一株高產(chǎn)尼莫克汀的產(chǎn)色鏈霉菌及其篩選方法
【專利摘要】一株高產(chǎn)尼莫克汀的產(chǎn)色鏈霉菌，分類名稱為產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces?cyanneorisens)DC18-01，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會，保藏編號為CGMCC?No.6217，保藏日期為2012年6月14日。本發(fā)明還提供了一株高產(chǎn)尼莫克汀的產(chǎn)色鏈霉菌的篩選方法，包括下述步驟：a、出發(fā)菌株斜面培養(yǎng)；b、制備孢子液；c、紫外線誘變篩選；d、斜面培養(yǎng)；e、種瓶培養(yǎng)；f、對照菌液的制備；g發(fā)酵搖瓶篩選；h菌株復(fù)試；i、穩(wěn)定性考察。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)量的方法，具體涉及一株高產(chǎn)尼莫克汀 的產(chǎn)色鏈霉菌及其篩選方法。 一株高產(chǎn)尼莫克汀的產(chǎn)色鏈霉菌及其篩選方法

【背景技術(shù)】
[0002] 尼莫克汀是由產(chǎn)色鏈霉菌或者藍灰鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類 抗生素，它主要用于合成親脂性更強的莫西克汀。從結(jié)構(gòu)上來看，尼莫克汀屬于大環(huán)內(nèi)酯類 抗生素，這類聚酮結(jié)構(gòu)物質(zhì)的生物合成過程呈現(xiàn)相似的規(guī)律，它是由7個乙酸鹽單位，6個 丙酸鹽單位和一個2-甲基丙酸鹽單位，通過聚酮體（多聚乙酰）途徑不斷縮合而成。構(gòu)成 尼莫克汀的原子全部來源于糖代謝后產(chǎn)生的支鏈脂肪酸、乙酸鹽及丙酸鹽，乙酸鈉為尼莫 克汀的一種前體誘導(dǎo)物質(zhì)，如果能夠篩選到一株能夠耐受高濃度乙酸鈉的突變株，且該突 變株能夠直接利用乙酸鈉做為合成前體誘導(dǎo)物，可以大幅提升尼莫克汀的產(chǎn)量，對尼莫克 汀的工業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，發(fā)明了能夠耐受高濃度乙酸鈉的一株高產(chǎn)尼莫 克汀的產(chǎn)色鏈霉菌，而且本發(fā)明還提供了其篩選方法。
[0004] 本發(fā)明為實現(xiàn)其目的采用的技術(shù)方案是：
[0005] -株高產(chǎn)尼莫克汀的產(chǎn)色鏈霉菌，分類名稱為產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces cyanneorisens)DC18-〇l，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會，保藏編號為CGMCC No. 6217,保藏日期為2012年6月14日。
[0006] -種如所述的一株高產(chǎn)尼莫克汀的產(chǎn)色鏈霉菌的篩選方法，包括以下操作步 驟：
[0007] a、出發(fā)菌株斜面培養(yǎng)：以砂土管保藏的產(chǎn)色鏈霉菌為出發(fā)菌株，使用無菌接種針 蘸取少量砂土孢子，劃線接種于試管斜面培養(yǎng)基中，于26-30?、30% -60%濕度條件下培 養(yǎng)96-144h，得到斜面菌種；
[0008] b、制備孢子液：用15_20mL無菌水將步驟a制備的斜面菌種洗下制成孢子液；
[0009] c、紫外線誘變篩選：取5mL步驟b制備的孢子液于滅菌的培養(yǎng)皿中，于波長 254nm、功率30W的紫外燈下30cm處垂直照射120s，照射后立即用無菌錫紙包住，避光靜 置15min，使用無菌水將紫外線照射過的孢子液稀釋至孢子液1(Γ 2-1(Γ8,取稀釋后的孢子液 0. 1-0. 3mL涂布于含有乙酸鈉濃度為0. 1-0. 5mg/L的固體培養(yǎng)基中，26-30°C、30%-60%濕 度條件下培養(yǎng)96-144h，得到成熟的單菌落；
[0010] d、斜面培養(yǎng)：將步驟c培養(yǎng)成熟的單菌落劃線轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，于26-30°C、 30% -60%濕度條件下培養(yǎng)96-144h，得到斜面孢子；
[0011] e、種瓶培養(yǎng)：挖取2_5cm2步驟d制備的斜面孢子接種于種瓶培養(yǎng)基中，于 26-30°C，220-240rpm震蕩培養(yǎng)24-30h得到成熟種液；
[0012] f、對照菌液的制備：以砂土管保藏的的產(chǎn)色鏈霉菌為出發(fā)菌株，依次經(jīng)過步驟a、 步驟b、步驟d、步驟e得到對照菌液；
[0013] g、發(fā)酵搖瓶篩選：以體積比2% -8%的接種量將步驟e制備的成熟種液轉(zhuǎn)接至 含有的乙酸鈉濃度為0. 05-0. 2mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于26-30°C、220-240rpm震蕩培養(yǎng) 240-288h，檢測效價，以體積比2% -8%的接種量將步驟f制備的對照菌液接種至不含乙酸 鈉的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于26-30°C、220-240rpm震蕩培養(yǎng)240-288h，檢測效價，選取檢測效價 高于對照菌液的斜面，向其中加入lmL無菌水，用接種針刮下斜面孢子，制成孢子懸液，吸 取0. 2mL孢子懸液至空白砂土管中，在-750_760mmHg柱條件下干燥4-6h后于2-8°C冰箱中 砂土保藏，得到保藏菌株；
[0014] h、菌株復(fù)試：取步驟g篩選的砂土保藏的砂土孢子劃線接種于斜面培養(yǎng)基中，于 26-30°C、30% -60%濕度條件下培養(yǎng)96-144h ;挖取2-5cm2斜面孢子接種于種瓶培養(yǎng)基中， 于26-30°C、220-240rpm震蕩培養(yǎng)24-30h，得到復(fù)試菌株成熟種液；取出發(fā)菌株的砂土孢 子作相同處理，得到出發(fā)菌株成熟種液，以體積比2% -8%接種量將復(fù)試菌株成熟種液轉(zhuǎn) 接至含有的乙酸鈉濃度為0. 05-0. 2mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，以體積比2% -8%接種量將出 發(fā)菌株成熟種液轉(zhuǎn)接至不含有乙酸鈉的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于26-30°C、220-240rpm震蕩培養(yǎng) 240-288h，檢測效價，并進行效價對比；
[0015] i、穩(wěn)定性考察：取步驟g保藏的砂土孢子劃線接種于斜面培養(yǎng)基中，于26-30°C、 30% -60 %濕度條件下培養(yǎng)96-144h，得到成熟斜面孢子；將成熟斜面孢子再劃線轉(zhuǎn)接于 斜面培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接三次后挖取2-5cm 2斜面孢子接種于種瓶培養(yǎng)基中，于26-30°C、 220-240rpm震蕩培養(yǎng)24-30h得到成熟種液；以體積比2% -8%接種量將成熟種液轉(zhuǎn)接至 含有的乙酸鈉濃度為0. 05-0. 2mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于26-30°C、220-240rpm震蕩培養(yǎng) 240-288h，檢測效價，判斷斜面?zhèn)魅笙噍^于一代斜面接入種瓶再接入發(fā)酵搖瓶后，搖瓶 效價的相對標準偏差。
[0016] 操作中所用斜面培養(yǎng)基成分及用量（g/l〇〇mL)為：葡萄糖0.3-0. 5、麥芽糖 0. 1-0. 15、酵母膏或酵母粉0. 3-0. 5、淀粉0. 4-0. 6、黃豆餅粉0. 4-0. 6、糊精0. 4-0. 6、磷酸 氫二鉀(λ 01-0. 03、瓊脂 1-2。
[0017] 操作中固體培養(yǎng)基成分及用量（g/l〇〇mL)為：葡萄糖0. 3-0. 5、麥芽糖0. 1-0. 15、 酵母膏或酵母粉〇. 3-0. 5、淀粉0. 4-0. 6、黃豆餅粉0. 4-0. 6、糊精0. 4-0. 6、磷酸氫二鉀 0· 01-0. 03、瓊脂 1-2。
[0018] 操作中種瓶培養(yǎng)基成分及用量（g/l〇〇mL)為：葡萄糖0. 5-2、糊精1-3、黃豆餅粉 1-2、酵母膏或酵母粉1-2、硫酸鎂0. 05-0. 2、磷酸氫二鉀0. 05-0. 2。
[0019] 操作中發(fā)酵培養(yǎng)基成分及用量（g/l〇〇mL)為：葡萄糖1-3、淀粉1-3、糊精3-5、乳 糖2-4、黃豆餅粉1-1. 5、棉籽餅粉0. 5-1、碳酸鈣0. 3-0. 5。
[0020] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明為一株高產(chǎn)尼莫克汀的產(chǎn)色鏈霉菌，本發(fā)明方法是 一種操作簡單、高效的提高產(chǎn)色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀水平的方法，通過將高濃度乙酸 鈉添加在固體培養(yǎng)基中，結(jié)合紫外誘變最終篩選出了一株能夠耐受發(fā)酵搖瓶0. 2mg/L乙酸 鈉的菌株，比出發(fā)菌株的尼莫克汀產(chǎn)量提高20%以上。

【具體實施方式】
[0021] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，發(fā)明了能夠耐受高濃度乙酸鈉的一株高產(chǎn)尼莫 克汀的產(chǎn)色鏈霉菌，而且本發(fā)明還提供了其篩選方法，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進一 步說明。
[0022] 具體實施例1，一株高產(chǎn)尼莫克汀的產(chǎn)色鏈霉菌，分類名稱為產(chǎn)色鏈霉菌 (Streptomyces cyanneorisens) DC18-01，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會，保藏編 號為CGMCC No. 6217,保藏日期為2012年6月14日。
[0023] 0. lmg/L乙酸鈉濃度紫外線誘變篩選
[0024] -株高產(chǎn)尼莫克汀的產(chǎn)色鏈霉菌的篩選方法，包括以下操作步驟：
[0025] a、出發(fā)菌株斜面培養(yǎng)：以砂土管保藏的的產(chǎn)色鏈霉菌為出發(fā)菌株，使用無菌接種 針蘸取少量砂土孢子，劃線接種于試管斜面培養(yǎng)基中，于28°C、30% -60%濕度條件下培養(yǎng) 120h ；
[0026] b、制備孢子液：用15_20mL無菌水將步驟a制備的斜面菌種洗下制成孢子液；
[0027] c、紫外線誘變篩選：取5mL步驟b制備的孢子液于滅菌的培養(yǎng)皿中，于波長 254nm、功率30W的紫外燈下30cm處垂直照射0s、30s、60s、90s和120s，照射后立即用無菌 錫紙包住，避光靜置15min，使用無菌水將紫外線照射過的孢子液稀釋至孢子液1(Γ 2-1(Γ8， 依次取0. 2mL稀釋后的孢子液涂布于含有的乙酸鈉濃度為0. lmg/L的固體培養(yǎng)基中，28°C、 40%-50%濕度條件下培養(yǎng)12011，0-2411正置培養(yǎng)，24-12011倒置培養(yǎng)，以種液紫外照射0 8 為對照，統(tǒng)計致死率，結(jié)果見表1 ;
[0028] 表1.不同紫外線照射時間的致死率（1)
[0029]

【權(quán)利要求】
1. 一株高產(chǎn)尼莫克汀的產(chǎn)色鏈霉菌，其特征在于：分類名稱為產(chǎn)色鏈霉菌 (Streptomyces cyanneorisens) DC18-01，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會，保藏編 號為CGMCC No. 6217,保藏日期為2012年6月14日。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株高產(chǎn)尼莫克汀的產(chǎn)色鏈霉菌的篩選方法，其特征在于， 包括以下操作步驟： a、 出發(fā)菌株斜面培養(yǎng)：以砂土管保藏的產(chǎn)色鏈霉菌為出發(fā)菌株，使用無菌接種針蘸 取少量砂土孢子，劃線接種于試管斜面培養(yǎng)基中，于26-30?、30% -60%濕度條件下培養(yǎng) 96-144h，得到斜面菌種； b、 制備孢子液：用15-20mL無菌水將步驟a制備的斜面菌種洗下制成孢子液； c、 紫外線誘變篩選：取5mL步驟b制備的孢子液于滅菌的培養(yǎng)皿中，于波長254nm、功 率30W的紫外燈下30cm處垂直照射120s，照射后立即用無菌錫紙包住，避光靜置15min，使 用無菌水將紫外線照射過的孢子液稀釋至孢子液1〇_ 2_1〇_8,取稀釋后的孢子液〇. 1-0. 3mL 涂布于含有乙酸鈉濃度為〇. 1-0. 5mg/L的固體培養(yǎng)基中，26-30°C、30% -60%濕度條件下 培養(yǎng)96-144h，得到成熟的單菌落； d、 斜面培養(yǎng)：將步驟c培養(yǎng)成熟的單菌落劃線轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，于26-30°C、 30% -60%濕度條件下培養(yǎng)96-144h，得到斜面孢子； e、 種瓶培養(yǎng)：挖取2-5cm2步驟d制備的斜面孢子接種于種瓶培養(yǎng)基中，于26-30°C， 220-240rpm震蕩培養(yǎng)24-30h得到成熟種液； f、 對照菌液的制備：以砂土管保藏的的產(chǎn)色鏈霉菌為出發(fā)菌株，依次經(jīng)過步驟a、步驟 b、步驟d、步驟e得到對照菌液； g、 發(fā)酵搖瓶篩選：以體積比2% -8%的接種量將步驟e制備的成熟種液轉(zhuǎn)接至含有的 乙酸鈉濃度為〇. 05-0. 2mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于26-30°C、220-240rpm震蕩培養(yǎng)240-288h， 檢測效價，以體積比2% -8%的接種量將步驟f制備的對照菌液接種至不含乙酸鈉的發(fā)酵 培養(yǎng)基中，于26-30°C、220-240rpm震蕩培養(yǎng)240-288h，檢測效價，選取檢測效價高于對照 菌液的斜面，向其中加入lmL無菌水，用接種針刮下斜面孢子，制成孢子懸液，吸取0. 2mL孢 子懸液至空白砂土管中，在-750-760mmHg柱條件下干燥4-6h后于2-8°C冰箱中砂土保藏， 得到保藏菌株； h、 菌株復(fù)試：取步驟g篩選的砂土保藏的砂土孢子劃線接種于斜面培養(yǎng)基中，于 26-30°C、30% -60%濕度條件下培養(yǎng)96-144h ;挖取2-5cm2斜面孢子接種于種瓶培養(yǎng)基中， 于26-30°C、220-240rpm震蕩培養(yǎng)24-30h，得到復(fù)試菌株成熟種液；取出發(fā)菌株的砂土孢 子作相同處理，得到出發(fā)菌株成熟種液，以體積比2% -8%接種量將復(fù)試菌株成熟種液轉(zhuǎn) 接至含有的乙酸鈉濃度為0. 05-0. 2mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，以體積比2% -8%接種量將出 發(fā)菌株成熟種液轉(zhuǎn)接至不含有乙酸鈉的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于26-30°C、220-240rpm震蕩培養(yǎng) 240-288h，檢測效價，并進行效價對比； i、 穩(wěn)定性考察：取步驟g保藏的砂土孢子劃線接種于斜面培養(yǎng)基中，于26-30°C、 30% -60%濕度條件下培養(yǎng)96-144h，得到成熟斜面孢子；將成熟斜面孢子再劃線轉(zhuǎn)接于 斜面培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接三次后挖取2-5cm 2斜面孢子接種于種瓶培養(yǎng)基中，于26-30°C、 220-240印111震蕩培養(yǎng)24-3011得到成熟種液 ；以體積比2(%-8(%接種量將成熟種液轉(zhuǎn)接至 含有的乙酸鈉濃度為0. 05-0. 2mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于26-30°C、220-240rpm震蕩培養(yǎng) 240-288h，檢測效價，判斷斜面?zhèn)魅笙噍^于一代斜面接入種瓶再接入發(fā)酵搖瓶后，搖瓶 效價的相對標準偏差。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一株高產(chǎn)尼莫克汀的產(chǎn)色鏈霉菌的篩選方法，其特征在 于：操作中所用斜面培養(yǎng)基成分及用量（g/l〇〇mL)為：葡萄糖0. 3-0. 5、麥芽糖0. 1-0. 15、 酵母膏或酵母粉〇. 3-0. 5、淀粉0. 4-0. 6、黃豆餅粉0. 4-0. 6、糊精0. 4-0. 6、磷酸氫二鉀 0· 01-0. 03、瓊脂 1-2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一株高產(chǎn)尼莫克汀的產(chǎn)色鏈霉菌的篩選方法，其特征在于： 操作中固體培養(yǎng)基成分及用量（g/l〇〇mL)為：葡萄糖0. 3-0. 5、麥芽糖0. 1-0. 15、酵母膏或 酵母粉0. 3-0. 5、淀粉0. 4-0. 6、黃豆餅粉0. 4-0. 6、糊精0. 4-0. 6、磷酸氫二鉀0. 01-0. 03、瓊 脂 1-2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一株高產(chǎn)尼莫克汀的產(chǎn)色鏈霉菌的篩選方法，其特征在于： 操作中種瓶培養(yǎng)基成分及用量（g/l〇〇mL)為：葡萄糖0. 5-2、糊精1-3、黃豆餅粉1-2、酵母 膏或酵母粉1-2、硫酸鎂0. 05-0. 2、磷酸氫二鉀0. 05-0. 2。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一株高產(chǎn)尼莫克汀的產(chǎn)色鏈霉菌的篩選方法，其特征在于： 操作中發(fā)酵培養(yǎng)基成分及用量（g/l〇〇mL)為：葡萄糖1-3、淀粉1-3、糊精3-5、乳糖2-4、黃 豆餅粉1-1. 5、棉籽餅粉0. 5-1、碳酸鈣0. 3-0. 5。
【文檔編號】C12N1/20GK104109648SQ201410327571
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】李明, 楊麗鋒 申請人:河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司