一種利用miRNA395k基因預報水稻白葉枯病的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用miRNA395k基因預報水稻白葉枯病的方法，屬于生物【技術(shù)領域】。所述方法包括以下步驟：選取待測水稻和對照水稻，選取的所述對照水稻為未感染白葉枯病但與待測水稻在相同條件下栽培的水稻；分別分離所述待測水稻和所述對照水稻中的總miRNA基因；分別檢測所述待測水稻和所述對照水稻中的總miRNA基因中的miRNA395k基因的表達量，所述miRNA395k基因的序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示；根據(jù)所述待測水稻和所述對照水稻中的miRNA395k基因的表達量，判斷實驗是否成功，若成功，進一步判定所述待測植株是否感染白葉枯病。本發(fā)明提供的預測方法獲得了成功，可以在水稻白葉枯病癥出現(xiàn)前數(shù)天實現(xiàn)準確預報，為早防早治贏得了時間，減少了白葉枯病對水稻造成的損失。
【專利說明】—種利用miRNA395k基因預報水稻白葉枯病的方法

【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領域】，特別涉及一種利用miRNA395k基因預報水稻白葉枯病的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]水稻是我國主要糧食作物，白葉枯病是水稻兩大主要病害之一，屬世界性病害，亞洲稻區(qū)發(fā)生尤重。白葉枯病發(fā)病率高、傳染快，發(fā)病稻田減產(chǎn)20-30%，甚至50%。與大部分病害一樣，白葉枯病發(fā)病早期防治效果較佳。發(fā)病中后期，病菌已大量繁殖，已對水稻造成了傷害，防治效果較差。由此可見，早期預報是水稻白葉枯病預防的關(guān)鍵所在。
[0003]傳統(tǒng)水稻白葉枯病預報主要依據(jù)氣候、天氣、品種抗性、氮肥施用情況、以及病害歷史等進行推測，也可依據(jù)田間水稻白葉枯病癥狀表現(xiàn)，對后期病情發(fā)展進行預報。
[0004]在實現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問題:
[0005]根據(jù)天氣、氣候、品種抗性、栽培現(xiàn)狀和歷史等進行的預報結(jié)果是很模糊的，可說明在一定區(qū)域與時間范圍內(nèi)病害發(fā)生的概率，但不能預報病害發(fā)生的具體時間與地點，預報結(jié)果的可應用性較差。例如，高溫高濕常作為水稻白葉枯病的流行預報的氣候條件，但不能確定高溫高濕下病害是否一定出現(xiàn)、在那塊田出現(xiàn)、在那天出現(xiàn)。由于以上的不確定性，農(nóng)民不能決定是否開始防治白葉枯、對哪塊田進行防治、以及何時防治。同時，病癥出現(xiàn)表明白葉枯病已進入中后期，病菌已大量繁殖，白葉枯病流行已難以避免，使得利用病癥調(diào)查進行預報的工作也無太大實際意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中水稻白葉枯病預報不及時、不準確的缺點，本發(fā)明實施例提供了一種利用miRNA395k基因預報水稻白葉枯病的方法。所述技術(shù)方案如下:
[0007]選取9311/Xa23水稻品種作為待測水稻和對照水稻；
[0008]栽培所述待測水稻和所述對照水稻；
[0009]分別分離所述待測水稻和所述對照水稻中的總miRNA基因；
[0010]分別檢測所述待測水稻和所述對照水稻中的所述總miRNA基因中的miRNA395k基因的表達量，所述miRNA395k基因的序列如序列表中SEQ ID N0:1所不；
[0011]根據(jù)所述待測水稻和所述對照水稻中的miRNA395k基因的表達量，判定實驗是否成功，若成功，則進一步判定所述待測植株是否感染白葉枯病。
[0012]具體地，所述栽培所述待測水稻和所述對照水稻時，所述對照水稻在栽培時采用保護性栽培措施并防治白葉枯病，除所述保護性栽培措施和防治白葉枯病外，所述對照水稻與所述待測水稻的栽培條件保持一致。
[0013]進一步地，所述保護性栽培措施包括對土壤隔離、水源隔離和空間隔離。
[0014]具體地，在上午8:55~9:05利用所述待測水稻和所述對照水稻的相同葉片的相同部位進行所述總miRNA基因的分離。
[0015]具體地，采用實時定量PCR方法，檢測所述miRNA395k基因在所述待測水稻和所述對照水稻中的表達量。
[0016]進一步地，所述實時定量PCR方法的前處理步驟包括:
[0017]利用分光光度計測定并獲得分離的所述總miRNA基因的濃度；
[0018]向所述總miRNA基因中加入外源參考miRNA基因，得到第一混合液，所述外源參考miRNA基因的加入量為所述總miRNA基因質(zhì)量的0.05 %，所述外源參考miRNA基因的序列如序列表中SEQ ID N0:2所示；
[0019]將所述總miRNA基因和所述外源參考miRNA基因的5’端與3’端連接，得到環(huán)化的所述總miRNA基因和環(huán)化的所述外源參考miRNA基因的混合液；
[0020]將所述環(huán)化的總miRNA基因和所述環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液進行逆轉(zhuǎn)錄，得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于進行所述實時定量PCR檢測。
[0021]進一步地，所述采用實時定量PCR方法，檢測所述miRNA395k基因在所述待測水稻和所述對照水稻中的表達量，包括:
[0022]將2μ I所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、3μ I濃度為ΙμΜ的引物、10μ I定量PCR混合物和
0.4 μ 150倍的ROX熒光校正染料混合均勻，得到第二混合液，將所述第二混合液在實時定量PCR儀中進行反應，所述反應程序為:50°C 2分鐘；95°C 10分鐘；95°C 45秒，56°C 45秒，66V 30秒，67°C 30秒，共45個循環(huán)，其中，66°C 30秒和67V 30秒這兩步在每循環(huán)一次后分別增加0.1°C和0.2°C，在每一次循環(huán)的最后一步收集熒光信號，所述熒光信號的強弱用于衡量所述表達量的多少；
[0023]所述引物包括:序列如序列表中SEQ ID NO:3所示的miRNA395k基因正向引物、序列如序列表中SEQ ID N0:4所示的miRNA395k基因反向引物、序列如序列表中SEQ ID N0:5所示的外源參考miRNA基因正向引物、以及序列如序列表中SEQ ID N0:6所示的外源參考miRNA基因反向引物。
[0024]進一步地，將所述總miRNA基因的5’端與3’端連接的步驟包括:
[0025]取5ng所述第一混合液、2 μ IlOX反應緩沖液、I μ 150mM的MnCl2、4 μ 15Μ的甜菜堿和1μ 15--/μ I的環(huán)化酶，用水補足20 μ I后混勻，得到第三混合液，將所述第三混合液于60°C保溫15分鐘后，80°C保溫10分鐘，使酶失活，得到所述環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液。
[0026]進一步地，將所述環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液體進行逆轉(zhuǎn)錄的步驟包括:
[0027]取所述環(huán)化的總miRNA基因和所述環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液2 μ 1、5μ1濃度為ΙμΜ的逆轉(zhuǎn)錄引物、2 μ I濃度為1mM的dNTP、5 μ I濃度為10mM的DTT和20U的逆轉(zhuǎn)錄酶，用水補足50 μ I混勻后，得到第四混合液，將所述第四混合液于42°C保溫2小時，75°C保溫15分鐘，使酶失活，得到所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；所述逆轉(zhuǎn)錄引物包括miRNA395k基因的逆轉(zhuǎn)錄引物和外源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物，所述miRNA395k基因的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如序列表中SEQ ID NO: 7所不,所述外源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。
[0028]具體地，所述判定實驗是否成功方法為:若所述對照水稻的miRNA395k基因的表達量最大值與表達量最小值的比值小于1.5，則實驗成功；若所述對照水稻的miRNA395k基因的表達量最大值與表達量最小值的大于等于1.5，則實驗不成功。
[0029]具體地，判定所述待測植株是否感染白葉枯病的方法為:若所述待測水稻的miRNA395k基因的表達量大于2倍所述對照水稻的miRNA395k基因的表達量，則所述待測水稻未感??；若所述待測水稻的miRNA395k基因的表達量小于或等于2倍的所述對照水稻的miRNA395k基因的表達量，則所述待測水稻感病。
[0030]本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是:本發(fā)明提供的一種利用miRNA395k基因預報水稻白葉枯病的方法，可將miRNA395k基因的表達變化可作為水稻感染白葉病菌的標志物，用以明確待測水稻是否染病，以及明確發(fā)病的時間與田塊，避免了傳統(tǒng)病害預報的模糊性。同時，本發(fā)明的預測時間早，可在水稻感染白葉枯病24小時內(nèi)作出預報。

【具體實施方式】
[0031]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施方式作進一步地詳細描述。本發(fā)明中未標注說明的試劑均為常用市售試劑，在大多數(shù)生物技術(shù)公司均可購買到且效果幾乎無差別。
[0032]實施例
[0033]本發(fā)明實施例將9311/Xa23水稻品種作為待測水稻和對照水稻，其中，待測水稻是指種植于大田正常栽培條件下，需要監(jiān)控是否感染白葉枯病的水稻；對照水稻是指通過保護性技術(shù)措施和白葉枯病防治措施，確保其為沒有感染白葉枯病的健康水稻，除保護性栽培措施和防治白葉枯病外，對照水稻與待測水稻的栽培條件保持一致，其中，保護性栽培措施包括土壤隔離、水源隔離和空間隔離。
[0034]種子的選取:待測水稻的種子和對照水稻的種子均收獲于健康的9311/Xa23水稻植株，并且種子表面無明顯病蟲害危害癥狀。其中，9311/Xa23水稻品種是通過回交育種的方法將Xa23基因轉(zhuǎn)入9311后獲得的水稻品種，具體制備過程為:利用含有Xa23基因的供體親本CBB23與受體親本9311雜交得到Fl代植株；利用9311為輪回親本，與得到的Fl代植株回交，獲得BC1F1群體；對BC1F1群體接種白葉枯菌，鑒定其抗病性，從BC1F1群體中選出抗白葉枯病且與9311最為相似的單株，與9311雜交，獲得BC2F1群體；再對BC2F1群體接種白葉枯菌，鑒定其抗病性，從BC2F1群體中選出抗白葉枯病且與9311最為相似的單株，與9311雜交，獲得BC3F1群體；如此循環(huán)，直至獲得BC6F1群體，再對BC6F1群體接種白葉枯菌，鑒定其抗病性，從BC6F1群體中選出抗白葉枯病且與9311最為相似的單株自交，從每個自交的單株上收獲種子，獲得SI群體；對SI群體接種白葉枯菌，鑒定其抗病性，篩選出抗性不分離的SI群體(即群體內(nèi)每個單株都抗白葉枯病)且與9311最為相似的單株，即為培育成功的9311/Xa23品種。
[0035]種子的前處理、播種與栽培條件:對照種子與待測種子均用濃度為70%的酒精浸泡2分鐘，再用去離子水洗2次，在30°C的水中浸泡過夜，在30°C的溫度下對種子進行催芽，種子出芽后播種。
[0036]從待測水稻生長的田塊中取土壤，利用滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠生產(chǎn)，型號為YSQ-LS-50S11)對土壤進行高溫高壓消毒滅菌，消毒滅菌條件為:120°C，30分鐘。消毒后的土壤作為對照水稻的種植土壤。將對照水稻在隔離條件下播種、移栽、生長于填有消毒土壤的塑料盆中，待測水稻則種植于大田環(huán)境中，栽培待測水稻和對照水稻時，除保護性栽培措施與白葉枯病防治措施外，待測水稻與待測水稻的栽培條件保持一致。
[0037]保護性栽培措施包括:(I) 土壤隔離:利用盆栽，使對照水稻生長的土壤與大田土壤隔離，避免通過土壤傳病感染白葉枯病；(2)水源隔離:采用自來水灌溉對照水稻，確保大田水源不進入對照水稻，避免通過水源感染白葉枯??；(3)空間隔離:對照水稻周圍10米不種植其它水稻，避免與帶白葉枯菌的水稻葉片摩擦感染白葉枯病。待測水稻不防治白葉枯病，除保護性栽培措施與白葉枯病防治措施外對照水稻與待測水稻的栽培條件盡可能保持一致，包括播種、移栽、施肥、防蟲、防病(除白葉枯病外其它病害)等生產(chǎn)管理措施同時、同步進行。
[0038]具體地，在對照水稻周圍10米范圍內(nèi)，不播種或種植其它水稻；對照水稻灌溉水采用干凈的自來水；除以上條件外，對照水稻與待測水稻的其它栽培條件與普通大田常規(guī)栽培條件相同，但所有栽培措施在對照水稻與待測水稻間保持一致，如播種、移栽、施肥、防蟲、防病(除白葉病外其它病害)等生產(chǎn)管理措施同時、同步進行。本次試驗中，播種期為2010年11月27日，地點為海南瓊海。
[0039]將對照水稻和待測水稻采用相同的栽培條件種植，使對照水稻和待測水稻能夠在相同的條件下生長，保證對照水稻和待測水稻的表達量不受栽培條件的影響。
[0040]在需要預報白葉枯病是否發(fā)生的時期，如苗期和破口期至抽穗揚花期，在上午8:55~9:05分別取倒數(shù)第二片中部2/3的部位的葉片。每次對照水稻與待測水稻各取至少3片葉片混合，用于代表對照水稻與待測水稻的樣本。所取葉片立即置于液氮中保存至總miRNA基因的提取。在本實施例中，取樣時間段為2011年2月28號至當年3月3號，連續(xù)取樣5天，共獲得對照水稻與待測水稻各5個樣本，分別編號為Cl~C5和Tl~T5，其中C表示Control, T表示Treatment,其中，對照水稻與待測水稻取樣的時間點是一致的,對照水稻和待測水稻所選取的葉片位置也是相同的，這能夠使對照水稻和待測水稻之間的生物時鐘與發(fā)育狀態(tài)是相同的，只有選取生物時鐘與發(fā)育狀態(tài)均相同的葉片才能進一步保證對照水稻和待測水稻間的miRNA表達量比較不受生物時鐘與發(fā)育的影響。
[0041]分離總miRNA基因:利用miRNA基因分離試劑盒(miRNA基因分離試劑盒為市售，貨號:R6727，生產(chǎn)公司:0mega，該試劑盒具體包括:RNA離心柱、基因組DNA去除離心柱、離心管、MCL裂解緩沖液、XD結(jié)合緩沖液、RNA洗脫液II和DEPC水)分離上述Cl~C5和Tl~T5水稻葉片中的總miRNA基因。
[0042]具體操作方法如下:從液氮中分別取出Cl~C5和Tl~T5水稻葉片樣本，分別置于10個研缽中，并立即向研缽中倒入液氮，充分研磨，分別研磨可以避免交叉污染。向每個研缽中取大約10mg研磨好的粉末置于1.5ml的離心管中，加700 μ L的裂解液，渦旋30秒以混勻樣品，55°C保溫30分鐘，在離心力為12000Xg的室溫條件下離心5分鐘，得到上清液，并將上清液轉(zhuǎn)移至離心柱中離心，用于去除基因組中的DNA，經(jīng)12000Xg室溫離心2分鐘，并將流出的液體轉(zhuǎn)移至一個新的1.5mL的離心管中，向該流出的液體中加入該液體體積1.1倍的無水乙醇并渦旋20秒混勻，將該渦旋后的液體轉(zhuǎn)移至RNA離心柱中經(jīng)12000 Xg室溫離心I分鐘，棄離心液，加入500 μ L濃度為96-100%的乙醇到RNA離心柱中，再經(jīng)12000 Xg室溫離心I分鐘，棄離心液，加入500 μ L XD結(jié)合緩沖液到RNA離心柱中，12000 X g室溫離心I分鐘，棄離心液，加入750 μ L RNA洗脫液II到RNA離心柱中，12000 X g室溫離心I分鐘，棄離心液，再加入750 μ LRNA洗脫液II到RNA離心柱中，12000 X g室溫離心I分鐘，棄離心液，將RNA離心柱在大于12000 X g的最大速度下，室溫離心2分鐘，向RNA離心柱中加入30-50 μ L DEPC水，室溫下放置5分鐘后，在大于12000 X g的最大速度下，室溫離心I分鐘，離心獲得的液體即為含有總miRNA基因的溶液，將該溶液保存于_70°C備用。
[0043]實時定量PCR(polymerase chain react1n,聚合酶鏈式反應)方法的前處理步驟包括:
[0044]總miRNA基因的定量:利用分光光度計(分光光度計由美國Quawell公司生產(chǎn)，型號為Q5000)中RNA定量程序，測定并獲得分離的總miRNA基因的濃度，根據(jù)濃度與體積計算總miRNA基因的質(zhì)量。
[0045]向分離的總miRNA基因中加入外源參考miRNA基因，得到第一混合液:外源參考miRNA基因的加入量為分離的總miRNA基因質(zhì)量的0.05%，外源參考miRNA基因的序列如序列表中SEQ ID N0:2所示，其由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。
[0046]miRNA基因環(huán)化:取含有約5ng總miRNA基因的第一混合液、2 μ IlOX反應緩沖液、I μ 150mM的MnCl2、4y 15M的甜菜堿和I μ 15u/y I的環(huán)化酶，用水補足20 μ I后混勻，得到第三混合液；將第三混合液于60°C保溫15分鐘后，80°C保溫10分鐘，使酶失活。將總miRNA基因和外源參考miRNA基因的5’端與3’端連接，獲得環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液，該混合液用于滾環(huán)逆轉(zhuǎn)錄。其中，環(huán)化酶由美國Epicentre公司生產(chǎn)，貨號為CL9021K。隨該酶一起提供的還有:10X反應緩沖液、50mM的MnC12、5M的甜菜堿和無酶水。
[0047]環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液的逆轉(zhuǎn)錄:取環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液2 μ 1、5 μ I濃度為I μ M的逆轉(zhuǎn)錄引物、2 μ I濃度為1mM的dNTP、5 μ I濃度為10mM的DTT、20U的逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Invitrigen公司生產(chǎn)，貨號為18064-014)和5μ110Χ的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液(隨逆轉(zhuǎn)錄酶一起提供)，用水補足50μ I混勻后，42°C保溫2小時，75°C保溫15分鐘，使酶失活。該逆轉(zhuǎn)錄引物包括miRNA395k基因的逆轉(zhuǎn)錄引物和外源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物，miRNA395k基因的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；據(jù)此設計的miRNA395k基因的逆轉(zhuǎn)錄引物如序列表中SEQID NO: 7所示；外源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所示,上述逆轉(zhuǎn)錄引物均由美國Invitrigen公司合成。其中，逆轉(zhuǎn)錄包括兩類，一類為目標基因，即miRNA395k基因的逆轉(zhuǎn)錄，另一類為外源參考miRNA基因(外源參考miRNA基因命名為ECK基因)的逆轉(zhuǎn)錄，兩個逆轉(zhuǎn)錄過程平行進行，且所有反應成份與條件均相同，僅逆轉(zhuǎn)錄引物不一致。對于miRNA395k基因的逆轉(zhuǎn)錄反應來說，所設計的逆轉(zhuǎn)錄引物跨過了 miRNA395k基因環(huán)化時的連接接點，因此，在逆轉(zhuǎn)錄時，僅環(huán)化成功的miRNA395k基因被逆轉(zhuǎn)錄，從而降低了其他基因的干擾。另外，miRNA395家族雖然共有a_y共23個家族成員，但在前期研究中發(fā)現(xiàn):所有成員在9311/Xa23感菌后24小時內(nèi)，表達量均下降了 2倍以上或幾乎不表達，因此，即使是這些成員被擴增，也不會影響我們對結(jié)果的判斷。因此，逆轉(zhuǎn)錄引物設計時，沒有刻意避免miRNA395家族中其它成員。
[0048]實時定量PCR方法檢測逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達量:實時定量PCR同樣包括兩類，一類為目標基因，即miRNA395k基因的實時定量，另一類為外源參考miRNA基因的實時定量，二者平行進行，所有反應成份與條件均相同，僅引物不相同。引物包括:miRNA395k基因正向引物序列如序列表中SEQ ID N0:3所示；miRNA395k基因反向引物序列如序列表中SEQID N0:4所示。miRNA395家族雖然共有a-y共23個家族成員，但在前期研究中發(fā)現(xiàn):所有成員在9311/Xa23感菌后24小時內(nèi)，表達量均下降了 2倍以上或幾乎不表達，因此，即使是這些成員被擴增，也不會影響我們對結(jié)果的判斷。因此，PCR引物設計時，沒有刻意避免miRNA395家族中其它成員。引物還包括:外源參考miRNA基因正向引物序列如序列表中SEQID N0:5所示；外源參考miRNA基因反向引物序列為如序列表中SEQ ID N0:6所示。實時定量PCR引物均由美國Invitrigen公司合成。
[0049]實時定量PCR方法的具體步驟如下:取2 μ I上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、3 μ I濃度為I μ M的引物(這里的引物指正向引物和反向引物等摩爾比混合物，即指序列如序列表中SEQ IDΝ0:3所示的miRNA395k基因正向引物和序列如序列表中SEQ ID NO:4所示的miRNA395k基因反向引物的等摩爾比的混合物，或者指序列如序列表中SEQ ID N0:5所示的外源參考miRNA基因正向引物和序列如序列表中SEQ ID N0:6所示的外源參考miRNA基因反向引物的等摩爾比的混合物)、10 μ I日本Toyobo公司生產(chǎn)的定量PCR混合物(貨號為QPS-201)和0.4 μ 150倍的ROX熒光校正染料(由日本Toyobo公司生產(chǎn)，并且隨QPS-201—起提供)混合均勻，得到第二混合液，將該第二混合液在ABI StepOne實時定量PCR儀中按如下程序進行實時定量PCR檢測:50°C 2分鐘；95°C 10分鐘；95°C 45秒，56°C 45秒，66°C 30秒，670C 30秒，共45個循環(huán)，其中，66°C 30秒和67°C 30秒在每循環(huán)一次后分別增加0.1°C和
0.2°C，在每一次循環(huán)的最后一步收集熒光信號，熒光信號的強弱用于衡量表達量的多少。實時定量的結(jié)果由Microsoft Excel2010進行處理，數(shù)據(jù)處理時以外源參考miRNA基因為miRNA395k表達分析的參考基因。結(jié)果見表1:
[0050]表1 miRNA395k基因在對照水稻與待測水稻間的相對表達量
[0051]
miRNA395k基因表達量* 2月28號2月29號3月I號3月2號3月3號待測水稻 2.87 2.69 2.68 1.03 1.12對照水稻 2.75 2.67 2.77 2.56 2.66待測水稻/對照水稻_IM_1.0丨 0.97 0.40 0.42
[0052]注:表達量* = 2(CT(miENA395k)-CT(ECK))，其中，CT (miRNA395k)和 CT (ECK)分別為實時定量PCR反應中獲得的miRNA395k基因和外源參考miRNA基因的CT值。
[0053]由表1數(shù)據(jù)可知，對照水稻在檢測時間段中的5個時間點的表達量最大值為3.77，表達量最小值為2.56，二者之間的比值為1.08，該比值小于1.5。表明本次實驗中，無白葉枯病或其它因素影響對照水稻miRNA395k基因的表達，實驗條件控制較好，實驗是成功的，實驗結(jié)果可用于水稻白葉枯病的預報。在待測水稻中，從2月28號到3月I號這三天，miRNA395k基因的表達量相對恒定，進一步說明本次實驗的條件控制較好。到3月2號，miRNA395k基因在待測水稻中的表達量比對照水稻低2倍多，這種表達變化在3月4號得以維持，表明所檢測到的待測水稻miRNA395k基因表達變化不太可能是檢測失誤等因素造成?？梢耘袛?，待測水稻很可能感染上白葉枯菌，需要藥物防治。據(jù)此進一步預測，在該地區(qū)種植的其它水稻也有近期感染白葉枯病的危險，需要防治。至3月6號開始，待測水稻開始出現(xiàn)白葉枯病癥狀，至3月12號，癥狀已經(jīng)相當明顯。同時，當?shù)仄渌酒贩N也出現(xiàn)了嚴重的白葉枯病與細菌性條斑病的混合危害，部分田塊出現(xiàn)絕收的情況。由此可見，本發(fā)明提供的miRNA395k基因的表達量可作為水稻感染白葉菌的早期(24小時內(nèi))標志物，可用于明確待測水稻是否染病，以及明確白葉枯發(fā)病時間與地點，避免了傳統(tǒng)病害預報的模糊性。
[0054]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用miRNA395k基因預報水稻白葉枯病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 選取9311/Xa23水稻品種作為待測水稻和對照水稻； 栽培所述待測水稻和所述對照水稻； 分別分離所述待測水稻和所述對照水稻中的總miRNA基因； 分別檢測所述待測水稻和所述對照水稻中的所述總miRNA基因中的miRNA395k基因的表達量，所述miRNA395k基因的序列如序列表中SEQ ID N0:1所示； 根據(jù)所述待測水稻和所述對照水稻中的miRNA395k基因的表達量，判定實驗是否成功，若成功，則進一步判斷所述待測植株是否感染白葉枯病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述栽培所述待測水稻和所述對照水稻時，所述對照水稻在栽培時采用保護性栽培措施并防治白葉枯病，除所述保護性栽培措施和防治白葉枯病外，所述對照水稻與所述待測水稻的栽培條件保持一致。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述保護性栽培措施包括土壤隔離、水源隔離和空間隔離。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在上午8:55~9:05利用所述待測水稻和所述對照水稻的相同葉片的相同部位進行所述總miRNA基因的分離。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用實時定量PCR方法，檢測所述miRNA395k基因在所述待 測水稻和所述對照水稻中的表達量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述實時定量PCR方法的前處理步驟包括: 利用分光光度計測定并獲得分離的所述總miRNA基因的濃度； 向所述總miRNA基因中加入外源參考miRNA基因，得到第一混合液，所述外源參考miRNA基因的加入量為所述總miRNA基因質(zhì)量的0.05%，所述外源參考miRNA基因的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示； 分別將所述總miRNA基因和所述外源參考miRNA基因的5’端與3’端連接，得到環(huán)化的所述總miRNA基因和環(huán)化的所述外源參考miRNA基因的混合液； 將所述環(huán)化的總miRNA基因和所述環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液進行逆轉(zhuǎn)錄，得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于進行所述實時定量PCR檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述采用實時定量PCR方法，檢測所述miRNA395k基因在所述待測水稻和所述對照水稻中的表達量，包括: 將2μ I所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、3μ I濃度為ΙμΜ的引物、10μ I定量PCR混合物和0.4μ 150倍的ROX熒光校正染料混合均勻，得到第二混合液，將所述第二混合液在實時定量PCR儀中進行反應，所述反應程序為:50°C 2分鐘；95°C 10分鐘；95°C 45秒，56°C 45秒，66°C 30秒，.670C 30秒，共45個循環(huán)，其中，66°C 30秒和67°C 30秒在每循環(huán)一次后分別增加0.1°C和.0.2°C，在每一次循環(huán)的最后一步收集熒光信號，所述熒光信號的強弱用于衡量所述表達量的多少； 所述引物包括:序列如序列表中SEQ ID NO: 3所不的miRNA395k基因正向引物、序列如序列表中SEQ ID N0:4所示的miRNA395k基因反向引物、序列如序列表中SEQ ID N0:5所示的外源參考miRNA基因正向引物、以及序列如序列表中SEQ ID N0:6所示的外源參考miRNA基因反向引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，將所述環(huán)化的總miRNA基因和所述環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液進行逆轉(zhuǎn)錄的步驟包括: 取所述環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液2 μ 1、5 μ I濃度為I μ M的逆轉(zhuǎn)錄引物、2 μ I濃度為1mM的dNTP、5 μ I濃度為10mM的DTT和20U的逆轉(zhuǎn)錄酶，用水補足50μ I混勻后，得到第四混合液，將所述第四混合液于42°C保溫2小時，75°C保溫15分鐘，使酶失活，得到所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；所述逆轉(zhuǎn)錄引物包括miRNA395k基因的逆轉(zhuǎn)錄引物和外源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物，所述miRNA395k基因的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示，所述外源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如序列表中SEQ IDNO:8所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述判定實驗是否成功的方法為:若所述對照水稻的miRNA395k基因的表達量最大值與表達量最小值的比值小于1.5，則實驗成功；若所述對照水稻的miRNA395k基因的表達量最大值與表達量最小值的比值大于等于1.5，則實驗不成功。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，判定所述待測植株是否感染白葉枯病的方法為:若所述待測水稻的miRNA395k基因的表達量大于2倍所述對照水稻的miRNA395k基因的表達量，則所述待測水稻未感病；若所述待測水稻的miRNA395k基因的表達量小于或等于2倍的所述對照水稻 的miRNA395k基因的表達量，則所述待測水稻感病。
【文檔編號】C12Q1/68GK104131075SQ201410305397
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】王沁, 盧龍 申請人:江漢大學