專利名稱：胡楊nac1基因啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胡楊(Populus euphratica)NACl基因啟動(dòng)子PeNAClP的分離鑒定，序 列分析，誘導(dǎo)活性分析、其全長(zhǎng)及缺失片斷植物表達(dá)載體的構(gòu)建及該啟動(dòng)子的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
NAC轉(zhuǎn)錄因子是近十年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在植物的生長(zhǎng)發(fā) 育、器官建成、激素調(diào)節(jié)和防御抵抗多種生物和非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要作用。但對(duì) NAC類轉(zhuǎn)錄因子的研究還剛處于起步階段，無(wú)論是它們的上游調(diào)控因子還是其調(diào)控的下游 靶基因，都不是很清楚。目前只報(bào)道有AP3/PI (MADS box)調(diào)控NAP的表達(dá)(Sablowski et al.，1998)，STM(KNOX)和MP(ARF)正調(diào)控CUC1/CUC2的表達(dá)，但它們也受到MYB類轉(zhuǎn) 錄因子ASl (ASYMMETRIC)和AS2的負(fù)調(diào)節(jié)(Hibara et al.，2003)；擬南芥的另外一基 因NACl過(guò)量表達(dá)促進(jìn)生長(zhǎng)素應(yīng)答基因AIR3 (AUXIN-INDUCED IN ROOT CULTURES 3)和 DBP (DNA-BINDINGPR0TEIN)的增強(qiáng)表達(dá)，表明它們可能為NACl的下游基因(Neuteboom et al.，1999)。但這些基因都是與發(fā)育相關(guān)的，在逆境誘導(dǎo)相關(guān)的NAC類轉(zhuǎn)錄因子中， 擬南芥脅迫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子ANAC019，ANAC055,和ANAC072能夠與早期應(yīng)答脫水脅迫基因 ERDl (EARLY RESPONSIVE T0DEHYDRATI0N STRESS 1 gene)的啟動(dòng)子區(qū)域的一段順式作用 元件CATGTG序列結(jié)合，正調(diào)控脫水脅迫基因ERDl的表達(dá)，增強(qiáng)植物的耐旱性(Tran LS et al.，2004)，表明脅迫應(yīng)答基因ERDl是NAC類轉(zhuǎn)錄因子的下游調(diào)節(jié)基因。對(duì)逆境誘導(dǎo)相關(guān) 的NAC類轉(zhuǎn)錄因子的上游調(diào)控研究中，還沒(méi)有報(bào)道過(guò)它們的上游調(diào)節(jié)因子。胡楊長(zhǎng)期生長(zhǎng)在我國(guó)西北荒漠、半荒漠地區(qū)，在起到防風(fēng)固沙、改善生態(tài)環(huán)境作用 的同時(shí)，也形成了極強(qiáng)地耐極端環(huán)境能力，其豐富的逆境基因資源也受到越來(lái)越多的研究 者的關(guān)注。我們從胡楊中分離得到一種與干旱、高鹽等逆境相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白，命名 為PeNACl，在應(yīng)答非生物脅迫同時(shí)也受到赤霉素、生長(zhǎng)素(IAA)等激素的調(diào)節(jié)。前人的研究 表明，擬南芥AtNAC2對(duì)鹽脅迫影響植物根發(fā)育的應(yīng)答需要乙烯和生長(zhǎng)素信號(hào)途徑參與，說(shuō) 明AtNAC2可能是一個(gè)整合環(huán)境和內(nèi)源激素信號(hào)的轉(zhuǎn)錄因子(He et al.，2005)。對(duì)胡楊中 PeNACl基因上游啟動(dòng)子的分離鑒定、可能包含的順式作用元件及其功能的研究為進(jìn)一步研 究胡楊PeNACl基因的上游調(diào)控因子以及PeNACl基因調(diào)控植物抗逆性的調(diào)控機(jī)制提供可能。同時(shí)，前人的研究表明利用組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)脅迫誘導(dǎo)DREB類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)， 在提高受體植物的耐受性的同時(shí)，也會(huì)造成受體植物的生長(zhǎng)受抑，植株生長(zhǎng)緩慢，植株矮 ??；而在選用了一個(gè)脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd-29A啟動(dòng)子與DREB類轉(zhuǎn)錄因子連接轉(zhuǎn)化受體植 物，能夠產(chǎn)生不影響植物生長(zhǎng)的脅迫耐受植物(JP專利公開(kāi)No. 2000-116260)。本研究提供 的胡楊PeNACl基因啟動(dòng)子PeNAClP屬誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在研究其功能的基礎(chǔ)上也為產(chǎn)生正常 的耐受轉(zhuǎn)基因植株提供可選擇的啟動(dòng)子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是發(fā)現(xiàn)一種在耐逆木本植物例如胡楊中能有效發(fā)揮作用的脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子，并提供利用該啟動(dòng)子適應(yīng)新的環(huán)境脅迫的耐逆植物。本發(fā)明涉及一種來(lái)源于胡楊的脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子由如下的DNA核苷酸序 列組成1)序列表中SEQ ID No 1所示的DNA核苷酸序列。2)能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表SEQ ID No 1中限定的DNA序列雜交的核苷酸序 列。序列表中的SEQ ID No :1由1217個(gè)堿基組成。利用PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)分析PeNACl啟動(dòng)子序列，預(yù)測(cè)其順式作用元件(如表1所示)。 根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)PeNACl啟動(dòng)子序列上主要存在一些環(huán)境因子應(yīng)答元件和激素應(yīng)答 元件。此外，還發(fā)現(xiàn)與病菌，鹽誘導(dǎo)相關(guān)的元件GT1GMSCAM4 (GAAAAA)，這個(gè)元件存在于大豆 CaM4基因啟動(dòng)子中，介導(dǎo)病菌，鹽信號(hào)。SUSIBA2蛋白在大麥中與WB0XHVIS01位點(diǎn)結(jié)合，參 與糖信號(hào)傳導(dǎo)。ABRERATCAL是響應(yīng)鈣離子的順式元件，在162個(gè)鈣離子上調(diào)基因上游皆存 在ABRERATCAL元件。在啟動(dòng)子序列中還發(fā)現(xiàn)一些和激素誘導(dǎo)相關(guān)的同源元件，GAREAT和 WRKY710S與GA誘導(dǎo)相關(guān)。W-BOX在擬南芥NPRl啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)，能被受SA誘導(dǎo)的WRKY蛋 白特異性識(shí)別。在啟動(dòng)子中還存在許多于光信號(hào)相關(guān)的同源元件，如GT1，GATAB0X等。綜上所述，我們推測(cè)該啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，受鈣離子、多種逆境因素和激素的 調(diào)控。
權(quán)利要求
從胡楊(Populus euphratica)中鑒定的NAC1基因的啟動(dòng)子，是下述核苷酸之一1)序列表中SEQ ID No1所示的DNA核苷酸序列。2)能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表SEQ ID No1中限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的序列，其特征是含有多處與干旱，高鹽和激素誘導(dǎo)相關(guān)的順式 作用元件的同源序列，如MYB和MYC識(shí)別的作用元件，此元件和水分脅迫和ABA誘導(dǎo)相關(guān)； G-box與JA誘導(dǎo)相關(guān)；W-BOX與SA誘導(dǎo)相關(guān)；GAREAT與GA誘導(dǎo)相關(guān)。與病菌，鹽誘導(dǎo)相關(guān) 的元件GT1GMSCAM4，響應(yīng)鈣離子的順式元件ABRERATCAL，參與糖信號(hào)傳導(dǎo)的WB0XHVIS01。
3.權(quán)利要求1所述的序列，瞬時(shí)表達(dá)分析它是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，受鹽和GA、IAA誘導(dǎo)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子片段全部或部分序列構(gòu)建的植物表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子片段全部或部分序列構(gòu)建的宿主菌。
6.權(quán)利要求4所述的植物表達(dá)載體在改良植物抗旱，耐鹽性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公布了胡楊(Ammopiptanthus mongolicus)PeNAC1基因1217bp啟動(dòng)子序列，命名為PeNAC1P，PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)分析預(yù)測(cè)PeNAC1P含有多處與干旱、高鹽和ABA、GA、JA、SA、MeJA等激素誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件；與病菌，鹽誘導(dǎo)相關(guān)的元件；響應(yīng)鈣離子的順式元件；參與糖信號(hào)傳導(dǎo)的順式元件。瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)分析，PeNAC1P啟動(dòng)子活性受鹽、GA、IAA誘導(dǎo)。本研究提供的胡楊PeNAC1P啟動(dòng)子屬誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在研究其功能的基礎(chǔ)上也為產(chǎn)生正常的耐受轉(zhuǎn)基因植株提供可選擇的啟動(dòng)子。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101955929SQ20091015816
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2009年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日
發(fā)明者夏新莉, 尹偉倫, 王俊英 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所