透明質酸酶及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種透明質酸酶及其制備方法，該透明質酸酶包含對卵子進行處理的組合物、殺菌劑及指示劑。本發(fā)明的透明質酸酶各項指標達到體外培養(yǎng)液的標準使用安全且易于判斷培養(yǎng)液是否變質，為輔助生殖技術提供有力保證。
【專利說明】透明質酸酶及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及人工輔助生殖技術，尤其涉及一種透明質酸酶及其制備方法。

【背景技術】
[0002] 透明質酸酶對分離卵丘已廣泛應用于試管嬰兒技術中。透明質酸酶的目的是分離 卵子周圍的卵丘。透明質酸酶的用途：用于卵子顯微注射之前的卵丘細胞與卵子的分離。
[0003] 目前，我國輔助生殖技術中的透明質酸酶依賴進口成品，成本高且溶液的有效性 的好壞不能很好的表現(xiàn)，如果在培養(yǎng)液變質后仍繼續(xù)使用將對實驗或臨床操作造成不可逆 轉的結果。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種各項指標達到體外培養(yǎng)液的標準使用安全且易于判 斷培養(yǎng)液是否變質的透明質酸酶，為輔助生殖技術提供有力保證。
[0005] 本發(fā)明的透明質酸酶，包含對卵子進行處理培養(yǎng)的組合物、殺菌劑及指示劑。
[0006] 所述殺菌劑為慶大霉素，濃度9. 5-10. 5mg/L。
[0007] 所述指示劑為酚紅，濃度9. 5-10. 5mg/L。
[0008] 所述組合物中包含氯化鈉 92. 815-102. 585mmol/L,氯化鉀 4. 465-4. 935mmol/ L，硫酸鎂 0· 19-0. 21mmol/L，氯化鈣 1. 9-2. 1 mmol/L，碳酸氫鈉 3. 8-4. 2mmol/L，4-羥 乙基脈嚷乙橫酸HEPES 19. 95-22. 05mmol/L,葡萄糖2. 66-2. 94mmol/L,丙麗酸納 0· 314-0. 347mmol/L、乳酸鈉 2. 274-2. 514g/L、丙氨酰谷氨酰胺 0· 95-1. 05mmol/L、?；撬?0· 095-0. 105mmol/L，非必需氨基酸 0· 95%-L 05% (v/v)磷酸二氫鉀 0· 352-0. 389mmol/L, 慶大霉素9.5-10.5 11^/1，酚紅9.5-10.511^/1，人血清白蛋白11.4%-12.6%&八），透明質 酸酶 247. 57-273. 63mg/L。
[0009] 所述非必需氨基酸為L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨 酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸中的一種或者幾種。
[0010] 透明質酸酶的溶劑采用超純水。
[0011] 本發(fā)明的透明質酸酶的ρΗ=7· 20-7. 40,滲透壓272-288m0sm/Kg。
[0012] 本發(fā)明透明質酸酶的制備方法，包括下面步驟： (1) 透明質酸酶基礎液的配制 a、 先按照比例稱量各組分，并分開放置； b、 先將稱量好的組分（除殺菌劑、指示劑、碳酸氫鈉）溶于超純水中，溶解過程中遵循先 固體后液體，NaHC03最后加入的原則； c、 向步驟b所得溶液中加入稱量好的殺菌劑、指示劑和NaHC03 ; d、 檢測溶液滲透壓和pH值，如果pH值不在范圍內則用配制好的鹽酸和氫氧化鈉溶液 調節(jié)pH值，并記錄最終滲透壓和pH值； (2) 透明質酸酶原液的配制 a、 在基礎液中加入透明質酸酶，在超凈工作臺下利用0. 2 μ m的濾膜過濾除菌，得到濾 液A ; b、 在濾液A中加入人血清白蛋白，震蕩或攪拌混合均勻，得到透明質酸酶的原液。
[0013] (3)透明質酸酶原液的處理 在無菌環(huán)境下對過濾后的溶液進行分裝封口，得到市售的透明質酸酶，將其放置冰箱 或冷庫內保存。
[0014] (4)透明質酸酶進行檢測 檢測項目是pH值、滲透壓、細胞毒性、皮內刺激、致敏、無菌、熱原、細菌內毒素、體外鼠 胚試驗來判斷透明質酸酶是否合格。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是，1、透明質酸酶中含有指示劑酚紅，酚紅在pH變化時顏色變 化明顯，pH在7. 20-7. 40范圍內酚紅溶液為粉紅色到橙紅色，當pH值小于6. 8時為黃色，當 pH值大于8. 4時為紅色，變色比較明顯，透明質酸酶的pH 7. 20-7. 40在此范圍內溶液為粉 紅色到橙紅色，當透明質酸酶顏色與此不符時，說明該透明質酸酶變質，不能用于實驗或臨 床，從而避免了使用變質透明質酸酶而產生的風險。2、使用抗生素來抑制細菌的生長，如慶 大霉素是一種廣譜、熱穩(wěn)定性好的抗生素，在透明質酸酶中添加慶大霉素可以有效抑制細 菌的生長。3、本發(fā)明透明質酸酶的原料均是已經證明其安全性的物質，在制備過程中其溶 劑采用超純水，超純水的總有機碳（T0C)超低，避免了因雜質過多影響測定的結果。4、國內 還沒有成型的用于試管嬰兒技術的培養(yǎng)液，此配方和制備方法為國內的試管嬰兒技術提供 了有力的保證，避免了國外產品因長途運輸帶來的不明因素，同時配制工藝操作簡單合理， 檢測嚴密，能夠提供新鮮的培養(yǎng)液供生殖中心或科研院所使用。

【具體實施方式】
[0016] 以下通過實施例對本發(fā)明做進一步的說明。
[0017] 一、透明質酸酶配方及制備方法 表1透明質酸酶配方

【權利要求】
1. 一種透明質酸酶，其特征在于，包含對卵子進行處理培養(yǎng)的組合物、殺菌劑及指示 劑。
2. 根據權利要求1所述的透明質酸酶，其特征在于，所述殺菌劑為慶大霉素 9. 5-10. 5mg/L〇
3. 根據權利要求1所述的透明質酸酶，其特征在于，所述指示劑為酚紅，濃度 9. 5-10. 5mg/L〇
4. 根據權利要求1所述的透明質酸酶，其特征在于，所述組合物中包含氯化 鈉 92.815-102. 585mmol/L,氯化鉀 4.465-4. 935mmol/L，硫酸鎂 0·19-0. 21mmol/ L，氯化鈣1. 9-2. 1 mmol/L，碳酸氫鈉3. 8-4. 2mmol/L，4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPES 19. 95-22. 05mmol/L，葡萄糖 2. 66-2. 94mmol/L，丙酮酸鈉 （λ 314-0. 347mmol/L、乳酸鈉 2. 274-2. 514g/L、丙氨酰谷氨酰胺 0. 95-1. 05mmol/L、?；撬?0. 095-0. 105mmol/L，非必需 氨基酸 〇· 95%-1· 05%, v/v，磷酸二氫鉀 0· 352-0. 389mmol/L,慶大霉素 9. 5-10. 5 mg/L,酚 紅 9. 5-10. 5mg/L,人血清白蛋白 11. 4%-12· 6%, v/v，透明質酸酶 247. 57-273. 63mg/L。
5. 根據權利要求4所述的透明質酸酶，其特征在于，所述非必需氨基酸為L-丙氨酸、 L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸中的一種或者幾 種。
6. 根據權利要求1所述的透明質酸酶，其特征在于透明質酸酶的溶劑采用超純水。
7. 制備權利要求1-6所述的透明質酸酶的方法，其特征在于包括下面步驟： (1) 透明質酸酶基礎液的配制 a、 先按照比例稱量各組分，并分開放置； b、 先將除殺菌劑、指示劑、碳酸氫鈉外的稱量好的組分溶于超純水中，溶解過程中遵循 先固體后液體，NaHC03最后加入的原則； c、 向步驟b所得溶液中加入稱量好的殺菌劑、指示劑和NaHC03 ; d、 檢測溶液滲透壓和pH值，如果pH值不在范圍內則用配制好的鹽酸和氫氧化鈉溶液 調節(jié)pH值，并記錄最終滲透壓和pH值； (2) 透明質酸酶原液的配制 a、 在基礎液中加入透明質酸酶，在超凈工作臺下利用0. 2 μ m的濾膜過濾除菌，得到濾 液A ; b、 在濾液A中加入人血清白蛋白，震蕩或攪拌混合均勻，得到透明質酸酶的原液； (3) 透明質酸酶原液的處理 在無菌環(huán)境下對過濾后的溶液進行分裝封口，得到市售的透明質酸酶，將其放置冰箱 或冷庫內保存； (4) 透明質酸酶進行檢測 檢測項目是pH值、滲透壓、細胞毒性、皮內刺激、致敏、無菌、熱原、細菌內毒素、體外鼠 胚試驗來判斷透明質酸酶是否合格。
【文檔編號】C12N5/075GK104140952SQ201410388804
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權日:2014年8月8日
【發(fā)明者】王維華, 呂汝舉, 劉美靜, 莊巍, 王英超 申請人:山東威高新生醫(yī)療器械有限公司