一種添加透明質(zhì)酸酶提高小分子透明質(zhì)酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)HA的微生物發(fā)酵過(guò)程中添加透明質(zhì)酸酶液制備小分子透明質(zhì)酸的方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用水蛭來(lái)源的重組透明質(zhì)酸酶，在獸疫鏈球菌發(fā)酵過(guò)程中添加透明質(zhì)酸酶，并進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵偶聯(lián)酶解法制備小分子透明質(zhì)酸及寡糖(分子量低于105道爾頓)，同時(shí)提高了小分子HA的產(chǎn)量。本發(fā)明為高效制備小分子透明質(zhì)酸奠定了一定的基礎(chǔ)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種添加透明質(zhì)酸酶提高小分子透明質(zhì)酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種發(fā)酵過(guò)程中添加酶制備小分子透明質(zhì)酸的方法，屬于生物工程技 術(shù)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸（Hyaluronic Acid, HA)，是一種高分子粘性多糖，以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu) 和理化性質(zhì)，使其具有良好的保濕性、粘彈性、滲透性和延展性，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中保 濕性最好的物質(zhì)，同時(shí)無(wú)任何免疫原性和毒性，被廣泛應(yīng)用于化妝品、食品和醫(yī)藥等行業(yè)領(lǐng) 域。透明質(zhì)酸以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)在機(jī)體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能，如潤(rùn) 滑關(guān)節(jié)，調(diào)節(jié)血管壁的通透性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，水電解質(zhì)擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn)，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等。
[0003] 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，低分子量的HA(低于1X104)和透明質(zhì)酸寡糖具有獨(dú)特的生物 學(xué)功能。根據(jù)文獻(xiàn)研究表明，分子量大小對(duì)HA的生物活性影響較大，不同分子量范圍的HA 卻表現(xiàn)出截然不同的生理學(xué)功能。高分子量的HA(Mr>2X106)由于具有較好的粘彈性、保 濕性、抑制炎性反應(yīng)、潤(rùn)滑等功能，可應(yīng)用于高端化妝品行業(yè)、眼科手術(shù)黏彈劑和關(guān)節(jié)腔內(nèi) 注射治療。中等分子量的HA(介于1 X 106-105)具有良好的保濕性、潤(rùn)滑和藥物緩釋作用， 可廣泛用于化妝品、滴眼液、皮膚燒傷愈合及術(shù)后防粘連。低分子量的HA(低于1X10 4)和 寡聚透明質(zhì)酸，表現(xiàn)出非常強(qiáng)的生物活性，具有抑制腫瘤擴(kuò)散、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、促進(jìn)骨和血 管生成、免疫調(diào)節(jié)等作用，且易于滲透到真皮中，免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子的激活劑。因此，小分 子透明質(zhì)酸在食品保健、化妝品以及臨床醫(yī)療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004] 隨著小分子HA和HA寡糖的研究與應(yīng)用迅速興起，近些年以來(lái)，國(guó)內(nèi)外開(kāi)始重視HA 的降解及其降解產(chǎn)物的制備研究。目前，HA降解的方法主要有物理降解、化學(xué)降解、生物降 解3大類(lèi)。物理降解方法主要有加熱、機(jī)械剪切力、紫外線、超聲波、 6°Co照射、γ-射線輻 射等因素均可使HA發(fā)生降解。但是，物理法制備的HA分子量普遍高于1萬(wàn)以上，產(chǎn)生的分 子量范圍分布較大，產(chǎn)品穩(wěn)定性較差。HA的化學(xué)降解方法有水解法和氧化降解法，水解法 分酸水解（HC1)和堿水解（NaOH)，氧化降解常用的氧化劑為次氯酸鈉（NaCIO)和過(guò)氧化氫 (H 202)。盡管使用化學(xué)降解方法降解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量可以通過(guò)改變酸堿或氧化劑的加 入量和反應(yīng)時(shí)間來(lái)控制，降解成本較低，易于大規(guī)模生產(chǎn)，但化學(xué)降解法引入了化學(xué)試劑， 反應(yīng)條件復(fù)雜，易給HA性質(zhì)產(chǎn)生影響和產(chǎn)品的純化帶來(lái)困難，且產(chǎn)生大量的工業(yè)廢水。生 物酶法降解是HA在透明質(zhì)酸酶（HAase)的作用下，糖鏈上的糖苷鍵斷裂發(fā)生降解。酶解法 是溫和的降解方法，不但可以制備小分子HA，而且利用此方法可制得鏈長(zhǎng)為4?22的寡糖， 而且經(jīng)過(guò)凝膠色譜分離后可以制得單一 HA寡糖。但是，目前商品化的透明質(zhì)酸酶（動(dòng)物組 織提起制備）價(jià)格昂貴，不適合應(yīng)用于工業(yè)化制備小分子HA。
[0005] 本發(fā)明在獸疫鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)HA過(guò)程中添加重組水蛭透明質(zhì)酸酶，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程 中直接制備獲取小分子透明質(zhì)酸，這一偶聯(lián)模式不僅解決了獸疫鏈球菌發(fā)酵后期由于HA 的積累粘稠度增大的問(wèn)題，同時(shí)對(duì)小分子HA的產(chǎn)量也具有明顯的提高。該發(fā)明操作過(guò)程簡(jiǎn) 單，反應(yīng)條件溫和、專(zhuān)一性高、且產(chǎn)品純度高，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)制備小分子透明質(zhì)酸。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明公開(kāi)了一種微生物發(fā)酵過(guò)程中添加酶制備小分子寡聚透明質(zhì)酸的方法，是 向產(chǎn)高分子HA的微生物發(fā)酵體系中添加一定濃度的透明質(zhì)酸酶溶液，發(fā)酵過(guò)程控制制備 得到小分子寡聚透明質(zhì)酸。
[0007] 所述高分子HA的分子量高于106Da，優(yōu)選105_107Da。
[0008] 所述產(chǎn)高分子HA的微生物為獸疫鏈球菌、枯草芽孢桿菌或者重組工程菌株，優(yōu)選 獸疫鏈球菌。
[0009] 所述透明質(zhì)酸酶溶液為粗酶液，過(guò)濾除菌，其中反應(yīng)體系中添加酶活單位數(shù)（U) 與HA發(fā)酵罐裝液量（ml)比為lOLlO 5 :1，優(yōu)選103-104 :1 ;所述HA溶液與酶液的添加體積 比為105 :104?1，優(yōu)選103 :10?1。
[0010] 所述發(fā)酵液的pH值控制在6. 0-7. 0之間，優(yōu)選ρΗ7· 0。
[0011] 所述發(fā)酵過(guò)程的溫度37°C。
[0012] 所述發(fā)酵時(shí)間為14-28h，優(yōu)選16-24h。
[0013] 所述發(fā)酵過(guò)程中添加酶液的時(shí)間點(diǎn)為接種后8h內(nèi)，優(yōu)選4h。
[0014] 所述小分子透明質(zhì)酸分子量小于105kDa，主要產(chǎn)物低分子量或者HA-4、HA-6、 HA-8、HA-10等透明質(zhì)酸寡聚糖。
[0015] 本發(fā)明利用透明質(zhì)酸酶直接添加到獸疫鏈球菌發(fā)酵液中，在產(chǎn)高分子HA的過(guò)程 中，被透明質(zhì)酸酶降解為寡聚糖小分子，具有直接的目的性。與其他方式相比，該發(fā)明具有 非常大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。首先，本發(fā)明過(guò)程中添加酶液，降低了發(fā)酵液粘稠度，增加了溶氧和提 高了 HA的產(chǎn)量；其次，發(fā)酵液中酶水解制備的小分子寡聚透明質(zhì)酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率高達(dá)95%以 上，產(chǎn)物的分子量小余1〇5道爾頓，且主要產(chǎn)物為低分子量寡聚糖，易于純化回收?；趹?yīng) 用分析，本發(fā)明方法在工業(yè)上用于制備小分子寡聚透明質(zhì)酸及其衍生體具有潛在而非常廣 泛的價(jià)值。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1所示為獸疫鏈球菌分批發(fā)酵時(shí)間關(guān)系曲線圖；
[0017] 圖2所示為獸疫鏈球菌發(fā)酵過(guò)程中第8h添加透明質(zhì)酸酶分批發(fā)酵時(shí)間關(guān)系曲線 圖；
[0018] 圖3所示為獸疫鏈球菌發(fā)酵過(guò)程中第8h添加透明質(zhì)酸酶補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)間關(guān)系曲線 圖；
[0019] 圖4所示為獸疫鏈球菌發(fā)酵過(guò)程中第4h添加透明質(zhì)酸酶補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)間關(guān)系曲線 圖；
[0020] 圖5所示為獸疫鏈球菌發(fā)酵過(guò)程中第4h添加透明質(zhì)酸酶分批補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)間關(guān)系 曲線圖；
[0021] 圖6所示為高效液相凝膠排阻色譜測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物小分子透明質(zhì)酸的分子量。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)施例1獸疫鏈球菌分批發(fā)酵（對(duì)照組）
[0023] 本發(fā)明所用的菌株為獸疫鏈球菌Streptococcus zooepidemicus WSH_24(本實(shí)驗(yàn) 室篩選），菌株先在M17培養(yǎng)基平板上劃線生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)接與50ml種子培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h，按 1〇%的接種量轉(zhuǎn)接于31^發(fā)酵罐（裝液量1.51^)，培養(yǎng)1611。發(fā)酵條件 ：轉(zhuǎn)速200印111，通氣量 1. Ovvm，溫度37°C，pH7. 0。種子培養(yǎng)基（g/L):蔗糖20,酵母粉20,七水硫酸鎂2. 0,四水硫 酸錳0. 1，磷酸二氫鉀2. 0,碳酸鈣20,微量元素 lml/L，緩沖液40ml/L，pH7. 0。微量元素（g/ L):氯化鈣2. 0,氯化鋅0. 046,五水硫酸銅0. 019。緩沖液（g/L):磷酸氫二鈉36. 76,磷酸 二氫鈉15. 98,碳酸氫鈉12. 5。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):酵母粉20,磷酸氫二鈉6. 2,硫酸鉀1.3， 蔗糖70,七水硫酸鎂2. 0,微量元素1 mL/L，pH7. 0。
[0024] 發(fā)酵過(guò)程中每隔2h取一次樣，測(cè)定菌體生長(zhǎng)0D6(?值，，添加終濃度0. 5%的SDS至 發(fā)酵液中，室溫孵育5min，lOOOOrpm離心10min，收集上清液。上清液采用2倍體積的無(wú)水 乙醇沉淀透明質(zhì)酸，室溫孵育lh，lOOOOrpm離心10min，沉淀采用等體積的1M的NaCl溶液 充分溶解，進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，采用Bitter-Muir硫酸咔唑法檢測(cè)HA酸含量。對(duì)照實(shí)施例中 HA的發(fā)酵產(chǎn)量在14h最高為3. 8g/L，分子量161萬(wàn)道爾頓。
[0025] 實(shí)施例2獸疫鏈球菌發(fā)酵過(guò)程中第8h添加透明質(zhì)酸酶進(jìn)行分批發(fā)酵
[0026] 所有操作條件同實(shí)施例1，在接種后第8h添加透明質(zhì)酸酶液7. 5ml (106U/ml)，在 發(fā)酵罐中透明質(zhì)酸酶的含量為5X103U/ml。HA的最高產(chǎn)量在14h達(dá)到4. 78g/L，結(jié)果如附 圖2所示。發(fā)酵液取收集后，沸水煮沸2min，使透明質(zhì)酸酶失活。
[0027] 實(shí)施例3獸疫鏈球菌發(fā)酵過(guò)程中第8h添加透明質(zhì)酸酶進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵
[0028] 所有操作條件同實(shí)施例1，在接種后第8h添加透明質(zhì)酸酶液7. 5ml (106U/ml)，在 發(fā)酵罐中透明質(zhì)酸酶的含量為5X103U/ml。同時(shí)，在第8h進(jìn)行蔗糖補(bǔ)料，50%的蔗糖按如 下程序進(jìn)行補(bǔ)料：
[0029]
[0030]

【權(quán)利要求】
1. 一種添加透明質(zhì)酸酶提高小分子透明質(zhì)酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于在微生物發(fā) 酵產(chǎn)高分子HA過(guò)程中添加透明質(zhì)酸酶溶液，直接發(fā)酵并提高小分子透明質(zhì)酸的產(chǎn)量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述產(chǎn)高分子HA的微生物為獸疫鏈球菌 Streptococcus zooepidemicus WSH-24。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述高分子HA的分子量大于106kDa。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述透明質(zhì)酸酶為水蛭透明質(zhì)酸酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，透明質(zhì)酸酶添加量為：酶活單位數(shù)（U)與 發(fā)酵罐裝液量（體積ml)比為lOLlO 5 :1 ;所述產(chǎn)HA發(fā)酵罐裝液量與酶液的添加體積比為 105 :104-1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，透明質(zhì)酸酶添加量為：酶活單位數(shù)（U)與 發(fā)酵罐裝液量（體積ml)比為103-10 4 :1 ;所述產(chǎn)HA發(fā)酵罐裝液量與酶液的添加體積比為 103:10-1。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵體系溶液的pH為6. 0-7. 0， 優(yōu)選pH為7. 0 ;溫度為37°C，發(fā)酵時(shí)間為14-28h ;透明質(zhì)酸酶液的添加時(shí)間點(diǎn)為接種后8h 內(nèi)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于透明質(zhì)酸酶液的添加時(shí)間點(diǎn)為接種后4h。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的方法，其特征在于所述小分子透明質(zhì)酸分子量小于 105kDa，主要產(chǎn)物低分子量或者HA-4、HA-6、HA-8、HA-10等透明質(zhì)酸寡聚糖。
10. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在于制備的小分子透明質(zhì)酸用于化妝品、食品 及醫(yī)藥相關(guān)領(lǐng)域。
【文檔編號(hào)】C12P19/26GK104120158SQ201410308790
【公開(kāi)日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月1日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 康振, 李江華, 金鵬 申請(qǐng)人:江南大學(xué)