一種辣椒根rna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種辣椒根RNA提取方法，屬生物【技術領域】。本發(fā)明所解決的技術問題是提供了一種成本較低、效率較高的辣椒根RNA提取方法。本發(fā)明提取的辣椒根RNA的方法包括如下步驟：稱取0.1g辣椒根，研磨后加入預熱的裂解液和β-巰基乙醇，渦旋后水浴，加氯仿/異戊醇(24/1)離心，取上清加等體積的氯仿/異戊醇(24/1)后再離心，加入沉淀劑沉淀后離心，乙醇洗滌并回收RNA。本發(fā)明操作簡單，節(jié)約成本，能夠很好的提取辣椒根RNA。
【專利說明】一種辣椒根RNA提取方法
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種辣椒根RNA提取方法，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】:
[0002]辣椒(Capsicum annuum L.)俗稱“辣子”,是全世界消費量最大的蔬菜之一,我國是居全球之首的辣椒生產和消費大國，辣椒在近幾十年其貿易量超過咖啡與茶葉。據(jù)不完全統(tǒng)計，全國辣椒播種面積已超過140多萬公頃，產量2700萬噸，實現(xiàn)產值270億元，占據(jù)我國蔬菜作物種植面積的1/10之多。隨著種植及消費變化，辣椒育種方向和目的不再單純以追求產量、早熟要求為目標，而逐步轉向優(yōu)質、抗病、抗逆和適應特殊要求，諸如適宜保護地栽培耐低溫、耐弱光、高產品種，適宜加工的加工型辣(甜)椒等。而選育抗逆、優(yōu)質、抗病品種的首要關鍵是選育具備目標特性的辣椒種質資源，因此通過現(xiàn)代生物技術及育種手段，探索特異資源的遺傳機理、選育理想的辣椒種質資源親本材料，顯得尤為重要和迫切。
[0003]目前對于辣椒的分子生物學研究正在深入，而RNA提取是分子生物學研究的基礎，所以摸索一套適合辣椒根的RNA提取技術顯的尤為重要。因為辣椒根中含有大量多糖和多酚，常規(guī)方法如Tr i Z01、改良Tr i z ο I等提取到的RNA質量不能滿足試驗要求，對辣椒的研究增加了困難。

【發(fā)明內容】
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[0004]針對目前的現(xiàn)狀及存在的問題，本發(fā)明所要解決的問題是提供一種成本較低、效率較高的辣椒根RNA提取方法，能夠提取到高質量的RNA，為后續(xù)試驗提供了良好的基礎。
[0005]本發(fā)明提取辣椒根的方法包括如下步驟:一種辣椒根RNA提取方法，包括如下步驟:
[0006](I)取2ml離心管，加CTAB提取液lml，在65 - 70°C水浴中預熱1min ；
[0007](2)液氮中研磨0.1g辣椒根；
[0008](3)將預熱過的CTAB提取液加入到研缽中裂解，加入β -巰基乙醇，裂解完畢后重新裝入離心管，激烈渦旋30s，然后放回65 - 70°C繼續(xù)水??；
[0009](4)向離心管中加入等體積的氯仿/異戊醇混合液并渦旋混合，在lOOOOrpm，4°C離心15min ；
[0010](5)將上清液轉移至一新的離心管，重復抽提一次；
[0011](6)繼續(xù)將上清液轉移至另一新離心管中，再加入異丙醇，在4°C下沉淀2h;
[0012](7)然后在4°C，12000rpm條件下離心20 - 30min，振蕩混勻分層后，再室溫靜置5~1min,棄上清液，用500 μ L70%乙醇洗沉淀,繼續(xù)在4°C, 12000rpm條件下離心5min,然后再用500 μ LlOO %乙醇洗沉淀I~2次；
[0013](8)棄上清，吹干后用30 μ LDEPC水溶解RNA。
[0014]優(yōu)選地，所述的CTAB提取液的組成成分為100mmol/L Tris - HCl、20mmol/LEDTA - Na2、l.4mol/L NaCl、2% CTABU % PVP (聚乙烯吡咯烷酮)，pH 值為 8.0。[0015]優(yōu)選地，步驟(3)中所述的β -巰基乙醇的加入量為30 μ L，水浴溫度為65 -70°C，時間為4 - 5min。
[0016]優(yōu)選地，步驟(4)中所述的氯仿/異戊醇的體積比為24:1。
[0017]優(yōu)選地，步驟(6)中所述異丙醇的加入體積為上清液體積的1/3。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為不用RNA提取方法的瓊脂糖凝膠電泳比較結果圖。A為Trizol法，B為改良Trizol法，C為本發(fā)明。
【具體實施方式】:
[0019]下面對本發(fā)明的較佳實施例進行詳細闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點和特征能更易于被本領域技術人員理解，從而對本發(fā)明的保護范圍做出更為清楚明確的界定。
[0020]一種辣椒根RNA提取方法，包括以下具體步驟:
[0021]試劑準備
[0022]1.2 X CTAB 提取緩沖液:100mmol/l Tris - HCl (ρΗ8.0)，20mmol/l EDTA - Na2,
1.4mol/l NaCl,2% CTAB(ff/V) ,1% PVP(聚乙烯吡咯烷酮)(W/W)。即:配置 100ml2XCTAB提取緩沖液需加=Trisl.2114g，EDTANa2.2Η200.7444g，NaC18.1816g，PVPlg，加水 60ml，用4MHC1調pH至8.0，定容至1 00ml，加入CTAB2g，65°C水浴溶解。以上試劑均用RNase Free水配置，122。。滅菌20min ;氯仿/異戊醇為24:1(V/V)。
[0023]2.具體操作步驟
[0024](I)取2ml離心管，加CTAB提取液1ml，65 - 70°C水浴中預熱lOmin。
[0025](2)液氮中研磨0.1g辣椒根。
[0026](3)將預熱過的CTAB提取液加入到研缽中裂解，加入β -巰基乙醇30 μ L，融化后重新裝入離心管，激烈渦旋30s，放回65 - 70°C水浴。
[0027](4)加入等體積的氯仿/異戍醇并潤旋混合，lOOOOrpm, 4°C離心15min。
[0028](5)將上清轉移至一新。重復抽提一次。
[0029](6)將上清轉移至一新離心管中，加入1/3上清體積冰冷的異丙醇，4°C下沉淀2h。
[0030](7) 4 V，12000rpm 離心 20 - 30min,棄上清，用 500 μ L70 % 乙醇洗沉淀，4 °C，12000rpm離心5min,然后用500 μ LlOO %乙醇洗沉淀。
[0031](8)棄上清，吹干后用30 μ LDEPC水溶解RNA。
[0032]3.Trizol法提取辣椒根RNA
[0033](I)稱取約0.1g辣椒根，在液氮環(huán)境下研磨成灰白色粉末后，加入ImL Trizol裂解液。
[0034](2)室溫放置5min，待融化后迅速轉至1.5mL離心管中，使核酸蛋白復合物完全分離。
[0035](3)4°C，12000rpm，離心10min，樣品分成三層:黃色的有機相，中間層和無色的水相，RNA主要在水相中。取上清(約500 μ L)，轉入另一干凈的1.5mL離心管中。
[0036](4)加入200 μ L氯仿，蓋好管蓋，渦旋混勻15s，室溫放置2min。
[0037](5)4。。, 12000rpm,離心1min,取上清(約600 μ L)，轉入1.5mL離心管中，加入等體積氯仿，渦旋混勻15s。
[0038](6) 4°C, 12000rpm,離心10min。取上清(約400 μ L),轉入1.5mL離心管中，加入
等體積冰的異丙醇，潤旋混勻15s,室溫放置lOmin。
[0039](7) 4°C, 12000rpm,離心1min (此時可能會出現(xiàn)沉淀)。棄上清，加入111^75%乙
醇，震蕩片刻。
[0040](8) 4°C, 7500rpm,離心5min。棄上清，4°C, 7500rpm,高速離心Imin,用移液器移走殘余溶液，室溫倒置lOmin。
[0041](9)加入 30 μ L RNase - free 水溶解 RNA。
[0042]4.改良Trizol法提取辣椒根RNA
[0043](I)取1.5mL離心管，加入ImL Trizol裂解液、30 μ L β -巰基乙醇、30mg PVP,混勻，65 °C 水浴 15min。
[0044](2)稱取0.1g辣椒根,在液氮條件下研成灰白色粉末后,迅速轉入Trizol裂解液的離心管中，渦旋混勻。
[0045](3)65°C水浴15min，使核酸蛋白復合物完全分離，4°C，12000rpm，離心10min。其余步驟同Trizol試劑法。
[0046]試驗結果如圖1和表1所示。
[0047]表1不同RNA提取方法的RNA濃度和純度
[0048]
【權利要求】
1.一種辣椒根RNA提取方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)取2ml離心管，加CTAB提取液1ml，在65- 70°C水浴中預熱1min ； (2)液氮中研磨0.1g辣椒根； (3)將預熱過的CTAB提取液加入到研缽中裂解，加入β-巰基乙醇，裂解完畢后重新裝入離心管，激烈渦旋30s，然后放回65 - 70°C繼續(xù)水?。? (4)向離心管中加入等體積的氯仿/異戊醇混合液并渦旋混合，在10000rpm，4°C離心15min ； (5)將上清液轉移至一新的離心管，重復抽提一次； (6)繼續(xù)將上清液轉移至另一新離心管中，再加入異丙醇，在4°C下沉淀2h； (7)然后在4°C，12000rpm條件下離心20- 30min,振蕩混勻分層后，再室溫靜置5~1min,棄上清液,用500 μ 170%乙醇洗沉淀,繼續(xù)在4°C, 12000rpm條件下離心5min,然后再用500 μ LlOO %乙醇洗沉淀I~2次； (8)棄上清，吹干后用30μ LDEPC水溶解RNA。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的CTAB提取液的組成成分為10mmoI/L Tris - HCl、20mmol/L EDTA - Na2U.4mol/L NaCl、2% CTABU % PVP (聚乙烯吡咯烷酮)，pH值為8.0。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的β-巰基乙醇的加入量為30 μ L，水浴溫度為65 - 70°C，時間為4 - 5min。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的氯仿/異戊醇的體積比為24:1。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(6)中所述異丙醇的加入體積為上清液體積的1/3。
【文檔編號】C12N15/10GK104031911SQ201410307733
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權日:2014年6月30日
【發(fā)明者】孫國勝, 馬志虎, 潘躍平, 戴忠良, 毛忠良, 孫春青, 吳國平, 王建華, 潘永飛, 張振超, 秦文斌, 姚悅梅 申請人:鎮(zhèn)江瑞繁農藝有限公司