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      一種檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物及其使用方法

      文檔序號(hào):482659閱讀:448來(lái)源:國(guó)知局
      一種檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物及其使用方法
      【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物,所述組合物包括SEQ?NO:1至SEQ?NO:17的引物序列,還包括SEQ?NO:18至SEQ?NO:21的block序列。本發(fā)明對(duì)腸癌相關(guān)突變的檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、受污染小、操作簡(jiǎn)單快速、安全性等優(yōu)點(diǎn),檢測(cè)結(jié)果具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性,尤其適合從血漿等體液中檢測(cè)腸癌驅(qū)動(dòng)基因的熱點(diǎn)突變,可以實(shí)時(shí)、無(wú)創(chuàng)地對(duì)腸癌患者進(jìn)行診斷,復(fù)發(fā)監(jiān)控和療效評(píng)估,具有重要的價(jià)值。
      【專利說(shuō)明】
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域,特別是涉及檢測(cè)腸癌驅(qū)動(dòng)基因熱點(diǎn)突變的組合物。 -種檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物及其使用方法

      【背景技術(shù)】
      [0002] 腸癌是結(jié)直腸癌和直腸癌的總稱,大腸癌的發(fā)病率從高到低依次為直腸、乙狀結(jié) 腸、盲腸、升結(jié)腸、降結(jié)腸及橫結(jié)腸,近年有向近端(右半結(jié)腸)發(fā)展的趨勢(shì)。腸癌的發(fā)病與 生活方式、遺傳、大腸腺瘤等關(guān)系密切。
      [0003] 研究發(fā)現(xiàn),腸癌的發(fā)生與KRAS、BRAF、PIK3CA熱點(diǎn)基因的突變有很大的關(guān)系。 K-ras基因位于12號(hào)染色體短臂上,35kb,屬于Ras基因家族的一員。在Ras基因中,K_Ras 對(duì)人類癌癥影響最大,它好像分子開(kāi)關(guān):正常時(shí)能控制調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的路徑;發(fā)生異常時(shí), 則導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng),并阻止細(xì)胞自我毀滅。它參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞,當(dāng)K-ras基因突變 時(shí),該基因永久活化,不能產(chǎn)生正常的ras蛋白,使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)紊亂,細(xì)胞增殖失控而 癌變。K-ras基因檢測(cè)是目前醫(yī)生了解大腸癌患者癌基因狀況最直接、最有效的方法???K-ras基因有沒(méi)有突變,可以篩選出抗EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體)靶向藥物治療有效的大腸 癌患者,實(shí)現(xiàn)腫瘤病人的個(gè)體化治療,從而延長(zhǎng)患者生存期。BRAF基因基因編碼一種絲/蘇 氨酸特異性激酶,參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件,如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等。在結(jié)直腸 癌患者中,BRAF基因突變率為15%,美國(guó)國(guó)家癌癥綜合治療聯(lián)盟《結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》 (V3. 2011)建議,在使用愛(ài)必妥或帕尼單抗等靶向藥物時(shí),須檢測(cè)腫瘤組織KRAS基因狀態(tài), 如果KRAS無(wú)突變,應(yīng)考慮檢測(cè)BRAF基因狀態(tài)。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)是EGFR下游信號(hào) 分子,可被生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶(如EGFR)激活,使絲/蘇氨酸激酶(AKT)磷酸化產(chǎn)生 多種生物學(xué)效應(yīng),包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和細(xì)胞周期調(diào)控等。研究發(fā)現(xiàn)PIK3CA基因產(chǎn)生 突變與結(jié)腸癌等多種癌癥發(fā)病存在相關(guān)性,32%的結(jié)腸癌患者體內(nèi)基因 PIK3CA存在突變 而在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、乳腺癌和肺癌患者中,該基因存在突變的比例分別為 8%和4%。NRAS基因是RAS基因家族中的一員,參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞。目前,應(yīng)用于腸 癌靶向治療的藥物主要有愛(ài)必妥(默克公司)和帕尼單抗(安進(jìn)公司),然而靶向藥物在不 同患者中有不同的療效,有效率約為20?50%。通過(guò)對(duì)腸癌患者進(jìn)行靶基因突變檢測(cè),能 夠科學(xué)的判斷該病人能否適應(yīng)靶向藥物治療,指導(dǎo)病人用藥,實(shí)現(xiàn)病人的個(gè)體化醫(yī)療。
      [0004] 目前檢測(cè)基因突變的方法主要有以下幾種:
      [0005] (1)直接測(cè)序法。直接測(cè)序法是運(yùn)用探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和 TA克隆并再次測(cè)序以最終確定突變的堿基位置。該方法比較繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng),而且由于自身的 限制導(dǎo)致其靈敏度不高,只能對(duì)含量大于20 %的基因突變進(jìn)行檢測(cè)。因此,此法不適合在臨 床中的應(yīng)用與大量的臨床樣本分析。
      [0006] (2)變性高效液相色譜法(DHPLC)。該方法的原理是基于發(fā)生錯(cuò)配的雜合雙鏈DNA 與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特征的差異將他們分離開(kāi)。通過(guò)洗脫峰的不同判斷有無(wú)突 變存在。DHPLC可檢測(cè)出含有單個(gè)檢測(cè)的突變、插入或者缺失的異源雙鏈片段。該法對(duì)已知 和未知的突變位點(diǎn)均可以檢測(cè),敏感性在5%左右,但檢測(cè)過(guò)程中需要打開(kāi)反應(yīng)管,容易造 成污染,而且陽(yáng)性結(jié)果不能確認(rèn)其具體未知,最終還需測(cè)序確認(rèn)。
      [0007] (3)高分辨率熔解曲線(HRM)。高分辨率熔解曲線是基于核酸的物理性質(zhì),通過(guò)飽 和染料結(jié)合于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,監(jiān)控產(chǎn)物熔解曲線的變化分析基因突變。檢測(cè)敏感性在5%左 右,對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果并不能確定其具體位置,最終還需要通過(guò)測(cè)序加以確認(rèn)。
      [0008] (4)探針擴(kuò)增阻滯突變法(ARMS)。利用PCR引物的3'端末位堿基必須與其模板 DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理,設(shè)計(jì)針對(duì)突變位點(diǎn)的特異性PCR擴(kuò)增引物,在嚴(yán)格的條件 下,只有在引物3'堿基與模板配對(duì)時(shí)PCR擴(kuò)增反應(yīng)才能正常進(jìn)行,從而檢測(cè)出突變。通過(guò) 設(shè)計(jì)兩個(gè)5'端引物,一個(gè)與正常DNA互補(bǔ),一個(gè)與突變DNA互補(bǔ),對(duì)于純和性突變,分別加 入兩種引物及3'端引物進(jìn)行兩個(gè)平行的PCR,結(jié)合有與突變DNA完全互補(bǔ)的引物才可以延 伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,該檢測(cè)方法的靈敏度在1 %左右。
      [0009] (5)等位基因特異的Taqman聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(CAST-PCR)。CAST-PCR法采用優(yōu)化 TaqMan探針,通過(guò)一段特異設(shè)計(jì)的MGB探針來(lái)阻止引物與野生型DNA結(jié)合,選擇性的優(yōu)先擴(kuò) 增突變型DNA,該檢測(cè)方法的靈敏度在0. 1?1%左右。
      [0010] 但這些技術(shù)的靈敏度都不高,檢測(cè)的特異性差,誤診率高,不能滿足對(duì)腸癌檢測(cè)的 需求。


      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0011] 本發(fā)明的目的是提供一種腸癌熱點(diǎn)基因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)的組合物,該組合物及其使用方 法特異性強(qiáng)且靈敏度高。
      [0012] 為達(dá)上述目的,本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物, 所述組合物包括SEQ N0 :1至SEQ N0 :17的引物序列,還包括SEQ N0 :18至SEQ N0 :21的 block序列。
      [0013] 其中,所述組合物在用于PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系為:1?10XPCR緩沖液、0. 1? ImM dNTPs、0.1 ?luM正向引物、0.1 ?ΙμΜ反向引物、0.1 ?2μΜ block、0.05?2ng/ μ L 模版 DNA、Eva Green 染料 0· 5 ?2 μ L、0. 01 ?0· 10U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶、1 ?5mM 氯 化鎂。
      [0014] 其中,所述block序列為PCR擴(kuò)增反應(yīng)中所用,是一段與野生型DNA序列完全匹配 的可偏向性擴(kuò)增突變DNA序列的突變型特異性引物。
      [0015] 其中,所述模板DNA濃度可以低至0. 1?lng/μ L。
      [0016] 其中,所述腸癌熱點(diǎn)基因?yàn)镵RAS、BRAF、PIK3CA基因野生型和KRAS、BRAF、PIK3CA 基因突變型。
      [0017] 其中,所述 KRAS、BRAF、PIK3CA 基因包含 G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、 E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047、V600E。
      [0018] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法,所述使用 方法的步驟為:
      [0019] 第一步:將待測(cè)樣品、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品和無(wú)模版對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng), 其中所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)以待測(cè)DNA為模板,設(shè)計(jì)針對(duì)目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物,同時(shí) 加入LNA鎖核酸修飾,通過(guò)對(duì)待測(cè)DNA樣品中的目的基因進(jìn)行偏向性PCR擴(kuò)增反應(yīng);
      [0020] 第二步:根據(jù)儀器檢測(cè)結(jié)果中Ct值和MeltCure的判讀,判斷所述待測(cè)樣品中目的 基因的突變情況。
      [0021] 其中,通過(guò)PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果中擴(kuò)增曲線和熔解曲線主峰來(lái)鑒別DNA特定突變。
      [0022] 其中,所述根據(jù)Ct值和MeltCure的判讀來(lái)判斷待測(cè)樣品中目的基因的突變情況, 其具體步驟為:
      [0023] 1).運(yùn)行CT值的計(jì)算,無(wú)模板對(duì)照應(yīng)無(wú)特異擴(kuò)增,或僅引物二聚體導(dǎo)致的熒光信 號(hào)增強(qiáng);當(dāng)Ct值> 45. 0時(shí),表明無(wú)模板對(duì)照有微弱的擴(kuò)增,對(duì)試驗(yàn)的影響極微,可以繼續(xù)分 析試驗(yàn)情況;
      [0024] 2).運(yùn)行內(nèi)控,一般Ct值< 40. 0,可以繼續(xù)分析,如果Ct值彡40. 0,則說(shuō)明樣品 DNA降解嚴(yán)重,不適合試驗(yàn)需要;
      [0025] 3).運(yùn)行陽(yáng)性質(zhì)控品,陽(yáng)性質(zhì)控的Ct值<45.0,熔解曲線最高峰的Tm值在相應(yīng)突 變的范圍內(nèi),說(shuō)明試驗(yàn)體系正常,可以繼續(xù)分析試驗(yàn)結(jié)果;
      [0026] 4).符合上述條件,運(yùn)行Tm calling程序,通過(guò)烙解曲線分析和Ct值,判讀樣本是 否存在突變:運(yùn)行Tm calling程序,若樣本熔解曲線最高峰的Tm值在相應(yīng)突變的范圍內(nèi), 并且Ct<45,表明擴(kuò)增區(qū)段發(fā)生突變;若樣本存在以下三種情況之一,則判斷為陰性:a,無(wú) 擴(kuò)增;b,有擴(kuò)增,Ct > 45 ;c,有擴(kuò)增,Ct < 45,但是運(yùn)行Tm calling程序,熔解曲線最高峰 的Tm值不在相應(yīng)突變的范圍內(nèi);
      [0027] 5).如果不符合上述第1、3項(xiàng)要求,建議重做本次實(shí)驗(yàn);如果不符合第2項(xiàng)要求, 建議重新從樣本中提取DNA,再次檢測(cè)。
      [0028] 其中,所述待測(cè)樣品為人類基因組DNA,所述陽(yáng)性質(zhì)控品為含有KRAS、BRAF、 PIK3CA基因突變的混合質(zhì)?;蛘呒兒腺|(zhì)粒,所述陰性質(zhì)控品為不含有KRAS、BRAF、PIK3CA 基因突變的混合質(zhì)?;蛘呒兒腺|(zhì)粒。
      [0029] 其中,所述待測(cè)DNA樣品為人類正常DNA、細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、外周血細(xì) 胞DNA、外周血血清或血漿DNA、體液DNA或排泄物細(xì)胞DNA。
      [0030] 其中,所述腸癌熱點(diǎn)基因?yàn)镵RAS、BRAF、PIK3CA基因野生型和KRAS、BRAF、PIK3CA 基因突變型。
      [0031] 其中,所述 KRAS、BRAF、PIK3CA 基因包含 G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、 E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047、V600E。
      [0032] 其中,所述樣品的DNA濃度可以低至0. 1?lng/μ L。
      [0033] 其中,所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的具體過(guò)程分為2個(gè)階段:
      [0034] (1)擴(kuò)增反應(yīng),92?97°C預(yù)變性5?15分鐘,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增階段,92?97°C 變性10?20s,50?65°C退火10?30s,70?75°C延伸10?35s,并進(jìn)行35?55個(gè)循 環(huán);
      [0035] (2)做熔解曲線,92?97°C預(yù)變性0· 2?5分鐘,20?55°C退火0· 2?5分鐘, 60?97°C采集熒光,每秒采集熒光10?30次。
      [0036] 本發(fā)明所用引物序列和block序列如表1和表2所示。
      [0037] 表1 KRAS、BRAF、PIK3CA熱點(diǎn)基因檢測(cè)引物序列
      [0038]

      【權(quán)利要求】
      1. 一種檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物,其特征在于,所述組合物包括SEQ NO :1 至SEQ NO :17的引物序列,還包括SEQ NO :18至SEQ NO :21的block序列。
      2. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物,其特征在于,所述組合 物在用于PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系為:1?10XPCR緩沖液、0. 1?ImM dNTPs、0. 1?luM正 向引物、〇· 1 ?1 μΜ反向引物、0· 1 ?2μΜ block、0. 05 ?2ng/y L 模版DNA、Eva Green染 料 0· 5 ?2 μ L、0. 01 ?0· 10U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶、1 ?5mM 氯化鎂。
      3. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物,其特征在于,所述 block序列為PCR擴(kuò)增反應(yīng)中所用,是一段與野生型DNA序列完全匹配的可偏向性擴(kuò)增突變 DNA序列的突變型特異性引物。
      4. 如權(quán)利要求1?3所述的檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法,其特征 在于,所述使用方法的步驟為: 第一步:將待測(cè)樣品、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品和無(wú)模版對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),其中, 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)以待測(cè)DNA為模板,設(shè)計(jì)針對(duì)目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物,同時(shí)加入 LNA鎖核酸修飾,通過(guò)對(duì)待測(cè)DNA樣品中的目的基因進(jìn)行偏向性PCR擴(kuò)增反應(yīng); 第二步:根據(jù)儀器檢測(cè)結(jié)果中Ct值和MeltCure的判讀,判斷所述待測(cè)樣品中目的基因 的突變情況。
      5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法,其特征在 于,通過(guò)PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果中擴(kuò)增曲線和熔解曲線主峰來(lái)鑒別DNA特定突變。
      6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法,其特征在 于,所述根據(jù)Ct值和MeltCure的判讀來(lái)判斷待測(cè)樣品中目的基因的突變情況,其具體步驟 為: 1) .運(yùn)行CT值的計(jì)算,無(wú)模板對(duì)照應(yīng)無(wú)特異擴(kuò)增,或僅引物二聚體導(dǎo)致的熒光信號(hào)增 強(qiáng);當(dāng)ct值> 45. 0時(shí),表明無(wú)模板對(duì)照有微弱的擴(kuò)增,對(duì)試驗(yàn)的影響極微,可以繼續(xù)分析試 驗(yàn)情況; 2) .運(yùn)行內(nèi)控,一般Ct值< 40. 0,可以繼續(xù)分析,如果Ct值彡40. 0,則說(shuō)明樣品DNA降 解嚴(yán)重,不適合試驗(yàn)需要; 3) .運(yùn)行陽(yáng)性質(zhì)控品,陽(yáng)性質(zhì)控的Ct值< 45. 0,熔解曲線最高峰的Tm值在相應(yīng)突變的 范圍內(nèi),說(shuō)明試驗(yàn)體系正常,可以繼續(xù)分析試驗(yàn)結(jié)果; 4) .符合上述條件,運(yùn)行Tm calling程序,通過(guò)熔解曲線分析和Ct值,判讀樣本是否 存在突變:運(yùn)行Tm calling程序,若樣本熔解曲線最高峰的Tm值在相應(yīng)突變的范圍內(nèi),并 且Ct < 45,表明擴(kuò)增區(qū)段發(fā)生突變;若樣本存在以下三種情況之一,則判斷為陰性:a,無(wú)擴(kuò) 增;b,有擴(kuò)增,Ct > 45 ;c,有擴(kuò)增,Ct < 45,但是運(yùn)行Tm calling程序,熔解曲線最高峰的 Tm值不在相應(yīng)突變的范圍內(nèi); 5) .如果不符合上述第1、3項(xiàng)要求,建議重做本次實(shí)驗(yàn);如果不符合第2項(xiàng)要求,建議 重新從樣本中提取DNA,再次檢測(cè)。
      7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法,其特征在 于,所述待測(cè)樣品為人類基因組DNA,所述陽(yáng)性質(zhì)控品為含有KRAS、BRAF、PIK3CA基因突變 的混合質(zhì)?;蛘呒兒腺|(zhì)粒,所述陰性質(zhì)控品為不含有KRAS、BRAF、PIK3CA基因突變的混合 質(zhì)粒或者純合質(zhì)粒。
      8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法,其特征在 于,所述待測(cè)DNA為人類正常DNA、細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、外周血細(xì)胞DNA、外周血 血清或血漿DNA、體液DNA或排泄物細(xì)胞DNA。
      9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法,其特征在 于,所述腸癌熱點(diǎn)基因?yàn)镵RAS、BRAF、PIK3CA基因野生型和KRAS、BRAF、PIK3CA基因突變型。
      10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法,其特征 在于,所述 KRAS、BRAF、PIK3CA 基因包含 G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、E542K、 E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047、V600E。
      11. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法,其特征 在于,所述樣品的DNA濃度可以低至0. 1?Ing/yL。
      12. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法,其特征 在于,所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的具體過(guò)程分為2個(gè)階段: (1) 擴(kuò)增反應(yīng),92?97°C預(yù)變性5?15分鐘,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增階段,92?97°C變 性10?20s,50?65°C退火10?30s,70?75°C延伸10?35s,并進(jìn)行35?55個(gè)循環(huán); (2) 做熔解曲線,92?97°C預(yù)變性0· 2?5分鐘,20?55°C退火0· 2?5分鐘,60? 97 °C采集熒光,每秒采集熒光10?30次。
      【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104099422SQ201410345693
      【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
      【發(fā)明者】王弢, 李宗飛, 張利清, 張麗, 樂(lè)飚, 徐維琛 申請(qǐng)人:普世華康江蘇醫(yī)療技術(shù)有限公司
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