用于結(jié)直腸癌預(yù)后的基因片段及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一組用于結(jié)直腸癌預(yù)后的基因片段，包括SEQ?ID?No.38～SEQ?ID?No.74所示核苷酸序列。此外，本發(fā)明還公開了上述基因片段的應(yīng)用，包括在制備用于結(jié)直腸癌預(yù)后的NanoString?nCounter分析系統(tǒng)中的應(yīng)用，以及在制備用于結(jié)直腸癌預(yù)后的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明有助于提高結(jié)直腸癌患者術(shù)后的生存率。在結(jié)直腸癌患者接受根治性手術(shù)后，即可通過對(duì)NanoString?nCounter的檢測和聯(lián)合分析，快速判斷出該患者術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)度。對(duì)于預(yù)測結(jié)果為非復(fù)發(fā)的個(gè)體，臨床上可以進(jìn)行常規(guī)治療，避免過度治療及其帶來的潛在副作用的影響，而其他患者可進(jìn)行更為積極的治療。
【專利說明】用于結(jié)直腸癌預(yù)后的基因片段及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及結(jié)直腸癌的預(yù)后領(lǐng)域，主要是II /III期(局部進(jìn)展期)結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測。更具體而言，涉及一組用于結(jié)直腸癌預(yù)后的基因片段及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類健康。迄今為止，結(jié)直腸癌在全球的發(fā)病率和死亡率仍成上升趨勢,其發(fā)病率約占所有惡性腫瘤的9.4%，是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡的第四大疾病(Brenner H, Kloor M, Pox CP.Colorectal cancer [J].L‘a(chǎn)ncet, 2013，Epub.)。2013年中國腫瘤登記年報(bào)公布的最新數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌在我國男性的腫瘤構(gòu)成中占第五位，在我國女性的腫瘤構(gòu)成中占第三位。傳統(tǒng)的臨床病理因素包括腸梗阻/穿孔、T4腫瘤、淋巴血管侵犯、組織學(xué)分級(jí)3-4級(jí)、切緣陽性等，可以為結(jié)直腸癌患者提供一定的預(yù)后信息，但這些風(fēng)險(xiǎn)因素所含的信息有限，并且每個(gè)因素對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后影響的程度不能很好地被量化和整合。目前，組織病理學(xué)分型和分期是腫瘤診斷和預(yù)后的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但正面臨著兩方面的挑戰(zhàn):(I)形態(tài)相同和分期相同的腫瘤，其治療反應(yīng)和預(yù)后可能不同；(2)形態(tài)不同和分期不同的腫瘤，其治療反應(yīng)和預(yù)后有可能相同?，F(xiàn)在普遍接受的觀點(diǎn)是，這種不確定性是由腫瘤分子表達(dá)差異(DNA、RNA或蛋白)所導(dǎo)致的。
[0003]結(jié)直腸癌是一類多因素參與、多步驟發(fā)展的復(fù)雜疾病，近年來對(duì)其發(fā)生發(fā)展機(jī)制、治療及預(yù)后的研究在世界范圍內(nèi)已得到廣泛的重視，尤其是分子水平的研究對(duì)認(rèn)識(shí)結(jié)直腸癌的本質(zhì)方面有很大的幫助。新的治療方法和靶向藥物不斷涌現(xiàn)，使結(jié)直腸癌患者的預(yù)后得到明顯改善，但實(shí)現(xiàn)個(gè)體化醫(yī)療仍處于起步階段(PritchardCC, Grady WM.Colorectal cancer molecular b1logy moves into clinical practice [J].Gut, 2011, 60(1):116-29.)。結(jié)直腸癌是一類在分子水平上具有高度異質(zhì)性的腫瘤，對(duì)其進(jìn)行分子分型和預(yù)后預(yù)測是個(gè)體化診療的必然要求，具有十分重要的意義。
[0004]NanoString nCounter system數(shù)字式單分子基因表達(dá)譜分析是繼生物芯片技術(shù)和新一代測序技術(shù)(NGS)后在基因表達(dá)譜分析上展示出強(qiáng)大應(yīng)用前景的一項(xiàng)新技術(shù)。nCounter Analysis System是直接對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行多重計(jì)數(shù)的全新數(shù)字式技術(shù),利用分子條形碼和單分子成像來檢測及統(tǒng)計(jì)每一個(gè)反應(yīng)體系中特定轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量，表現(xiàn)出極高的靈敏度、精確度和重復(fù)性。該技術(shù)整個(gè)系統(tǒng)包括全自動(dòng)的樣品處理工作站、數(shù)字化成像分析儀、CodeSet (分子條形碼)和相關(guān)試劑，可以使研究人員用少量的實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行特定或一組基因的表達(dá)特征研究。該技術(shù)上無需使用酶，無需反轉(zhuǎn)錄，也不需要做PCR擴(kuò)增，從而可進(jìn)一步減少誤差的產(chǎn)生，因此nCounter在表達(dá)譜定量分析領(lǐng)域具有無可比擬的優(yōu)勢。NanoString nCounter system數(shù)字式單分子基因表達(dá)譜分析系統(tǒng)在分析石臘樣本表達(dá)譜分析領(lǐng)域非常有優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一組用于結(jié)直腸癌預(yù)后的基因片段及其應(yīng)用，能對(duì)結(jié)直腸癌患者術(shù)后的復(fù)發(fā)生存進(jìn)行預(yù)測，有助于提高結(jié)直腸癌患者術(shù)后的生存率。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0007]在本發(fā)明的一方面，提供一組用于結(jié)直腸癌預(yù)后的基因片段，包括SEQ ID N0.38~SEQ ID N0.74所示核苷酸序列。
[0008]在本發(fā)明的另一方面，提供一組用于結(jié)直腸癌預(yù)后的基因片段在制備用于結(jié)直腸癌預(yù)后的NanoString nCounter分析系統(tǒng)中的應(yīng)用，所述NanoString nCounter分析系統(tǒng)包括固相載體和探針，所述探針與待測SEQ ID N0.38~SEQ ID N0.74所示核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交。優(yōu)選地，所述NanoString nCounter分析系統(tǒng)為NanoString nCountersystem數(shù)字式單分子基因表達(dá)譜分析系統(tǒng)。
[0009]所述探針包括下列三組核苷酸序列之一:
[0010](I) SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.37 所示序列；
[0011](2) SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.37所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈；
[0012](3)與SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.37所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0013]優(yōu)選的，所述探針包括SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.37所示序列。
[0014]在本發(fā)明的 另一方面，提供一組用于結(jié)直腸癌預(yù)后的基因片段在制備用于結(jié)直腸癌預(yù)后的試劑盒中的應(yīng)用，所述試劑盒包含:與SEQ ID N0.38~SEQ ID N0.74中至少一個(gè)核苷酸序列進(jìn)行雜交的探針。
[0015]所述探針包括下列三組核苷酸序列之一:
[0016](I) SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.37 所示序列；
[0017](2) SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.37所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈；
[0018](3)與SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.37所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0019]優(yōu)選的，所述探針包括SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.37所示序列。
[0020]本發(fā)明通過多基因計(jì)算模型預(yù)測結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)生存的檢測方法，主要包括以下步驟:
[0021](I)收集結(jié)直腸癌患者的手術(shù)切除癌組織標(biāo)本；
[0022](2)提取組織的RNA樣本；
[0023](3)RNA質(zhì)量控制:用Aligent2100生物分析儀檢測抽提的總RNA的質(zhì)量及完整性；
[0024](4)通過定制的NanoString nCounter system基因表達(dá)譜檢測，發(fā)現(xiàn)37個(gè)探針在非復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組中存在差異表達(dá)(所述探針為SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.37所示序列)；
[0025](5)計(jì)算上述37個(gè)探針的基因表達(dá)權(quán)重，通過預(yù)測復(fù)發(fā)模型計(jì)算公式對(duì)患者術(shù)后預(yù)后進(jìn)行評(píng)價(jià)；預(yù)測復(fù)發(fā)模型計(jì)算公式如下:y = 0+(Β1*ΧΡ..Β33*Χ33), P = EXP(y)/((I+EXP (y)) ；C為權(quán)重值的常數(shù)，C = -160.677788 ；B為每個(gè)基因的權(quán)重系數(shù)；X為每個(gè)探針表達(dá)值進(jìn)行四分法分類后的賦值。根據(jù)計(jì)算的P值來預(yù)測復(fù)發(fā)的可能性:P〈0.5不復(fù)發(fā)；P>0.5復(fù)發(fā)。所述探針的表達(dá)計(jì)算所得概率越大，該患者術(shù)后的復(fù)發(fā)率越高，無復(fù)發(fā)生存時(shí)間越短。[0026]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明人等對(duì)前期全基因組表達(dá)譜篩選出的結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)基因、臨床常用免疫組化標(biāo)記物及文獻(xiàn)報(bào)道比較多的和結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)的基因反復(fù)進(jìn)行研究，通過Nanostring40基因表達(dá)譜分析(三個(gè)內(nèi)參基因包括:ABCF1、B2M、PGKl ；37基因包括:PTGS2、TAF11、GENE3、NDRGl、STMN2、SCG5、PLK4、TNFRSF11B、MMP3、ZNF503、UBD、PROSl、AKR1C2、NUP210、HS2ST1-L0C339524、C5orf23、PBK、DEPDCl、BRIPl、MEG3、CDCA2、RGL3、SPATA、GENE24、L0C400713、GENE29、GENE31、C9orf116、CD44、CTNNB1、GADD45B、IGF2R、MMP2、MYBL2、NME1、HMP1、VEGFC)，得到37基因模型，用于預(yù)測II / III期結(jié)直腸癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。模型的建立包括以下步驟:采集結(jié)直腸癌患者的手術(shù)切除石蠟標(biāo)本；抽提石蠟組織RNA ;檢測473例結(jié)直腸癌組織(復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院362例，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院111例；未發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移個(gè)體326例，發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移個(gè)體146例)進(jìn)行nCounter表達(dá)譜研究；通過統(tǒng)計(jì)分析建立37基因模型，以用于預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)；通過計(jì)算公式得出每個(gè)探針的表達(dá)權(quán)重，進(jìn)而評(píng)價(jià)該患者復(fù)發(fā)的可能性大小。本發(fā)明還公開了由上述探針組成的探針組，以及包含該探針組的計(jì)算過程及公式。本發(fā)明通過NanoString nCounter基因表達(dá)譜檢測，通過對(duì)37個(gè)探針的聯(lián)合分析，可快速判斷結(jié)直腸癌患者術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)度，從而可以在術(shù)后早期篩查出復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)度較高的結(jié)直腸癌患者，并對(duì)其進(jìn)行積極的輔助治療，以提高結(jié)直腸癌患者術(shù)后的生存率，延長患者的生存時(shí)間。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明實(shí)施例訓(xùn)練組中復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組/未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組Kaplan-Meier生存分析示意圖；
[0028]圖2為本發(fā)明 實(shí)施例驗(yàn)證組中復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組/未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組Kaplan-Meier生存分析示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照制造試劑盒生產(chǎn)公司所建議的條件或按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，例如 Sambrook 等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件。
[0030]1、實(shí)驗(yàn)對(duì)象
[0031]本實(shí)施例的研究對(duì)象選擇2007年I月一2010年5月間復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院及第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院結(jié)直腸癌癌術(shù)后石蠟組織473例。納入及排除標(biāo)準(zhǔn)如下:
[0032](I)新發(fā)結(jié)直腸癌患者(需以手術(shù)標(biāo)本的病理診斷為標(biāo)準(zhǔn))；
[0033](2)年齡18-75歲之間，病理診斷為腺癌；
[0034](3)臨床分期:I1-1II期；
[0035](4)患者手術(shù)前未接受放射性治療、化學(xué)藥物治療及分子靶向藥物治療，術(shù)后采用相同或相近的化療方案治療:包括不含奧沙利鉬的單藥化療方案(5-氟尿嘧啶/甲酰四氫葉酸鈣或卡培他濱單藥)和含奧沙利鉬的聯(lián)合化療方案(5-氟尿嘧啶+甲酰四氫葉酸鈣+奧沙利鉬或卡培他濱+奧沙利鉬)；
[0036](5)無其他器官腫瘤病史；無以下家族史:1~2級(jí)親屬中無結(jié)直腸腫瘤史，無腺瘤性息肉病史和家族遺傳性綜合征史，主要包括家族性腺瘤性息肉病(FAP)、遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌(HNPCC)等；
[0037](6)收集病例隨訪時(shí)間已達(dá)3年(其中有1/4-1/3病例復(fù)發(fā)或死亡)。
[0038]2、實(shí)驗(yàn)方法
[0039]米集上述473例患者的手術(shù)切除癌組織標(biāo)本，用Amb1n公司的Amb1n?RecoverAlI? FFPE組織總核酸分離試劑盒，按照試劑盒的說明，抽提RNA樣本。抽提后的RNA樣本保存在-70°C的深低溫冰箱中。
[0040]用Aligent2100生物分析儀，檢測抽提的總RNA的質(zhì)量及片段化程度。
[0041]從美國Nanostring公司定制40基因表達(dá)譜分析(三個(gè)內(nèi)參基因包括=ABCFl、B2M、PGKl ;37 基因包括:PTGS2、TAFl 1、GENE3、NDRGl、STMN2、SCG5、PLK4、TNFRSFI IB、MMP3、ZNF503、UBD、PROSl、AKR1C2、NUP210、HS2ST1-L0C339524、C5orf23、PBK、DEPDCl、BRIPl、MEG3、CDCA2、RGL3、SPATA, GENE24 、L0C400713、GENE29、GENE31、C9orfll6、CD44、CTNNBl、GADD45B、IGF2R、MMP2、MYBL2、NME1、--ΜΡ1、VEGFC)。依據(jù) Nanostringncounter system 基因表達(dá)譜分析系統(tǒng)操作步驟，對(duì)473例石蠟組織的RNA樣本進(jìn)行40基因表達(dá)譜的檢測。采用分子條形碼技術(shù)，用nSolver分析軟件讀取數(shù)據(jù)，F(xiàn)OV百分比>75 %，探針結(jié)合率介于0.05和2.25之間，陽性對(duì)照線性值>0.95的數(shù)據(jù)為質(zhì)檢合格的數(shù)據(jù)，采用nSolver分析軟件自帶標(biāo)化功能進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理分析，得出每一個(gè)基因在每一個(gè)樣本中的表達(dá)值。
[0042]3、結(jié)果分析
[0043]結(jié)合473例患者的臨床隨訪結(jié)果，隨機(jī)分成訓(xùn)練組和驗(yàn)證組，訓(xùn)練組237例，驗(yàn)證組236例。為了避免檢測過程中出現(xiàn)的極值的影響采用rank的方法給每個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行排序。按照表達(dá)水平分為四組:位次在前25%，位次在26-50%，位次在51% -75%，位次在最后25%，分別賦值為1、2、3、4。同時(shí)由于不同醫(yī)院來源的標(biāo)本表達(dá)水平差異較大，故分別進(jìn)行rank。將是否復(fù)發(fā)作為因變量，37基因和腫瘤分期Stage作為共變量進(jìn)行二分類Logistics回歸分析。探針名稱、對(duì)應(yīng)的基因及權(quán)重系數(shù)見表1。根據(jù)每個(gè)基因表達(dá)量進(jìn)行權(quán)重后，得出預(yù)測生存情況的計(jì)算公式。具體預(yù)測計(jì)算公式如下:C為權(quán)重值的常數(shù)，C = -166.0 ；B為每個(gè)基因的權(quán)重系數(shù)；X為每個(gè)基因在四分類方法中的賦值；y =C+(B1*X1...B7*X7)，P = EXP (y) / ((1+EXP (y))。依據(jù)ROC曲線來選擇合適的切點(diǎn)將計(jì)算的P值分組，并來預(yù)測復(fù)發(fā)的可能性。
[0044]表1本發(fā)明中的37個(gè)探針及基因名稱
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一組用于結(jié)直腸癌預(yù)后的基因片段，其特征在于，包括SEQ ID N0.38~SEQ ID N0.74所示核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的一組用于結(jié)直腸癌預(yù)后的基因片段在制備用于結(jié)直腸癌預(yù)后的NanoString nCounter分析系統(tǒng)中的應(yīng)用，所述NanoString nCounter分析系統(tǒng)包括固相載體和探針，其特征在于，所述探針與待測SEQ ID N0.38~SEQ ID N0.74所示核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，所述NanoStringnCounter分析系統(tǒng)為NanoStringnCounter system數(shù)字式單分子基因表達(dá)譜分析系統(tǒng)。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述探針包括下列三組核苷酸序列之一:
(1)SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.37 所示序列； (2)SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.37所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈； (3)與SEQID N0.1~SEQ ID N0.37所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述探針包括SEQID N0.1~SEQ ID N0.37所示序列。
6.如權(quán)利要求1所述的一組用于結(jié)直腸癌預(yù)后的基因片段在制備用于結(jié)直腸癌預(yù)后的試劑盒中的應(yīng)用，其 特征在于，所述試劑盒包含:與SEQ ID N0.38~SEQ ID N0.74中至少一個(gè)核苷酸序列進(jìn)行雜交的探針。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述探針包括下列三組核苷酸序列之一:
(1)SEQ ID N0.1 ~SEQ ID No37 所示序列； (2)SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.37所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈； (3)與SEQID N0.1~SEQ ID N0.37所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述探針包括SEQID N0.1~SEQ ID N0.37所示序列。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104031915SQ201410268474
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月17日
【發(fā)明者】杜祥, 周曉燕, 王志敏, 王麗莎, 沈曉涵, 危平, 徐清華 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院, 上海人類基因組研究中心