梨轉(zhuǎn)錄因子PsJOINTLESS及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了梨轉(zhuǎn)錄因子PsJOINTLESS及其應(yīng)用。一種分離自‘庫(kù)爾勒香梨’具有促進(jìn)植物器官脫落功能的轉(zhuǎn)錄因子PsJOINTLESS基因，屬于MADS-box家族成員，其核苷酸序列為SEQ?ID?No.1所示，其編碼的氨基酸序列為序列表SEQ?ID?No.2所示。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化方法將轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)化番茄，獲得的轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)生物學(xué)功能驗(yàn)證，表明本發(fā)明克隆的PsJOINTLESS基因具有促進(jìn)植物器官脫落的功能。PsJOINTLESS基因的發(fā)現(xiàn)，為促進(jìn)植物器官脫落的分子育種提供新的基因資源，為實(shí)施綠色農(nóng)業(yè)提供新的遺傳資源，該遺傳資源的開發(fā)利用有利于降低農(nóng)業(yè)成本和實(shí)現(xiàn)環(huán)境友好。
【專利說明】梨轉(zhuǎn)錄因子PsJOINTLESS及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及梨轉(zhuǎn)錄因子PsJOINTLESS及其應(yīng)用，具體 涉及從'庫(kù)爾勒香梨'中分離、克隆得到一個(gè)植物器官脫落相關(guān)的MADS-box家族成員 PsJOINTLESS基因及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 器官脫落，是指植物細(xì)胞、組織或器官脫離母體的生理過程。器官脫落是細(xì)胞結(jié) 構(gòu)、代謝和基因表達(dá)變化共同作用的結(jié)果。一般情況下，把器官或組織脫落的組織區(qū)域及其 鄰近部分稱為"離區(qū)（Abscission Zone)"，而把此區(qū)域內(nèi)僅發(fā)生組織與細(xì)胞分離的數(shù)層細(xì) 胞叫"離層"。對(duì)多種植物園藝植物器官離區(qū)的解剖結(jié)構(gòu)觀察顯示，不同植物離層細(xì)胞大小 有3種類型：①離層細(xì)胞比鄰近細(xì)胞小，大多等徑；離層細(xì)胞比鄰近細(xì)胞小，大多長(zhǎng)方形；離 層細(xì)胞大小與相鄰細(xì)胞近似。器官或組織脫落的組織區(qū)域內(nèi)細(xì)胞小而等徑，胞質(zhì)致密，胞間 隙?。―eng et al, 2007 ;Rosales et al, 2009 ;Ayeh et al, 2009)。
[0003] 植物激素在植物器官脫落的發(fā)生過程中起著一定的作用，其中乙烯和生長(zhǎng)素類激 素發(fā)揮主要作用（Meir et al，2010;Patterson and Bleecker，2004)。生長(zhǎng)素在器官脫落 過程中與乙烯的作用相拮抗，它控制離區(qū)細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間對(duì)乙烯產(chǎn)生應(yīng)答，而乙烯則影 響生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸。
[0004] 器官分離脫落是細(xì)胞壁和中膠層在離層部位斷裂的結(jié)果。在離層產(chǎn)生的過 程中，果膠降解，胞間層增大，開孔并消失，期間伴隨微纖絲結(jié)構(gòu)解體，呼吸代謝和細(xì)胞 壁水解酶活性的增加。目前研究最多的是脫落相關(guān)的酶類主要有多聚半乳糖醛酸酶 (Polygalacturonase, PG)、纖維素酶（Cellulase，EG)。此外，參與細(xì)胞壁降解的酶類還有 果膠甲酯酶（Pectinmethylesterase，PME)、過氧化物酶（Peroxidase，P0D)、苯丙氨酸解 氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL)、幾丁質(zhì)酶（Chitinase)、多酚氧化酶、膜相關(guān) 的類受體蛋白激酶（Burr et al，2011)等也與植物器官脫落有關(guān)（Bunya-atichart K et al, 2011 ；ffang et al, 2005)〇
[0005] 脫落過程伴隨著一系列基因表達(dá)的變化，已經(jīng)鑒定出多個(gè)與離區(qū)發(fā)育相關(guān)的 基因。如擬南芥中已發(fā)現(xiàn)的控制花器官離區(qū)發(fā)育的唯一一對(duì)功能重復(fù)基因 BLADE 0N PETI0LEl/2(B0Pl/2)，雙突變體boplbop2中不能形成花器官離區(qū)，而像葉柄發(fā)育和器 官的非對(duì)稱性生長(zhǎng)等性狀也受到不同程度的影響（Norberge et al, 2005 ;McKim et al，2008)。影響番茄花柄離區(qū)發(fā)育的基因 LATERAL SUPPRESSOR(LS)，該基因突變后部分 花柄離區(qū)發(fā)育受到影響而消失（Schumacher et al.，1999)。番爺中，還有其他的一些基 因本身并不影響離區(qū)的形成，但在器官脫落中起著一定的作用。利用VIGS系統(tǒng)特異沉默 了 TAPGs(tomoto abscission-related polygalacturonases)基因，能夠延遲乙烯處理后 番茄葉片的脫落和增加葉片斷裂力，說明此類基因在番茄葉片脫落的過程中扮演重要的角 色（Jiang et al.，2008)。番茄中的CELUcellulasel)基因也參與番茄花柄脫落的過程 (Gonzalez-Bosch et al.，1997)。番爺1，4-β-葡聚糖酶（cel2)反義抑制轉(zhuǎn)基因植株中， 顯著提高了番爺果實(shí)離區(qū)的斷裂力（Brummelll et al·，1999)。
[0006] 對(duì)于植物離區(qū)發(fā)育在模式植物擬南芥、經(jīng)濟(jì)作物番茄、禾本科作物水稻、小麥中的 解析，很大程度上幫助植物育種專家有效解決禾本科植物落粒、果樹生理落果、豆類作物提 前開莢等問題。必須指出的是，雖然已經(jīng)從不同物種中克隆出JOINTLESS序列，但是大部分 JOINTLESS序列在器官脫落過程中的功能仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，有關(guān)JOINTLESS的大部 分信息來源于茄科植物，如番茄、辣椒等，但有關(guān)果樹的JOINTLESS的研究則非常有限。本 發(fā)明以'庫(kù)爾勒香梨'為試材，利用同源克隆技術(shù)，克隆得到梨JOINTLESS基因的全長(zhǎng)序列， 并分析其在脫萼處理、宿萼處理下不同時(shí)期花萼不同部位的表達(dá)特性；構(gòu)建植物超表達(dá)載 體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄使其過量表達(dá)，證明其可能參與番茄 花（果）柄離區(qū)發(fā)育的過程，從而擴(kuò)展了離區(qū)發(fā)育的分子調(diào)控途徑。另外，克隆梨中有關(guān)器 官脫落的基因很大程度上提高作物改良和育種的效率，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)也具有非常重要的理論 和實(shí)踐意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)落花落果轉(zhuǎn)錄因子PsJOINTLESS基因。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供該基因的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0010] 一種分離自'庫(kù)爾勒香梨'具有促進(jìn)植物器官脫落功能的轉(zhuǎn)錄因子PsJOINTLESS 基因，屬于MADS-box家族成員，其核苷酸序列為SEQ ID No. 1所示，包含672bp的開放閱讀 框；編碼224個(gè)氨基酸，其編碼的氨基酸序列為序列表SEQ ID No. 2所示，等電點(diǎn)為5. 48， 分子量為25. 43kDa。。
[0011] 含有本發(fā)明所述PsJOINTLESS基因的重組表達(dá)載體。
[0012] 所述的重組表達(dá)載體，優(yōu)選以PCAMBIA1301為出發(fā)載體，所述PsJOINTLESS基因的 插入位點(diǎn)為Nco I和BstE II之間。
[0013] 含有本發(fā)明所述PsJOINTLESS基因的宿主菌。
[0014] 克隆本發(fā)明所述PsJOINTLESS基因 cDNA序列的引物對(duì)，上游引物PsJOINTLESS-Fl 序列如SEQ ID No. 3所示，下游引物PsJOINTLESS-Rl序列如SEQ ID No. 4所示。
[0015] 本發(fā)明所述PsJOINTLESS基因在促進(jìn)番茄花（果）柄脫落中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明所述的重組表達(dá)載體在促進(jìn)番茄花（果）柄脫落中的應(yīng)用。
[0017] 有益效果
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0019] 1. PsJOINTLESS基因的發(fā)現(xiàn)，為促進(jìn)植物器官脫落的分子育種提供新的基因資源， 為實(shí)施綠色農(nóng)業(yè)提供新的遺傳資源，該遺傳資源的開發(fā)利用有利于降低農(nóng)業(yè)成本和實(shí)現(xiàn)環(huán) 境友好。
[0020] 2.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化方法將轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)化番茄，獲得的轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)生 物學(xué)功能驗(yàn)證，表明本發(fā)明克隆的PsJOINTLESS基因具有促進(jìn)植物器官脫落的功能。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明PsJOINTLESS基因在脫萼處理和宿萼處理后的時(shí)空表達(dá)模式分析。
[0022] 圖2為本發(fā)明PsJOINTLESS基因亞細(xì)胞定位示意圖。
[0023] 其中：圖A，GFP基因（對(duì)照）在明場(chǎng)、圖B，紫外線（UV)光下的成像，圖C為二者 疊加后的成像；圖D和圖E，PsJOINTLESS基因在明場(chǎng)、UV光下的成像，圖F為二者疊加后的 圖像。
[0024] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3的載體構(gòu)建流程示意圖。
[0025] 圖4為PsJOINTLESS基因轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定示意圖。其中，利用PsJOINTLESS 基因特異引物PCR鑒定番茄轉(zhuǎn)基因植株。M :DL2000Marker，P :質(zhì)粒，WT :野生型植株，1-9 : 轉(zhuǎn)基因株系；具有特異條帶的為轉(zhuǎn)基因植株，沒有特定條帶的為假陽性植株。
[0026] 圖5為本發(fā)明PsJOINTLESS基因在轉(zhuǎn)基因植株的基因表達(dá)量分析示意圖（半定量 RT-PCR)。WT為野生型，其余編號(hào)：轉(zhuǎn)基因株系。
[0027] 圖6為轉(zhuǎn)PsJOINTLESS基因的番茄表型觀察示意圖。其中：圖A和圖B分別為野 生型與轉(zhuǎn)基因株系，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出易脫落的癥狀；圖C和圖D分別為野 生型與轉(zhuǎn)基因株系，轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)于野生型番茄，花柄離區(qū)前移，花柄明顯變細(xì)。
[0028] 圖7轉(zhuǎn)基因番茄植株細(xì)胞學(xué)分析。其中：WT :野生型；35S: :PsJOINTLESS為轉(zhuǎn)基因 株系。
[0029] 圖8轉(zhuǎn)基因番茄植株與野生型番茄花柄離區(qū)掃描電鏡示意圖。其中WT :野生型； 35S: :PsJOINTLESS為轉(zhuǎn)基因株系。
[0030] 圖9轉(zhuǎn)基因番爺植株與野生型番爺花柄尚區(qū)透射電鏡不意圖。其中圖A和圖C為 野生型，圖B和圖D為轉(zhuǎn)基因株系。CW :細(xì)胞壁；CH :葉綠體；P :嗜鋨顆粒；S :淀粉粒。
[0031] 圖10轉(zhuǎn)基因番茄植株花柄離區(qū)多聚半乳糖醛酸酶（A)及纖維素酶（B)活性測(cè)定。 其中：WT :野生型；35S: :PsJOINTLESS為轉(zhuǎn)基因株系。
[0032] 圖llPsJOINTLESS超表達(dá)影響離區(qū)形成等相關(guān)基因的表達(dá)。其中：WT :野生型；其 余編號(hào)為轉(zhuǎn)基因株系。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出詳細(xì)的描述。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下， 可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
[0034] 實(shí)施例IPsJOINTLESS基因分離克隆及表達(dá)分析
[0035] 從'庫(kù)爾勒香梨'花萼中抽提RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA用于擴(kuò)增 PsJOINTLESS基因全長(zhǎng)。
[0036] RNA抽提使用Trizol試劑盒（購(gòu)自TakaRa，按照該試劑盒提供的操作說明書操 作），抽提1 μ g總RNA樣品經(jīng)1U DNase (購(gòu)自Thermo公司）。第一鏈cDNA的合成用Τ0Υ0Β0 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（按照該試劑盒提供的說明書操作）。擴(kuò)增基因引物對(duì)為：PsJOINTLESS-Fl : 5'-ATGGATGGCGAGGGAGAAAATTCAG-3'（SEQ ID No.3) ;PsJ0INTLESS-Rl:5'-GGTCACCTTATC AGATGACTTAAACGCAC-3'（SEQ ID Νο·4)。50yL 的反應(yīng)體系中包括 200ng cDNA，lX 緩沖 液（TransStart FastPfu Buffer)，10mM dNTP，lU Taq 聚合酶（TransStart FastPfu DNA Polymerase)(前述緩沖液和Taq聚合酶購(gòu)自TRANS公司），1. 0 μ M上述引物。PCR反應(yīng)在 印pendorf擴(kuò)增儀上按以下程序完成：95°C，預(yù)變性2分鐘，95°C變性20秒，52°C退火20秒， 72°C延伸30秒，35個(gè)熱循環(huán)，72°C延伸10分鐘，4°C保存。產(chǎn)生一條單一 PCR條帶產(chǎn)物。
[0037] PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用AxyGEN小量膠回收試劑盒（購(gòu)自愛 思進(jìn)生物技術(shù)杭州有限公司，中國(guó)）回收DNA片段，步驟參照使用說明?；厥占兓腄NA溶 液與PMD19-T載體（購(gòu)自寶生物工程大連有限公司即TaKaRa公司）進(jìn)行連接反應(yīng)，按說明 書步驟操作。連接反應(yīng)體系總體積是10 μ L，其中包括5 μ L的2 X緩沖液（購(gòu)自寶生物工程 大連有限公司），4. 5yL純化的PCR產(chǎn)物，0. 5yL Τ載體。16°C連接3-4小時(shí)。取10yL連 接產(chǎn)物，采用熱擊法（參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三版，科學(xué)出版社，2002)轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a，在含有50mg/L氨芐霉素的LB固體平板中篩選陽性克隆，挑取5個(gè)陽性克隆測(cè)序（由 上海英俊生物技術(shù)有限公司完成）。測(cè)序結(jié)果表明，PsJOINTLESS基因全長(zhǎng)為694bp，其核苷 酸序列為SEQ ID NO. 1所示，BLAST的結(jié)果分析證明從梨中新得到的基因?yàn)橐粋€(gè)MADS-box 基因家族成員， 申請(qǐng)人:將這個(gè)基因命名為PsJOINTLESS。同源性分析表明，PsJOINTLESS編 碼的氨基酸序列與蘋果的氨基酸長(zhǎng)度一致，同源性達(dá)到98% ;與其他植物的JOINTLESS也 有較高的同源性，如葡萄、辣椒、棉花及番茄，同源性分別為80^^77^^77%及74%。以上 結(jié)果表明本發(fā)明克隆得到的基因確實(shí)是梨中JOINTLESS基因。但是值得一提的是，還未見 相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于蘋果中JOINTLESS基因的功能。
[0038] 為分析PsJOINTLESS基因在脫落過程是否有所響應(yīng)，采用實(shí)時(shí)定量PCR分析該基 因在盛花期對(duì)'庫(kù)爾勒香梨'實(shí)施脫萼處理及宿萼處理后的表達(dá)量的變化。根據(jù)基因全長(zhǎng) 序列，設(shè)計(jì)1對(duì)該基因的熒光定量引物對(duì)，PsJ0INTLESS-F2 :5' -AGACAAGAAGTGGCGGAGAAATC -3'（SEQ ID No.5) ;PsJ0INTLESS-R2:5'-CGTTGTTTGAGTTACAGGGATTGG-3'（SEQ ID Νο·6)。 結(jié)果表明，該基因在梨花萼脫落過程中高度表達(dá)（圖1)。
[0039] 實(shí)施例2PsJ0INTLESS基因亞細(xì)胞定位
[0040] 由于PsJOINTLESS基因有1個(gè)核定位信號(hào)（NLS)，本研究通過農(nóng)桿菌侵染洋蔥表 皮來研究PsJOINTLESS基因的亞細(xì)胞定位。利用RT-PCR擴(kuò)增出PsJOINTLESS基因整個(gè) 〇RF(閱讀框），并在其擴(kuò)增引物兩端加上Nco I和Spe I兩個(gè)酶切位點(diǎn)。首先將擴(kuò)增產(chǎn)物裝 在PMD19-T載體上，從而得到一個(gè)pMD19-TN/S-PsJ0INTLESS重組載體。同時(shí)用Nco I和Spe I雙酶切pMD19-TN/S-PsJ0INTLESS和pCAMBIA1302,將回收酶切的基因與載體骨架相連接， 得到pCAMBIA-1302-PsJ0INTLESS-GFP重組質(zhì)粒，對(duì)重組的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將雙酶切 鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明得到的重組質(zhì)粒pCAMBIA-1302-PsJ0INTLESS-GFP 無誤，并將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。農(nóng)桿菌侵染洋蔥表皮方法詳見黃小三博士畢業(yè)論文 (2011)。結(jié)果表明，對(duì)照載體轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞均充滿熒光（圖2B)，而重組載體轉(zhuǎn)化的 細(xì)胞中只有核中檢測(cè)到熒光（圖2E)，說明PsJOINTLESS是一個(gè)核定位蛋白。
[0041] 實(shí)施例3植物轉(zhuǎn)化超表達(dá)載體的構(gòu)建
[0042] 根據(jù)pCAMBIA-1301載體的多克隆位點(diǎn)和PsJOINTLESS基因的編碼區(qū)序列上的 酶切位點(diǎn)分析，選擇Nco I和BstE II作為內(nèi)切酶。按照一般設(shè)計(jì)引物的原則用Primer Primer3. 0軟件設(shè)計(jì)出帶有酶切位點(diǎn)的引物，其引物對(duì)序列如下所示：
[0043] PsJ0INTLESS-F3:TGCCATGGTGATGGCGAGGGAGAAAATTCAG(SEQ ID NO. 7)
[0044] PsJ0INTLESS-R3:GGGGTCACCTTATCAGATGACTTAAACGCAC(SEQ ID NO. 8)
[0045] 以測(cè)序正確的保存菌液提取質(zhì)粒為模板，進(jìn)行含限制性酶切位點(diǎn)基因的克隆。 PCR擴(kuò)增的退火溫度為52°C，PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序同實(shí)施例1?；厥漳康臈l帶，再連 接PMD19-T載體上，從而構(gòu)建一個(gè)重組載體pMD19-T-PsJ0INTLESS。雙酶切體系總體積為 40yL，其中含有 PCR 的純化產(chǎn)物 12yL，10XK Buffer(購(gòu)自 TakaRa 公司）4yL，Nco I2yL， BstE 112 μ L及水20 μ L。pCAMBIA1301載體的雙酶切體系總體積為40 μ L，其中含有經(jīng)過 質(zhì)粒提取獲得的 PCAMBIA1301 載體 DNA8yL，10XK Buffer(購(gòu)自 TakaRa 公司）4yL，Nco I2yL，BstE II2yL及水24yL。于37°C酶切3-4小時(shí)后回收。經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化過 的表達(dá)載體PCAMBIA1301與PsJOINTLESS基因使用T4DNA連接酶（購(gòu)自TaKaRa公司）于 16°C連接 14-16 小時(shí)。反應(yīng)總體積 10μ L，其中含有 10XT4DNA Ligase Bufferl μ L，T4DNA Ligasel μ L，PsJOINTLESS基因的雙酶切回收產(chǎn)物6 μ L，pCAMBIA1301載體的雙酶切回收產(chǎn) 物2 μ L。取連接產(chǎn)物10 μ L轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α，在含有50mg/L卡那霉素的LB固 體平板中篩選出陽性克隆，抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切及PCR鑒定，測(cè)序結(jié)果確定沒有讀碼框突變， 獲得含有插入目的片段的重組載體，將其命名為pCAMBIA1301-PsJ0INTLESS重組載體，構(gòu) 建完成的載體圖見圖3所示。應(yīng)用凍融法將重組載體導(dǎo)入到農(nóng)桿菌GV3101中。
[0046] 實(shí)施例4番茄的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化植株分子鑒定
[0047] 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化具體步驟參照王保全博士畢業(yè)論文（2012)。按 照上述方法得到轉(zhuǎn)PsJOINTLESS的番茄植株，采用小量法提取番茄植株葉片的總DNA， 以此為模板，采用合成的特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定陽性苗，產(chǎn)物大小為419bp。 PsJ0INTLESS-F4 ：5, -GAGAACAGCAACTACACCATG-3, (SEQ ID NO. 9) ；PsJ0INTLESS-R4 ： 5'-TATCAGATGACTTAAACGCAC-3'（SEQ ID NO. 10)。反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性 3 分鐘，94°C變性 30秒，59 °C退火50秒，72 °C延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)，循環(huán)完成后72 °C延伸10分鐘。番茄轉(zhuǎn) 基因植株鑒定見圖4。
[0048] 轉(zhuǎn)基因番茄PsJOINTLESS表達(dá)水平分析
[0049] 轉(zhuǎn)基因番茄外源基因表達(dá)量采用半定量RT-PCR進(jìn)行表達(dá)水平分析。選取相同發(fā) 育階段的經(jīng)PCR鑒定為陽性番茄植株與野生型番茄植株花柄離區(qū)為材料，提取總RNA并反 轉(zhuǎn)錄為cDNA，半定量檢測(cè)靶基因的表達(dá)量。所用引物為基因特異引物對(duì)：PsJ0INTLESS-F5 : 5,-AGACAAGAAGTGGCGGAGAAATC-3,(SEQ ID NO. 11) ；PsJ0INTLESS-R5 ：5,-CGTTGTTTGAGTTAC AGGGATTGG-3'（SEQ ID N0.12);以番茄 β-actin 為內(nèi)參基因，Leactin-F:5'-ATGGCAGACGG AGAGGATATTCA-3'（SEQ ID N0.13) ;Leactin-R:5'-GCCTTTGCAATCCACATCTGCTG-3'（SEQ ID NO. 14)。反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，35 個(gè)循環(huán)，循環(huán)完成后72°C延伸10分鐘。半定量PCR分析結(jié)果如圖5所示，目的基因在轉(zhuǎn)基 因株系中超量表達(dá)，野生型中沒有表達(dá)。其中#57和#61表達(dá)豐度較高，而#62和#88表達(dá) 豐度略低?？梢钥闯觯康幕虼_實(shí)已經(jīng)整合到了番茄植株中，選取#57、#61、#62及#88用 于隨后的功能的研究。
[0050] 實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察及脫落相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定
[0051] (1)轉(zhuǎn)基因植株表型觀察
[0052] 番茄以其獨(dú)特的花柄離區(qū)結(jié)構(gòu)而成為研究器官脫落的理想模式植物。本專利對(duì)轉(zhuǎn) 基因番茄花柄的脫落率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并且測(cè)定了番茄花柄的直徑及離區(qū)長(zhǎng)度。結(jié)果表明，超表 達(dá)植株表現(xiàn)出花柄離區(qū)前移，花柄明顯變細(xì)（表1)，易脫落等癥狀（圖6)。
[0053] 表IPs JOINTLESS過表達(dá)番茄植株生理指標(biāo)測(cè)定
[0054]

【權(quán)利要求】
1. 一種分離自'庫(kù)爾勒香梨'具有促進(jìn)植物器官脫落功能的轉(zhuǎn)錄因子PsJOINTLESS基 因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2. 權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子PsJOINTLESS基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3. 含有權(quán)利要求1所述基因的重組表達(dá)載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于以pCAMBIA1301為出發(fā)載體，權(quán)利 要求1所述基因的插入位點(diǎn)為Nco I和BstE II之間。
5. 含有權(quán)利要求1所述基因的宿主菌。
6. 克隆權(quán)利要求1所述基因 cDNA序列的引物對(duì)，其特征在于上游引物 PsJOINTLESS-Fl 序列如 SEQ ID No. 3 所示，下游引物 PsJOINTLESS-Rl 序列如 SEQ ID No. 4 所示。
7. 權(quán)利要求1所述的基因在促進(jìn)番茄花（果）柄脫落中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體在促進(jìn)番茄花（果）柄脫落中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK104099344SQ201410340408
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】張紹鈴, 齊笑笑, 黃小三 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)