 取^的載體1--1-見12與0.5%戊二醛（64)在室溫下反應(yīng)111，然后用雙蒸水洗 滌三次，盡可能洗去多余的戊二醒，室溫下干燥，制備成MCM-41-NH-GA。取1 g MCM-41-NH-GA 與50mg的酶活性為4. 2U/mg的酶溶液（Tis-HIC緩沖液溶液，50mM，pH8. 5)進(jìn)行混合，在室 溫下反應(yīng)2h，獲得共價(jià)固定化酶MCM-41-NH-GA-RgPAL，流程如圖2所示。獲得的固定化酶 的活力達(dá)到4. 08U/mg。
[0048] 3、固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)
[0049] 取適量的固定化酶和游離酶分別加入至250 μ L Tris-HIC緩沖溶液（50Mm， pH8. 5)，然后加入250 μ L的40mM的L-苯丙氨酸溶液，于50°C反應(yīng)30min后，測定反式肉桂 酸的含量。酶單位的定義為：在50°C下每min形成1 μ mol的反式肉桂酸所需的酶為1個(gè) 單位。固定化PAL的酶活為游離酶的92%，酶活為4. 08U/mg。酶的最適反應(yīng)溫度為55°C， 最適反應(yīng)pH為8. 5,重復(fù)催化反應(yīng)30次后，固定化酶的酶活僅損失15% (圖4)，表面該方 法制備的酶穩(wěn)定好，能適應(yīng)工業(yè)化的應(yīng)用。
[0050] 實(shí)施例4固定化酶催化DL-苯丙氨酸產(chǎn)D-苯丙氨酸
[0051] 填充床酶反應(yīng)器的構(gòu)建：100個(gè)酶活單位的MCM-41-NH-GA-RgPAL與100g的硅藻 土充分混合，裝進(jìn)50cmX 25cm的玻璃柱中，反應(yīng)液從底部由蠕動泵泵入酶床，反應(yīng)液從柱 上部流出，反應(yīng)液循環(huán)進(jìn)出填充床反應(yīng)器，反應(yīng)器的溫度由循環(huán)夾套控制在50°C (圖5)。
[0052] 生產(chǎn)工藝：以12mL/min的流速往填充床酶反應(yīng)器中泵入lOOmM的DL-苯丙氨酸， 溫度控制在50°C，每隔4h取樣分析反應(yīng)液中D-苯丙氨酸的光學(xué)純度和L-苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化 率，當(dāng)L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到80%時(shí)，調(diào)整反應(yīng)液的pH至5,沉淀產(chǎn)物肉桂酸后再調(diào)整至 初始pH8. 5,反應(yīng)液泵入反應(yīng)器繼續(xù)反應(yīng)，直至光學(xué)純度（ee值）超過99 %時(shí)，反應(yīng)結(jié)束，反 應(yīng)過程中D-苯丙氨酸的光學(xué)純度變化圖6所示。
[0053] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種應(yīng)用固定化苯丙氨酸脫氨酶生產(chǎn)D-苯丙氨酸的方法，其特征在于，以DL-苯丙 氨酸溶液為底物，將固定化苯丙氨酸脫氨酶填裝入固定床得到固定床酶反應(yīng)器，催化L-苯 丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸，得到高光學(xué)純的D-苯丙氨酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定床酶反應(yīng)器是由固定化苯丙氨 酸脫氨酶與硅藻土混勻后填充玻璃柱得到。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述固定床酶反應(yīng)器是將100-200個(gè)酶活 單位的固定化苯丙氨酸脫氨酶與100 -120g的娃藻土充分混合，裝進(jìn)徑高比為5:1，體積為 450mL的玻璃柱中，固定床酶反應(yīng)器的溫度以循環(huán)夾套控制。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述固定化苯丙氨酸脫氨酶主 要通過以下步驟獲得：（1)MCM-41載體的修飾：以介孔二氧化硅MCM-41為載體，將氨基嫁 接在MCM-41材料孔道中硅羥基上得到MCM-41-NH 2，提供共價(jià)固定的錨定位點(diǎn)；（2)制備 1〇1-41-順-64:取適量的載體1〇1-41-順2與0.5%戊二醛在室溫下反應(yīng)111，然后用雙蒸 水洗滌，洗去多余的戊二醛，室溫下干燥，制備成MCM-41-NH-GA ;(3)固定化酶：取適量的 MCM-41-NH-GA與酶溶液進(jìn)行混合，在室溫下反應(yīng)2h，獲得共價(jià)固定化酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟⑴具體是將lg MCM-41、50mL 無水甲苯、2mL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷180°C回流12h后用無水甲醇洗滌三次，真空干燥 后獲得修飾的載體MCM-41-NH2 ;所述步驟（2)取lg MCM-41-NH2載體與0. 5%戊二醛在室溫 下反應(yīng)lh，然后用雙蒸水洗滌三次，洗去多余的戊二醛，室溫下干燥，制成MCM-41-NH-GA。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟（3)取lg MCM-41-NH-GA 與50mg的酶活性為3-5U/mg的酶溶液進(jìn)行混合，在室溫下反應(yīng)2h，獲得共價(jià)固定化酶 MCM-41-NH-GA-RgPAL〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述催化L-苯丙氨酸脫氨生成反 式肉桂酸包括以下步驟：以12mL/min的流速往固定床酶反應(yīng)器中泵入lOOmM的DL-苯丙氨 酸，溫度控制在50°C，當(dāng)流出的反應(yīng)液中L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到80%時(shí)，調(diào)整反應(yīng)液的pH 至5,沉淀產(chǎn)物肉桂酸后再調(diào)整至初始pH8. 5,將反應(yīng)液泵入反應(yīng)器繼續(xù)反應(yīng)，直至流出的 反應(yīng)液中D-苯丙氨酸的光學(xué)純度超過99%時(shí)，反應(yīng)結(jié)束。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述苯丙氨酸脫氨酶是將苯丙氨酸脫氨 酶在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)后獲得的。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，將SEQ ID NO. 1所示的基因以pET-28a(+) 為表達(dá)載體，在E.coli BL21中進(jìn)行表達(dá)得到苯丙氨酸脫氨酶。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，還包括對酶進(jìn)行純化：（1)收集重組菌， 破碎菌體后，離心取上清，上清液中加入硫酸銨粉末，至飽和度為35%，緩慢攪拌使其完全 溶解；（2)調(diào)節(jié)pH值使酶液的pH保持在8. 7,靜置半小時(shí)后低溫離心收集上清液，繼續(xù)加 入硫酸銨至飽和度為55%，4°C靜置數(shù)小時(shí)后，低溫離心收集蛋白沉淀；（3)將沉淀溶解在 25mM Tris-HCl pH8. 7的緩沖液中并且4°C透析數(shù)小時(shí)。
【文檔編號】C12P13/22GK104152523SQ201410364770
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】房月芹, 周哲敏, 朱龍寶, 肖克, 周麗, 崔文璟 申請人:江南大學(xué)