專利名稱：與肝細(xì)胞癌或結(jié)直腸癌相關(guān)的基因和多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及癌癥研究領(lǐng)域。本發(fā)明具體 涉及與細(xì)胞增殖機制有關(guān)的新基因『Di PL^r， i^ZF尸t///,尸戶/丄7和vlPCDZ)7 以及由這些基因編碼的多肽。本發(fā)明的基因和多肽可用于例如診斷細(xì)胞增 殖性疾病，以及用作靶分子來開發(fā)針對所述疾病的藥物。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞癌(HCC)和結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)癌癥死亡的誘因(Akriviadis et al.， Br J Surg 85(10): 1319-31(1998))。盡管最新的醫(yī)學(xué)進(jìn)展已在診斷和治療策 略方面取得很大進(jìn)步，但大量癌癥患者在確診時已到晚期，完全治愈晚期 癌癥是人們迫切關(guān)心的事情。最新的分子研究進(jìn)展揭示出腫瘤抑制基因和/ 或癌基因的改變與癌癥發(fā)生有關(guān)，然而，其精確的機理仍有待闡明。
最新分子生物學(xué)進(jìn)展表明包含多個步驟的過程構(gòu)成肝癌發(fā)生的基礎(chǔ)， 同時也構(gòu)成結(jié)腸肺瘤發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ)。這些過程包括多個基因產(chǎn)物性質(zhì) 和數(shù)量上的改變。據(jù)報道p-連環(huán)蛋白/Tcf信號傳導(dǎo)途徑參與發(fā)育過程中的 形態(tài)發(fā)生(Wodarz and Nusse， Annu Rev Cell Dev Biol 14: 59-88(1998); Polakis, Genes Dev 14: 1837-51(2000); Bienz and Clevers， Cell 103: 311-20(2000))。癌
癥研究的最新進(jìn)展強調(diào)信號傳導(dǎo)途徑在人類腫瘤發(fā)展過程中的重要性，所 述腫瘤可出現(xiàn)在結(jié)腸、肝臟、前列腺、胃、腦、子宮內(nèi)膜或其它位置 (Bullions and Levine, Curr Opin Oncol 10: 81-7(1998》。多發(fā)性結(jié)腸腺癌基因 (APC)是一種腫瘤抑制基因，它與(3-連環(huán)蛋白、Axin、 conductin和糖原合酶 激酶-3p(GSK-3p)相互作用，促進(jìn)p-連環(huán)蛋白經(jīng)由遍在蛋白-蛋白體系統(tǒng)發(fā) 生降解(Polakis, Genes Dev 14: 1837-51(2000))。大多數(shù)散布的結(jié)腸腫瘤因 爿PC, y4X/A^或y!Z/A^(conductin)中的失活突變，或因CrAWW((3-連環(huán)蛋白)中的穩(wěn)定致癌突變而在胞質(zhì)和/或細(xì)胞核中積累P-連環(huán)蛋白，從而導(dǎo)致p-連
環(huán)蛋白/Tcf轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組成型激活(Polakis， Genes Dev 14: 1837-51(2000); Korinek et al" Science 275: 1784-7(1997))。隨后，復(fù)合物激活耙基因,如c- ，, c-乂w"，戶a扁7，尿激酵型纖溶酵原激
活物受體07Mi )，連接蛋白^， CZ)W， PA4i -^， ^F-77和五7VC-7(He et al.， Science 281: 1509-12(1998); Shtutman et al., Proc Natl Acad Sci USA 96: 5522-7(1999); Brabetz et a.，Am J Pathol 155: 1033-1038(1999); Crawford et al" Oncogene 18: 2883-91(1999); Mann et al.， Proc Natl Acad Sci USA 96: 1603-8 (1999); van der Heyden et al.， J Cell Sci 111: 1741-9(1998); Wielenga et al., Am J Pathol 154: 515-23(1999); He et al.， Cell 99: 335-45(1999); Lin et al. Cancer Res 61: 6345-9(2001); Fujitaetal., Cancer Res 61: 7722-6(2001))。然而，通過 激活該途徑的結(jié)腸癌腫瘤發(fā)生的精確機理仍有待闡明。
已知另一種蛋白質(zhì)驛蛋白(stathmin)也與多種癌癥有關(guān)(Hanash et a!., J Biol Chem 263: 12813-5(1988); Roos et al" Leukemia 7: 1538-46(1993); Nylander et al., Histochem J 27: 155-60(1995); Friedrich et al., Prostate 27: 102-9(1995); Bieche et al" Br J Cancer 78: 701-9(1998))。驛蛋白(Sobel et al" J Biol Chem 264: 3765-72(1989); Sobel et al" Trends Biol Sci 16: 301-5(1991))是 由148個氨基酸殘基構(gòu)成的胞質(zhì)磷蛋白(19kD)，也被稱為pl9， prosolin， Lapl8,癌蛋白18, metablastin和Op18。在多種多能胚胎癌性細(xì)胞和小鼠胚泡 內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的多能細(xì)胞中，驛蛋白的表達(dá)量很高(Doye et al., Differentiation 50: 89-96(1992))。釋蛋白以幾種非-磷酸化和磷酸化形式存在于細(xì)胞中，其存 在形式依賴于多個生物系統(tǒng)中細(xì)胞的增殖、分化或激活狀態(tài)(Sobel et al.， Trends Biol Sci 16: 301-5(1991))。另外，已知驛蛋白的微管解聚活性受其磷 酸化水平變化的調(diào)節(jié)，據(jù)報道驛蛋白的微管解聚活性對于在細(xì)胞周期的不 同時期調(diào)節(jié)微管的動態(tài)不穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用(Marklund et al.， EMBO J 15: 5290-8(1996); Horwitz et al" J Biol Chem 272: 8129-31(1997))。驛蛋白的充 分磷酸化發(fā)生在有絲分裂期間(Strahler et al" Biochem Biophy Res Commun 185: 197-203 (1992); Luo et al., J Biol Chem 269: 10312-8(1994); Brattsand et al.， Eur J Biochem 220: 359-68(1994))，這似乎是細(xì)胞周期進(jìn)程所必需的。 然而，驛蛋白磷酸化的精確機理及其與癌癥發(fā)生的關(guān)系仍有待闡明。
cDNA微陣列技術(shù)使人們獲得正常和惡性細(xì)胞中基因表達(dá)的全面分布圖(Okabe et al., Cancer Res 61: 2129-37(2001); Lin et al.， Oncogene 21: 4120-8 (2002); Hasegawa et al.， Cancer Res 62: 7012-7(2002》。該方法才皮露了癌癥細(xì) 胞的復(fù)雜性質(zhì)，有助于人們了解癌癥發(fā)生的機理。鑒定出腫瘤中的失控基 因能夠更準(zhǔn)確地診斷個體癌癥，并可開發(fā)新的治療耙(Bienz and Clevers, Cell 103: 311-20(2000))。為了從整個基因組的角度揭示腫瘤發(fā)生的機理， 并且找出用于診斷和新型治療藥開發(fā)的靶分子，本發(fā)明人使用23040個基 因的的cDNA微陣列來分析肺瘤細(xì)胞的基因表達(dá)分布圖(Okabe et al., Cancer Res 61: 2129-37(2001); Kitahara et al., Cancer Res 61: 3544-9(2001); Lin et al" Oncogene 21: 4120-8(2002); Hasegawa et al" Cancer Res 62: 7012-7(2002》。
被設(shè)計用于揭示癌癥發(fā)生機理的研究推動了抗-腫瘤藥劑分子靶的鑒 定。例如，最初被開發(fā)用于抑制與Ras有關(guān)的生長-信號傳導(dǎo)途徑、其激活 依賴于翻譯后法尼基化的法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)能在動物模型中有效治 療Ras-依賴型腫瘤(He et al" Cell 99: 335-45(1999))。聯(lián)合使用抗癌藥物和 抗-HER2單克隆抗體trastuzumab對人進(jìn)行了臨床試驗，以抵銷原癌基因受 體HER2/neu的作用；在乳腺癌患者身上已獲得改善的臨床反應(yīng)和整體存活 率(Lin et al" Cancer Res 61: 6345-9(2001))。選擇性失活bcr-abl融合蛋白的 酪氨酸激酶抑制劑STI-571被開發(fā)用于治療慢性骨髓性白血病，其中bcr-abl 酪氨酸激酶的組成型激活對白細(xì)胞轉(zhuǎn)化起決定性作用。這些類型的藥劑被 設(shè)計用于抑制特定基因產(chǎn)物的致癌活性(Fujita et al., Cancer Res 61: 7722_ 6(2001》。
發(fā)明概述
本發(fā)明的目的是提供與肝細(xì)胞癌或結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖機理有關(guān)的新蛋 白質(zhì)和編碼所述蛋白質(zhì)的基因，以及所述蛋白質(zhì)和基因的制備方法和使用 它們診斷和治療肝細(xì)胞癌(HCC)或結(jié)腸癌的方法。
為了揭示肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌的癌癥發(fā)生才幾理，并鑒定出新的診斷標(biāo)記
和/或治療這些腫瘤的藥物靶，本發(fā)明人使用含有23040個基因的全-基因組 cDNA微陣列分析了基因在肝細(xì)胞和結(jié)腸癌癥發(fā)生中的表達(dá)分布圖。從藥 物學(xué)的觀點看，在實際操作中抑制致癌信號比激活腫瘤-抑制效應(yīng)更加容 易。因此，本發(fā)明人檢索了在肝細(xì)胞和結(jié)腸癌癥發(fā)生過程中被上調(diào)的基因。
從在肝細(xì)胞癌中 一般被上調(diào)的轉(zhuǎn)錄物中，將新的人基因^Di PW/(在HCC中被上調(diào)的WD40重復(fù)蛋白)和Xi ZFP W/(在HCC中被上調(diào)的Kruppel-型鋅指蛋白)分別定位于染色體帶17pl3和16p11。 ^T^尸t/H或i^ZF尸W/的基因轉(zhuǎn)移促使細(xì)胞增殖。另外，通過轉(zhuǎn)染其特異性的反義S-寡核香酸來降低
『￡>7^^///或/^2/^//表達(dá)即可抑制11(:(:細(xì)胞生長。很多抗癌藥物，如
DNA和/或RNA合成抑制劑、代謝抑制因子和DNA嵌入劑不僅對癌細(xì)胞有毒，對正常生長的細(xì)胞也有毒。然而，抑制『Z)i 戶W7和^2F尸M7表達(dá)的藥劑對其它器官卻沒有不利的作用，這是因為這些基因的正常表達(dá)分別局限于睪丸以及胎盤和睪丸，因此所述藥劑對治療癌癥非常重要。
另外，從在結(jié)腸癌中一般被上調(diào)的轉(zhuǎn)錄物中，鑒定出定位于染色體帶6p21.1的基因PPILl(肽基脯氨酸異構(gòu)酶-樣l)。另外，免疫沉淀試驗揭示出PPIL1蛋白與參與維生素D受體轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)SNW1(SKI相互作用蛋白)和參與細(xì)胞周期進(jìn)程的胞質(zhì)磷蛋白驛蛋白結(jié)合。本發(fā)明人還檢索了調(diào)節(jié)p-
連環(huán)蛋白/Tcf4復(fù)合物的基因，所述基因在肝癌和結(jié)腸癌中被異常上調(diào)，并且鑒定出定位于染色體帶18pll.2的新基因^PCZ)D7(被多發(fā)性結(jié)腸腺癌下調(diào))。所述基因的表達(dá)因轉(zhuǎn)導(dǎo)野生型APC而降低，并在絕大多數(shù)結(jié)腸癌組織中有所升高。戶尸/丄/或^尸CDZ^的基因轉(zhuǎn)移促使缺乏任一種所述基因的內(nèi)源性表達(dá)的細(xì)胞增殖。另外，通過轉(zhuǎn)染針對尸尸/丄7或^^/)￡^的特異性反義8-寡核苷酸降低戶尸幾7或J尸CDZ^表達(dá)即可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長。
因此，本發(fā)明提供了分離的新基因『Z^尸W/， ^/ ZF尸W^, P尸/丄/和J尸CD"7，這些基因是候選的癌癥診斷標(biāo)記，并且是可用于開發(fā)新診斷策略和有效抗癌劑的理想的潛在靶。另外，本發(fā)明提供了由這些基因編碼的多肽及其制備方法和用途。更具體地，本發(fā)明提供了下述內(nèi)容
本申請?zhí)峁┝诵碌娜硕嚯腤DRPUH， KRZFPUH， PPIL1和APCDD1或其功能等同物，所述多肽能促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且在如HCC和結(jié)腸癌的細(xì)胞增殖疾病中凈皮上調(diào)。
在優(yōu)選實施方案中，WDRPUH多肽包括推定的由SEQ ID NO: l的開放閱讀框編碼的620個氨基酸長的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有11個WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域。WDRPUH多肽優(yōu)選包括SEQ IDNO: 2所示的氨基酸序列。本申請還提供了由附〕i 尸t/Z/多核苷酸序列的至少一部分或與SEQ ID NO: l所示序列至少15%、更優(yōu)選至少25%互補的多核苷酸序列編碼的分離的蛋白質(zhì)。
另一方面，在優(yōu)選實施方案中，KRZFPUH多肽包括推定的與大鼠基因鋅指蛋白HIT-39(GenBank登錄號AF277902)具有同源性的500個氨基酸長的蛋白質(zhì)，并包括由SEQ ID NO: 3的開放閱讀框編碼的Krupple-型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域(KRAB)。 KRZFPUH多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。本申請還提供了由KRZFPUH多核苷酸序列的至少一部分或與SEQ IDNO: 3所示序列至少15%、更優(yōu)選至少25。/?；パa的多核苷酸序列編碼的分離的蛋白質(zhì)。
另外，在優(yōu)選實施方案中，PPILl多肽包括推定的由SEQIDNO: 5的開放閱讀框編碼的166個氨基酸長的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)與Pjw77的同一性為98.1%,與尸戶"的同一性為41.6%，與Cyp2的同一性為57.4Q/。，與Q^五的同一性為50%。 PPILl多肽優(yōu)選包括SEQIDNO: 6所示的氨基酸序列。本申請還提供了由尸尸/丄7多核苷S臾序列的至少一部分或與SEQ ID NO: 5所示序列至少15%、更優(yōu)選至少25%互補的多核苷酸序列編碼的分離的蛋白質(zhì)。
另外，在優(yōu)選實施方案中，APCDD1多肽包括推定的由SEQ ID NO: 7的開放閱讀框編碼的514個氨基酸長的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)與解木聚糖熱桿菌(77zemok^7/w xy/am'(y"cw力的內(nèi)切-1,4-卩-木聚糖酶有31%的同一'1"生。APCDDI多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。本申請還提供了由APCDD1多核普酸序列的至少一部分或與SEQ ID NO: 7所示序列至少15%、更優(yōu)選至少25。/?；パa的多核苷酸序列編碼的分離的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了新的人基因『/)/^1[///和^2/^^///，與相應(yīng)的非癌肝組織相比，在絕大多數(shù)HCC中，所述基因的表達(dá)顯著升高。分離的『Z^尸i7/f基因包括SEQIDNO: l所述的多核苷酸序列。fFDi^t///cDNA特別地包括2152個核苷酸，其中含有1860個核苷酸長的開放閱讀框。本發(fā)明還包括能與SEQ ID NO: l所示多核苷酸序列雜交并與其至少15%、更優(yōu)選至少25%互補的多核苷酸，雜交和互補的程度應(yīng)使其能編碼WDRPUH蛋白或其功能等同物。所述多核苷酸的例子是SEQ ID NO: l的簡并和等位突變體。另一方面，分離的Ki ZF尸(/7/基因包括SEQIDNO: 3所述的多核苷酸序列。jO Z^P6好cDNA特別地包括2744個核苷酸，其中含有1500個核苷酸長的開放閱讀框。本發(fā)明還包括能與SEQ ID NO: 3所示多核苷酸序列雜交并與其至少15%、更優(yōu)選至少25%互補的多核苷酸，雜交和互補的程度應(yīng)4吏其能編碼KRZFPUH蛋白或其功能等同物。所述多核苷酸的例子是SEQ IDNO: 3的簡并和等位突變體。另外，本發(fā)明提供了新的人基因尸尸/"，與相應(yīng)的非癌組織相比，在絕大多數(shù)結(jié)腸癌中，所述基因的表達(dá)顯著升高。分離的尸尸/丄7基因包括
SEQ ID NO: 5所述的多核苷酸序列。P戶/丄7 cDNA特別地包括1734個核香酸，其中含有498個核苷酸長的開放閱讀框。本發(fā)明還包括能與SEQIDNO:5所示多核苷酸序列雜交并與其至少15%、更優(yōu)選至少25。/?；パa的多核苷酸，雜交和互補的程度應(yīng)使其能編碼PPIL1蛋白或其功能等同物。所述多核苷酸的例子是SEQIDNO: 5的簡并和等位突變體。
另外，本發(fā)明提供了新的人基因APCZ)Z^，與相應(yīng)的非癌組織相比，在絕大多數(shù)原發(fā)性結(jié)腸癌中，所述基因的表達(dá)顯著升高，將野生型^PC7轉(zhuǎn)導(dǎo)至結(jié)腸癌細(xì)胞后，所述基因?qū)ζ渥鞒龇磻?yīng)而被下調(diào)。分離的爿尸CDD/基因包括SEQ ID NO: 7所述的多核香酸序列。APCDD7 cDNA特別地包括2607個核苷酸，其中含有1542個核普酸長的開放閱讀框。本發(fā)明還包括能與SEQ ID NO: 7所示多核苷酸序列雜交并與其至少15%、更優(yōu)選至少25%互補的多核苷酸，雜交和互補的程度應(yīng)使其能編碼APCDD1蛋白或其功能等同物。所述多核苷酸的例子是SEQIDNO: 7的簡并和等位突變體。
本文所用的分離基因是一種多核苷酸，其結(jié)構(gòu)與任何天然多核苷酸結(jié)構(gòu)或橫跨三個以上分離基因的天然基因組多核苷酸的任何片段的結(jié)構(gòu)都不相同。因此，該術(shù)語包括例如(a)具有生物體基因組中的天然基因組DNA分子的部分序列的DNA，所述DNA天然存在于所述生物體中；(b)以所得分子不同于任何天然載體或基因組DNA的方式摻入原核或真核載體或基因組DNA的多核普酸；(c)分離的分子，如cDNA、基因組片段、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段或限制性片段；和(d)重組核苷酸序列，其為雜合基因，即編碼融合多肽的基因的一部分。
因此，本發(fā)明一方面提供了編碼本文所述多肽或其片段的分離的多核苷酸。優(yōu)選分離的多核苷酸包括與SEQIDNO: 1, 3， 5或7所示核苷酸序列至少60%相同的核苷酸序列。更優(yōu)選分離的核酸分子與SEQIDNO: 1， 3， 5或7所示核苦酸序列的同一性至少為65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%， 92%,93%, 94%, 95°/。， 96%， 97%, 98%， 99%或更高。當(dāng)分離的多核苷酸的長度長于或等于參照序列，如SEQIDNO: 1，3, 5或7時，與參照序列的全長進(jìn)行比較。當(dāng)分離的多核苷酸的長度短于參照序列，如短于SEQIDNO: 1,3, 5或7時，與相同長度的參照序列的區(qū)段進(jìn)行比較(排除同源性計算所需的任何環(huán))。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，所述方法是用編碼WDRPUH，KRZFPUH， PPIL1或APCDD1蛋白的多核苷酸序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并且表達(dá)所述多核苷酸序列。另外，本發(fā)明提供了含有編碼WDRPUH,KRZFPUH， PPIL1或APCDD1蛋白的核苷酸序列的載體，和攜有編碼WDRPUH， KRZFPUH， PPIL1或APCDD1蛋白的多核苷酸的宿主細(xì)胞。所述載體和宿主細(xì)胞可用于生產(chǎn)WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1或APCDD1蛋白。
本申請還提供了識別WDRPUH， KRZFPUH， PPIL1或APCDD1蛋白的抗體。在某種程度上還提供了『￡>i^t///， ^ ZF尸M^ PP/ZJ或^PO)Z)/基因的反義多核苷酸(如反義DNA)、核酶和siRNA(小的干擾RNA)。
本發(fā)明還提供了診斷細(xì)胞增殖性疾病的方法，所述方法包括測定樣本生物樣品中基因的表達(dá)水平，將^Di 戶t/7/， A7 ZF尸t///，尸戶/丄7或APCZ)D7基因的表達(dá)水平與正常樣品中的相比較，將樣品中Ki ZF尸W/，尸尸/Z7或/lPa^)/基因的高表達(dá)水平定義為患有細(xì)胞增殖性疾病，如癌癥。
用尸尸/"或^pa〕z)/的表達(dá)水平斥全測的是結(jié)直腸癌。
另外，還提供了篩選可用于治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法。所
述方法包括使WDRPUH， KRZFPUH, PPILl或APCDD 1多肽與受試化合物接觸，并選擇與WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1或APCDD1多肽結(jié)合的受試化合物。
本發(fā)明還提供了篩選可用于治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，其中所述方法包括使WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1或APCDD1多肽與受試化合物接觸，并選擇能抑制WDRPUH， KRZFPUH, PPIL1或APCDD1多肽的表達(dá)水平或生物活性的受試化合物。
本發(fā)明還提供了篩選可用于治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，其中所述方法包括在適于表達(dá)報道基因的條件下，使受試化合物、p-連環(huán)蛋白/Tcf 4復(fù)合物和具有^尸CDD7的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)、含有兩個Tcf/LEF結(jié)合基元的報道基因接觸，并選擇抑制報道基因表達(dá)的受試化合物。
另外，本發(fā)明提供了篩選可用于治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，其中所述方法包括在受試化合物的存在下使PPIL1與驛蛋白或SNW1接觸，并選擇抑制PPIL1與驛蛋白或SNW1結(jié)合的受試化合物。本申請還提供了用于治療細(xì)胞增殖性疾病，如癌癥的藥物組合物。藥
物組合物可以是例如抗癌劑。藥物組合物可被描述為分別如SEQ ID NO: 1,3， 5或7所示和所述的『Z^尸[///， ^ZF尸(/T/，尸P/丄7或^PCDZ)7多核苷酸序列的反義S-寡核苷酸或siRNA的至少一部分。適當(dāng)?shù)姆戳xS-寡核苷酸具有選自SEQ ID NO: 16, 37， 44或89的核苷酸序列。包括具有SEQ ID NO: 16所示核苷酸序列的反義S-寡核苷酸的『"及/^7/f反義S-寡核普酸適用于治療肝癌和胃癌；包括具有SEQ ID NO: 37所示核苷酸序列的反義S-寡核苷酸的^ ZF尸t/7/反義S-寡核苷酸適用于治療肝癌、胃癌和肺癌；包括具有SEQID NO: 44所示核菩酸序列的反義S-寡核苷酸的尸尸/丄7反義S-寡核芬酸適用于治療結(jié)腸癌；而包括具有SEQIDNO: 89所示核香酸序列的反義S-寡核苷酸的J尸a)D7反義S-寡核苷酸適用于治療結(jié)腸癌。藥物組合物也可以含有通過本發(fā)明的治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的篩選方法所選擇的化合物。
藥物組合物的作用過程需要抑制癌細(xì)胞的生長?？蓪⑺鏊幬锝M合物施用于哺乳動物，包括人和家養(yǎng)的哺乳動物。
本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明提供的藥物組合物治療細(xì)胞增殖性疾病的方法。
另外，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括施用WDRPUH， KRZFPUH, PPIL1或APCDD1多肽的步驟。預(yù)期施用WDRPUH，KRZFPUH, PPIL1或APCDD1多肽能引發(fā)抗腫瘤免疫力。因此，本發(fā)明還提供了引發(fā)抗肺瘤免疫力的方法，所述方法包括施用WDRPUH, KRZFPUH,PPIL1或APCDD1多肽，以及含有WDRPUH， KRZFPUH, PPIL1或APCDD1多肽的治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物的步驟。
應(yīng)理解不論是上文的發(fā)明概述還是下文的詳細(xì)描述都是優(yōu)選的實施方案，而不是對本發(fā)明或本發(fā)明的其它可替換實施方案的限制。
本發(fā)明還涉及
1.選自下列的基本上純的多肽
(a) 多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2， 4, 6或8;
(b) 多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2， 4, 6或8，其中的一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2，4，6或8組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和
(c) 多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO: 1, 3， 5或7組成的多核苷酸雜交的多核苦酸編碼，且所述多肽具有與由SEQ ID NO: 2,4, 6或8中任一氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
2. 分離的多核苷酸，其編碼項l的多肽。
3. 載體，其含有項2的多核苷酸。
4. 宿主細(xì)胞，其攜有項2的多核苷酸或項3的載體。
5. 產(chǎn)生項l的多肽的方法，所述方法包括下述步驟
(a) 培養(yǎng)項々的宿主細(xì)胞；
(b) 使宿主細(xì)胞表達(dá)所述多肽；和
(c) 收集所表達(dá)的多肽。
6. 抗體，其與項l的多肽結(jié)合。
7. 多核苷酸，它與項2的多核香酸或其互補鏈互補，并且含有至少15個核苷酸。
8. 反義多核苦酸或小的干擾RNA,其針對項2的多核苦酸。
9. 項8的反義多核苷酸，其選自含有核苷酸序列SEQIDNO: 16, 37,44和89的核香酸。
10. 項8的小的干擾RNA，其有義鏈選自含有核苷酸序列SEQ ID NO:93, 94, 95, 96, 97, 98， 99， 100， 101, 102和103的核苷酸。
11. 診斷細(xì)胞增殖性疾病的方法，所述方法包括下述步驟
(a) 檢測樣本的生物樣品中編碼氨基酸序列SEQ ID NO: 2， 4， 6或8的基因的表達(dá)水平；和
(b) 將對表達(dá)水平的評價與疾病相關(guān)聯(lián)。
12. 項11的方法，其中通過選自下列的任一種方法檢測表達(dá)水平
(a) 檢測編碼氨基酸序列SEQ ID NO: 2， 4， 6或8的mRNA;
(b) 檢測含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2, 4， 6或8的蛋白質(zhì)；和
(c) 檢測含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2, 4, 6或8的蛋白質(zhì)的生物活性。
13. 篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，所述方法包括下述步
驟
(a)使受試化合物與選自下列的多肽接觸
(1) 多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2， 4, 6或8;
(2) 多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2， 4， 6或8,其中的一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2，4,6或8組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和
(3)多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO: 1, 3， 5或7 組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列 SEQ ID NO: 2， 4， 6或8組成的多肽等同的生物活性；
(b) 檢測所述多肽與受試化合物之間的結(jié)合活性；和
(c) 選擇與所述多肽結(jié)合的化合物。
14. 篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，所述方法包括下述步
驟
a) 使候選化合物與細(xì)胞接觸，所述細(xì)胞表達(dá)一種或多種由核普酸序列 SEQIDNO: 1，3，5或7組成的多核苷酸；和
b) 選擇與缺乏受試化合物時檢測到的表達(dá)水平相比，能降低一種或多 種由核苷酸序列SEQ ID NO: 1， 3， 5或7組成的多核苷酸的表達(dá)水平的受試化合物。
15. 篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，所述方法包括下述步
驟
(a) 使受試化合物與選自下列的多肽接觸
(1) 多肽，含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2, 4, 6或8的；
(2) 多肽，含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2， 4， 6或8,其中的一個或多個 氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且具有與由氨基酸序列SEQ ID NO:2,4,6或8組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和
(3) 多肽，由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO: 1, 3, 5或7組 成的多核香酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列 SEQ ID NO: 2， 4, 6或8組成的多肽等同的生物活性；
(b) 檢測步驟(a)的多肽的生物活性；和
(c) 選擇與缺乏受試化合物時檢測到的生物活性相比，能抑制所述多肽 生物活性的化合物。
16. 項15的方法，其中生物活性是細(xì)胞-增殖活性。
17. 篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，所述方法包括下述步
驟
a)使候選化合物與已導(dǎo)入載體的細(xì)胞接觸，所述載體含有一或多種標(biāo) 記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制之下表達(dá)的報道基因，其中一或多種標(biāo)記基因含有選自SEQ ID NO: 1， 3, 5或7的任一核苷酸序列，
b) 測定所述報道基因的活性；和
c) 選擇與對照相比能降低所述報道基因的表達(dá)水平的化合物。
18.篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，所迷方法包括下述步
驟
體；
(a)構(gòu)建,
(b) 用步驟(a)的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞；
(c) 在p-連環(huán)蛋白/Tcf4復(fù)合物的存在下，使受試化合物和與步驟(b)的 細(xì)胞接觸；
(d) 檢測報道基因的表達(dá)；和
(e) 選擇與缺乏受試化合物時相比，能抑制報道基因表達(dá)的受試化合物。
19. 篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，所述方法包括下述步
驟
(a) 在受試化合物存在的情況下，使選自下列的多肽與驛蛋白或 SNW1接觸
(1) 多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO: 6;
(2) 多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO: 6且其中一個或多個氨基酸被 取代、缺失、插入和/或添加，并且該多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO: 6組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和
(3) 多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由SEQIDNO: 5的核苷酸序列組成的 多核苷酸雜交的多核普酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO: 6組成的多肽等同的生物活性；
(b) 檢測多肽與驛蛋白或SNWl之間的結(jié)合；和
(c) 選擇能抑制所迷多肽與驛蛋白或SNW1之間的結(jié)合的受試化合物。
20. 項11至19中任一項的方法，其中細(xì)胞-增殖性疾病是癌癥。
21. 治療細(xì)胞增殖性疾病的組合物，所述組合物含有藥物有效量的針 對編碼選自下列之多肽的多核苷酸的反義多核苷酸或小干擾RNA:
(a) 多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4, 6或8;
(b) 多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2, 4, 6或8且其中一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列
SEQ ID NO: 2， 4， 6或8組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和
(c)多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO: 1, 3， 5或7 組成的多核苦酸雜交的多核香酸編碼，其中所迷多肽具有與由氨基酸序列 SEQ ID NO: 2, 4， 6或8組成的多肽等同的生物活性。
22. 治療細(xì)胞增殖性疾病的組合物，所述組合物含有藥物有效量的抗 選自下列之多肽的抗體
(a) 多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4，6或8;
(b) 多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2, 4， 6或8且其中一個或多個 氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列 SEQ ID NO: 2, 4, 6或8組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和
(c) 多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO: 1, 3， 5或7 組成的多核香酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列 SEQ ID NO: 2， 4， 6或8組成的多肽等同的生物活性。
23. 治療細(xì)胞增殖性疾病的組合物，所述組合物含有藥物有效量的通 過項13至19中任一項的方法選擇的化合物。
24. 項21至23中任一項的組合物，其中細(xì)胞增殖性疾病是癌癥。
25. 治療細(xì)胞增殖性疾病的方法，所述方法包括施用藥物有效量的針 對編碼選自下列之多肽的多核苷酸的反義多核苷酸或小干擾RNA的步驟
(a) 多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2， 4， 6或8;
(b) 多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2, 4， 6或8且其中一個或多個 氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述具有與由氨基酸序列SEQ ID NO: 2, 4, 6或8組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和
(c) 多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO: 1, 3, 5或7 組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列 SEQ ID NO: 2, 4, 6或8組成的多肽等同的生物活性。
26. 治療細(xì)胞增殖性疾病的方法，所述方法包括施用藥物有效量的抗 選自下列之多肽的抗體的步驟
(a) 多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4，6或8;
(b) 多肽，含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2， 4, 6或8且其中一個或多個氨 基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4, 6或8組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和
(c)多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO: 1, 3, 5或7 組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列 SEQ ID NO: 2, 4， 6或8組成的多肽等同的生物活性。
27. 治療細(xì)胞增殖性疾病的方法，所述方法包括施用藥物有效量的通 過項13至19中任一 項的方法選4奪的化合物的步驟。
28. 項25至27中任一項的組合物，其中細(xì)胞增殖性疾病是癌癥。
29. 治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括施用藥物有效量的選自(a)-(c)的多肽或編碼所述多肽的多核普酸的步驟
(a) 多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4，6或8;
(b) 多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2， 4, 6或8且 其中一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽或其 片段具有與由氨基酸序列SEQIDNO: 2， 4， 6或8組成的蛋白質(zhì)等同的生物活 性；和
(c) 多肽或其片段，所述多肽由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO: 1, 3, 5或7組成的多核苦酸雜交的多核普酸編碼，其中所述多肽具有 與由氨基酸序列SEQ ID NO: 2， 4, 6或8組成的多肽等同的生物活性。
30. 誘導(dǎo)抗肺瘤免疫力的方法，所述方法包括使選自(a)-(c)的多肽與 抗原呈遞細(xì)胞接觸或?qū)⒕幋a所述多肽的多核苷酸或含有所述多核苷酸的載 體導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞的步驟
(a) 多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQIDNO:2，4，6或8;
(b) 多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2, 4, 6或8且 其中一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有 與由氨基酸序列SEQ ID NO: 2, 4， 6或8組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和
(c) 多肽或其片段，所述多肽由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO: 1， 3， 5或7組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有 與由氨基酸序列SEQ ID NO: 2, 4， 6或8組成的多肽等同的生物活性。
31. 項30的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的方法，其中所述方法還包括給受試者 施用抗原呈遞細(xì)胞的步驟。
32. 治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，所述組合物含有藥物有效量的選 自(a)-(c)的多肽或編碼所述多肽的多核苷酸(a) 多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2, 4， 6或8;
(b) 多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2， 4, 6或8且 其中一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且具有與由氨基 酸序列SEQ IDNO: 2， 4， 6或8組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和
(c) 多肽或其片段，所述多肽由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQ IDNO: 1， 3, 5或7組成的多核苷酸雜交的多核苦酸編碼，其中所述多肽具有 與由氨基酸序列SEQ ID NO: 2, 4， 6或8組成的多肽等同的生物活性。
33.項32的藥物組合物，其中多核普酸被摻入表達(dá)載體。


圖1 a至1 d顯示出『"7 尸^7和^2^尸￡///在1^(:€中的表達(dá)。圖1 a顯示出
非-癌癥)。在穿過截留濾器(Cy3和Cy5信號都大于25，000)的12個HCC中，11 個HCC中的『2^ 尸 7//表達(dá)被上調(diào)(073^丫5強度比率〉2.0)。圖lb顯示出 /O ZF尸W^在20個HCC中的相對表達(dá)率(癌癥/非-癌癥)。在穿過截留濾器的 14個HCC中，11個HCC中的iCRZF尸t/7/表達(dá)被上調(diào)(Cy3 :Cy5強度比率 >2.0)。圖lc和ld提供照片顯示出使用額外的10個HCC病例，經(jīng)半-定量RT-PCR分析獲得的『Di^W/(c)和^Zi^W/(d)的表達(dá)情況(T,腫瘤組織；N, 正常組織)。將04戶D7/的表達(dá)用作內(nèi)部對照。
圖2a和2b顯示出『Di 戶W/在多種人組織中的表達(dá)以及WDRPUH的推定 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)基元。圖2a提供照片顯示出經(jīng)多組織Northern印跡分 析獲得的『Z^尸W7在多種人組織中的表達(dá)。圖2b顯示出WDRPUH的推定蛋 白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
圖3提供照片顯示出WDRPUH的亞細(xì)胞定位，所述定位是通過免疫細(xì) 胞化學(xué)在經(jīng)pcDNA3.1 myc/His-WDRPUH轉(zhuǎn)染的SNU475細(xì)胞上觀察得到 的，其中特別地使用了抗-myc單克隆抗體，為了進(jìn)行觀察還使用了與FITC 偶聯(lián)的抗-小鼠IgG第二抗體。細(xì)胞核用DAPI復(fù)染。
圖4a和4b顯示出奶Di 尸t/7/對NIH3T3細(xì)胞的細(xì)胞生長的影響。圖4a提供 照片顯示出被『Z)i 尸l7/f,『Di 戶C/7/的反義核酸和單獨的載體轉(zhuǎn)染的 NIH3T3細(xì)胞的集落形成試驗結(jié)果。圖4b顯示出經(jīng)電光密度法計數(shù)的集落數(shù) 目。("表示經(jīng)Student，s/試驗測定的與對照細(xì)胞的顯著性差異(p0.05)。
圖5a和5b顯示出被指定用于抑制『Di^W/的反義S-寡核普酸的生長抑
19制作用。圖5a提供照片顯示出『￡^尸^///和04/^//(對照)在用有義 (WDRPUH-S4)或反義(WDRPUH-AS4)寡核苷酸處理12小時的SNU475細(xì)胞 中的表達(dá)。圖5b顯示出用寡核苷酸處理72小時后，經(jīng)MTT試驗測定的 SNU475細(xì)胞的細(xì)胞生存力。
圖6A和6B顯示出WDRPUH-siRNA的生長抑制作用。圖6A^是供照片顯 示出^D7 尸L/i/和GylP/)i/(對照)在被WDRPUH-siRNA轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中的 表達(dá)。圖6B提供照片顯示出用對照-siRNA或WDRPUH-siRNA處理的存活 細(xì)胞的Giemsa染色結(jié)果。
圖7提供照片顯示出經(jīng)FLAG-標(biāo)記的WDRPUH蛋白使用抗-WDRPUH抗 血清(#1， #2和#3),預(yù)-免疫血清(pre-immune sera)和抗-FLAG抗體的狹線印 跡(slot blot)分析結(jié)果。
圖8a和8b顯示出^ZFPt/7/在多種人組織中的表達(dá)以及KRZFPUH的推 定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)基元。圖8a提供照片顯示出經(jīng)多組織Northern印跡 分析獲得的K/ Z/TO7/在多種人組織中的表達(dá)。圖8b顯示出KRZFPUH的推 定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
圖9提供照片顯示出KRZFPUH的亞細(xì)胞定位，所述定位是通過免疫細(xì)
的，其中特別地使用了抗-His單克隆抗體，為了進(jìn)行觀察還使用了與羅丹 明偶聯(lián)的抗-小鼠IgG第二抗體。細(xì)胞核用DAPI復(fù)染。
圖10a和10b顯示出K/ ZF尸C7/f對COS7細(xì)胞的細(xì)胞生長的影響。圖10a提 供照片顯示出凈iU^ZF尸t/7/轉(zhuǎn)染，和^^ZF尸C/Z/的反義核酸轉(zhuǎn)染的COS7細(xì) 胞的集落形成試驗結(jié)果。圖10b顯示出經(jīng)電光密度法計數(shù)的集落數(shù)目。(*) 表示經(jīng)Student，sri式驗測定的與對照細(xì)胞的顯著性差異(p0.05)。
圖11&和111>顯示出被指定用于抑制^2/^//的反義8-寡核苷酸的生長 抑制作用。圖1 la提供照片顯示出『/^尸[///和04尸D7/(對照)在被有義 (KRZFPUH-S4)或反義(KRZFPUH-AS4)寡核苷酸轉(zhuǎn)染的Alexander細(xì)胞中的
時的SNU475細(xì)胞中的表達(dá)。("表示經(jīng)Student，s 試^r測定的與對照細(xì)胞的 顯著性差異(p〈0.05)。
圖12A至12D顯示出KRZFPUH-siRNA對Huh7細(xì)胞中i^ ZF尸W/表達(dá)的 生長抑制作用。圖12A表示使用提取自Huh7細(xì)胞的RNA進(jìn)行的半定量RT-PCR的結(jié)果，其中所述細(xì)胞被psiU6BX-KRZFPUH2(Si-02), psiU6BX-EGFP (EGFP)或模擬載體(Mock)轉(zhuǎn)染。將04尸D/Z用作內(nèi)部對照。圖12B顯示出在 轉(zhuǎn)染的第5天，用對照質(zhì)粒(Mock和EGFP)或表達(dá)KRZFPUH-siRNA的質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染的存活細(xì)胞的MTT試驗結(jié)果。("表示經(jīng)Fisher，s protected least顯著性 差異試驗測定的顯著性差異(pO.Ol)。圖12C顯示出在轉(zhuǎn)染的第10天，用對 照質(zhì)粒(Mock和EGFP)或psiU6BX-KRZFPUH2(Si-02)轉(zhuǎn)染的存活細(xì)胞的MTT 試驗結(jié)果。("表示經(jīng)Fisher，s protected least顯著性差異試驗測定的顯著性差 異(pO.Ol)。圖12D提供照片顯示出在轉(zhuǎn)染的第10天，用對照質(zhì)粒(Mock和 EGFP)或psiU6BX-KRZFPUH2(Si-02)轉(zhuǎn)染的存活細(xì)胞的Giemsa染色結(jié)果。
圖13A至13C顯示出KRZFPUH-siRNA對多種細(xì)胞生存力的影響。圖 13A顯示出在轉(zhuǎn)染的第IO天，使用經(jīng)對照質(zhì)粒(Mock和EGFP)或psiU6BX-KRZFPUH2(Si-02)轉(zhuǎn)染的Alexander細(xì)胞進(jìn)行的MTT試驗的結(jié)果。圖13B顯 示出在轉(zhuǎn)染的第10天，使用經(jīng)對照質(zhì)粒(Mock和EGFP)或psiU6BX-KRZFPUH2(Si-02)轉(zhuǎn)染的SNU449細(xì)胞進(jìn)行的MTT試驗的結(jié)果。圖13C顯示 出經(jīng)MTT試驗測定的KRZFPUH-siRNA對HepG2細(xì)胞生存力的影響。(*)表 示經(jīng)Fisher，s protected least顯著性差異試-瞼測定的顯著性差異(pO.Ol)。
圖14a和14b顯示出/^/ZJ在結(jié)腸癌中的表達(dá)。圖14a顯示出通過cDNA 微陣列檢測獲得的P戶/ZJ在11個結(jié)腸癌病例中的相對表達(dá)率(癌癥/非-癌 癥)。在穿過截留濾器的6個病例中，6例中的尸尸/丄7表達(dá)被上調(diào)(Cy3:Cy5強 度比率〉2.0)。圖14b提供照片顯示出使用額外的20個結(jié)腸癌病例，經(jīng)半-定 量RT-PCR分析獲得的戶尸幾7的表達(dá)情況(T,腫瘤組織；N,正常組織)。將 04尸D77的表達(dá)用作內(nèi)部對照。
圖15顯示出PPILl(人(7/owo s^ /em1)), Ppill(鼠(A/附w附cw/w力)，Cyp2(粟 酒裂歹直斗唐酵母(Sc/Kosacc/zaro附y(tǒng)ces pomZ7e))#。CypE(D/c"asfe//wm A、co/t/eww) 之間的相似性。
圖16顯示出尸尸/Z^對NIH3T3和HCT16細(xì)胞的細(xì)胞生長的影響。圖16a 提供照片顯示出被尸尸/W轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞的集落形成試驗結(jié)果。圖16b 提供照片顯示出被/^/丄/轉(zhuǎn)染的HCT116細(xì)胞的集落形成試驗結(jié)果。在這兩 個實驗中，將pcDNA-LacZ和表達(dá)戶尸/丄7編碼區(qū)的互補鏈的pcDNA3.1 -antisense用作陰性對照。
圖17a至17c顯示出尸尸/ZJ的反義S-寡核苷酸在人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480中的生長抑制作用。圖17a提供照片顯示出戶尸/"和04尸D/Z(對照)在用有義 (PPIL 1-S2)、反義(PPIL 1-AS2)或scramble(PPIL 1 -SCR2)S-寡核普酸處理的 SW々80細(xì)胞中的表達(dá)。圖17b提供照片顯示出PPILl-AS2的生長抑制作用。 圖17c顯示出用寡核普酸處理72小時后，經(jīng)MTT試驗測定的SE480、 SNUC4 和SNUC5細(xì)胞的細(xì)胞生存力。
圖18提供照片表示PPIL1在體外與SNW1結(jié)合。用pFLAG CMV-PPIL1 和pcDNA3.1 myc/His-SNW 1共轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞。將細(xì)胞裂解物與抗c-Myc多 克隆抗體或抗FLAG單克隆抗體一起進(jìn)行免疫沉淀，分別用抗-FLAG單克 隆抗體或抗c-Myc多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡。
圖19a至19d提供照片顯示出經(jīng)FLAG標(biāo)記的PPIL 1和經(jīng)myc-標(biāo)記的 SNW1蛋白的亞細(xì)胞定位。圖19a提供照片顯示出用pFLAG CMV-PPIL1轉(zhuǎn) 染、并用抗-FLAG M2單克隆抗體染色的COS7細(xì)胞。使用經(jīng)羅丹明標(biāo)記的 抗小鼠IgG抗體觀察到經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)。圖19b提供照片顯示出用 pcDNA3,lmyc/His-SNW1轉(zhuǎn)染、并用抗c-Myc抗體染色的COS7細(xì)胞。使用 經(jīng)FITC標(biāo)記的抗兔IgG抗體觀察到經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)。圖19c是細(xì)胞的照片， 其中細(xì)胞核被DAPI復(fù)染。圖19d是(a), (b)和(c)的合并圖。PPIL1和SNW1共 同定位于細(xì)胞核中。
圖20提供照片顯示出經(jīng)多組織Northem印跡分析獲得的尸尸/丄/在多種人 組織中的表達(dá)。
圖21A和21B顯示出PPIL1 - siRN A對SNUC4和SNUC 5細(xì)胞的生長抑制作 用。圖21A提供照片顯示出尸尸/ZJ和04尸D/f(對照)在被PPILl-siRNA轉(zhuǎn)染的 SNUC4和SNUC5細(xì)胞中的表達(dá)。圖21B提供照片顯示出用對照-siRNA或 PPIL 1 -siRNA處理的存活細(xì)胞的Giemsa染色結(jié)果。
圖22 A和22B顯示出PPIL l重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)。圖22A提 供照片顯示出與GST-融合的PPIL1蛋白的表達(dá)。圖22B提供照片顯示出經(jīng) His-標(biāo)記的PPIL1蛋白的表達(dá)。
圖23A和23B顯示出在酵母雙雜合系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)中， PPIL1和驛蛋白之間的相互作用。圖23A提供照片顯示出在雙雜合系統(tǒng)中 PPIL1與驛蛋白的相互作用。圖23B提供照片顯示出PPIL1與驛蛋白在體內(nèi) 的相互作用。
圖24顯示出PPIL1和驛蛋白共同定位于被pFLAG-PPILl和pCMV-HA-STMN共轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞的胞質(zhì)中。圖24提供照片顯示出對COS7細(xì)胞胞 質(zhì)中PPIL1和驛蛋白的熒光免疫組化染色結(jié)果。
圖25A和25B顯示出驛蛋白的多個缺失突變體與PPIL1在體內(nèi)的相互作 用。圖25A圖解顯示了驛蛋白的多個缺失突變體結(jié)構(gòu)。圖25B提供照片顯示
圖26A和26B顯示出驛蛋白突變體與PPIL1在體內(nèi)的相互作用。圖26A 圖解顯示了驛蛋白突變體，其中Ser被Ala所取代。圖26B提供照片顯示出驛 蛋白的表達(dá)以及PPIL1與突變體在體內(nèi)的共沉淀。
圖27a至27c提供照片顯示出^尸CD"/的表達(dá)。圖27a提供照片闡明了被
被所示腺病毒感染的SW480細(xì)胞中分離RNA和蛋白質(zhì)提取物并保溫72小 時。圖27b提供照片顯示出經(jīng)Northern印跡分析得到的力尸a)D7在成人組織 中的表達(dá)。J尸CD/)/在心臟、胰腺、前列腺和卵巢中顯著表達(dá)，而在肺、 肝臟、腎臟、脾、胸腺、結(jié)腸和外周血細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。圖27c提供照 片顯示出經(jīng)半定量RT-PCR測定的^尸CDD7在結(jié)腸癌組織(T)和相應(yīng)的非癌 粘膜(N)中的表達(dá)。在所檢查的3 0個病例的2 0例中觀察到增加的表達(dá) (67%)。將04尸Z)/7的表達(dá)用作內(nèi)部對照。
圖28顯示出使用多種^PCZ)Z)/質(zhì)粒進(jìn)行的報道子試驗(reporter assay)的 結(jié)果。圖28a圖解顯示了APCDDl 5，側(cè)翼區(qū)中的推定Tcf4-結(jié)合元件和多種 爿PCDD7報道質(zhì)粒。加號和減號表示自推定的轉(zhuǎn)錄起始位點起的核苷酸位 置。圖28b表示^i艮道質(zhì)斗立和表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-mock, pcDNA-mut卩-catenin， pcDNA-wtTcf-4，或pcDNA-dnTcf4)以多種組合共轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的螢光素 酶活性。轉(zhuǎn)染后48小時，同時進(jìn)行三份報道試驗。線條表示SD。 (*)表示經(jīng) Schefft，s F試驗測定的顯著性差異(尸O.Ol)。
圖29提供照片表示EMSA的結(jié)果，圖中顯示出含有TBM1或TBM2的元 件與(3-連環(huán)蛋白/Tcf4復(fù)合物之間的相互作用。加入抗-(3-連環(huán)蛋白抗體(泳 道2)而不是抗-P53-抗體(泳道3)之后，觀察到代表復(fù)合物的帶的超級位移。 通過加入未經(jīng)標(biāo)記的野生型探針特異性封閉對應(yīng)于Tcf4-探針和(3-連環(huán)蛋白 /Tcft-探針的帶(泳道5)。
供照片顯示出LoVo細(xì)胞集落-形成試驗的結(jié)果。用pcDNA3.1-APCDDl 、pcDNA或pcDNA-antisense轉(zhuǎn)染細(xì)胞。圖30b提供照片顯示出」PCDZ)7在表達(dá) 外源性^PCZ)Z)7的LoVo細(xì)胞(LoVo-APCDDl)和對照(LoVo-載體)細(xì)胞中的 表達(dá)。圖30c顯示出LoVo-APCDDl和LoVo-載體細(xì)胞的生長。圖30d顯示出 在棵鼠中兩克隆LoVo-APCDDl細(xì)胞和兩克隆LoVo-載體細(xì)胞內(nèi)的腫瘤生長。
圖31A至31C顯示出被指定用于降^^PCDD/表達(dá)的反義S-寡核苷酸的 生長抑制作用。圖31A提供照片顯示出^PO^^在用有義(APCDD-S2)或反 義(APCDD-AS2)S-寡核苷酸處理24小時的SW480細(xì)胞中的表達(dá)。將(24戶D// 的表達(dá)用作內(nèi)部對照。圖31B提供照片顯示出APCDD-AS2的生長抑制作 用。圖31C顯示出用寡核普酸處理之后，經(jīng)MTT試驗測定的SW480細(xì)胞的 細(xì)胞生存力。線條表示SD。("表示經(jīng)SchefK，s F試驗測定的顯著性差異 (尸O.Ol)。
圖32提供照片顯示出用APCDD1 、用或不用pFLAG-APCDDl轉(zhuǎn)染的
COS7細(xì)胞，以及結(jié)腸癌細(xì)胞系的Western印跡分析結(jié)果。
圖33提供照片顯示出APCDD1蛋白在SW480細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。
圖34提供照片顯示出結(jié)腸的非癌粘膜(A)和腺癌(B)中APCDD1的熒光
免疫組化染色結(jié)果。
圖3 5提供照片顯示出結(jié)腸癌組織中AP CDD1的免疫組化染色結(jié)果。 圖36提供照片顯示出結(jié)腸腺瘤中APCDD1的免疫組化染色結(jié)果。 發(fā)明詳述
除非另有說明，本文所用術(shù)語"一個"、"一種"指的是"至少一 個"和"至少一種"。
本申請鑒定出新的人基因『Z^尸67/和A^ZF尸t///，與相應(yīng)的非癌肝組 織相比，所述基因在HCC中的表達(dá)顯著升高。^T^尸W/cDNA由"2個核 苷酸組成，其中含有如SEQ ID NO: l所示的1860個核苷酸長的開放閱讀 框。開放閱讀框編碼推定的620個-氨基酸長的蛋白質(zhì)，其中含有l(wèi)l個 WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域。因此，將該蛋白質(zhì)命名為WDRPUH(在HCC中被上調(diào)的 WD40重復(fù)蛋白質(zhì))。另一方面，^ ZF尸M7 cDNA由2744個核苷酸組成，其 中含有如SEQ ID NO: 3所示的1500個核苷酸長的開放閱讀框。開放閱讀框 編碼推定的500個-氨基酸長的蛋白質(zhì)，其中含有Kruppel-型鋅指蛋白結(jié)構(gòu) 域。因此，將該蛋白質(zhì)命名為KRZFPUH(在HCC中被上調(diào)的Krupple-型鋅指蛋白)。
此外，本發(fā)明包括新的人基因尸尸7L7和v4PO)D7,與相應(yīng)的非癌組織相 比，所述基因在結(jié)腸癌中的表達(dá)顯著升高。尸尸/ZJ cDNA由1734個核苦酸組 成，其中含有如SEQIDNO: 5所示的498個核苷酸長的開放閱讀框。開放閱 讀框編碼推定的166個-氨基酸長的蛋白質(zhì)。PPIL1與參與維生素D受體轉(zhuǎn)錄 活性的蛋白質(zhì)，即SKI相互作用蛋白(SNW1)以及參與細(xì)胞周期進(jìn)程的胞質(zhì) 磷蛋白，即驛蛋白直接結(jié)合。另一方面，^尸CZ)D7 cDNA由2607個核苷酸 組成，其中含有如SEQ ID NO: 7所示的1542個核香酸長的開放閱讀框。開 放閱讀框編碼推定的5M個-氨基酸長的蛋白質(zhì)，其中不含已知的基元。該 基因被稱為爿尸CDD7(被APC l下調(diào))。另外，(3-連環(huán)蛋白/Tcf4復(fù)合物通過與 爿戶CDD/轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)中的兩個Tcf/LEF結(jié)合基元結(jié)合來增強APCDDl的表 達(dá)。
『i^戶C/7/， i^ZF戶f///，尸尸/ZJ或APO)D7在細(xì)胞內(nèi)的外源性表達(dá)總能使 細(xì)胞生長增強，而用反義S-寡核苷酸或小的干擾RNA(siRNA)抑制其表達(dá)會 導(dǎo)致對癌細(xì)胞的顯著生長-抑制作用。這些發(fā)現(xiàn)表明WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1和APCDD1為癌細(xì)胞提供了致癌活性，抑制這些蛋白質(zhì)的活性不失為 一種治療癌癥的理想策略。
本發(fā)明包括新的人基因『i^尸t/i/,其包括SEQIDNO: l所述的多核苷 酸序列及其簡并序列和突變體，條件是它們都能編碼WDRPUH蛋白，所述 蛋白質(zhì)包括SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列或其功能等同物。與WDRPUH蛋 白功能等同的多肽包括例如其它生物體中與人WDRPUH蛋白相對應(yīng)的同源 蛋白質(zhì)以及人WDRPUH蛋白的突變體。
本發(fā)明包括新的人基因^2F戶L^,其包括SEQ ID NO: 3所述的多核苷 酸序列及其簡并序列和突變體，條件是它們都能編碼KRZFPUH蛋白，所 述蛋白質(zhì)包括SEQIDNO: 4所示氨基酸序列或其功能等同物。與KRZFPUH 功能等同的多肽包括例如其它生物體中與人KRZFPUH蛋白相對應(yīng)的同源 蛋白質(zhì)以及人KRZFPUH蛋白的突變體。
另外，本發(fā)明包括新的人基因尸尸/ZJ，其包括SEQIDNO:5所述的多核 苷酸序列及其簡并序列和突變體，條件是它們都能編碼PPIL1蛋白，所述 蛋白質(zhì)包括SEQIDNO: 6所示氨基酸序列或其功能等同物。與PPIU功能等 同的多肽包括例如其它生物體中與人PPIL 1蛋白相對應(yīng)的同源蛋白質(zhì)以及人PPIL1蛋白的突變體。
本發(fā)明包括新的人基因」PCDZ^,其包括SEQ ID NO: 7所述的多核苷 酸序列及其簡并序列和突變體，條件是它們都能編碼APCDD1蛋白，所述 蛋白質(zhì)包括SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列或其功能等同物。與APCDD1功 能等同的多肽包括例如其它生物體中與人APCDD1蛋白相對應(yīng)的同源蛋白 質(zhì)以及人APCDD 1蛋白的突變體。
在本發(fā)明中，術(shù)語"功能等同"指的是所述多肽具有類似于WDRPUH KRZFPUH, PPIL1或APCDD1蛋白的促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性，并能賦予癌細(xì)胞 以致癌活性。通過將編碼所述多肽的DNA導(dǎo)入表達(dá)各個多肽的細(xì)胞，并檢 測對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用或集落形成活性的提高，即可判斷所述多肽是否 具有細(xì)胞增殖活性。所述細(xì)胞包括例如針對WDRPUH的NIH3T3， SNU475 和HepG2;針對KRZFPUH的COS7和Alexander細(xì)胞；針對PPIL1的NIH3T3， HCT116, SW480, SNU-C4和SNU-C5;以及針對APCDD1的LoVo細(xì)胞和 SW480。或者，可通過檢測其與SNW1或驛蛋白的結(jié)合能力來判斷所述多 肽是否與PPIL1功能等同。
與給定蛋白質(zhì)功能等同的多肽的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知 的，并且包括在蛋白質(zhì)中導(dǎo)入突變的已知方法。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員通 過定點誘變(Hashimoto-Gotoh et al., Gene 152: 271-275(1995); Zoller and Smith, Methods Enzymol 100: 468-500(1983); Kramer et al.， Nucleic Acids Res. 12: 9441-9456(1984); Kramer and Fritz, Methods Enzymol 154: 350-367(1987); Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82: 488-492(1985); Kunkel， Methods Enzymol 85: 2763-2766(1988))在人WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1或APCDD1蛋白的氨 基酸序列中導(dǎo)入適當(dāng)?shù)耐蛔儯纯芍苽涑雠c所述的任一種蛋白質(zhì)功能等同 的多肽。氨基酸突變也可自然發(fā)生。本發(fā)明的多肽包括具有人WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1或APCDD1蛋白的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中一個或多個 氨基酸已經(jīng)突變，條件是所得突變多肽與人WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1或 APCDD1蛋白的功能等同。所述突變體中突變氨基酸的數(shù)目 一般為10個氨 基酸或更少，優(yōu)選為6個氨基酸或更少，更優(yōu)選為3個氨基酸或更少。
已知經(jīng)突變或修飾的蛋白質(zhì)能保留原始的生物活性，其中所述蛋白質(zhì) 具有因在某個氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一個或多個氨基酸 殘基而被修飾的氨基酸序歹'KMark et al.， Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-5666(1984); Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10: 6487-6500(1982); Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-6413(1982))。
優(yōu)選將待突變的氨基酸殘基突變成不同的氨基酸，其中氨基酸側(cè)鏈的 特性是保守的(已知為保守的氨基酸取代過程)。氨基酸側(cè)鏈特性的例子 為:疏水氨基酸(A, I， L， M， F, P， W, Y, V),親水氨基酸(R， D， N， C， E, Q, G, H，K，S，T),以及具有下述官能團(tuán)或共有特性的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A，V, L, I，P);含羥基側(cè)鏈(S, T, Y);含硫原子側(cè)鏈(C, M);含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D, N， E, Q);含堿基側(cè)鏈(R, K, H)和含芳香族側(cè)鏈(H, F, Y, W)。需說明的是括 號中的字母表示氨基酸的單字母代碼。
在人WDRPUH, KRZFPUH， PPIL1或APCDD1蛋白的氨基酸序列中添加 一個或多個氨基酸殘基所得多肽的例子是含有人WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1或APCDD1蛋白的融合蛋白。融合蛋白是人WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1或APCDD1蛋白與其它肽或蛋白質(zhì)的融合蛋白，本發(fā)明包括所述融合 蛋白。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)即可制備融合蛋白，例如將編 碼本發(fā)明的人WDRPUH， KRZFPUH, PPIL1或APCDD1蛋白的DNA與編碼其 它肽或蛋白質(zhì)的DNA連接，使得讀碼框匹配，將融合DNA插入表達(dá)載體并 在宿主中表達(dá)所述融合DNA。對于與本發(fā)明的蛋白質(zhì)融合的肽或蛋白質(zhì)沒 有限制。
可用于與本發(fā)明的蛋白質(zhì)融合的已知肽包括例如FLAG (Hopp et d., Biotechnology 6: 1204-1210(1988))、含有6個His(組氨酸)殘基的6xHis、 10x His、流感病毒凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP片段、plSHIV片段、 T7-標(biāo)記、HSV-標(biāo)記、E-標(biāo)記、SV40T抗原片段、lck標(biāo)記、a-微管蛋白片 段、B-標(biāo)記、C蛋白片段等?？膳c本發(fā)明的蛋白質(zhì)融合的蛋白質(zhì)包括例如 GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)、流感病毒凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定區(qū)、(3-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖-結(jié)合蛋白)等。
通過將編碼上述融合肽或蛋白質(zhì)的商購DNA與編碼本發(fā)明多肽的DNA 融合，并表達(dá)所制備的融合DNA即可制備出融合蛋白。
另 一種本領(lǐng)域已知的分離功能等同多肽的方法是例如使用雜交技術(shù)的 方〉去(Sambrook et al.， Molecular Cloning 2nd ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press(1989))。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地分離出與編碼人WDRPUH, KRZFPUH, PPILl或APCDDl蛋白的DNA序列(即SEQ ID NO: 1， 3， 5或7)的
27全部或部分具有高度同源性的DNA，并且能從分離的DNA中分離出人 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1或APCDD1蛋白的功能等同多肽。本發(fā)明的多 肽包括由能與編碼人WDRPUH, KRZFPUH， PPIL1或APCDD1蛋白的DNA序 列的全部或部分雜交的DNA編碼、并且與人WDRPUH, KRZFPUH， PPIL1或 APCDD1蛋白功能等同的多肽。所述多肽包括對應(yīng)于人源蛋白質(zhì)的哺乳動 物同系物(例如由猴、大鼠、兔和?；蚓幋a的多肽)。當(dāng)從動物中分離與 編碼人WDRPUH蛋白的DNA高度同源的cDNA時，特別優(yōu)選使用得自睪丸 的組織。或者，當(dāng)從動物中分離與編碼人KRZFPUH蛋白的DNA高度同源 的cDNA時，特別優(yōu)選使用得自胎盤或睪丸的組織。另外，當(dāng)從動物中分 離與編碼人PPIL 1蛋白的DNA高度同源的cDNA時，特別優(yōu)選使用得自心 臟、骨骼肌、睪丸、曱狀腺或腎上腺的組織；當(dāng)從動物中分離與編碼人 APCDDl蛋白的DNA高度同源的cDNA時，優(yōu)選使用得自心臟、胰腺、前 列腺、卵巢、肺、肝臟、腎臟、脾、胸腺、結(jié)腸或外周白細(xì)胞的組織，特 別優(yōu)選使用得自心臟、胰腺、前列腺或卵巢的組織。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)選擇分離DNA所用的雜交條件，所述DNA編 碼與人WDRPUH， KRZFPUH， PPIL1或APCDD1蛋白功能等同的多肽。例 如，可通過于68。C使用"Rapid-hyb緩沖液，，(Amersham LIFE SCIENCE)進(jìn)行 預(yù)雜交達(dá)30分鐘或更長時間，加入經(jīng)標(biāo)記的^:針并于68。C加熱1小時或更 長時間來進(jìn)行雜交。例如，可在低嚴(yán)緊條件下進(jìn)行下述洗滌步驟。低嚴(yán)緊 條件是例如42。C， 2xSSC, 0.1% SDS,或優(yōu)選為50。C， 2XSSC, 0.1% SDS。更 優(yōu)選使用高度嚴(yán)緊條件。高度嚴(yán)緊條件是例如室溫下用2xSSC， 0.01% SDS 洗滌3次，每次20分鐘，然后于37。C用lxSSC，0.1。/。SDS洗滌3次，每次20分 鐘，再于50。C用lxSSC, 0.1% SDS洗滌2次，每次20分鐘。然而，幾個諸如 溫度和鹽濃度的因素可影響雜交的嚴(yán)緊度，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)選擇這 些因素以獲得所需的嚴(yán)緊度。
可以使用基因擴增法，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法替代雜交來分離 DNA，所述DNA編碼與人WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1或APCDD1蛋白功能 等同的多肽，所迷方法使用基于編碼蛋白質(zhì)的DNvVf列信息(SEQIDNO: 1,
3,5或7)所合成的引物。
由通過上述雜交技術(shù)或基因擴增技術(shù)分離的DNA編碼的、與人 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1或APCDD1蛋白功能等同的多肽一般與人WDRPUH， KRZFPUH， PPIL1或APCDD1蛋白的氨基酸序列具有高度同源 性。"高度同源性" 一般指的是同源性為40%或更高，優(yōu)選為60%或更 高，更優(yōu)選為80%或更高，甚至更優(yōu)選為95°/?；蚋摺８鶕?jù)"Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80:726-730 (1983)，，中的算法即可測定多肽 的同源性。
本發(fā)明多肽的氨基酸序列、分子量、等電點、糖鏈的存在或缺乏、或 形式可以有所不同，這取決于用于產(chǎn)生所述多肽的細(xì)胞或宿主或所使用的 純化方法。無論如何，只要其功能等同于本發(fā)明的人WDRPUH, KRZFPUK PPIL1或APCDD1蛋白，就落入本發(fā)明的范圍。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法可將本發(fā)明的多肽制備成重組蛋 白質(zhì)或天然蛋白質(zhì)。通過下述方法即可制備重組蛋白質(zhì)，即將編碼本發(fā)明 多肽的DNA(例如含有核苷酸序列SEQ ID NO: 1， 3, 5或7的DNA)插入適當(dāng)?shù)?表達(dá)載體，將載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，獲得提取物，通過對提取物進(jìn)行 層析來純化多肽，所述層析包括例如離子交換層析、反相層析、凝膠過 濾、或利用固定有抗本發(fā)明蛋白質(zhì)之抗體的層析柱的親和層析，或一種以 上所述柱的組合。
另外，當(dāng)在宿主細(xì)胞(例如動物細(xì)胞和大腸桿菌)中將本發(fā)明的多肽表 達(dá)成與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白或添加有多個組氨酸的重組蛋白質(zhì) 時，可使用谷胱甘肽柱或鎳柱來純化所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)?；蛘?，當(dāng)將本 發(fā)明的多肽表達(dá)成被c-myc，多個組氨酸或FLAG標(biāo)記的蛋白質(zhì)時，可分別 使用抗c-myc, His或FLAG的抗體來檢測和純化所述蛋白質(zhì)。
純化融合蛋白之后，必要時也可以通過凝血酶或Xa因子切割來切除非 目的多肽區(qū)域。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如通過使結(jié)合有能與WDRPUH， KRZFPUH， PPIL1或APCDD1蛋白結(jié)合的下述抗體的親和柱與表達(dá)本發(fā)明多 肽的組織或細(xì)胞提取物接觸，即可分離出天然蛋白質(zhì)?？贵w可以是多克隆 抗體或單克隆抗體。
本發(fā)明還包括本發(fā)明多肽的部分肽。部分肽具有本發(fā)明多肽所特有的 氨基酸序列，并由至少7個氨基酸，優(yōu)選為8個或更多個氨基酸，更優(yōu)選為 9個或更多個氨基酸組成。部分肽可用于例如制備抗本發(fā)明多肽的抗體， 篩選與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物，以及篩選本發(fā)明多肽的促進(jìn)劑或抑制劑。
通過基因工程，通過已知的肽合成法或通過用適當(dāng)?shù)碾拿赶景l(fā)明 的多肽，即可產(chǎn)生本發(fā)明的部分肽。例如，可以使用固相合成或液相合成 來進(jìn)行肽合成。
另外，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明多肽的多核苦酸。本發(fā)明的多核苷酸 可用于體內(nèi)或體外產(chǎn)生如上所述的本發(fā)明多肽，或者可用于因編碼本發(fā)明 蛋白質(zhì)的基因中的基因異常所致疾病的基因治療?？梢允褂萌魏涡问降谋?br> 發(fā)明的多核普酸，只要它能編碼本發(fā)明的多肽即可，其包括mRNA，RNA, cDNA,基因組DNA和化學(xué)合成的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸包括含有給 定核苦酸序列及其簡并序列的DNA,只要所得DNA能編碼本發(fā)明的多肽即可。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法即可制備本發(fā)明的多核苷酸。例如， 可通過下述方法制備本發(fā)明的多核普酸由表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞制備 cDNA文庫，并使用本發(fā)明DNA(如SEQ ID NO: 1， 3, 5或7)的部分序列作為 探針進(jìn)行雜交。例如，通過Sambrook et al.， Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)中所述的方法即可制備cDNA文庫；或者也可 以使用商購的cDNA文庫。也可通過下述方法制備cDNA文庫從表達(dá)本發(fā) 明多肽的細(xì)胞中提取RNA，基于本發(fā)明DNA的序列(如SEQIDNO: 1,3,5或 7)合成寡DNA，使用寡DNA作為引物進(jìn)行PCR,并擴增編碼本發(fā)明蛋白質(zhì) 的cDNA。
另外，通過對所得cDNA的核苷酸進(jìn)行測序，即可常規(guī)測定由cDNA編 碼的翻譯區(qū)，并能容易地獲得本發(fā)明多肽的氨基酸序列。另外，通過使用
D亂
更具體地，可首先從表達(dá)本發(fā)明目的多肽的細(xì)胞、組織或器官中制備 mRNA(『Di 尸t/Z/:睪丸；^ZF尸W/:胎盤或睪丸；尸尸iX7:心臟、骨骼 肌、睪丸、甲狀腺或腎上腺；^尸CDZ)7:心臟、胰腺、前列腺、卵巢、 肺、肝臟、腎臟、脾、胸腺、結(jié)腸或外周白細(xì)胞，優(yōu)選為心臟、胰腺、前 列腺或印巢)。可使用已知方法分離mRNA;例如，通過胍超速離心 (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 5294畫5299(1979))或AGPC法(Chomczynski andSacchi， Anal Biochem 162: 156-159(1987))即可制備總RNA。另外，可使
30用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)等從總RNA中純化mRNA ，或者使用 QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmada)直接純化mRNA。
使用逆轉(zhuǎn)錄酶，用所得mRNA合成cDNA?？墒褂蒙藤彽脑噭┖校?AMV逆轉(zhuǎn)錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒(Seikagaku Kogyo)合成cDNA。或 者，可以根據(jù)5，-RACE法(Frohman et al.， Proc Natl Acad Sci USA 85: 8998-9002 (1988》Belyavsky et al., Nucleic Acids Res 17: 2919-2932(1989))合成和 擴增cDNA,所述方法4吏用本文所述的引物、5，-Ampli FINDER RACE試劑 盒(Clontech)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。
由PCR產(chǎn)物制備所需DNA片段，并與載體DNA連接。使用重組載體轉(zhuǎn) 化大腸桿菌等，由選定菌落制備所需重組載體。通過常規(guī)方法，如雙脫氧 核苷酸鏈終止法證實所需DNA的核苷酸序列。
考慮到用于表達(dá)的宿主中的密碼子使用頻率，將本發(fā)明多核苷酸的核 普酸序列設(shè)計成能夠更有效地表達(dá)(Grantham et al.， Nucleic Acids Res 9: 43-74 (1981))?？赏ㄟ^商購試劑盒或常規(guī)方法改變本發(fā)明多核苷酸的序列。例 如，可通過用限制性酶消化、插入合成的寡核苷酸或適當(dāng)?shù)亩嗪塑账崞?段、添加接頭或插入起始密碼子(ATG)和/或終止密碼子(TAA， TGA或TAG) 來改變序列。
具體地說，本發(fā)明的多核苷酸包括含有核苷酸序列SEQ ID NO: 1， 3， 5 或7的DNA。
另外，本發(fā)明提供了能在嚴(yán)緊條件下與具有核苷酸序列SEQIDNO: 1, 3， 5或7的多核苷酸雜交、并且編碼與上文所述的本發(fā)明WDRPUH, KRZFPUH， PPIL1或APCDD1蛋白功能等同的多肽的多核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù) 人員可適當(dāng)選擇嚴(yán)緊條件。例如，可使用低度嚴(yán)緊條件。更優(yōu)選使用高度 嚴(yán)緊條件。這些條件與上文所述的相同。上述雜交DNA優(yōu)選為cDNA或染 色體DNA。
本發(fā)明還提供了載體，其中插入了本發(fā)明的多核苷酸。本發(fā)明的載體 可用于在宿主細(xì)胞中維持本發(fā)明的多核苷酸，尤其是DNA，從而表達(dá)本發(fā) 明的多肽，或者可用于施用本發(fā)明的多核苷酸以進(jìn)行基因治療。
當(dāng)宿主細(xì)胞為大腸桿菌，并且在大腸桿菌(如JM109, DH5ot, HB101或 XLlBlue)中大量擴增和制備載體時，載體應(yīng)具有欲在大腸桿菌中擴增的 "ori"和用于選擇轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的標(biāo)記基因(例如用藥物進(jìn)行選擇的藥物-抗性基因，如氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素等)。例如，可使用
M13-系列載體、pUC-系列載體、pBR322、 pBluescript、 pCR-Script等。另 外，也可使用pGEM-T、 pDIRECT和pT7亞克隆和提取cDNA以及上述載 體。當(dāng)使用載體制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)時，表達(dá)載體特別有用。例如，欲在 大腸桿菌中表達(dá)的表達(dá)載體應(yīng)具有欲在大腸桿菌中擴增的上述特征。當(dāng)將 大腸桿菌，如JM109， DH5ot， HB101或XLlBlue用作宿主細(xì)胞時，載體應(yīng)具 有能在大腸桿菌中有效表達(dá)所需基因的啟動子，例如lacZ啟動子(Ward et al., Nature 341: 544-546(1989); FASEB J 6: 2422-2427(1992))、 araB啟動子 (Better etal.， Science 240: 1041-1043(1988))或T7啟動子等。在此方面，可使 用例如pGEX-5X-l (Pharmacia) 、 " QIAexpress系統(tǒng)，，(Qiagen) 、 pEGFP和 pET(此時，宿主優(yōu)選為表達(dá)T7 RNA聚合酶的BL21)來替代上述載體。另 外，載體也可含有多肽分泌所用的信號序列。介導(dǎo)多肽分泌至大腸桿菌周 質(zhì)的信號序列的例子為pdB信號序列(Lei et al.， J Bacteriol 169: 4379(1987))。將載體導(dǎo)入靶宿主細(xì)胞的方法包括例如氯化鈣法和電穿孔 法。
除了大腸桿菌外，也可使用下述載體制備本發(fā)明的多肽，即得自哺乳 動物的表達(dá)載體(例如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17): 5322(1990))， pEF, pCDM8)，得自昆蟲細(xì)胞的表達(dá)載體(例如"Bac-to-BAC桿狀病毒表達(dá)系 統(tǒng)，，(GIBCO BRL), pBacPAK8),得自植物的表達(dá)載體 (例如pMHl， pMH2)，得自動物病毒的表達(dá)載體(例如pHSV, pMV， pAdexLcw)，得自逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)載體(例如pZIpneo)，得自酵母的表達(dá) 載體(例如"畢赤氏酵母表達(dá)試劑盒，，(Invitrogen)， pNVll， SP-Q01)以及得自 枯草芽孢桿菌的表達(dá)載體(如pPL60S，pKTH50)。
為了在動物細(xì)胞，如CHO, COS或NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)載體，載體應(yīng)具 有在所述細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)所必需的啟動子，例如SV恥啟動子(Mulligan et al., Nature 277: 108(1979))、 MMLV-LTR啟動子、EFla啟動子(Mizushima et al.， Nucleic Acids Res 18: 5322(1990))、 CMV啟動子等，優(yōu)選還具有選擇轉(zhuǎn)化子 所用的標(biāo)記基因(例如用藥物進(jìn)行選擇的藥物抗性基因(如新霉素、 G418))。具有這些特征的已知載體的例子包括例如pMAM， pDR2， pBK-RSV， pBK-CMV， pOPRSV和pOP 13 。
另外，可使用 一些方法在穩(wěn)定表達(dá)基因的同時在細(xì)胞內(nèi)擴增基因的拷貝數(shù)。例如，可將含有互補DHFR基因的栽體(如pCHO I)導(dǎo)入核酸合成途 徑缺失的CHO細(xì)胞，然后通過氨甲蝶呤(MTX)進(jìn)行擴增。另外，當(dāng)瞬時表 達(dá)基因時，可以使用這樣一種方法，其中含有SV40復(fù)制起點的載體(pcD等) 被轉(zhuǎn)化至染色體上含有表達(dá)SV40 T抗原的基因的COS細(xì)胞。
按上述方法獲得的本發(fā)明多肽可分離自宿主細(xì)胞的內(nèi)部或外部(如培養(yǎng) 基)，并被純化成基本上純的均質(zhì)多肽。本文所用的與給定多肽有關(guān)的術(shù)語 "基本上純"指的是多肽基本上不含其它生物大分子?；旧霞兊亩嚯氖?指干重至少75°/。(如至少80, 85, 95或99%)純。通過任何適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)方法皆可 測定純度，所述方法包括例如柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分 析。分離和純化多肽的方法不局限于任何特定的方法；實際上，可使用任 何標(biāo)準(zhǔn)方法。
例如，可以適當(dāng)選擇柱層析、過濾、超濾、鹽沉淀、溶劑沉淀、溶劑 提取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點電泳、透析和 重結(jié)晶，并將它們組合用于分離和純化多肽。
層析的例子包括例如親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過 濾、反相層才斤、吸附層沖斤等(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Ed. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996))。通過液相層沖斤，如HPLC和 FPLC即可進(jìn)行這些層析。因此，本發(fā)明提供了通過上述方法制備的高度純 化的多肽。
通過在純化前或純化后用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)修飾酶處理本發(fā)明的多肽，即 可對其進(jìn)行任意修飾或部分缺失。有用的蛋白質(zhì)修飾酶包括但不限于胰蛋 白酶、胰凝乳蛋白酶、賴氨酰內(nèi)肽酶、蛋白激酶、葡糖苷酶等。
本發(fā)明提供了與本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體可以任何形 式被使用，如單克隆或多克隆抗體，并且包括通過用本發(fā)明的多肽免疫動 物，如兔獲得的抗血清、所有類別的多克隆和單克隆抗體、人抗體和通過 基因重組產(chǎn)生的人源化抗體。
可用作抗原以獲得抗體的本發(fā)明多肽可得自任何動物，但優(yōu)選得自哺 乳動物，如人、小鼠或大鼠，更優(yōu)選得自人。人源多肽可得自本文公開的 核苷酸或氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，用作免疫抗原的多肽可以是完整蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分肽。部分肽可含有例如本發(fā)明多肽的氨基(N)-末端或羧基(C)-末端片段。在 本文中，抗體被定義為與本發(fā)明多肽的全長或片段反應(yīng)的蛋白質(zhì)。
可將編碼本發(fā)明多肽或其片段的基因插入已知表達(dá)載體，然后按本文 所述用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。通過任何標(biāo)準(zhǔn)方法從宿主細(xì)胞的外部或內(nèi) 部回收所需多肽或其片段，隨后將其用作抗原。或者，將表達(dá)多肽的完整 細(xì)胞或其裂解物或化學(xué)合成的多肽用作抗原。
可用抗原免疫任何哺乳動物，但優(yōu)選考慮與細(xì)胞融合所用親代細(xì)胞的
相容性。 一般使用嚙齒類、兔形目(Lagomorpha)或靈長類動物。嚙齒類動 物包括例如小鼠、大鼠和倉鼠。兔形目動物包括例如兔。靈長類動物包括 i"列^;o Catarrhini浙吳(old worldlf吳)，嘖口食蟹《美(Afacac(3 y^s".cw/an^) ， 'i"亙;可浙吳 (rhesus monkey), sacred狒狒和黑猩猩(chimpanzees)。
用抗原免疫動物的方法是本領(lǐng)域已知的。腹膜內(nèi)注射或皮下注射抗原 是免疫哺乳動物的標(biāo)準(zhǔn)方法。更具體地，可稀釋抗原，將其懸浮于適當(dāng)量 的磷酸緩沖鹽水(PBS)、生理鹽水等中。必要時，可將抗原懸浮液與適當(dāng)量 的標(biāo)準(zhǔn)佐劑，如弗氏完全佐劑混合，制成乳劑，然后施用給哺乳動物。優(yōu) 選隨后按照4至21天的間隔數(shù)次施用與適當(dāng)量的弗氏不完全佐劑混合的抗 原。適當(dāng)?shù)妮d體也可用于免疫。按上文所述進(jìn)行免疫之后，通過標(biāo)準(zhǔn)方法 檢查血清中所需抗體量的增加。
通過從經(jīng)檢查后確定血清中所需抗體量有所增加的經(jīng)免疫哺乳動物體 內(nèi)收集血液，并通過使用任何常規(guī)方法從血液中分離出血清，即可制備抗 本發(fā)明多肽的多克隆抗體。多克隆抗體包括含有多克隆抗體的血清，可以 從血清中分離含有多克隆抗體的組分?？梢允褂美缗c本發(fā)明多肽偶聯(lián)的 親和柱獲得僅識別本發(fā)明多肽的組分，并使用蛋白A或蛋白G柱進(jìn)一 步純化 該組分，從而由所述組分制備免疫球蛋白G或M。
為了制備單克隆抗體，從用抗原免疫的哺乳動物體內(nèi)收集免疫細(xì)胞， 按上文所述檢查血清中水平有所增加的所需抗體，并進(jìn)行細(xì)胞融合。用于 細(xì)胞融合的免疫細(xì)胞優(yōu)選得自脾臟。其它可與上述免疫細(xì)胞融合的優(yōu)選親 代細(xì)胞包括例如哺乳動物的骨髓瘤細(xì)胞，更優(yōu)選為具有用藥物選擇融合細(xì) 胞時所需的獲得型特性的骨髓瘤細(xì)胞。
可根據(jù)已知方法，例如Milstein等的方法(Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981))融合上述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞。通過在標(biāo)準(zhǔn)的選擇培養(yǎng)基，如HAT培養(yǎng)基(含有次黃。票呤、氨基蝶呤和
胸苷的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)即可選擇出通過細(xì)胞融合獲得的雜交瘤。 一般在HAT 培養(yǎng)基中維持細(xì)胞培養(yǎng)物數(shù)天至數(shù)周，維持的時間應(yīng)足以使除所需雜交瘤 以外的所有其它細(xì)胞(非融合細(xì)胞)死亡。然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的有限稀釋以篩選 和克隆能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。
體外用多肽、表達(dá)多肽的細(xì)胞或其裂解物免疫人淋巴細(xì)胞，例如被EB病毒 感染的人淋巴細(xì)胞。然后，使經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞與得自人的能夠無限分裂 的骨髓瘤細(xì)胞，如U266融合，從而產(chǎn)生能生成所需人抗體的雜交瘤，所述 抗體能結(jié)合所述多肽(未審公開的日本專利申請(JP-A) Sho 63-17688)。
隨后，將所得雜交瘤移植到小鼠腹腔中并抽取腹水?？赏ㄟ^例如硫酸 銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或偶聯(lián)有本發(fā)明多肽的親 和柱來純化所獲得的單克隆抗體。本發(fā)明的抗體不僅可用于純化和檢測本 發(fā)明的多肽，還可用作本發(fā)明多肽的候選激動劑和拮抗劑。另外，所述抗 體還可用于與本發(fā)明多肽相關(guān)之疾病的抗體治療。當(dāng)給人體施用所得抗體 時(抗體治療)，優(yōu)選人抗體或人源化抗體以降低免疫原性。
例如，可以用選自多肽、表達(dá)多肽的細(xì)胞或其裂解物的抗原免疫攜有 人抗體基因的轉(zhuǎn)基因動物。然后從動物體內(nèi)收集產(chǎn)生抗體的細(xì)胞并與骨髓 瘤細(xì)胞融合，從而獲得雜交瘤，從中可制備出抗所述多肽的人抗體(參見 WO92-03918, W093-2227, WO94-02602， W094-25585, W096-33735和 W096-34096)。
或者，可通過癌基因無限增殖化能產(chǎn)生抗體的免疫細(xì)胞，如經(jīng)免疫的 淋巴細(xì)胞，并將其用于制備單克隆抗體。
也可使用基因工程技術(shù)重組制備如此獲得的單克隆抗體(參見例如 Borrebaeck and Larrick， Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD (1990))。例如，可從能產(chǎn)生抗 體的免疫細(xì)胞，如雜交瘤或經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞中克隆編碼抗體的DNA，將 其插入適當(dāng)載體，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞以制備重組抗體。本發(fā)明還提供了按上 文所述制備的重組抗體。
另外，本發(fā)明的抗體可以是抗體片段或經(jīng)修飾的抗體，只要它們能結(jié) 合本發(fā)明的一種或多種多肽即可。例如，抗體片段可以是Fab，F(xiàn)(ab，)2，F(xiàn)v或
35單鏈Fv(scFv),其中通過適當(dāng)接頭連接得自H和L鏈的Fv片段(Huston et al.， ProcNatl Acad Sci USA 85:5879-5883 (1988))。更具體地，通過用酶，如木 瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體即可產(chǎn)生抗體片段?；蛘?，可構(gòu)建編碼抗體 片段的基因，將其插入表達(dá)載體，并在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)(參見例如Co et al.， J Immunol 152: 2968-2976(1994); Better and Horwitz， Methods Enzymol 178: 476-496(1989); Pluckthun and Skerra， Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol. 121: 652-663(1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-669(1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-137(1991))。
通過與多種分子，如聚乙二醇(PEG)偶聯(lián)即可修飾抗體。本發(fā)明提供 了這種經(jīng)修飾的抗體。通過對抗體進(jìn)行化學(xué)修飾即可獲得經(jīng)修飾的抗體。 這些修飾方法是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。
或者，本發(fā)明的抗體可以是得自非人抗體的可變區(qū)與得自人抗體的恒 定區(qū)之間的嵌合抗體，或者是含有得自非人抗體的互補決定區(qū)(CDR)、得 自人抗體的構(gòu)架區(qū)(FR)和恒定區(qū)的人源化抗體。使用已知技術(shù)即可制備出 所述抗體。
可將按上文所述獲得的抗體純化至均質(zhì)。例如，可根據(jù)用于普通蛋白 質(zhì)的分離和純化方法進(jìn)行抗體的分離和純化。例如，通過適當(dāng)選擇和組合 使用柱層析，如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝 膠電泳、等電聚焦等可以分離抗體(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), 4旦并不局限 于此。蛋白A柱和蛋白G柱可用作親和柱?？梢允褂玫牡鞍譇柱的例子包括 例如Hyper D， POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除親和層析以外的層析例包括例如離子交換層析、疏水層析、凝膠 過濾、反相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))?？赏ㄟ^液相層才斤，fe口HPLC禾口 FPLC進(jìn)行層析過程。
例如，可以使用吸光度測定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、酶免疫測定 (EIA)、放射免疫測定(RIA)和/或免疫熒光來測定本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合活 性。在ELISA中，將本發(fā)明的抗體固定在培養(yǎng)板上，將本發(fā)明的多肽上樣于板上，然后上樣含有所需抗體的樣品，如產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清 液或純化抗體樣品。然后上樣能識別第一抗體并被酶，如i威性磷酸酶標(biāo)記 的第二抗體，并保溫培養(yǎng)板。接著，在洗滌之后，在培養(yǎng)板中加入酶底 物，如對硝基苯磷酸，測定吸光度以評價樣品的抗原結(jié)合活性。多肽的片
段，如C-末端或N-末端片段可用作多肽?？墒褂肂IAcore(Pharmacia)評價本
發(fā)明抗體的活性。
上述方法通過將本發(fā)明的抗體暴露于假定含有本發(fā)明多肽的樣品，并 斥企測或測定抗體和多肽形成的免疫復(fù)合物，可以;險測或測定本發(fā)明的多肽。
由于檢測或測定本發(fā)明多肽的方法可特異性沖企測或測定多肽，因此， 所述方法可用于多種使用所述多肽的實驗。
本發(fā)明還提供了含有至少15個核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸能與 編碼人WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1或APCDD1蛋白的多核苦酸(SEQ ID NO: 1， 3, 5或7)或其互補鏈雜交。優(yōu)選本發(fā)明的多核苷酸是能與編碼本發(fā)明多肽 的DNA特異性雜交的多核苷酸。本文所用術(shù)語"特異性雜交"指的是在通 常的雜交條件下，優(yōu)選在嚴(yán)緊雜交條件下不與編碼其它蛋白質(zhì)的DNA發(fā)生 顯著交叉雜交。所述多核苷酸包括能與編碼本發(fā)明多肽的DNA或其互補鏈 特異性雜交的探針、引物、核苷酸和核苷酸衍生物(例如反義寡核苷酸和核 酶)。另外，所述多核普酸可用于制備DNA芯片。
本發(fā)明包括能與核苷酸序列SEQ ID NO: 1， 3, 5或7內(nèi)的任何位點雜交的 反義寡核苷酸。優(yōu)選所述反義寡核苷酸針對的是核苷酸序列SEQIDNO: 1， 3， 5或7中的至少15個連續(xù)核苷酸。甚至更優(yōu)選上述反義寡核苷酸在上述至 少15個連續(xù)核苷酸中含有起始密碼子。更具體地，所述反義寡核苷酸包括 含有SEQ ID NO: 16的核苷酸序列的反義寡核苷酸用于抑制WDRPUH表 達(dá)；含有SEQ ID NO: 37的核普酸序列的反義寡核苷酸用于抑制KRZFPUH 的表達(dá)；含有SEQ ID NO: 44的核苷酸序列的反義寡核苷酸用于抑制PPIL1 的表達(dá)；和含有SEQ ID NO: 89的核苷酸序列的反義寡核苷酸用于抑制 APCDD1的表達(dá)。
反義寡核苷酸的衍生物或修飾產(chǎn)物可用作反義寡核苷酸。所述修飾產(chǎn) 物的例子包括低級烷基磷酸酯修飾，如曱基-磷酸酯型或乙基-磷酸酯型修 飾，疏代磷酸酯修飾和氨基磷酸酯修飾。本文所用術(shù)語"反義寡核苷酸，，不僅意味著其中與構(gòu)成DNA或mRNA特 定區(qū)域的核苷酸相對應(yīng)的核苷酸能夠完全互補，還意味著其中可含有一個 或多個核苦酸錯配，只要DN A或mRN A和反義寡核苷酸能與核普酸序列 SEQIDNO: 1， 3, 5或7特異性雜交即可。
"至少15個連續(xù)核香酸序列區(qū)域"中所包含的這種多核普酸的同源性 至少為70%或更高，優(yōu)選為80%或更高，更優(yōu)選為90%或更高，甚至更優(yōu) 選為95%或更高?？梢允褂帽疚奶峒暗乃惴y定同源性。所述多核苷酸可 用作探針以按照下文實施例所述分離或檢測編碼本發(fā)明的多肽，或用作擴 增所用的引物。
本發(fā)明的反義寡核苷酸衍生物通過下述機制對產(chǎn)生本發(fā)明多肽的細(xì)胞 發(fā)揮作用，即與編碼多肽的DNA或mRNA結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn) mRNA降解并抑制本發(fā)明多肽的表達(dá)，從而導(dǎo)致多肽功能受抑制。
通過與對衍生物無活性的適當(dāng)基質(zhì)混合，可將本發(fā)明的反義寡核苷酸 衍生物制成外用制劑，如涂抹劑(liniment)或泥罨敷劑(poultice)。
必要時，也可通過加入賦形劑、等滲劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、 止痛劑等，將衍生物配制成片劑、粉劑、顆粒劑、膠嚢、脂質(zhì)體膠嚢、注 射劑、溶液、滴鼻劑和凍干劑。通過下述的一般方法即可制備所述制劑。
通過直接施用于病痛部位或注射至血管以使其到達(dá)病痛部位，將反義 寡核苷酸衍生物施用給患者。也可使用反義寡核苷酸-固定介質(zhì)增加持久性 和膜-通透性。所述介質(zhì)如脂質(zhì)體、聚-L-賴氨酸、脂質(zhì)、膽固醇、脂質(zhì)轉(zhuǎn) 染試劑，或其衍生物。
可根據(jù)患者的身體狀況適當(dāng)調(diào)整本發(fā)明的反義寡核苷酸衍生物的劑 量，并按所需的量使用所述劑量。例如，可以施用的劑量范圍為0.1至100 mg/kg,優(yōu)選為O. 1至50 mg/kg。
本發(fā)明還包括siRNA，其含有核苷酸序列SEQ ID NO: 1, 3， 5或7的有義 鏈核酸和反義鏈核酸組合。術(shù)語"siRNA"指的是能防止靶mRNA翻譯的雙鏈 RNA分子?？墒褂脤iRNA導(dǎo)入細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括將DNA用作模板， 由其轉(zhuǎn)錄RNA的技術(shù)。siRNA含有編碼人WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1或 APCDD1蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO: 1, 3, 5或7)的有義核酸序列和反義核
列，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)。該方法被用于改變細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中在所述細(xì)胞中，作為例如
細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的結(jié)果，WDRPUH, KRZFPUH， PPIL1或APCDD1的表達(dá)被上 調(diào)。siRNA與靶細(xì)胞中WDRPUH， KRZFPUH, PPIL1或APCDD1轉(zhuǎn)錄物的結(jié)
合導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)減少。寡核苷酸的長度至少為10個核苷酸，并且 可以與天然轉(zhuǎn)錄物一樣長。優(yōu)選寡核苷酸長度為19-25個核普酸。最優(yōu)選寡 核香酸長度少于75, 50或25個核苷酸。能抑制其在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá) 的WDRPUH， KRZFPUH， PPIL1或APCDD1 siRNA寡核苷酸的例子包括含有 SEQ ID NO: 93-103中的任一個的寡核苦酸。這些序列分別是下述siRNA序 列的靶序列。
SEQ ID NO: 93 ， SEQ ID NO: 24和25 (WDRPUH); SEQ ID NO: 94， SEQ ID NO: 26和27 (WDRPUH); SEQ ID NO: 95 ， SEQ ID NO: 28和29 (WDRPUH); SEQ ID NO: 96， SEQ ID NO: 30和31 (WDRPUH); SEQ ID NO: 97， SEQ ID NO: 104和105 (KRZFPUH); SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 106和107 (KRZFPUH); SEQ ID NO: 99 ， SEQ ID NO: 108和109 (KRZFPUH); SEQ ID NO: 100， SEQ ID NO: 110和111 (KRZFPUH); SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 47和48 (PPIL1); SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 49和50 (PPIL1);和 SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 51和52 (PPILl)。
4吏用可4尋自 Ambion 網(wǎng) 3占(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/ siRNA—fmder.html)的siRNA設(shè)計計算機程序設(shè)計siRNA的核苷酸序列。計 算機程序基于下述方案選擇siRNA合成所用的核苷酸序列。
選擇siRNA耙位點
1. 自目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼子開始，掃描下游的AA二核苷酸序 列。記錄每個AA和3'方向鄰接的19個核苷酸的出現(xiàn)，以作為潛在的siRNA 耙位點。Tuschl等推薦針對5'和3'非翻譯區(qū)(UTR)和起始密碼子附近的區(qū)域 (75個堿基以內(nèi))設(shè)計siRNA,因為所述區(qū)域中的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點較多。 UTR-結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合物可干擾siRNA內(nèi)切核酸酶復(fù)合物的結(jié) 合。
2. 將潛在的靶位點與人基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，無需考慮任何與其它
39編碼序列具有顯著同源性的靶序列?？墒褂媚茉贜CBI服務(wù)器
(www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/)中找到的BLAST進(jìn)行同源性檢索。
3.選擇合格的靶序列用于合成。在Ambion網(wǎng)站，優(yōu)選沿著需評價之基 因的長度選擇幾個靶序列。
本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA能抑制本發(fā)明多肽的表達(dá)，從而可用 于抑制本發(fā)明多肽的生物活性。含有本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA的表 達(dá)-抑制劑也可用于抑制本發(fā)明多肽的生物活性。因此，含有本發(fā)明的反義 寡核苷酸或siRNA的組合物可用于治療細(xì)胞增殖性疾病，如癌癥。
另外，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明多肽的表達(dá)水平作為診斷標(biāo)記以診斷 細(xì)胞增殖性疾病的方法。
該診斷方法包括步驟(a)檢測本發(fā)明的『D7 i5[///， X/ ZF尸C///， 或APCDD7基因的表達(dá)水平；和(b)將表達(dá)水平的升高與細(xì)胞增殖性疾病， 如癌癥相關(guān)耳關(guān)。
通過定量與『Z^尸t//7, ^ ZF尸[///,戶尸/丄7或」尸CDZ)7基因相對應(yīng)的 mRNA或由所述基因編碼的蛋白質(zhì)，即可估計特定樣品中『Z^尸f/" A7 ZF尸"http://,尸尸/丄7或v4戶CDi^基因的表達(dá)水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知定量 mRNA的方法。例如，通過Northem印跡或RT-PCR即可估計出與『Di 尸t/H, JO ZFPW/,尸P/"或^4戶CZ)Z)7基因相對應(yīng)的mRNA的水平。由于『Di 尸W/, I六ZF尸t///,尸尸/"或爿戶CDD7基因的全長核苷酸序列示于SEQ ID NO: 1， 3, 5
『Di 尸W7， X7 ZF尸t///，尸iY"或爿戶CDD/基因。
也可基于基因所編碼蛋白質(zhì)的活性或量來分析WDitPW/， X7 ZF尸W7， 尸尸/丄7或APCDD7基因的表達(dá)水平。下文將描述測定WDRPUH， KRZFPUH, PPIL1或APCDD1蛋白量的方法。例如，免疫測定法可用于測定生物材料中 的蛋白質(zhì)。任何生物材料都可用于測定蛋白質(zhì)或其活性。例如，可分析血 樣以估計由血清標(biāo)記編碼的蛋白質(zhì)。另一方面，可選擇適當(dāng)方法，以根據(jù) 每種待分析蛋白質(zhì)的活性測定『DA尸C///， ^ZF尸Wf, P尸/丄7或^尸a)Z)/基因
所編碼蛋白質(zhì)的活性。
估計樣品(檢測樣品)中『Di^t///, i^ZFPt///，戶尸/"或APO)D7基因的 表達(dá)水平，并與正常樣品中的表達(dá)水平相比較。當(dāng)比較結(jié)果表明靶基因的 表達(dá)水平高于正常樣品中的表達(dá)水平時，可以判斷受試者患有細(xì)胞增殖性疾病?？赏瑫r測定得自正常樣品和受試者的樣本中的『i^尸t///， A7 ZF尸t///, 尸尸/丄7或JPCDD7基因的表達(dá)水平?；蛘?，以分析先前從對照組收集的樣品 中的基因表達(dá)水平所得的結(jié)果為基礎(chǔ)，通過統(tǒng)計學(xué)方法測定表達(dá)水平的正 常范圍。通過將受試者的樣品與正常范圍相比較得出結(jié)果；當(dāng)結(jié)果未落入 正常范圍時，可判斷受試者患有細(xì)胞增殖性疾病。在本發(fā)明中，被診斷的 細(xì)月包增殖性疾病優(yōu)選為癌癥。更優(yōu)選地，當(dāng)估計出『D^PW7或^Z^Pf/T7 基因的表達(dá)水平并與正常樣品中的表達(dá)水平相比較時，診斷出的細(xì)胞增殖 性疾病是肝細(xì)胞癌；而當(dāng)估計出尸/V丄7或APCDD/基因的表達(dá)水平時，診 斷出的疾病是結(jié)腸癌。另外，當(dāng)估計出^ZF尸t/Z/基因的表達(dá)水平并與正 常樣品中的表達(dá)水平相比較時，診斷出的細(xì)胞增殖性疾病除了可以是肝細(xì) 胞癌外，還可以是胃癌或肺癌。
在本發(fā)明中，還提供了診斷細(xì)胞增殖性疾病所用的診斷試劑，所述疾 病如癌癥，包括肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌。本發(fā)明的診斷試劑含有與本發(fā)明的多 核苷酸或多肽結(jié)合的化合物。優(yōu)選與本發(fā)明的多核苷酸雜交的寡核苷酸或 與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體可用作所述化合物。
另外，本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的多肽篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的 化合物的方法。所述篩選方法的實施方案包括步驟(a)使受試化合物與本 發(fā)明的多肽接觸，(b)檢測本發(fā)明多肽與受試化合物之間的結(jié)合活性，和(c) 選擇與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物。
用于篩選的本發(fā)明多肽可以是重組多肽或得自天然的蛋白質(zhì)，或其部 分肽?？梢允褂萌魏问茉嚮衔?，例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物上清液、 發(fā)酵微生物的產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化的或粗的蛋白 質(zhì)、肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物和天然化合物。與受試化合物 接觸的本發(fā)明多肽可以是例如純化的多肽、可溶性蛋白質(zhì)、與載體結(jié)合的 形式或與其它多肽融合的融合蛋白。
至于使用本發(fā)明的多肽篩選蛋白質(zhì)，例如與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì) 的方法，可以使用多種本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法。通過例如免疫沉 淀法，特別是按照下述方式即可進(jìn)行所述篩選。通過將基因插入外源基因 的表達(dá)載體，如pSVheo， pcDNAI和pCD8，在動物細(xì)胞等中表達(dá)編碼本發(fā) 明多肽的基因。用于表達(dá)的啟動子可以是任何常用的啟動子，包括例如 SV40早期啟動子(Rigby in Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3.Academic Press, London, 83-141(1982))、 EF-la啟動子(Kim et al., Gene 91: 217-223(1990))、 CAG啟動子(Niwa et al.， Gene 108: 193-200(1991))、 RSV LTR啟動子(Cullen， Methods in Enzymology 152: 684-704(1987))、 SRot啟動 子(Takebe et al,， Mol Cell Biol 8: 466(1988))、 CMV即早期啟動子(Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-3369(1987))、 SV40晚期啟動子 (Gheysen and Fiers， J Mol Appl Genet 1: 385-394(1982))、 A泉病毒晚期啟動子 (Kaufman et al,, Mol Cell Biol 9: 946(1989))、 HSV TK啟動子等。可根據(jù)任 何方法將基因?qū)雱游锛?xì)胞以表達(dá)外源基因，所述方法如電穿孔法(Chu et al.， Nucleic Acids Res 15: 1311-1326(1987))、石舞酸鉤法(Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-2752(1987))、 DEAE葡聚糖法(Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-5717(1984); Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: GAS-WAS (1985》、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(Derijard, B Cell 7: 1025-1037(1994); Lamb et al.， Nature Genetics 5: 22-30(1993): Rabindran et al.， Science 259: 230-234(1993)) 等。通過在本發(fā)明多肽的N-或C-末端導(dǎo)入特異性已被揭示的單克隆抗體表 位，可將本發(fā)明的多肽表達(dá)成含有單克隆抗體識別位點(表位)的融合蛋 白?？梢允褂蒙藤彽谋砦?抗體系統(tǒng)(Experimental Medicine 13: 85-90(1995))。利用其多克隆位點表達(dá)與例如p-半乳糖苷酶、麥芽糖-結(jié)合蛋 白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、綠色熒光蛋白(GFP)等的融合蛋白的載體可以商 購。
本文還報道了通過僅導(dǎo)入由幾個至十幾個氨基酸組成的小表位而制備 的融合蛋白，以致于融合不會改變本發(fā)明多肽的特性。諸如聚組氨酸(His-標(biāo)記)、流感病毒聚集體HA、人c-myc、 FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白 (VSV-GP)、 T7基因10蛋白(T7-標(biāo)記)、人單純皰疹病毒糖蛋白(HSV-標(biāo)記)、 E-標(biāo)記(單克隆噬菌體上的表位)等的表位和識別它們的單克隆抗體可用作 表位-抗體系統(tǒng)，用于篩選與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)(Experimental Medicine 13:85-90(1995》。
在免疫沉淀中，通過在使用適當(dāng)去污劑制備的細(xì)胞裂解物中加入這些 抗體以形成免疫復(fù)合物。免疫復(fù)合物由本發(fā)明的多肽、能與所述多肽結(jié)合 的多肽和抗體組成。除了使用抗上述表位的抗體外，還可使用可按上文所 述制備的抗本發(fā)明多肽的抗體進(jìn)行免疫沉淀。
當(dāng)抗體是小鼠IgG抗體時，可通過例如蛋白A Sepharose凝膠或蛋白GSepharose凝膠沉淀免疫復(fù)合物。如果本發(fā)明的多肽被制備成與表位，如 GST的融合蛋白，可按照與使用抗本發(fā)明多肽的抗體相同的方式，使用與 這些表位特異性結(jié)合的物質(zhì)，如谷胱甘肽-Sepharose 4B形成免疫復(fù)合物。
可根據(jù)或按照例如文獻(xiàn)中所述的方法(Harlow and Lane， Antibodies, 511-552， Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988))進(jìn)行免疫 沉淀。
SDS-PAGE常用于分析被免疫沉淀的蛋白質(zhì)，使用具有適當(dāng)濃度的凝 膠，通過蛋白質(zhì)的分子量可分析結(jié)合的蛋白質(zhì)。由于通過普通的染色法， 如考馬斯染色或銀染難以檢測與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)，通過在含有放 射性同位素"S-甲硫氨酸或"S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，標(biāo)記細(xì)胞中 的蛋白質(zhì)并檢測蛋白質(zhì)即可改善蛋白質(zhì)的檢測敏感性。當(dāng)已揭示出蛋白質(zhì) 的分子量時，可直接從SDS-聚丙烯酰胺凝膠中純化靶蛋白質(zhì)并測定其序 列。
至于使用本發(fā)明多肽篩選與所述多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的方法，可以使用 例如West-Western印跡分析(Skolnik et al.， Cell 65: 83-90(1991))。具體地 說，可通過下述步驟獲得與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)使用噬菌體栽體(如 ZAP),由有望表達(dá)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的細(xì)胞、組織、器官(例 如，篩選與WDRPUH結(jié)合的蛋白質(zhì)時，所述組織如睪丸；篩選與 KRZFPUH結(jié)合的蛋白質(zhì)時，所述組織為胎盤或睪丸；篩選與PPILl結(jié)合的 蛋白質(zhì)時，所述組織為心臟、骨骼肌、睪丸、曱狀腺或腎上腺；篩選與 APCDD1結(jié)合的蛋白質(zhì)時，所述組織為心臟、胰腺、前列腺、卵巢、肺、 肝臟、腎臟、脾、胸腺、結(jié)腸或外周白細(xì)胞)或經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞制備cDNA文 庫，在LB-瓊脂糖上表達(dá)蛋白質(zhì)，將表達(dá)的蛋白質(zhì)固定于濾膜上，使經(jīng)純 化和標(biāo)記的本發(fā)明多肽與上述濾膜反應(yīng)，以及^4居標(biāo)記^r測表達(dá)與本發(fā)明 多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的噬斑。利用生物素和親和素之間的結(jié)合，或利用與本 發(fā)明多肽特異性結(jié)合的抗體，或與本發(fā)明多肽融合的肽或多肽(如GST)， 可以標(biāo)記本發(fā)明的多肽。也可利用使用放射性同位素或熒光等的方法。
或者，在本發(fā)明篩選方法的另一個實施方案中，可使用利用細(xì)胞的雙-雜合系統(tǒng)("MATCHMAKER雙-雜合系統(tǒng)，，，"哺乳動物MATCHMAKER雙-雜 合試驗試劑盒，，，"MATCHMAKER單-雜合系統(tǒng)"(Clontech); "HybriZAP雙-雜 合載體系統(tǒng)，，(Stratagene);參見文獻(xiàn)"Dalton and Treisman， Cell 68: 597-612(1992)，，， "Fields and Stemglanz， Trends Genet 10: 286-292(1994)，，)。
在雙-雜合系統(tǒng)中，本發(fā)明的多肽與SRF-結(jié)合區(qū)或GAL4-結(jié)合區(qū)融合并 在酵母細(xì)胞中表達(dá)。cDNA文庫制備自有望表達(dá)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白 質(zhì)的細(xì)胞，使得所述文庫表達(dá)時能與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合。然后 將cDNA文庫導(dǎo)入上述酵母細(xì)胞，從檢測到的陽性克隆中分離得自文庫的 cDNA(當(dāng)在酵母細(xì)胞中表達(dá)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)時，兩者的結(jié)合激 活了報道基因，使得陽性克隆能被檢測到)。通過將上文分離到的cDNA導(dǎo) 入大腸桿菌并表達(dá)蛋白質(zhì)即可制備由cDNA編碼的蛋白質(zhì)。
至于報道基因，除了HIS3基因外，還可使用例如Ade2基因、lacZ基 因、CAT基因、螢光素酶基因等。
也可使用親和層析篩選與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物。例如，可將本發(fā) 明的多肽固定在親和柱的載體上，將含有能與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的 受試化合物上樣于親和柱。本文中的受試化合物可以是例如細(xì)胞提取物、 細(xì)胞裂解物等。上樣受試化合物之后，洗滌柱，即可制備與本發(fā)明多肽結(jié) 合的化合物。
當(dāng)受試化合物是蛋白質(zhì)時，分析所得蛋白質(zhì)的氨基酸序列，基于所述 序列合成寡DNA ，使用該寡DNA作為探針篩選cDNA文庫以獲得編碼蛋白 質(zhì)的DNA。
在本發(fā)明中，使用表面胞質(zhì)基因組共振現(xiàn)象的生物傳感器可用作檢測 或定量結(jié)合化合物的儀器。當(dāng)使用所述生物傳感器時，僅使用極少量的多 肽并且無需標(biāo)記，即可實時觀察到表現(xiàn)為表面胞質(zhì)基因組共振信號的本發(fā) 明多肽和受試化合物之間的相互作用(例如BIAcore， Pharmacia)。因此，可 以使用生物傳感器，如BIAcore評價本發(fā)明多肽和受試化合物之間的結(jié)合。
當(dāng)固定化的本發(fā)明多肽暴露于合成化合物，或天然物質(zhì)庫，或隨機噬 菌體肽展示文庫時篩選結(jié)合分子的方法，以及基于組合化學(xué)技術(shù)(Wrighton et al., Science 273: 458-64(1996); Verdine， Nature 384: 11-13(1996); Hogan, Nature 384: 17-9(1996))進(jìn)行高通量篩選從而不僅分離出蛋白質(zhì)，還分離出 與本發(fā)明蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物(包括激動劑和拮抗劑)的方法是本領(lǐng)域技術(shù) 人員眾所周知的。
通過篩選分離出的化合物是能促進(jìn)或抑制本發(fā)明多肽活性的候選藥 物，可用于治療或預(yù)防例如細(xì)^<增殖性疾病所導(dǎo)致的疾病，如癌癥。通過
44本發(fā)明的篩選方法獲得的化合物包括這樣一種化合物，其中通過本發(fā)明的 篩選方法獲得的、具有與本發(fā)明多肽結(jié)合之活性的化合物的部分結(jié)構(gòu)通過 添加、缺失和/或取代;波改變。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了篩選候選藥劑的方法，所述藥劑 是治療細(xì)胞增殖性疾病的潛在靶。如上文所詳細(xì)討論的，通過控制
WDRPUH， KRZFPUH， PPIL1或APCDD1的表達(dá)水平，就可以控制癌癥的發(fā) 生和發(fā)展。因此，通過利用WDRPUH， KRZFPUH， PPIL1或APCDD1的表達(dá) 水平和活性作為指標(biāo)進(jìn)行篩選，即可鑒定出身為治療細(xì)胞增殖性疾病的潛 在靶的候選藥劑。在本發(fā)明的上下文中，所述篩選包括例如下述步驟
a) 使候選化合物與表達(dá)WDRPUH, KRZFPUH， PPIL1或APCDD1的細(xì)胞 接觸；和
b) 選擇與缺乏所述化合物時檢測到的表達(dá)水平相比，能降低WDRPUH， KRZFPUH, PPIL1或APCDD1表達(dá)水平的化合物。
表達(dá)WDRPUH， KRZFPUH, PPIL 1或APCDD 1中的至少 一種的細(xì)胞包括 例如由HCC或結(jié)腸癌建立的細(xì)胞系；所述細(xì)胞可用于本發(fā)明的上述篩選。 通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法即可估計出表達(dá)水平。在篩選方法 中，可將能降低WDRPUH, KRZFPUH， PPIL1或APCDD1中的至少一種的表 達(dá)水平的化合物選擇為候選藥劑。
在本發(fā)明的另 一個篩選治療細(xì)胞增殖性疾病所用化合物的方法的實施 方案中，所述方法利用本發(fā)明多肽的生物活性作為指標(biāo)。由于本發(fā)明的 WDRPUH， KRZFPUH， PPIL 1或APCDD 1蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性，使 用此活性作為指標(biāo)可以篩選出能促進(jìn)或抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)之一的此活性的 化合物。該篩選方法包括步驟(a)使受試化合物與本發(fā)明的多肽接觸；(b) 檢測步驟(a)中多肽的生物活性；和(c)選擇與缺乏受試化合物時檢測到的生 物活性相比，能抑制多肽生物活性的化合物。
任何多肽都可用于篩選，只要它們具有WDRPUH, KRZFPUH, PPIL 1或 APCDD1蛋白的生物活性即可。所述生物活性包括人WDRPUH， KRZFPUH, PPILl或APCDDl蛋白的細(xì)胞-增殖活性，PPILl與SNWl或驛蛋白結(jié)合的活 性。例如，可使用人WDRPUH， KRZFPUH, PPIL1或APCDD1蛋白，也可使 用與這些蛋白質(zhì)功能等同的多肽。所迷多肽可由細(xì)胞內(nèi)源或外源性地表 達(dá)。可以使用任何受試化合物，例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物上清液、發(fā) 酵微生物的產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化的或粗的蛋白質(zhì)、 肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物或天然化合物。
通過所述篩選分離出的化合物是本發(fā)明多肽的候選激動劑或拮抗劑。 術(shù)語"激動劑"指的是通過與本發(fā)明多肽結(jié)合而激活所述多肽功能的分 子。類似地，術(shù)語"拮抗劑"指的是通過與本發(fā)明多肽結(jié)合而抑制所述多 肽功能的分子。另外，通過所述篩選分離出的化合物是能抑制本發(fā)明多肽
與分子(包括DNA和蛋白質(zhì))的體內(nèi)相互作用的候選化合物。
當(dāng)本發(fā)明方法欲檢測的生物活性是細(xì)胞增殖時，通過例如制備能表達(dá) 本發(fā)明多肽的細(xì)胞，在受試化合物的存在下培養(yǎng)細(xì)胞，并按實施例中所述 測定細(xì)胞增殖的速度，測定細(xì)胞周期，以及測定集落形成活性即可檢測到 所述活性。
通過上述篩選分離出的化合物是能抑制本發(fā)明多肽之活性的候選藥 物，并可用于治療與本發(fā)明多肽相關(guān)的疾病，如包括癌癥的細(xì)胞增殖性疾
病。更具體地，當(dāng)將WDRPUH或KRZFPUH蛋白的生物活性用作指標(biāo)時， 通過本發(fā)明的方法篩選的化合物用作治療肝細(xì)胞癌的候選藥物。另外，當(dāng) 將KRZFPUH蛋白的生物活性用作指標(biāo)時，除了HCC夕卜，通過本發(fā)明的方 法篩選的化合物還可用作治療胃癌或肺癌的候選藥物。另一方面，當(dāng)將 PPIL1或APCDD1蛋白的生物活性用作指標(biāo)時，通過本發(fā)明的方法篩選的化 合物還可用作治療結(jié)直腸癌的候選藥物。
另外，通過本發(fā)明的篩選方法可以獲得的化合物還包括這樣一種化合 物，其中能抑制WDRPUH， KRZFPUH， PPIL1或APCDD1蛋白之活性的化合 物的部分結(jié)構(gòu)通過添加、缺失和/或取代被改變。
或者，本發(fā)明的篩選方法可包括下述步驟
a) 使候選化合物與已導(dǎo)入載體的細(xì)胞接觸，所述載體含有一個或多個 標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制之下表達(dá)的報道基因，其中一 個或多個標(biāo)記基因選自WDRPUH， KRZFPUH, PPIL1和APCDD1 ，
b) 測定所述報道基因的活性；和
c) 選擇與對照相比能降低所述報道基因的表達(dá)水平的化合物。
適當(dāng)?shù)膱蟮阑蚝退拗骷?xì)胞是本領(lǐng)域眾所周知的。通過使用標(biāo)記基因 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可以制備篩選所需的報道構(gòu)建體。當(dāng)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知時，使用先前已知的序列信息即可制備報道構(gòu)建 體。當(dāng)仍未鑒定出標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)時，可基于標(biāo)記基因的核苷酸序 列信息，從基因組文庫中分離出含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的核苷酸區(qū)段。
另外，在本發(fā)明的另 一個篩選治療細(xì)胞增殖性疾病所用化合物的方法
的實施方案中，所述方法利用^pa)z)7的啟動子區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)p
元結(jié)合，并參與轉(zhuǎn)錄激活^尸CDD/。因此，將能抑制^尸CDZ^的轉(zhuǎn)錄激活 的化合物用作抑制本發(fā)明^PCZ)i)7多肽之活性的候選藥物，并用于治療與
所述多肽有關(guān)的疾病，例如細(xì)胞增殖性疾病，如癌癥，尤其是結(jié)直腸癌。
所述篩選方法包括步驟(a)構(gòu)建在才艮道基因上游含有^尸CZ)Z)/的兩個 Tcf/LEF結(jié)合基元的載體；(b)用步驟(a)的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞；(c)使受試化合物 和(3-連環(huán)蛋白/Tcf-4復(fù)合物與步驟(b)的細(xì)胞接觸；(d)檢測報道基因的表 達(dá)；和(e)選擇與缺乏受試化合物時相比，能抑制報道基因表達(dá)的化合物。
可以使用任何受試化合物，例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物上清液、發(fā) 酵微生物的產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化的或粗的蛋白質(zhì)、 肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物和天然化合物。
例如，可根據(jù)實施例28所述的方法進(jìn)行篩選。例如，通過將APCDD7 的啟動子區(qū)域插入含有報道基因的表達(dá)載體，即可構(gòu)建在報道基因上游含 有^PCDD7的兩個Tcf/LEF結(jié)合基元的載體?？墒褂萌薧尸CDD7基因的5，區(qū) 域(SEQIDNO: 7)作為探針，從基因組文庫中獲得APCDD1的啟動子區(qū)域。 可以如實施例28所述制備(3-連環(huán)蛋白和Tcf-4。
任何報道基因都可用于篩選，只要能檢測到所述基因的表達(dá)即可。報 道基因的例子包括(3-gal基因、CAT基因和螢光素酶基因?？筛鶕?jù)報道基因 的類型來檢測報道基因的表達(dá)。盡管對導(dǎo)入載體的細(xì)胞沒有特別的限制， 但優(yōu)選的例子包括HeLa細(xì)胞。
通過篩選分離出的化合物是能抑制本發(fā)明APCDD1蛋白之表達(dá)的候選 藥物，并可用于治療與APCDD1蛋白相關(guān)的疾病，例如細(xì)胞增殖性疾病， 如癌癥，更具體地為結(jié)腸癌。另外，通過本發(fā)明的篩選方法可以獲得的化 合物還包括這樣一種化合物，其中能通過p-連環(huán)蛋白/Tcf-4復(fù)合物抑制 APCDD1蛋白之轉(zhuǎn)錄激活的化合物的部分結(jié)構(gòu)通過添加、缺失和/或取代被 改變。在本發(fā)明的另 一個篩選治療細(xì)胞增殖性疾病所用化合物的方法的實施
方案中，所述方法利用PPIL1與SNW1 (SKI相互作用蛋白)或驛蛋白的結(jié)合 能力。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的PPIL1蛋白能與參與維生素D受體轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì) SNW1(SKI相互作用蛋白)和參與細(xì)胞周期進(jìn)程的胞質(zhì)磷蛋白驛蛋白結(jié)合。 這些發(fā)現(xiàn)表明本發(fā)明的PPIL1蛋白通過與諸如SNW1和驛蛋白的分子結(jié)合而 發(fā)揮細(xì)胞增殖功能。因此，抑制PPIL1蛋白與SNW1或驛蛋白之間的結(jié)合有 望導(dǎo)致細(xì)胞增殖受抑制，能抑制結(jié)合的化合物可用作治療細(xì)胞增殖性疾 病，如癌癥的藥物。通過本發(fā)明的方法篩選的化合物所治療的細(xì)胞增殖性 疾病優(yōu)選為結(jié)腸癌。
該篩選方法包括步驟(a)在受試化合物的存在下使本發(fā)明的多肽與驛 蛋白或SNW1接觸；(b)檢測多肽與驛蛋白或SNWl之間的結(jié)合；和(c)選擇 能抑制多肽與驛蛋白或SNW1之間的結(jié)合的化合物。
用于篩選的本發(fā)明的PPIL1多肽以及SNW1或驛蛋白可以是重組多肽或 天然來源的蛋白質(zhì)，或者也可以是它們的部分肽，只要能保留彼此之間的 結(jié)合能力即可。用于篩選的PPIL1多肽、SNW1或驛蛋白可以是例如純化的 多肽、可溶性蛋白質(zhì)、與載體結(jié)合的形式或與其它多肽融合的融合蛋白。
可以使用任何受試化合物，例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物上清液、發(fā) 酵微生物的產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化的或粗的蛋白質(zhì)、 肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物和天然化合物。
至于篩選能抑制PPIL1蛋白與SNW1或驛蛋白結(jié)合的化合物的方法，可 使用多種本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法?？稍隗w外檢測系統(tǒng)，如細(xì)胞系 統(tǒng)中進(jìn)行篩選。更具體地，首先使PPIL1多肽，或者SNW1或驛蛋白與支持 物結(jié)合，再在支持物上添加另一種蛋白質(zhì)以及受試樣品。接著保溫混合 物，洗滌，檢測和/或測定與支持物結(jié)合的另一種蛋白質(zhì)。
可用于結(jié)合蛋白質(zhì)的支持物包括例如不溶性的多糖，如瓊脂糖、纖維 素和葡聚糖；和合成樹脂，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；優(yōu)選使用由上 述材料制備的可商購的珠和板(如多孔板，生物傳感器芯片等)。當(dāng)使用珠 時，可將其填充于柱中。
可根據(jù)常規(guī)方法，如化學(xué)鍵合和物理吸附使蛋白質(zhì)與支持物結(jié)合。或 者，可經(jīng)由特異性識別蛋白質(zhì)的抗體使蛋白質(zhì)與支持物結(jié)合。另外，也可 以利用親和素和生物素結(jié)合使蛋白質(zhì)與支持物結(jié)合。在例如，但不限于磷酸緩沖液和Tris緩沖液的緩沖液中進(jìn)行蛋白質(zhì)之 間的結(jié)合，只要緩沖液不會抑制蛋白質(zhì)之間的結(jié)合即可。
在本發(fā)明中，使用表面胞質(zhì)基因組共振現(xiàn)象的生物傳感器可用作檢測 或定量結(jié)合蛋白質(zhì)的儀器。當(dāng)使用所述生物傳感器時，僅使用極少量的多 肽并且無需標(biāo)記，即可實時觀察到表現(xiàn)為表面胞質(zhì)基因組共振信號的蛋白 質(zhì)之間的相互作用(例如BIAcore， Pharmacia)。因此，可以使用生物傳感 器，如BIAcore評價PPIL 1多肽與SNW1或驛蛋白之間的結(jié)合。
或者，可標(biāo)記PPIL1多肽，或SNW1或驛蛋白，結(jié)合蛋白質(zhì)的標(biāo)記可用 于檢測或測定結(jié)合蛋白質(zhì)。具體地，預(yù)標(biāo)記一種蛋白質(zhì)之后，在受試化合 物的存在下使標(biāo)記的蛋白質(zhì)與另一種蛋白質(zhì)接觸，洗滌后根據(jù)標(biāo)記檢測或 測定結(jié)合蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的方法中，可使用標(biāo)記物質(zhì)，如放射性同位素(如SH, 14C, 32P， 33P, 35S， 125I, 131I)、酶(如^5成性磷酸酶、辣根過氧化物酶、(3-半乳糖苷酶、p-葡糖苷酶)、焚光物質(zhì)(如異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明)和生物素/親和素 標(biāo)記蛋白質(zhì)。當(dāng)用放射性同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)時，可通過液體閃爍進(jìn)行檢測 或測定?；蛘撸ㄟ^加入酶底物，用吸光計沖企測底物的酶促變化，如顏色 的產(chǎn)生，即可檢測或測定用酶標(biāo)記的蛋白質(zhì)。另外，當(dāng)將熒光物質(zhì)用作標(biāo) 記時，可使用焚光光度計檢測或測定結(jié)合蛋白質(zhì)。
另外，使用抗PPIL1多肽和SNW1或驛蛋白的抗體也可檢測或測定 PPIL1多肽與SNW1或'譯蛋白的結(jié)合。例如，使固定于支持物上的PPIL1多 肽與受試化合物和SNW1或驛蛋白接觸之后，保溫混合物并洗滌，使用抗 SNW1或驛蛋白的抗體進(jìn)行檢測或測定。或者，將SNW1或驛蛋白固定于支 持物上，將抗PPIL1的抗體用作抗體。
當(dāng)在本發(fā)明的篩選方法中使用抗體時，優(yōu)選用上述的 一種標(biāo)記物質(zhì)標(biāo) 記抗體，并基于標(biāo)記物質(zhì)檢測或測定抗體?；蛘?，將抗PPIL1多肽、SNW1 或驛蛋白的抗體用作第 一抗體，用經(jīng)標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的第二抗體可以才企測出 所述第一抗體。另外，使用蛋白G或蛋白A柱可以檢測或測定在本發(fā)明的篩 選方法中與蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。
或者，在本發(fā)明篩選方法的另一個實施方案中，可使用利用細(xì)胞的雙-雜合系統(tǒng)("MATCHMAKER雙-雜合系統(tǒng)"，"哺乳動物MATCHMAKER雙-雜 合試驗試劑盒"，"MATCHMAKER單-雜合系統(tǒng)，，(Clontech); "HybriZAP雙-雜合載體系統(tǒng)，，(Stratagene);參見文獻(xiàn)"Dalton and Treisman， Cell 68: 597-612(1992)，，， "Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-292(1994)，，)。
在雙-雜合系統(tǒng)中，本發(fā)明的PPILl多肽與SRF-結(jié)合區(qū)或GAL4-結(jié)合區(qū) 融合并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。與本發(fā)明的PPIL1多肽結(jié)合的SNW1或驛蛋白與 VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合，并能在受試化合物的存在下在酵母細(xì)胞中 表達(dá)。當(dāng)受試化合物不能抑制PPIL1多肽與SNW1或驛蛋白之間的結(jié)合時， 兩者的結(jié)合會激活報道基因，使得陽性克隆能被檢測到。
至于報道基因，除了HIS3基因外，還可使用例如Ade2基因、lacZ基 因、CAT基因、螢光素酶基因等。
通過篩選分離出的化合物是能抑制本發(fā)明PPIL1蛋白之活性的候選藥 物，并可用于治療與PPIL1蛋白相關(guān)的疾病，例如細(xì)胞增殖性疾病，如癌 癥，更具體地為結(jié)腸癌。另外，通過本發(fā)明的篩選方法可以獲得的化合物 還包括這樣一種化合物，其中能抑制PPIL1蛋白與SNW1或驛蛋白之間的結(jié) 合的化合物的部分結(jié)構(gòu)通過添加、缺失和/或取代纟皮改變。
當(dāng)將通過本發(fā)明的方法分離出的化合物作為藥物施用于人和其它哺乳 動物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、雞、貓、狗、綿羊、豬、牛、猴、狒 狒、黑猩猩以治療細(xì)胞增殖性疾病(如癌癥)時，可直接施用分離的化合 物，或使用已知的藥物制備方法將其配制成劑量形式。例如，根據(jù)需要， 可以糖衣片劑、膠嚢、酏劑和微嚢劑型口服藥物，或者以溶于水或任何其 它藥物可接受液體的無菌溶液或懸浮液注射劑形式非口服給藥。例如，可 以常規(guī)藥物實踐所需的單位劑量形式將化合物與藥學(xué)可接受載體或介質(zhì)混 合，所述載體或介質(zhì)具體地為無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮 劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、增味劑、賦形劑、載體、防腐劑、結(jié)合劑等。 這些制品中活性成分的量能提供所示范圍內(nèi)的適當(dāng)劑量。
可與片劑和膠嚢混合的添加劑的例子有如明膠、玉米淀粉、黃蓍膠 和阿拉伯膠的結(jié)合劑；如晶體纖維素的賦形劑；如玉米淀粉、明膠和藻酸 的膨脹劑；如硬脂酸鎂的潤滑劑；如蔗糖、乳糖或糖精的甜味劑；如胡椒 薄荷、Gaultheria adenothrix油和櫻桃的增味劑。當(dāng)單位劑量形式是膠嚢 時，上述成分中還可包括液體載體，如油。可使用注射用載體，如蒸餾 水，根據(jù)常規(guī)藥物實踐配制注射用的無菌混合物。
生理鹽水、葡萄糖和其它包括助劑的等滲液體，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉可用作注射用的水溶液。它們可與適當(dāng)?shù)脑鋈?br> 劑，如醇，特別是乙醇；聚醇，如丙二醇和聚乙二醇；非離子型表面活性 劑，如Polysorbate 80 (TM)和HCO-50—起使用。
芝麻油或豆油可用作油質(zhì)液體，并可與苯曱酸千酯或千醇一起用作增 溶劑，并可與如磷酸緩沖液和醋酸鈉緩沖液的緩沖液；如鹽酸普魯卡因的 止痛劑；如千醇、酚的穩(wěn)定劑；和抗氧化劑一起配制?？蓪⒅苽浜玫淖⑸?液注入適當(dāng)?shù)陌碴持小?br> 可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法給患者施用本發(fā)明的藥物組合 物，例如以動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮注射給藥和鼻內(nèi)、經(jīng)支氣管、肌內(nèi)或口 服給藥。給藥劑量和方法隨患者體重和年齡的變化而改變；然而，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可常規(guī)選"^給藥劑量和方法。如果所述化合物可由DNA編碼，可 將DNA插入基因治療載體，施用所述載體以進(jìn)行治療。給藥劑量和方法隨 患者體重、年齡和癥狀的變化而改變；但本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)選擇給藥 劑量和方法。
例如，當(dāng)給正常成人(體重為60kg)口服給藥時，盡管根據(jù)癥狀的不同 有一些差異，但與本發(fā)明多肽結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的化合物劑量約為0.1mg 至100mg/天，優(yōu)選約為1.0mg至50mg/天，更優(yōu)選約為1.0mg至20mg/天。
當(dāng)以注射液形式給正常成人(體重為60kg)非腸道給藥時，盡管#4居患 者、靶器官、癥狀和給藥方法的不同有一些差異，但合適的靜脈內(nèi)注射劑 量約為0.01mg至30mg/天，優(yōu)選約為0.1至20mg/天，更優(yōu)選約為0.1至10mg/ 天。當(dāng)給其它動物給藥時，可以施用^L轉(zhuǎn)換成60kg體重的量。
另外，本發(fā)明提供了使用抗本發(fā)明多肽的抗體治療或預(yù)防細(xì)胞增殖性 疾病，如癌癥的方法。才艮據(jù)此方法，需施用藥物有效量的抗本發(fā)明多肽的 抗體。由于WDRPUH， KRZFPUH, PPIL1和APCDD1蛋白的表達(dá)在癌細(xì)胞中 被上調(diào)，因此抑制這些蛋白質(zhì)的表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性降低，通過抗體 與這些蛋白質(zhì)的結(jié)合有望治療或預(yù)防細(xì)胞增殖性疾病。因此，以足以降低 本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的劑量施用抗本發(fā)明多肽的抗體，所述劑量范圍是0.1至 約250mg/kg/天。成人的劑量范圍一般約為5mg至17.5g/天，優(yōu)選約為5mg至 10g/天，最優(yōu)選約為100mg至3g/天?；蛘?，將與特異于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表 面標(biāo)記結(jié)合的抗體用作藥物傳遞的工具。例如，以足以損傷腫瘤細(xì)胞的劑 量施用帶有細(xì)胞毒性劑的抗體。本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)抗-腫瘤免疫力的方法，所述方法包括施用
WDRPUH, KRZFPUH， PPIL1或APCDD1蛋白或其免疫活性片段，或編碼任 一種蛋白質(zhì)及其片段的核酸的步驟。WDRPUH， KRZFPUH, PPIL1或
明中，抗細(xì)胞增殖性疾病的疫苗指的是當(dāng)接種于動物時，具有誘導(dǎo)抗-胂瘤 免疫力作用的物質(zhì)。 一般說來，抗-腫瘤免疫力包括如下所述的免疫應(yīng)答
-誘導(dǎo)抗腫瘤的細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞，
-誘導(dǎo)識別肺瘤的抗體，和
-誘導(dǎo)產(chǎn)生抗-腫瘤的細(xì)胞因子。
因此，當(dāng)將某種蛋白質(zhì)接種于動物可誘導(dǎo)任一種免疫應(yīng)答時，就可以 說該蛋白質(zhì)具有誘導(dǎo)抗-腫瘤免疫力的作用。通過觀察宿主免疫系統(tǒng)在體內(nèi) 或體外針對蛋白質(zhì)的反應(yīng)，即可檢測出蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的抗-腫瘤免疫力。
例如，檢測細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的方法是眾所周知的。進(jìn)入活體的 外源物質(zhì)通過抗原呈遞細(xì)胞(APC)的作用被呈遞至T細(xì)胞和B細(xì)胞。以抗原 特異性方式對APC呈遞的抗原作出反應(yīng)的T細(xì)胞因受抗原的刺激而分化成 細(xì)胞毒T細(xì)胞(或細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞；CTL),然后進(jìn)行增殖(也稱作T細(xì)胞激 活)。因此，通過用APC將某種肽呈遞至T細(xì)胞，并檢測CTL的誘導(dǎo)即可評 價肽導(dǎo)致的CTL誘導(dǎo)。另外，APC具有激活CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨 噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞的作用。由于CD4十丁細(xì)胞和008+T細(xì)胞 對抗-肺瘤免疫力也很重要，因此，使用這些細(xì)胞的激活作用作為標(biāo)志，即 可評價肽的抗-胂瘤免疫力誘導(dǎo)作用。
知的。DC是具有最強CTL誘導(dǎo)作用的代表性APC。在此方法中，起初使受 試多肽與DC接觸，然后使該DC與T細(xì)胞接觸。與DC接觸后檢測到具有針 對感興趣細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的T細(xì)胞，這表明受試多肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì) 胞的活性。例如，使用"Cr-標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞的裂解作為標(biāo)志，可以;險測抗 腫瘤的CTL活性?；蛘?，使用3H-胸苷攝取活性或LDH(乳糖脫氫酶)-釋放作 為標(biāo)志評價腫瘤細(xì)胞損害程度的方法也是眾所周知的。
APC不限于DC，也可使用外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在這種情況下， 有報道表明在GM-CSF和IL-4的存在下培養(yǎng)PBMC可以增強CTL誘導(dǎo)。類似 地，已證實在匙孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)和IL-7的存在下培養(yǎng)PBMC可以誘導(dǎo)CTL。
經(jīng)這些方法證實具有CTL誘導(dǎo)活性的受試多肽是具有DC激活作用繼而 具有CTL誘導(dǎo)活性的多肽。因此，能誘導(dǎo)針對腫瘤細(xì)胞的CTL的多肽可用 作抗腫瘤疫苗。另外，通過與多肽接觸獲得誘導(dǎo)抗肺瘤CTL的能力的APC 可用作抗肺瘤疫苗。另外，因APC呈遞多肽抗原而獲得細(xì)胞毒性的CTL也 可用作抗腫瘤疫苗。使用APC和CTL所導(dǎo)致的抗-腫瘤免疫力的肺瘤治療方 法-〖皮稱為細(xì)胞免疫治療。
通常，當(dāng)使用多肽進(jìn)行細(xì)胞免疫治療時，已知混合多種具有不同結(jié)構(gòu) 的多肽并將它們與DC接觸可以增加CTL-誘導(dǎo)的效率。因此，當(dāng)用蛋白質(zhì) 片段刺激DC時，使用多種類型的片段較為有利。
或者，通過觀察對抗腫瘤抗體產(chǎn)生的誘導(dǎo)可以進(jìn)一步證實多肽對抗-肺 瘤免疫力的誘導(dǎo)。例如，當(dāng)在用多肽免疫的實驗室動物中誘導(dǎo)出抗多肽的 抗體時，以及在腫瘤細(xì)胞的生長受所述抗體抑制時，多肽能夠誘導(dǎo)抗-胂瘤 免疫力。
通過施用本發(fā)明的疫苗可"i秀導(dǎo)抗-腫瘤免疫力，所述免疫力可治療和預(yù) 防HCC或結(jié)腸癌?？拱┋煼ɑ蝾A(yù)防癌癥發(fā)生的作用可以是下述步驟中的任 何一種，如抗癌細(xì)胞生長的抑制活性、癌癥的退化和對癌癥發(fā)生的抑制作 用。也可以是患癌個體死亡率的降低、血液中腫瘤標(biāo)記的減少、與癌癥相 伴隨的可測癥狀的減輕等。優(yōu)選所述作用在統(tǒng)計學(xué)上是顯著的，例如，與 未施用疫苗的對照相比，優(yōu)選在5%或更低的顯著性水平上觀察到抗癌癥的 治療效果或抗癌癥發(fā)生的預(yù)防作用。例如，Student's t-試驗、Mann-Whitney U-試驗或ANOVA可用于統(tǒng)計學(xué)分析。
上述具有免疫活性的蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的載體可與佐劑混合。佐 劑指的是當(dāng)與具有免疫活性的蛋白質(zhì)一起(或相繼)施用時能增強抗蛋白質(zhì) 的免疫應(yīng)答的化合物。佐劑的例子包括霍亂毒素、沙門氏菌毒素、明礬 等，但并不局限于此。另外，本發(fā)明的疫苗可與藥物可接受載體適當(dāng)混 合。所述載體的例子是無菌水、生理鹽水、磷酸緩沖液、培養(yǎng)液等。另 外，必要時疫苗還可含有穩(wěn)定劑、懸浮劑、防腐劑、表面活性劑等。可全 身或局部施用疫苗。可通過單次給藥施用疫苗，或通過多次給藥加強免 疫。
當(dāng)使用APC或CTL作為本發(fā)明的疫苗時，可通過例如來自體內(nèi)的方法治療或預(yù)防腫瘤。更具體地，收集接受治療或預(yù)防的受試者的PBMC，使
來自體內(nèi)的細(xì)胞與多肽接觸，誘導(dǎo)APC或CTL之后，可給受試者施用細(xì) 胞。也可通過在來自體內(nèi)的PBMC中導(dǎo)入編碼多肽的載體來誘導(dǎo)APC。在 給藥前可克隆在體外誘導(dǎo)的APC或CTL。通過克隆和培養(yǎng)具有較高耙細(xì)胞 損害活性的細(xì)胞，可更有效地進(jìn)行細(xì)胞免疫治療。另外，按此方式分離的 APC和CTL不僅可用于針對細(xì)胞所來源的個體的細(xì)胞免疫治療，還可用于 針對來自其它個體的相似類型腫瘤的細(xì)胞免疫治療。
另外，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防細(xì)胞增殖性疾病，如癌癥的藥物 組合物，其含有藥物有效量的本發(fā)明多肽。藥物組合物可用于產(chǎn)生抗腫瘤 免疫力。^ 7 尸^///和7^2尸戶^/7/的正常表達(dá)分別局限于睪丸以及胎盤和睪 丸，因此，抑制這些基因不會對其它器官有不利影響。因此，優(yōu)選使用 WDRPUH和KRZFPUH多肽治療細(xì)胞增殖性疾病，特別是HCC。
提供下述實施例是為了闡明本發(fā)明，并幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員制備和使 用本發(fā)明。這些實施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
除非另有說明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng) 域的普通技術(shù)人員所通常理解的意思相同。盡管在本發(fā)明的實踐或檢驗中 可使用與本文所述類似或等同的方法和材料，但下文描述了適當(dāng)?shù)姆椒ê?材料。本文提及的任何專利、專利申請和出版物都列入本文作為參考。
實施本發(fā)明的最佳模式
通過下述實施例詳細(xì)闡明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于這些實施例。 實施例l:鑒定兩個常在HCC中被上調(diào)的新基因『Z)i P^/和^ZFZX/// 使用含有23040個基因的來自機構(gòu)內(nèi)部的全基因組cDNA微陣列，將20 個HCC的表達(dá)分布圖與相應(yīng)的非-癌肝組織的表達(dá)分布圖進(jìn)行比較。更具體 地，在已接受外科手術(shù)的患者知情同意的情況下，從其手術(shù)樣品中獲得 HCC組織和相應(yīng)的非-癌組織。根據(jù)廠商提供的方案，使用QiagenRneasy試 劑盒(Qiagen)或Trizol試劑(Life Technologies)從微量解剖組織中提取總 RNA 。用DNase I處理提取的總RNA ,用Ampliscribe T7轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Epicentre Technologies)進(jìn)行擴增，并在逆轉(zhuǎn)錄過程中使用Cy-染料 (Amersham)進(jìn)行標(biāo)記。分別使用Cy5和Cy3標(biāo)記得自非-癌組織和腫瘤的 RNA。然后，根據(jù)Ono等的方法(Cancer Res 60: 5007-11(2000))進(jìn)行雜交、 洗滌和檢測。使用Array Vision軟件(Amersham Pharmacia)測定每個靶點Cy5和Cy3的熒光強度。測定雙份數(shù)值，從在每個耙點檢測到的熒光強度中減 去背景信號之后，計算平均值。然后，將在載玻片上檢測到的所有焚光強 度歸一化以調(diào)整每個載玻片上52個持家基因的平均Cy5和Cy3強度。從進(jìn)一 步的研究中排除Cy3和Cy5的熒光強度皆低于25000個單位的基因，選擇 Cy3/Cy5信號比率〉2.0的基因進(jìn)行進(jìn)一步評價。
通常在HCC中^皮上調(diào)的基因中，對應(yīng)于UniGene簇的EST(Hs. 122614) (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)、機構(gòu)內(nèi)部登錄號為D3197的基因在 12個HCC的11個中過表達(dá)，所述過表達(dá)是與相應(yīng)的非-癌肝組織相比而言的 (圖la)。該基因含有編碼具有WD40重復(fù)的蛋白質(zhì)的開放閱讀框，因此被稱 為ffDi 尸t/Z/(在HCC中被上調(diào)的WD40重復(fù)蛋白)?！篋7 尸W/也在兩例胃癌 的一例中被上調(diào)。另外，還檢測到機構(gòu)內(nèi)部登錄號為C6242(ESTHs. 58461) 的基因，與相應(yīng)的非-癌肝組織相比，所述基因在14個HCC的11個中被顯著 上調(diào)(圖lb),基于其編碼蛋白質(zhì)含有鋅指基元，將其稱為^ZF尸t/Z/(在 HCC中被上調(diào)的Kmpple-型鋅指蛋白)。^ZFi^/Z也在所有被檢測的胃癌病 例(2例)和36個肺癌病例中的2例中被上調(diào)。
隨后，進(jìn)行半定量RT-PCR以進(jìn)一 步證實另外IO個HCC病例中 ^^7^17//和^7^尸尸^/表達(dá)的提高(圖10和￡1)。具體地說，根據(jù)廠商提供的 方案，使用Qiagen Rneasy試劑盒(Qiagen)或Trizol試劑(Life Technologies)提 耳又總RNA。 4吏用聚(5丁12.18引物(Amersham Pharmacia Biotech)與Superscript II 逆轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies),將10微克總RNA等分試樣逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。 將所得單鏈cDNA制品稀釋于20pl PCR緩沖液(TaKaRa)中。然后使用下述 引物，通過標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR實驗進(jìn)行PCR擴增
^7^尸"http://正向引物5 ，-CAGGTGGAAATGACCATCTGGTCAAAG-3 ， [SEQ ID NO:9]和反向引物5'-CATCAGCTTCAGGAGGTATATGGTAC-3， [SEQIDNO:10];和
i^Z/^W/正向引物5，-GTGGCACTGTGGTGTTACCTTAT-3， [SEQ ID NO:ll]和反向引物5 ， -CCTCTAAACCTTTGCCTACGACT-3 ， [SEQ ID NO: 12]。
在下述條件下使用GeneAmp PCR 9700系統(tǒng)(Perkin-Elmer)進(jìn)行擴增94 。C變性4分鐘；94。C30秒，56。C 30秒和72。C 45秒共35輪循環(huán)。 實施例2:表達(dá)、分離和鑒定新的人基因『Z^/^///接著，使用『/^尸^///的？01產(chǎn)物作為探針進(jìn)行多-組織Northern印跡分 析。更具體地，使人多-組織印跡(Clontech)與經(jīng)"P-標(biāo)記的『Di 尸t/7/PCR產(chǎn) 物雜交。根據(jù)廠商的推薦進(jìn)行預(yù)-雜交、雜交和洗滌。于-80。C用增感屏對 印跡進(jìn)行放射自顯影24至72小時。結(jié)果，在睪丸中檢測到2-kb轉(zhuǎn)錄物的大 量表達(dá)(圖2a)。由于D3197小于在Northern印跡上#r測到的『Di^ W cDNA,隨后，發(fā)明人研究了 WD7 尸L^ cDNA的5，序列。首先，使用 BLAST程序在基因組數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中檢索對 應(yīng)于D3197的基因組序列，以尋找定位于染色體帶17pl3的粘粒序列 (GenBank登錄號AC026855)。 使用GENSCAN 、 Gene Recognition和 Assembly Internet Link程序推測基因組序列的候選外顯子序列，連接推測的 外顯子序列。然后，按下述進(jìn)行cDNA末端的5，快速擴增(5，-RACE):根據(jù) 廠商說明，使用Marathon cDNA擴增試劑盒(Clontech)進(jìn)行5 ， RACE 。使用 基因-特異性反向引物5 ， -TTACCGTCGTTCCATGCTGAAATGATGC-3 ， 〖SEQ ID >^0:13]和試劑盒提供的八？-1引物制備)^^/ (7//的5，部分。由人睪 丸mRNA(Clontech)合成cDNA模板，使用TA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆擴 增產(chǎn)物，用ABI PRISM 3700 DNA測序儀(Applied Biosystems)測定其序列。 測定的裝配序列由2152個核苷酸組成，其中含有1860個核苷酸長的開^C閱 讀框，其編碼620個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(GenBank登錄號AB065281)。用 Simple Modular Architecture Research Tool(SMART， http:〃smart.embl-heidelberg. de)檢索蛋白質(zhì)基元，結(jié)果表明推測的蛋白質(zhì)中有11個WD40重 復(fù)結(jié)構(gòu)域(圖2b)。測定的『Di PI7/f核苷酸序列及其推測的氨基酸序列分別 示于SEQ ID NO:l和2。
實施例3: WDRPUH的亞細(xì)胞定位
使用基因特異性引物套5 ， -GGGGTACCACCATGGATAACAAAATTT CGCCGGAG-3， [SEQ ID NO: 14]和5,-CGGAATTCTCAGGAGGTATATGG GTACTTCCATGC-3 ， [SEQ ID NO: 15]擴增對應(yīng)于『Z^尸f/7/的完整編碼 區(qū)，并克隆至pcDNA3.1 myc /His載體(Invitrogen)。然后，將構(gòu)建的載體 pcDNA 3.1myc/His-WDRPUH瞬時轉(zhuǎn)染至SNlM75細(xì)胞(韓國細(xì)胞系庫)，在 RPMI1640中培養(yǎng)細(xì)胞。在含有4。/o低聚曱醛的PBS中固定細(xì)胞15分鐘，然 后于室溫(RT)下用含有0.1。/。 Triton X-100的PBS透化2.5分鐘。隨后，于々C 用含2% BSA的PBS覆蓋細(xì)胞24小時以阻斷非特異性雜交。將1:1000稀釋的小鼠抗-myc單克隆抗體(Sigma)用作免疫細(xì)胞化學(xué)染色所用的第 一抗體，在 同與羅丹明-偶聯(lián)的抗-小鼠第二抗體(Leinco和ICN)保溫之后觀察反應(yīng)。用4 ',6，-二脒-2，-苯基吲哚二鹽酸化物(DAPI)復(fù)染細(xì)胞核。在ECLIPSE E800顯微 鏡下獲得熒光圖像。結(jié)果顯示出細(xì)胞的胞質(zhì)中存在經(jīng)標(biāo)記的WDRPUH蛋白 (圖3)。
實施例4:『D/ /^7/對細(xì)胞生長的作用
為了研究『Z^尸"/Z對細(xì)胞生長的作用，通過用表達(dá)『Z)A尸67/的質(zhì)粒 (pcDNA-WDRPUH)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞(ATCC, Rockville， MD)以進(jìn)行集落-形 成試驗。具體地說，按實施例3所述擴增對應(yīng)于『Z^PC/Z/的完整編碼區(qū)， 并克隆至pcDNA3.1 (Invitrogen)。分別用質(zhì)粒pcDNA-WDRPUH 、對照質(zhì)粒 (mock)和表達(dá)『Di^Pt/i/互補鏈的質(zhì)粒(pcDNA-antisense)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在含有 適當(dāng)濃度的遺傳霉素的DuIbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中將轉(zhuǎn)染細(xì)胞 培養(yǎng)10至21天。然后，用100%曱醇固定細(xì)胞，并用Giemsa溶液進(jìn)行染色。 所有實驗同時做三份。
結(jié)果，與對照質(zhì)粒(mock)或pcDNA-antisense相比，用pcDNA-WDRPUH轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生了顯著更多的集落(圖4a和b)。根據(jù)Student，s /試 驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析以測定顯著差異。
實施例5:通過指定用于降低『D7 尸/77/表達(dá)的反義S-寡核苷酸抑制肝 癌細(xì)"包生長
為了檢測抑制『Di^f/H是否能導(dǎo)致HCC細(xì)胞的生長阻滯和/或細(xì)胞死 亡，合成了多個被指定用于抑制叨^ 尸M7表達(dá)的反義S-寡核苷酸。使用 LIPOFECTIN試劑(GIBCO BRL),用包含『￡>/ 尸17//的第一個外顯子-內(nèi)含子 邊界的反義S-寡核苷酸(WDRPUH-AS4; 5 ， -GGCCTCACCATTGAAG-3 ， [SEQ ID NO: 16])或?qū)φ誗-寡核苦酸(WDRPUH-S4; 5，-CTTCAATGGTGA GGCC-3， [SEQ ID NO: 17])轉(zhuǎn)染鋪于10-cm平皿上的SNU475細(xì)胞(韓國細(xì)胞 系庫)(2><105個細(xì)胞/皿)；并在添加有適當(dāng)濃度的遺傳霉素的RPMI1640中培 養(yǎng)6至12天。通過RT-PCR和Western印跡分析細(xì)胞的『Di 尸C/7/和04尸D/f表 達(dá)。
與對照(WDRPUH-S4)相比，用WDRPUH-AS4轉(zhuǎn)染的SNU475細(xì)胞中 『D7 尸W7的內(nèi)源性表達(dá)顯著降低(圖5a)。
接著，通過以5><105個細(xì)胞/100111111平皿的密度平鋪8]^475細(xì)胞進(jìn)行3-(4,5-二曱基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)試驗。用指定用于抑制『Di 尸Wf的有義或反義S-寡核苷酸轉(zhuǎn)染三份細(xì)胞。培養(yǎng)72小時之后，用含有50(^g/ml MTT(Sigma)的新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，將平板置于37。C保溫4小時。然后，加入lml 0.01N HCl/10% SDS以裂解細(xì)胞。用ELISA平板讀數(shù)器，在570nm的檢測波長下(參比波長為630nm)定量顏色反應(yīng)。用與對照相比的吸光度描述細(xì)胞生存力。
與上述RT-PCR和Western印跡分析相似，與WDRPUH-S4相比，WDRPUH-AS4的轉(zhuǎn)染能顯著降低存活細(xì)胞的數(shù)目(圖5b)，這表明WD7 尸t///對肝細(xì)胞癌細(xì)胞的細(xì)胞生長和/或存活起著重要作用。通過三個獨立的實驗進(jìn)一步證實了該結(jié)果。
實施例6:表達(dá)WDRPUH siRNA的質(zhì)粒的構(gòu)建及其對HCC細(xì)胞生長的
作用
最近已證實在哺乳動物細(xì)胞中，短的干擾RNA(siRNA)具有基因特異性的基因沉默作用，而不會誘導(dǎo)基因表達(dá)的全面改變，所述siRNA由具有19個互補核苷酸和3，末端互補的胸苷或尿苷二聚體的20至21聚體雙鏈RNA(dsRNA)組成。因此，本發(fā)明人構(gòu)建了表達(dá)多種WDRPUH-siRNA的質(zhì)粒，并檢查了它們對WDRPUH^達(dá)的作用。
首先，按下述構(gòu)建psiHlBX3.0載體。由于據(jù)報道H1RNA基因由RNA聚合酶ni轉(zhuǎn)錄，所述酶可在3，末端產(chǎn)生具有尿苷的短轉(zhuǎn)錄物，因此，使用一套引物5，-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3， [SEQ ID NO: 18]和5，-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA畫3， [SEQ ID NO: 19]，以人胎盤DNA作為模板，通過PCR擴增含有其啟動子區(qū)域的H1RNA基因的基因組片段。純化產(chǎn)物，根據(jù)廠商提供的方案使用TA克隆試劑盒(Invitrogen)將產(chǎn)物克隆至pCR2.0質(zhì)粒載體。用 一套引物5，-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3， [SEQ ID NO: 20]和5,-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3， [SEQ ID NO: 21]，通過PCR擴增含有H1RNA基因的片段；用^^HI和屈oI消化，再進(jìn)行純化。然后，將經(jīng)純化的含有H1RNA基因的"awHnoI片段克隆至pcDNA3.1(+)(Invitrogen)的核苷酸1257至56片段。將連接的DNA用作PCR模板，PCR引物是5 ， -TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3,[SEQ ID NO: 22]和5，-TTTAAGCT TGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3， [SEQ ID NO:23]。用歷"Jin消化產(chǎn)物，隨后自身連接以產(chǎn)生psiHlBX3.0載體質(zhì)粒。
通過將雙鏈寡核苷酸克隆至psiHlBX3.0載體的^^I位點，制備出對照質(zhì)粒和表達(dá)WDRPUH-siRNA的質(zhì)粒。克隆至載體的寡核普酸如下psiH 1BX-WDRPUHO1, 5 ， -CACCAATGTGATCTTCTCCAGGTGCTTCAAGAGAGCACCTGGAGAAGATC ACATT畫3 ， [SEQ ID NO: 24]和5 ，-AAAA
ATT-3,[SEQ ID NO: 25]; psiHlBX-WDRPUH02, 5，-CACCAAGGACACCAGTTTCTCGTAGTTCAAGAGACTACGAGAAACTGGTGTCCTT-3 ， [SEQID NO: 261和5 ， -AAAAAAGGACACCAGTTTCTCGTAGTCTCTTGAACTACGAGAAACTGGTGTCCTT-3,[SEQIDNO: 27]; psiHlBX-WDRPU訓(xùn)，5,-CACCAAAGAGAC GCTCATAGCGACTTTCAAGAGAAGTCGCTATGAGCGTCTCTTT-3，[SEQ ID NO: 28]和5 ， -AAAAAAAGAGACGCTCATAGCGACTTCTCTTGAAAGTCGCTATGAGCGTCTCTTT-3 ， [SEQ ID NO: 29];psiH 1BX-WDRPUH05 ， 5 ， -CACCAACGACGGTAAAATCCGAGCCTTCAAGAGAGGCTCGGATTTTACCGTCGTT-3 ， [SEQ ID NO: 30]和5 '-AAAA
GTT-3，[SEQ ID NO: 31];和對照psiHlBX-EGFP(mock)， 5，-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3 ， [SEQID NO: 32]和5 ， -AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3，[SEQ ID NO: 33]。每個序列中的下劃線部分是siRNA的耙序列。根據(jù)廠商的推薦，使用FuGENE6試劑(Roche)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時之后，從細(xì)胞中提取總RNA。
結(jié)果，其中的psiHIBX-WDRPUHO 1而不是psiHlBX-WDRPUH02 、psiHlBX-WDRPUH03或psiHIBX-WDRPUH05能顯著抑制細(xì)胞中的WDRPUH表達(dá)(圖6A)。為了檢測抑制WDRPUH是否能導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的生長受抑制，用psiHIBX-WDRPUHOl 、 psiHlBX-WDRPUH02 、 psiHlBX-WDRPUH03或psiHlBX-WDRPUH05 、 psiHlBX-EGFP或模擬載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。與用psiHlBX-WDRPUH02 、 psiHlBX-WDRPUH03或psiHlBX-WDRPUH05 、 psiHlBX-EGFP或?qū)φ辙D(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，用psiH 1 BX-WDRPUH01轉(zhuǎn)染的存活細(xì)胞顯著減少，這表明WDRPUH表達(dá)的降低能抑制肝癌細(xì)胞的生長(圖6B)。實施例7:制備抗-WDRPUH抗體
為了檢查WDRPUH的表達(dá)并研究其功能，按下述制備抗WDRPUH的多克隆抗體。首先，在大腸桿菌中產(chǎn)生重組的經(jīng)His-標(biāo)記的WDRPUH,并根據(jù)廠商的推薦，使用Pro BondTM組氨酸樹脂(Invitrogen)從細(xì)胞中純化所述WDRPUH。將重組蛋白質(zhì)用于免疫兔。從血清中純化抗WDRPUH的多
克隆抗體。
抗-WDRPUH血清而不是預(yù)-免疫血清的免疫印跡顯示出70kD經(jīng)FL AG-標(biāo)記的WDRPUH帶，其大小與使用抗-FLAG抗體檢測到的相同(圖7)。
實施例8:表達(dá)、分離和鑒定新的人基因^ZF/^///
使用C6242 cDNA作為探針，按實施例2所述進(jìn)行多-組織Northern印跡分析。結(jié)果顯示出2.8-kb轉(zhuǎn)錄物在胎盤和睪丸中大量表達(dá)(圖8a)。由于C6242比在Northern印跡上檢測到的小，發(fā)明人研究了 ^ZF尸i7i/ cDNA 5，部分的序列。首先，使用BLAST程序在基因組數(shù)據(jù)庫(http:〃www,ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中檢索對應(yīng)于C6242的基因組序列，以尋找定位于染色體帶16pl 1的工作草圖序列(GenBank登錄號NT-024802)。使用GENSCAN、Gene Recognition和Assembly Internet Link程序推測基因組序列的候選外顯子序列，連接推測的外顯子序列。然后，按實施例2所述進(jìn)行5，-RACE,不同的是將5，-TAGATTCTGGGCGCACTTGTGGCTCTCC-3， [SEQ ID NO: 34]用作引物，結(jié)果獲得2744個核苷酸長的裝配序列，其中含有1500個核苷酸長的開放閱讀框，其編碼500個氨基酸長的蛋白質(zhì)(GenBank登錄號AB065282)。 用Simple Modular Architecture Research Tool (SMART,http:〃smart. embl-heidelberg.de)檢索蛋白質(zhì)基元，結(jié)果表明推測的蛋白質(zhì)含有Kruppel-型鋅指結(jié)構(gòu)域(圖8b)。測定的^ZF尸W/核苷酸序列及其推測的氨基酸序列分別示于SEQIDNO: 3和4。
實施例9: KRZFPUH的亞細(xì)胞定位
使用基因特異性引物套5，-GGGGTACCACCATGGCGCCACCTTCG-3，[SEQ ID NO: 35]和5 ,-CGGAATTCATGGGCGTTGCCCCTCTGACTGG-3 ,[SEQ ID NO: 36]擴增對應(yīng)于的^/ ZF尸L/H的完整編碼區(qū)；并將其克隆至pcDNA3.1 myc/His載體(Invitrogen)。然后將該構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染至SNU475細(xì)胞(韓國細(xì)胞系庫)，并按實施例3所述研究KRZFPUH的亞細(xì)胞定位。細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色揭示出經(jīng)標(biāo)記的KRZFPUH蛋白存在于細(xì)胞核中(圖9)。
實施例10: ^^/^ 7//對細(xì)胞生長的作用
為了分析^ZF戶C/if對細(xì)胞生長的作用，通過用表達(dá)OZF尸C/Z/的質(zhì)粒(pcDNA-KRZFPUH)轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞(ATCC, Rockville， MD)以進(jìn)行集落-形成試驗。具體地說，按實施例9所述擴增對應(yīng)于^ZF尸C/7/的完整編碼區(qū)，并克隆至pcDNA3.1 (Invitrogen)。分別用質(zhì)粒pcDNA-KRZFPUH 、對照質(zhì)粒(mock)和表達(dá)KRZFPUH互補鏈的質(zhì)粒(pcDNA-antisense)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在含有適當(dāng)濃度的遺傳霉素的DMEM中將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)10至21天。然后，用100%曱醇固定細(xì)胞并用Giemsa溶液染色。所有實驗都做三份。如圖10a和b所示，與表達(dá)A^ZF尸W/互補鏈的對照質(zhì)粒(pcDNA-antisense)相比，pcDNA-KRZFPUH在COS7細(xì)胞中產(chǎn)生了明顯更多的集落。通過三個獨立的實一瞼進(jìn)一步證實該結(jié)果。根據(jù)Student，s ri式驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析以測定顯著性差異。
實施例ll:通過指定用于降低尺i ZF尸^/Z/表達(dá)的反義S-寡核苷酸抑制肝癌細(xì)l包生長
為了檢測抑制^ZFPt/7/是否能導(dǎo)致HCC細(xì)胞的生長阻滯和/或細(xì)胞死亡，合成了多個被指定用于抑制其表達(dá)的反義S-寡核苷酸。使用LIPOFECTIN試劑(GIBCO BRL)，用包含i^ZF尸C/i/的第一個外顯子-內(nèi)含子邊界的反義S-寡核苷酸(KRZFPUH-AS4; 5 ， -GGCCTCACCGAGCGCG-3 ，[SEQ ID NO: 37]或?qū)φ誗-寡核苷酸(KRZFPUH-S4; 5 ，-CGCGCTCGGTGAGGCC-3 ， [SEQ ID NO: 38])轉(zhuǎn)染鋪于10-cm平皿上的Alexander細(xì)胞(ATCC, Rockville, MD)(2x 105個細(xì)胞/皿)；并在添加有適當(dāng)濃度的遺傳霉素的RPMI1640中培養(yǎng)6至12天。然后，用100%曱醇固定細(xì)胞并用Giemsa溶液染色。在組成型表達(dá)大量^ZF尸t/7/的Alexander細(xì)胞中，與對照有義S-寡核苷酸(KRZFPUH-S4)相比，通過用反義S-寡核苷酸(KRZFPUH-AS4)轉(zhuǎn)染，X7 ZFPt/7/的內(nèi)源性表達(dá)和存活細(xì)胞的數(shù)目顯著降低(圖1 la和b)，這表明X7 ZF尸U7/對HCC細(xì)胞的細(xì)胞生長和/或存活起著重要作用。通過三個獨立的實驗進(jìn)一步證實了該結(jié)果。根據(jù)Student's f試驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析以測定顯著性差異。
實施例12:表達(dá)KRZFPUH siRNA的質(zhì)粒的構(gòu)建及其對HCC細(xì)胞生長
的作用通過將雙鏈寡核苷酸克隆至psiU6BX3.0載體來制備表達(dá)KRZFPUH-siRNA的質(zhì)粒。用于KRZFPUH-siRNA的寡核苷酸是
psiU6BX-KRZFPUHl: 5, -CACCAACGAAACACCGATGACTGGGTTCAAGAGACCCAGTCA TCGGTGTTTCGTT-3，(SEO ID NO: 104)和5，-AAAA
^U-3,(SEQIDNO: 105); psiU6BX-KRZFPUH2: 5，-CACCAATCACCGGACCACACACACATTCAAGAGATGTGTGTGTGGTCCG GTGATT-3 ,(SEO IDNO: 106)和5 , -AAAAAATCACCGGACCACACACACATCTCTTGAATGTGTGTGTGGTCCGGTGATT-3，(SEO ID NO: 107、: psiU6BX畫KRZFPUH3: 5，-
AAGGTTT-3，(SEO ID NO: 108)和5 ，-AAAAAAACCTTGCCTACGACATGTTTCTCTTGAAAACATGTCGTA GGCAAGGTTT-3 ， (SEO ID NO: 109);和psiU6BX-KRZFPUH45 ， -CACCAAAAGG TTTCCGTTAGCCCCGTTCAAGAGACGGGGCTAACGGAAACCTTTT-3 ， (SEO ID NO: 110)和5，-AAAA
TTT-3， (SEQ ID NO: 111)。每個序列中的下劃線部分是siRNA的耙序列。
根據(jù)廠商的推薦，使用FuGENE6試劑(Roche)將psiU6BX-KRZFPUH、psiU6BX-EGFP或psiHlBX-mock質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時之后，從細(xì)胞中提取總RNA。
最近已證實在哺乳動物細(xì)胞中，短的干擾RNA(siRNA)具有基因特異性的基因沉默作用，而不會誘導(dǎo)基因表達(dá)的全面改變，所述siRNA由具有19個互補核苦酸和3，末端互補的胸普或尿普二聚體的20至21聚體雙鏈RNA(dsRNA)組成。因此，本發(fā)明人構(gòu)建了表達(dá)多種KRZFPUH-siRNA的質(zhì)粒，并檢查了它們對KRZFPUH表達(dá)的作用。在siRNA中，是psiU6BX-KRZFPUH2而不是psiU6BX-KRZFPUHl 、 psiU6BX-KRZFPUH3或psiU6BX-KRZFPUH4能顯著抑制Huh7 、 Alexander 、 HepG2和SNU449細(xì)胞中的KRZFPUH表達(dá)(圖U和13,數(shù)據(jù)未顯示)。為了檢測抑制KRZFPUH是否能導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的生長受抑制，用psiU6BX-KRZFPUH2 、 psiHlBX-KRZFPUH1， psiHlBX-KRZFPUH3、 psiHIBX-KRZFPUH4、 psiHlBX-EGFP或模擬載體轉(zhuǎn)染Huh7 、 Alexander細(xì)胞。與用psiHlBX-KRZFPUHl 、psiHlBX-KRZFPUH3 、 psiHlBX-KRZFPUH4 、 psiU6BX-EGFP或?qū)φ辙D(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，用psiU6BX-KRZFPUH2轉(zhuǎn)染的存活細(xì)胞顯著減少，這表明KRZFPUH表達(dá)的降低能抑制肝癌細(xì)胞的生長(圖12和13)。實施例13:鑒定常在人結(jié)腸癌中被上調(diào)的新基因尸/Yi:/使用含有23040個基因的cDNA微陣列，按實施例l所述將ll個結(jié)腸癌組織的表達(dá)分布圖與相應(yīng)的非-癌結(jié)腸粘膜組織的表達(dá)分布圖進(jìn)行比較。該分析鑒定出多個基因，與其在相應(yīng)非-癌組織中的表達(dá)水平相比，所述基因在癌癥組織中的表達(dá)水平通常有所升高。其中，與。(^/-/%/尸戶/丄7基因(GenBank登錄號為AF151882)相對應(yīng)、機構(gòu)內(nèi)部登錄號為B9486的基因在穿過截留濾器的所有6個病例的癌癥組織中的表達(dá)水平在2.36至4.68的放大范圍內(nèi)有所增強，所述增強是與相應(yīng)的非-癌粘膜相比而言的(圖14a)。為了闡明微陣列的結(jié)果，使用引物5，-GGACAGGTCGAGGTGGTGC-3，(正向)[SEQID NO: 39]和5，-CTCGACGAGTTCTCCCATCG陽3，(反向)[SEQ ID NO: 40]，按實施例l所述，通過半定量RT-PCR檢查這些轉(zhuǎn)錄物在其它結(jié)腸癌樣品中的表達(dá)。根據(jù)半定量RT-PCR，證實在20個病例的17個中，尸尸/丄7的表達(dá)有所增加(圖14b)。
實施例14:戶尸/L7的結(jié)構(gòu)
使用國立生物技術(shù)信息中心的BLAST程序(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，在公共數(shù)據(jù)庫中對對應(yīng)于尸/VZJ的AF151882序列進(jìn)行額外的同源性檢索，鑒定出包括BE908798、 AK026636的EST,它們分別含有尸尸/U的5，或3，部分，還鑒定出被定位于染色體帶6p21.1的基因組序列(GenBank登錄號為NT—007592)。裝配的尸尸/ZJ cDNA序列具有1734個核苷酸，其中含有498個核苷酸長的開放閱讀框。將該cDNA序列與基因組序列相比較，揭示出該基因由4個外顯子組成。該基因推測的氨基酸序列與鼠的相應(yīng)序列具有98%的同一性(圖15)。測定的尸/YZ/核苷酸序列及其推測的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO: 5和6。
實施例15:尸尸/丄7對細(xì)胞生長的作用
為了研究尸尸/丄7對細(xì)胞生長的作用，通過用表達(dá)經(jīng)myc-標(biāo)記的PPILl蛋白的質(zhì)粒(pcDNA3.1myc/His-PPILl)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞(ATCC， Rockville, MD)進(jìn)行集落-形成試驗。按下述構(gòu)建質(zhì)粒。首先，根據(jù)廠商提供的方案，使用Qiagen Rneasy試劑盒(Qiagen)或Trizol試劑(Life Technologies)提取總RNA。j吏用聚dTj2.,8引物(Amersham Pharmacia Biotech)與Superscript II逆專爭錄酶(Life Technologies),將10微克總RNA等分試樣逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。將所得單鏈cDNA制品稀釋于20pl PCR緩沖液(TaKaRa)中。然后使用下述引物，通過標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR實驗進(jìn)行PCR擴增以擴增出對應(yīng)于尸戶/丄7的完整編碼區(qū)5，-AGACAAGCTTTCCGCCGCCGGC-3 ，(正向)[SEQ ID NO: 41]和5 ，-GTCTCTCGAGAAGGGTATGCCTTAATGATCTTC-3,(反向)[SEQ ID NO:42]。
在下述條件下使用GeneAmp PCR 9700系統(tǒng)(Perkin-Elmer, Foster City，CA)進(jìn)行RT-PCR: 94。C變性4分鐘；94。C 30秒，56。C 30秒和72。C 45秒共28輪循環(huán)。將擴增的片段插入pcDNA3.1myc/His(Invitrogen)載體。然后將構(gòu)建的pcDNA3.1 myc/His-PPIL 1轉(zhuǎn)染至NIH3 T3細(xì)胞。
與對照質(zhì)粒，pcDNA3.1myc/His-LacZ或表達(dá)尸/YZJ互補鏈的pcDNA3.1 myc/His-asPPIL 1相比，pcDNA3.1 myc/His-PPIL 1能在NIH3T3細(xì)胞中誘導(dǎo)明顯更多的集落(圖16a)。
另外，進(jìn)行與上述類似的實驗，不同的是將表達(dá)少量內(nèi)源性尸戶/"的HCT116人結(jié)腸癌細(xì)胞(ATCC， Rockville， MD)用作被pcDNA3.lmyc/His-PPIL1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。結(jié)果，在轉(zhuǎn)染的HCT116人結(jié)腸癌細(xì)胞中觀察到增強的集落形成活性(圖16b)。
實施例16:通過指定用于降低尸尸/"表達(dá)的反義S-塞核苷酸抑制結(jié)腸癌細(xì)l包生長
為了檢測抑制尸尸/丄/ 否能導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的生長阻滯和/或細(xì)胞死亡，合成了4對對應(yīng)于PP/丄7的對照和反義S-寡核苷酸對照有義寡核苷酸PPIL1陽S2， 5，-CTTCGCTATGGCGGCA-3,[SEQ ID NO: 43];反義S-寡核苷酸PPIL1-AS2， 5,-TGCCGCCATAGCGAAG-3，[SEQ ID NO: 44];和scramle S-寡核苷酸PPIL1-SCR2， 5，畫GTTGCACAGCGACGCA陽3，[SEQ ID NO: 92]。使用LIPOFECTIN試劑(GIBCO BRL)，將每一種合成的寡核苷酸轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480(ATCC， Rockville， MD)、 SNU-C4和SNU-C5(皆得自韓國細(xì)胞系庫)，在被檢測的ll抹結(jié)腸癌細(xì)胞系中，上述細(xì)胞顯示出較高水平的尸尸/Z7表達(dá)。在Leibovitz，s L-15中培養(yǎng)SW480，在RPMI1640中培養(yǎng)SNU-C4和SNU-C5，所有培養(yǎng)基都添加有適當(dāng)濃度的遺傳霉素，培養(yǎng)時間為6至12天。然后用100%曱醇固定細(xì)胞，并用Giemsa溶液進(jìn)行染色。
在反義S-寡核苷酸中，與對照有義(PPIL1-S2)相比，PPIL1-ASZ能顯著降低SNU-C5細(xì)胞中的尸戶/丄7表達(dá)(圖17a)。轉(zhuǎn)染6天后，被PPIL1-AS2轉(zhuǎn)染的 存活細(xì)胞數(shù)目顯著少于用對照，PPIL1-S2或scramle S-寡核香酸(PPILl-SCR2)轉(zhuǎn)染的存活細(xì)胞數(shù)目，這表明抑制P尸/ZJ能降低轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長和/ 或存活(圖17b)。在三個獨立的實驗中獲得了一致的結(jié)果。
接著進(jìn)行3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)試驗以測 定PPIL1-AS2對SW480、 SNU-C4和SNU-C5細(xì)胞的生長-抑制作用。具體地 說，以5xl()S個細(xì)胞/100mm平皿的密度平鋪細(xì)胞，用指定用于抑制戶尸/丄7的 有義或反義S-寡核苷酸轉(zhuǎn)染三份細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72小時之后，用含有500iug/ml MTT(Sigma)的新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，將平板置于37。C保溫4小時。然 后，加入lml 0.01N HCl/10% SDS以裂解細(xì)胞，并用ELISA平板讀數(shù)器，在 570nm的4企測波長下(參比波長為630nm)測定裂解物的吸光度。用與對照細(xì) 胞相比的吸光度描述細(xì)胞生存力。結(jié)果，在這三個細(xì)胞系中，相對于 PPIL1-S2而言，用PPIL1-AS2轉(zhuǎn)染的存活細(xì)胞數(shù)目明顯較少(圖17c)。
實施例17: PPIL1蛋白與SNW1的相互作用
據(jù)報道，兩種與PPIL1高度同源的原核蛋白質(zhì)Cyp2(粟酒裂殖糖酵母)和 CypECD/c"o^e//ww ofoco/cfeMm)分別能與Snwl和SnwA相互作用。因此，假 設(shè)PPIL1蛋白能與Snwl和SnwA的人同系物SNW1/SKIP結(jié)合。為了研究該假 說，構(gòu)建了表達(dá)經(jīng)Flag標(biāo)記的PPILl蛋白的pFLAG-PPILl。首先按實施例15 所述擴增尸尸/丄7的完整編碼區(qū)，將產(chǎn)物克隆至pFLAG-CMV-5c(Sigma)的克 隆位點以制備pFLAG-PPILl。類似地，使用基因特異性引物套5，-TGGG AAQTTCCGGAAGAAGATGGCGCTCACCAGC-3，(正向)[SEQ ID NO: 45〗和 5 ， -GTGCCTCGAGCTTCCTCCTCTTCTTGCCTTCATGC-3 ，(反向)[SEQ ID NO: 46],通過RT-PCR擴增57V『/的完整編碼區(qū)；并將其克隆至pcDNA3.1 myc/His(Invitrogen)的克隆位點以構(gòu)建表達(dá)經(jīng)myc-標(biāo)記的SNWl的pcDNA3.1 myc-SNWl 。接著，與或不與pcDNA3.1myc-SNWl相伴將pFLAG-PPILl轉(zhuǎn) 染至COS7細(xì)胞(ATCC, Rockville, MD)。
然后，按下述用抗-FLAG抗體對細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫沉淀轉(zhuǎn)染48小 時后，收集用pFLAG-PPILl和pcDNA3.1myc/His-SNWl轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞， 并用含有20mM Tris-HCl pH7.5、 150mM NaCl、 1% NP-40和lx完全蛋白酶 抑制劑混合物EDTA(-)(Boehringer)的裂解緩沖液裂解細(xì)胞。用抗-FLAG M2 抗體(SIGMA)免疫沉淀細(xì)胞裂解物。通過SDS-PAGE分離沉淀的蛋白質(zhì)并使用抗-FLAG M2抗體進(jìn)行免疫印跡分析。
免疫沉淀之后，使用抗-c-Myc抗體進(jìn)行免疫印跡分析。具體地說，用 PBS將用pFLAG-PPILl和/或pcDNA3. lmyc/His-SNWl轉(zhuǎn)染的細(xì)胞洗滌2次， 并用裂解緩沖液(150mM NaCl， 1% Triton X-IOO， 50mM Tris-HCl pH 7,4， lmM DTT和lx完全蛋白酶抑制劑混合物(Boehringer))收集細(xì)胞。勻漿細(xì)胞 并以10，000xg離心30分鐘后，通過Bradford試驗(Bio-Rad)使上清液中的蛋白 質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)化。通過10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并用小鼠抗-myc抗體 (SANTA CRUZ)進(jìn)行免疫印跡。將與HRP-偶聯(lián)的山羊抗-小鼠IgG (Amersham)用作ECL檢測系統(tǒng)(Amersham)的第二抗體。
結(jié)果表明當(dāng)用兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，觀察到對應(yīng)于經(jīng)myc-標(biāo)記的 SNW1蛋白的帶(圖18)。另外，用抗-cMyc抗體免疫沉淀裂解物可沉淀出經(jīng) Flag-標(biāo)記的PPIL1蛋白。這些結(jié)果證實PPIL1可在體內(nèi)直接或間接與SNW1 結(jié)合。
實施例18: PPILl與SNWl的共-定位
為了進(jìn)一步證實PPIL1與SNW1結(jié)合，通過使用抗-FLAG抗體對用 pFLAG-PPILl和pcDNA3.1myc-SNWl共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，檢 查經(jīng)FLAG標(biāo)記的PPIL1蛋白和經(jīng)myc-標(biāo)記的SNW1蛋白在COS7細(xì)胞中的亞 細(xì)胞定位。具體地說，用含有4。/。低聚曱醛的PBS將用pFLAG-PPILl和 pcDNA3.1myc/His-SNWl轉(zhuǎn)染的細(xì)胞固定15分鐘，然后于室溫下，用含有 0.1% Triton X-100的PBS透化細(xì)胞達(dá)2.5分鐘。隨后，于4。C用含有2。/。 BSA 的PBS覆蓋細(xì)胞24小時以阻斷非-特異性雜交。將l:1000稀釋的小鼠抗-myc 單克隆抗體(Sigma)或l:2000稀釋的小鼠抗-FLAG抗體(Sigma)用作第 一抗 體，在同與羅丹明-偶聯(lián)的抗-小鼠第二抗體(Leinco和ICN)保溫之后觀察反 應(yīng)。用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。在ECLIPSEE800顯微鏡下獲得熒光圖像。
用抗-FLAG抗體對細(xì)胞進(jìn)行的免疫組化染色顯示出細(xì)胞核中的信號， 用抗-myc抗體顯示出細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中類似的陽性染色。圖19a和b以及用 DAPI復(fù)染的圖19c的合并圖像顯示出經(jīng)FLAG標(biāo)記的PPIL1蛋白和經(jīng)myc標(biāo) 記的SNW1蛋白共同定位于細(xì)胞核中(圖19d)，這與PPIL1和SNW1之間存在 相互作用的看法一致。
實施例19:在人的多個組織中表達(dá)尸尸/L/
使用cDNA作為探針進(jìn)行多-組織Northem印跡分析。更具體地，使人多-組織印跡(Clontech， Palo Alto， CA)與經(jīng)3￥-標(biāo)記的戶尸/丄7 PCR產(chǎn)物雜 交。根據(jù)廠商的推薦進(jìn)行預(yù)-雜交、雜交和洗滌。于-80。C用增感屏對印跡 進(jìn)行放射自顯影24至72小時。
結(jié)果顯示出所表達(dá)的1.7kb轉(zhuǎn)錄物的遍在表達(dá)。在被檢查的組織中，在 心臟、骨骼肌、睪丸、曱狀腺和腎上腺中觀察到大量表達(dá)(圖20)。
實施例20:表達(dá)PPIL1 siRNA的質(zhì)粒的構(gòu)建及其對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的
作用
構(gòu)建表達(dá)多種PPILl-siRNA的質(zhì)粒以4企查其對P尸/丄/表達(dá)的作用。首 先，按照與實施例6類似的方法構(gòu)建psiHlBX3.0載體。另外，按實施例6所 述制備對照載體psiHlBX-EGFP。然后，通過將雙鏈寡核苷酸克隆至 psiHlBX3.0載體的SZwI位點以制備表達(dá)PPIL 1 -siRNA的質(zhì)粒?？寺≈凛d體 的寡核苷酸如下
psiHlBX-PPIL-A , 5 ， -TCCCGCATGCTCCAAAGACCTGTTTCAAGA GAACAGGTCTTTGG AGCATGC-3, [SEQ ID NO: 471和5,-AAAAGCATGC TCCAAAGACCTGTTCTCTTGAAACAGGTCTTTGGAGCATGC-3 ， [SEQ ID NO: 48]; psiHlBX-PPIL-B， 5，-TCCCAGA CTTCATGATCCAAGGATTCA AGAGATCCTTGGATCATGAAGTCT-3 ， [SEQ ID NO: 49]和5 ， -AAAA
，[SEQ ID NO: 50];和psiHlBX畫PPIL陽C, 5,-TCCCTGGCAGCCAGTTCTTT GTGTTCAAGAGACACAAAGAACTGGCTGCCA-3'『SEQ ID NO: 51]和5，-
CCA-3，[SEQ ID NO: 52]。每個序列中的下劃線部分是siRNA的靶序列。
根據(jù)廠商的推薦，使用FuGENE6試劑(Roche)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細(xì)胞 SNUC4或SNUC5中。轉(zhuǎn)染48小時之后，從細(xì)胞中提取總RNA。
其中，是psiHlBX-PPIL-A而不是psiHlBX-PPIL-B或psiHlBX-PPIL-C能 顯著抑制SNUC4以及SNUC5細(xì)胞中的尸戶/L/表達(dá)(圖Z1A)。為了檢測抑制 尸尸/丄7是否能導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞SNUC4和SNUC5的生長受抑制，用psiHlBX-PPIL-A 、 psiHlBX-PPIL-B 、 psiHlBX-PPIL-C或?qū)φ誴siHlBX-EGFP轉(zhuǎn)染細(xì) 胞。與用psiHlBX-PPIL-B、 psiHlBX-PPIL-C或psiHlBX-EGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 相比，用psiHlBX-PPIL-A轉(zhuǎn)染的存活細(xì)胞明顯減少，這表明戶戶/丄7表達(dá)的 降低能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(圖21B)。實施例21:制備重組PPIL1蛋白
為了產(chǎn)生抗PPIL1的特異性抗體，需制備重組PPIL1蛋白。使用一套引 物5，-CGCCGGATCCGCTATGGCGGCAATTCCCCCAG-3， [SEQ ID NO: 53] 和5,-AGCACTCGAGCCCAGAAGGGTATGCCTTAATGATC-3， [SEQ ID NO: 54]，通過RT-PCR擴增PPIL1的完整編碼區(qū)。純化產(chǎn)物，用5amHI和屈ol消 化，克隆至pGEX-6P-l(pGEX-PPILl)或pET21a(pET-PPILl)載體的適當(dāng)克隆 位點。將pGEX-PPILl或pET-PPILl轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10B或BL21密碼子正 細(xì)胞。通過加入IPTG誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)，根據(jù)廠商提供的方案從提取物中純 化重組蛋白質(zhì)。當(dāng)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細(xì)胞時，可在SDS-PAGE上觀察 到預(yù)期大小的重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生(圖22 A和B)。
實施例22:通過細(xì)菌雙-雜合篩選系統(tǒng)將驛蛋白鑒定為PPILl-相互作用
蛋白
為了分析PPIL1的功能，使用細(xì)菌雙-雜合篩選系統(tǒng)搜索PPILl-相互作 用蛋白。根據(jù)廠商提供的方案，使用BacterioMatch雙雜合系統(tǒng)(Stratagene) 進(jìn)行細(xì)菌雙-雜合試驗。將實施例21所得的戶尸7L7完整編碼序列克隆至pBT 載體的SamHI-XhoI位點以用作何，并篩選人胎腦cDNA文庫(Stratagene)。 在鑒定出的陽性克隆中，通過同時用pBT-PPILl和pTRG-STMN轉(zhuǎn)化細(xì)菌顯 示出驛蛋白與PPIL1的相互作用(圖23A)。
另外還進(jìn)行免疫沉淀試驗。具體地說，用按實施例17所述制備的表達(dá) 經(jīng)FLAG-標(biāo)記的PPIL1的pFLAG-PPIL 1,和表達(dá)經(jīng)HA-標(biāo)記的驛蛋白蛋白的 pCMV-HA-STMN或其組合轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞，并用含有150 mM NaCl, 1% NP-40, 10mM Tris-HCl pH8.0, lmM EDTA和lx完全蛋白酶抑 制劑混合物(Roche)的NET-N緩沖液裂解細(xì)胞。在典型的免疫沉淀反應(yīng)中， 于4。C,將300^g全細(xì)胞提取物與lpg小鼠抗〗1^0(810^^)或3^大鼠抗-HA抗體和2(y蛋白G Sepharose珠(Zymed)—起保溫l至2小時。用lml NET-N緩沖液將珠洗滌5次，通過在SDS樣品緩沖液中煮沸以洗脫與珠結(jié)合的蛋 白質(zhì)。通過SDS-PAGE分離沉淀的蛋白質(zhì)，并使用抗-HA抗體或抗-FLAG M2抗體進(jìn)行免疫印跡分析。
如上所述，通過COS7細(xì)胞中的免疫沉淀試驗證實了體內(nèi)經(jīng)FLAG-標(biāo)記 的PPIL1蛋白和經(jīng)HA-標(biāo)記的驛蛋白蛋白之間的結(jié)合(圖23B)。有趣的是， 使用抗-驛蛋白抗體的Western印跡分析顯示出兩條對應(yīng)于18-kDa和20-kDa蛋白質(zhì)的帶，這表明驛蛋白修飾形式的存在。由于已證實驛蛋白具有推定
的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點(Ser16, Ser25, Ser38和Ser63)，較大的帶可能對 應(yīng)于驛蛋白的磷酸化形式。另外，由于用抗-Flag抗體進(jìn)行免疫沉淀顯示出 對應(yīng)于20-kDa蛋白質(zhì)的單條帶，PPIL1可能與修飾形式結(jié)合，或通過與之 結(jié)合來增加驛蛋白的修飾。
實施例23:經(jīng)Flag-標(biāo)記的PPILl和經(jīng)HA-標(biāo)記的驛蛋白在細(xì)胞中的共-
定位
為了檢測PPILl和驛蛋白是否共-定位于細(xì)胞中，按實施例22所述，將
檢查其亞細(xì)胞定位(圖24)。用抗-FLAG抗體染色，結(jié)果表明經(jīng)Flag-標(biāo)記的 PPIL1定位于細(xì)胞核和胞質(zhì)中，而用抗-HA抗體染色的結(jié)果表明經(jīng)HA-標(biāo)記 的驛蛋白與PPILl共-定位于胞質(zhì)中。該數(shù)據(jù)支持PPIL1和驛蛋白在胞質(zhì)中相 互作用的觀點。
實施例24:用于與PPIL1相互作用的驛蛋白反應(yīng)區(qū)
另外，使用pCMV-HA-STMN的多種缺失突變體和野生型pFLAG-PPIL1,按照類似于實施例22的方式進(jìn)行免疫沉淀試-瞼以闡明用于相互作 用的反應(yīng)區(qū)。使用下述引物套，以全長克隆(pFLAG-PPILl)作為模板擴增 STMN的缺失突變體
缺失突變體1 ， 5 ， -ATTGGTACCATGGAGCTGATTCTCAGCCCTCGGTC-3 ， [SEQ ID NO: 55]和5,-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3， [SEQIDNO: 56];
缺失突變體2 ， 5 ，-ATTGGTACCATGGTTCCAGAATTCCCCCTTTCCCCT-3 ,[SEQ ID NO: 57]和5，-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3， [SEQ ID NO: 58];
缺失突變體3 ， 5，-ATTGGTACCATGGATCTTTCCCTGGAGGAAATTCAG-3,[SEQ ID NO: 59]和5，-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3 ，[SEQIDNO: 60];
缺失突變體4, 5 ，-ATTGGTACCATGGCTGAGGTCTTGAAGCAGCTGGC-3 ， [SEQ ID NO: 61]和5，-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3， [SEQIDNO: 62];和
缺失突變體5 , 5 ， -ATTGGTACCTTCACCATGGCTTCTTCTGATATCC-3 ，[SEQ ID NO: 63]和5,-AATCTCGAGGCGTCTTTCTTCTGCAGCTTC-3，[SEQ ID NO: 64]。將PCR產(chǎn)物克隆至pcDNA3.1myc/His的^^l和^zol位點。
缺失驛蛋白的氨基酸l-43的缺失突變體(Del3)能與PPILl結(jié)合，但缺失l 至65的突變體(Del 4)卻不能與PPIL1結(jié)合。同時，另一個含有氨基酸1至61 的突變體能夠結(jié)合PPIL1(圖25A和B)，這表明包含密碼子44至61的區(qū)域是 結(jié)合所必需的。
實施例25:驛蛋白的磷酸化及其與PPIL1的相互作用 由于抗-Flag抗體的免疫沉淀顯示出對應(yīng)于驛蛋白修飾形式的單條帶， 制備在推定的絲氨酸磷酸化位點表達(dá)其突變形式的質(zhì)粒以檢測其與PPIL1 的結(jié)合(圖26A)。具體地說，根據(jù)廠商的推薦，使用QuikChange定點誘變試 劑盒(Stratagene)和下述引物套制備突變體(用Ala取代Ser): S16A， 5，-CTGGAGAAGCGTGCCGCAGGCCAGGCTTTTG-3, [SEQ ID NO: 65〗和5，-CAAAAGCCTGGCCTGCGGCACGCTTCTCCAG-3， [SEQ ID NO: 66];
S25A, 5 ，匿GCTTTTGAGCTGATTCTCGCCCCTCGGTCAAAAGAATCTG-3 ， [SEQ ID NO: 67]和5,-CAGATTCTTTTGACCGAGGGGCGAGAATCAGCTC AAAAGC-3， [SEQ ID NO: 68];
S38A ， 5 , -CCAGAATTCCCCCTTGCCCCTCCAAAGAAGAAG-3 ， [SEQ ID NO: 69]和5 ， -CTTCTTCTTTGGAGGGGCAAGGGGGAATTCTGG-3 ， [SEQ ID NO: 70];
S63A, 5,-CAGAAGAAAGACGCAAGGCCCATGAAGCTGAGG-3， [SEQ ID NO: 71]和5,-CCTCAGCTTCATGGGCCTTGCGTCTTTCTTCTG-3， [SEQ ID NO: 72]。
用S16A或S63A突變體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的Western印跡檢測出非磷酸化和磷 酸化形式，而用S38A突變體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的Western印跡顯示出對應(yīng)于非磷 酸化形式的單條帶。因此，驛蛋白的絲氨酸38可能在細(xì)胞中被磷酸化。令 人奇怪的是，驛蛋白-S38A突變體能與PPlLl結(jié)合(圖26B)。因此，PPIL1與 驛蛋白的相互作用可增強位于驛蛋白密碼子44和61之間的PPILl-結(jié)合位點 附近的絲氨酸3 8的磷酸化。
實施例26:分離受APC調(diào)節(jié)的基因^PCDZ)7
結(jié)腸癌發(fā)生的早期與p-連環(huán)蛋白/Tcf途徑的調(diào)節(jié)受損有關(guān)。因此，在接下來的方案中搜索該途徑的下游基因。v4尸C的轉(zhuǎn)導(dǎo)能降低結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)
胞核中的p-連環(huán)蛋白水平，隨后便能抑制(3-連環(huán)蛋白/Tcf復(fù)合物的反式激活 活性(vanderHeydenetal.， J Cell Scil 11: 1741-9(1998))。因此，使用與實施 例1類似的微陣列方法比較SW480細(xì)胞的表達(dá)分布圖，其中大量(3-連環(huán)蛋白 積累于SW480細(xì)胞的核和胞質(zhì)中。
為了鑒定受p-連環(huán)蛋白/Tcf復(fù)合物調(diào)節(jié)的基因，以MOI^100用表達(dá)野 生型J戶C(Ad-APC)或ZflcZ(Ad-LacZ;對照基因)的腺病毒構(gòu)建體感染SW480 細(xì)胞(ATCC， Rockville， MD)，并在Leibovitz，s L-15中培養(yǎng)細(xì)胞。感染72小 時之后，從細(xì)胞中提取總RNA,根據(jù)Satoh等(Nat Genet 24: 245-50(2000))的 方法，使用純化自提取物的polyA RNA進(jìn)行基于T7的RNA擴增。分別用 Cy5-dCTP和Cy3-dCTP標(biāo)記得自含Ad-APC和Ad-LacZ的SW480細(xì)胞的擴增 RNA (aRNA),將等量的兩種經(jīng)標(biāo)記aRNA作為探針，用于在微陣列載玻片 上共-雜交。
比較23040個基因在用Ad-APC感染和用Ad-LacZ感染的SW480細(xì)胞中 的表達(dá)分布圖，從而鑒定出多個基因，所述基因的表達(dá)水平因^尸C的轉(zhuǎn)染 而被下調(diào)。在這些基因中，鑒定出對應(yīng)于NCBI(國立生物技術(shù)信息中 心)UniGene簇的EST Hs.20665、機構(gòu)內(nèi)部登錄號為B7323N的基因，與Ad-LacZ相比，所述基因?qū)d-APC作出的反應(yīng)是表達(dá)水平降低約4倍。
隨后，進(jìn)行半定量RT-PCR實驗以進(jìn)一步證實^PC表達(dá)的降低(圖27a)。 具體地說，根據(jù)廠商提供的方案，使用Qiagen Rneasy試劑盒(Qiagen)或 Trizol試劑(Life Technologies)提取總RNA 。使用聚dT12_18 S1物(Amersham Pharmacia Biotech)與Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies),將1 (M鼓克總 RNA等分試樣逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。將所得單鏈cDNA制品稀釋于2(y PCR緩沖 液(TaKaRa)中。然后使用下述引物，通過標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR實驗進(jìn)行PCR擴增 正向，5，-GGATCATCTATCGGTCAGACG-3，[SEQIDNO: 73];和反向，5， -TGGGTCACATCCTGCTGGATG-3，[SEQ ID NO: 74]。在下述條件下使用 GeneAmp PCR 9700系統(tǒng)(Perkin-Elmer, Foster City, CA)進(jìn)行擴增94。C變性 4分鐘；94。C30秒，56。C30秒和72。C45秒共30輪循環(huán)。
另外，也用腺病毒Ad-Axin處理細(xì)胞并檢查細(xì)胞中的B732:3N表達(dá)，其 中所述腺病毒表達(dá)也能下調(diào)p-連環(huán)蛋白/Tcf-4復(fù)合物活性的野生型^fflV7。 結(jié)果，也觀察到AfflV7的轉(zhuǎn)導(dǎo)能降低B7323N的表達(dá)(圖27a)。用B7323N的cDNA序列在公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性檢索，鑒定出IOO多 個EST和定位于染色體帶18pl 1.2的人基因組序列(GenBank登錄號NT— 019631)。為了測定B7323N的全長cDNA序列，如實施例2所述進(jìn)行5' RACE ，不同的是使用了 B7323N基因-特異性的引物(5 ，-GCTCGTCTGACCGATA GATGATCC-3，[SEQ ID NO: 75])，最終獲得cDNA 序列。從而測定其全長cDNA序列。所述cDNA由2607個核苦酸組成，其中 含有1542個核苷酸長的開放閱讀框，它編碼推定的514個氨基酸長的蛋白 質(zhì)，其預(yù)測分子量為58.8kD(GenBank登錄號AB104887)。推測的APCDD1 蛋白與解木聚糖熱桿菌的內(nèi)切-1 ，4-p-木聚糖酶具有31 %的同 一性。使用計 算機程序SMART(http:〃smart/embl-heidelberg/de/)和PSORT II Prediction (http:〃psort. nibb.ac.jp/form2.html)在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基元檢索，未鑒定出任何 已知的結(jié)構(gòu)域。因此，將該基因稱為」尸CDD/(被APC1下調(diào))。比較cDNA 序列與基因組序列即可測定爿PO)Z)/的基因組結(jié)構(gòu)，它由5個外顯子組成， 約覆蓋40-kb的基因組區(qū)域(數(shù)據(jù)未顯示)。測定的J戶CZ)D7核苷酸序列及其 推測的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO: 7和8。
最終，按實施例2所述對/lPCZ)Z)7進(jìn)行Northern印跡分析。Northern印 跡分析表明」PCDD7的2.6-kb轉(zhuǎn)錄物在心臟、胰腺、前列腺和卵巢中大量表 達(dá)，但很少在肺、肝臟、腎臟、脾、胸腺、結(jié)腸和外周白細(xì)胞中表達(dá)(圖 27b)。
實施例27:在結(jié)腸-癌組織中表i^4尸CDD7
由于p-連環(huán)蛋白的積累是結(jié)腸癌的常見特征，因此，按實施例26所 述，通過半定量RT-PCR檢查結(jié)腸癌和相應(yīng)非-癌組織中的爿PCDZ)7表達(dá)， 在被檢查的30個腫瘤的20個(67。/。)中檢測出增加的表達(dá)(圖27。。該結(jié)果與 APCDD7對(3-連環(huán)蛋白/Tcf轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的激活作出反應(yīng)而被上調(diào)的事實一致。
實施例28: ^PCDD7的啟動子活性被p-連環(huán)蛋白和野生型Tcf4的復(fù)合
物上調(diào)
為了檢測爿PCDD7的啟動子活性是否受f3-連環(huán)蛋白/Tcf4復(fù)合物的調(diào) 節(jié)，將含有兩個推定的Tcf/LEF結(jié)合基元(TBM1和2)的報道質(zhì)粒P1轉(zhuǎn)染至 HeLa細(xì)胞，所述結(jié)合基元具有/不具有激活形式的突變(3-連環(huán)蛋白和野生型 Tcf4(圖28a)。更具體地，通過比較人基因組序歹ll (GenBank登錄號為NT—019631.4)和爿尸CDD/ cDNA序列測定J尸CDZ)7的推定轉(zhuǎn)錄起始位點 (TIS)。通過PCR擴增^PCDD7 5，側(cè)翼區(qū)的3個片段(P1， P2和P3),將它們克 隆至pGL3-Basic載體(Promega)的適當(dāng)酶切位點。使用QuickChange 定點 誘變試劑盒(STRATAGENE)對含有一個或兩個推定的Tcf/LEF結(jié)合基元的 Pl和P2進(jìn)行定點誘變。使用一套引物5 ,-AAGGATCCGCGTGGACAATGGCTACTCAAG-3 ， [SEQ ID NO: 76]和5，-GGACTCGAGACAGGTCAGTATCAAACCAGGCCAG-3 ， [SEQ ID NO: 77]，以提取自HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞的RNA為模板，通過RT-PCR制備激活形 式的突變p-連環(huán)蛋白，隨后克隆至pcDNA3.1質(zhì)粒載體(Invitrogen)的適當(dāng)克 隆位點。分別使用引物套Tcffl: 5，-AAGAATTCTGCTGGTGGGTGAAAA AAAAATGC-3，[SEQ ID NO: 78]和TcfRl: 5，-CTACTCGAGTTCTAAAGAC TTGG TGACGAGCGAC-3，[SEQ ID NO: 79],以及TcfF3: 5，-AGGAATTCG TGCATCATGGTCCCACCACATCATAC-3，[SEQ ID NO: 80]和TcfRl，通過 RT-PCR擴增Tcf-4完整編碼區(qū)及其5 ，缺失區(qū)的人cDNA片段(wtTcf4, dnTcf4)。將產(chǎn)物克隆至pcDNA3.1質(zhì)粒載體。使用FuGENE6 (Boehringer Mannheim),將2(ag各種報道質(zhì)粒和1.5jag各種表達(dá)構(gòu)建體與0.5^g pRL-TK 質(zhì)粒(Promega)—起共轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞以使轉(zhuǎn)染效率歸一化。根據(jù)廠商的推 薦，使用雙重-螢光素酶報道試驗系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行報道試驗。
通過導(dǎo)入激活形式的p-連環(huán)蛋白和野生型Tcf4可顯著增強質(zhì)粒Pl的報 道活性(圖28b)。有趣的是，當(dāng)Pl與Tcf4的顯性失活形式共轉(zhuǎn)染時，可降低 增強的活性，這表明Tcf4能影p向爿尸CDi^的啟動子活性。
為了測定負(fù)責(zé)其啟動子活性的元件，我們進(jìn)一步比較了P1的每個缺失 突變體的啟動子活性。P1的活性分別顯著高于P2和P3的活性，僅含有 TBM2的P2的活性顯著高于P3的活性(圖28b)。這些數(shù)據(jù)暗示包含一971至-151的區(qū)域可與p-連環(huán)蛋白/Tcf4復(fù)合物結(jié)合，并且與^PCDZ)7啟動子活性有 關(guān)。由于該區(qū)域含有兩個可能的Tcf/LEF-結(jié)合基元，假定這些基元負(fù)責(zé)轉(zhuǎn) 錄激活。
為了研究該假說，構(gòu)建了報道質(zhì)粒P1M和P2M,其中將候選的 Tcf/LEF-結(jié)合基元變?yōu)椴荒芙Y(jié)合p-連環(huán)蛋白/Tcf4復(fù)合物的CTTTG^S[SEQ ID NO: 81]。使用這5個質(zhì)粒的報道試驗揭示出含有突變基元的P1M和P2M 片段激活JPCDD7轉(zhuǎn)錄的能力降低；而其螢光素酶活性等同于PZ或P3片段(圖28b)。這些結(jié)果暗示這兩個推定的Tcf/LEF-結(jié)合基元都參與^PO)Z^的 轉(zhuǎn)錄激活。
實施例29:電泳遷移率變動分析
為了測定p-連環(huán)蛋白/Tcf4復(fù)合物是否直接與TBMl和TBM2結(jié)合，使用
寡核苷酸進(jìn)行電泳遷移率變動分析(EMSA)。具體地說，按上文所述，使用 得自SW480細(xì)胞完整細(xì)胞核的提取物進(jìn)行EMSA(van der Heyden et al.， J Cell Sci 111: 1741-9(1998))。通過退火FF(5，-GCTTTGATTGTGGTGA-3，[SEQ ID NO: 82])和RR(5 ，-TCACCACAATCAAAGC-3 ， [SEQ ID NO: 83])(針對 APCDD1-TBM1而言)以及FF2(5 ， -CCCCTTTGAACACCTT-3 ， [SEQ ID NO: 84])和RR2(5，-AAGGTGTTCAAAGGGG-3，[SEQ ID NO: 85])(針對APCDD1-TBM2而言)，制備出兩個雙鏈16-核苷酸DNA探針。
通過加入抗-(3-連環(huán)蛋白抗體而不是P53抗體(對照)，觀察到對應(yīng)于(3-連 環(huán)蛋白/Tcf4與APCDD1-TBM1和APCDD1-TBM2的結(jié)合的帶的變動(圖 29)。正如所預(yù)期的，通過加入野生型未標(biāo)記的寡核苷酸而不是突變的未標(biāo) 記寡核苷酸可取消所述結(jié)合。
實施例30: ^PCDD7在體外對LoVo細(xì)胞生長的作用
為了披露yl戶CDI)7對結(jié)腸癌腫瘤發(fā)生的潛在作用，制備表達(dá)APCDD/ (pcDNA-APCDD1 )和y^CDD/互補鏈(pcDNA-antisense)的質(zhì)粒以在表達(dá)少量 爿PCDD/的LoVo細(xì)胞(ATCC, Rockville, MD)中進(jìn)行集落形成試驗。更具體 地，使用基因特異性引物套5，-GCGGAATTCAGGGCCCAGAGCAGGACTG -3，[SEQ ID NO: 86]和5,-TAGCTCGAGCTAAAACTTCTATCTGCGGATGT-3，[SEQIDNO: 87],通過RT-PCR擴增^PCDD7的完整編碼區(qū)。將PCR產(chǎn)物 克隆至pcDNA3.1 (Invitrogen)的適當(dāng)克隆位點。然后，用構(gòu)建的pcDNA-APCDDl或pcDNA-antisense轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞，在添加有適當(dāng)濃度的遺傳霉素 的HAM，s F-12中培養(yǎng)細(xì)胞10至21天。用100%曱醇固定細(xì)胞并用Giemsa溶 液染色。
結(jié)杲，與對照質(zhì)粒pcDNA-antisense或pcDNA相比，pcDNA-APCDD 1產(chǎn) 生了明顯更多的集落(圖30a)。通過三個獨立的實驗進(jìn)一步證實了該結(jié)果。 為了在體外證實它對細(xì)胞生長的作用，建立表達(dá)外源性^PCDD7的LoVo細(xì) 胞(LoVo-APCDDl細(xì)胞)以將它們的生長情況與被模擬載體轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞相比較(圖30b)。與對照LoVo-mock細(xì)胞相比，LoVo-APCDDl細(xì)胞以顯著 增加的速率生長(圖30c)。
實施例31:」PCDZ)7對棵鼠胂瘤生長的作用
為了研究APCDD1在體內(nèi)的作用，將2克隆LoVo-APCDDl細(xì)胞或2克隆 LoVo-mock細(xì)胞皮下移植至U只BALBcAnN Crj-nu/nu小鼠。具體地說,將 腫瘤細(xì)胞LoVo-APCDDl或LoVo-vector調(diào)節(jié)至終濃度為5X 107個細(xì)胞/ml，分 別將100jal細(xì)胞皮下注射至BALB/cAnN Crj-nu/nu小鼠的后背中間位置。每 過7天測量一次腫瘤大小，共持續(xù)8周，通過公式K二;/6x^x6估計肺瘤體 積，其中'W，是短軸，'A，，是長軸。
結(jié)果，移植8周后，LoVo-APCDDl克隆的腫瘤平均大小達(dá)到約482和 653mm3,而LoVo-mock達(dá)到65和277mm3;這表明在體內(nèi)導(dǎo)7vv4PCZ)Z)/能對 細(xì)胞生長起促進(jìn)作用(圖30d)。
實施例32:被指定用于降^^尸CDD7表達(dá)的反義S-寡核苷酸的生長-抑 制作用
為了評估jPCDZ)7的生長-促進(jìn)作用，合成多對與^pa)D/相對應(yīng)的對
照和反義S-寡核苷酸以將它們轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞，在被4企查的11個結(jié)腸癌 細(xì)胞系中，SW480細(xì)胞能表達(dá)大量^PCDZ)7。根據(jù)實施例5所述的方法進(jìn)行 實驗，不同的是使用SW480細(xì)胞替代SNU475細(xì)胞，接著使用下述S-寡核苷 酸對照有義S-寡核苷酸APCDD1-S2， 5，-ATGTCCTGGCCGCGCC-3，[SEQ ID NO: 88];反義S漏寡核苷酸APCDD1-AS2， 5，-GGCGCGGCCAGGACAT-3， [SEQ ID NO: 89]; 反向S-寡核苷酸APCDD1-R2， 5 ，-TACAGGACCGGCGCGG畫3 ， [SEQ ID NO: 90];和scrambled S-寡核苷酸 APCDD1-Sc2, 5，-ATCTGGTCCGGCGCGG-3，[SEQ ID NO: 91〗。
在寡核苷酸中，與對照APCDD1-S1相比，APCDD1-AS2能顯著抑制細(xì) 胞中的爿PCDD7表達(dá)(圖31a)。有趣的是，轉(zhuǎn)染6天后，與APCDD1-S2相 比，導(dǎo)入APCDD1-AS2能明顯抑制細(xì)胞灶的形成，暗示著抑制」戶CDD/能 降低轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長和/或存活(圖31b)。 MTT試驗進(jìn)一步證實與APCDDl-R2、 APCDD1-Sc2和未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，對APCDD1-AS2作出的反應(yīng)是 細(xì)胞存活降低(圖31c)。
實施例33:在結(jié)腸癌細(xì)胞系中表^4PCZ)ZX
為了測定APCDD1的表達(dá)和功能，按下述制備抗APCDD1多克隆抗體。首先，在大腸桿菌中產(chǎn)生重組的經(jīng)His-標(biāo)記的APCDDl蛋白，并根據(jù) 廠商的推薦，使用Pro BondTM組氨酸樹脂(Invitrogen)從細(xì)胞中純化所述 APCDD1。將重組蛋白質(zhì)用于免疫兔。從血清中純化抗APCDD1的多克隆 抗體。為了進(jìn)行Westem印跡分析，通過10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并用抗-APCDD1抗體進(jìn)行免疫印跡。將與HRP-偶聯(lián)的山羊抗-兔IgG(Santa Cruz Bio-technology)用作ECL^r測系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech)的第二抗 體。
按實施例18所述，使用抗-APCDDl抗體進(jìn)行SW480細(xì)胞和冷凍組織的 免疫組化染色。根據(jù)廠商推薦的方法，用SAB-PO過氧化物酶免疫染色系 統(tǒng)(Nichirei， Tokyo, Japan)對石蠟包埋的組織切片進(jìn)行染色。通過在微波爐 中，以700W的功率將置于檸檬酸緩沖液(pH6)中的載玻片預(yù)處理10分鐘， 從脫石蠟和重新水合的組織中挽救抗原。使用包括HCT116、 SNUC4和 SW480W的結(jié)腸癌細(xì)胞的提取物，用抗-APCDDl抗體進(jìn)行的Western印跡分 析顯示出對應(yīng)于APCDD1的58-kDa帶(圖32)。內(nèi)源性APCDD1蛋白的大小與 用抗-FLAG抗體檢測到的經(jīng)Flag-標(biāo)記的外源性APCDD1蛋白十分類似。在 上述3個結(jié)腸癌細(xì)胞系中，SW480細(xì)胞中的APCDD1表達(dá)最為豐富。
實施例34: APCDD1在結(jié)腸癌細(xì)胞和組織中的亞細(xì)胞定位
為了研究其亞細(xì)胞定位，使用SW480細(xì)胞進(jìn)行APCDD1的熒光免疫組 化染色。固定細(xì)胞，用抗-APCDDl染色，并用與熒光素偶聯(lián)的第二抗體進(jìn) 行觀察。在細(xì)胞與細(xì)胞接觸的邊界和細(xì)胞質(zhì)中觀察到信號(圖33)。
還研究了非-癌結(jié)腸粘膜和癌組織中的APCDDl表達(dá)，在非-癌細(xì)胞和 癌細(xì)胞的胞質(zhì)中觀察到染色(圖34)。值得注意的是在上皮細(xì)胞的頂板(apical boarder)處觀察到強信號。
實施例35: APCDD1在結(jié)腸的正常上皮、腺癌和腺瘤中的表達(dá)
為了比較非-癌上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的APCDDl蛋白表達(dá)水平，對 石蠟包埋的組織進(jìn)行免疫組化染色。與非癌上皮細(xì)胞相比，癌細(xì)胞能被抗-APCDD1抗體更強地染色(圖35)。另外，還在腺瘤細(xì)胞中觀察到微弱的信 號(圖36)。
工業(yè)實用性
與非癌肝組織相比，新的人基因『/^尸^///和^2尸尸^///在肝細(xì)胞癌中 的表達(dá)顯著提高。另一方面，與非癌組織相比，新的人基因尸尸/丄7和」尸CDD7在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著提高。因此，這些基因可用作癌癥的
診斷標(biāo)記，由它們編碼的蛋白質(zhì)可用于診斷試驗。
本發(fā)明人還證實新蛋白質(zhì)WDRPUH， KRZFPUH， PPIL1或APCDD1的表 達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞生長，而通過與『D^PC///， ^Z/^PC///,尸尸/"或爿尸CDZ)i基因 相對應(yīng)的反義寡核苷酸或siRNA可抑制細(xì)胞生長。這些發(fā)現(xiàn)暗示W(wǎng)DRPUH， KRZFPUH, PPIL1或APCDD1蛋白刺激致癌活性。因此，這種新的癌癥蛋白 質(zhì)是對開發(fā)抗癌藥物有用的把。例如，能阻斷WDRPUH， KRZFPUH， PPIL1 或APCDDl表達(dá)或抑制其活性的藥劑具有作為抗-癌藥劑，特別是治療HCC 和結(jié)腸癌的抗-癌藥劑的治療用途。所述藥劑的例子包括反義寡核苷酸、 siRNA和能識別WDRPUH, KRZFPUH， PPIL1或APCDD1的抗體。
另外，本發(fā)明人還證實了PPIL1能直接與驛蛋白結(jié)合，該結(jié)果暗示 PPIL1能在體內(nèi)增強驛蛋白的磷酸化。據(jù)報道驛蛋白與細(xì)胞周期進(jìn)程有關(guān) 并與多種類型的癌癥相關(guān)聯(lián)，因此，能抑制復(fù)合物活性的藥劑也能用于治 療和預(yù)防結(jié)腸癌。
另外，本發(fā)明已闡明(3-連環(huán)蛋白/Tcf-4復(fù)合物與^PCZ)"/的兩個 Tcf/LEF結(jié)合基元的結(jié)合與APCZ)D7的轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)。因此，能抑制復(fù)合物 與結(jié)合基元結(jié)合的藥劑也能用于治療和預(yù)防結(jié)腸癌。
盡管根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案詳細(xì)描述了本發(fā)明，但本發(fā)明的多種 變化和修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，并不背離本發(fā)明的精 神和范圍。序列表
<110〉 腫瘤療法科學(xué)股份有限公司(ONCOT服RAPY SCIENCE, INC.)
<120> 與肝細(xì)胞癌或結(jié)直腸癌相關(guān)的基因和多肽
<130> ONC-A0203P
<150> US 60/386,985 <151> 2002-06-06
<160> 111
<170〉 Patentln version 3.1
<210> 1
<211〉 2152
<212> DNA
<213〉 人(Homo sapiens) <220>
<221〉 CDS
<222> (35). (1897)
<223>
<400> 1
agcgggagag caaagtaatc agaacctccc aagg atg gat aac aaa att tcg ccg 55
Met Asp Asn Lys lie Ser Pro 1 5
gag gcc caa gtg gcg gag ctg gaa ctt gac gcc gtg ate ggc ttc aat 103 Glu Ala Gin Val Ala Glu Leu Glu Leu Asp Ala Val lie Gly Phe Asn 10 15 20
gga cat gtg ccc act ggt etc aaa tgc cat cct gac cag gag cat atg 151 Gly His Val Pro Thr Gly Leu Lys Cys His Pro Asp Gin Glu His Met 25 30 35
att tat cct ctt ggt tgc aca gtc etc att cag gca ata aat act aaa 199 lie Tyr Pro Leu Gly Cys Thr Val Leu lie Gin Ala lie Asn Thr Lys 40 45 50 55
gag cag aac ttc eta cag ggt cat ggc aac aac gtc tec tgc ttg gcc 247 Glu Gin Asn Phe Leu Gin Gly His Gly Asn Asn Val Ser Cys Leu Ala 60 65 70
ate tec agg tct gga gag Uc ate gcc tec gga caa gtc aca ttc atg 295 lie Ser Arg Ser Gly Glu Tyr lie Ala Ser Gly Gin Val Thr Phe Met 75 80 85
ggg ttc aag gca gac ate att Ug tgg gat Ut aag aac aga gag ctg 343 Gly Phe Lys Ala Asp lie lie Leu Trp Asp Tyr Lys Asn Arg Glu Leu 90 95 100
ctt get egg ctg tec ctt cac aaa ggc aaa att gaa get ctg gcc ttt 391 Leu Ala Arg Leu Ser Leu His Lys Gly Lys lie Glu Ala Leu Ala Phe 105 110 115
tct cca aat gat ttg Uc Ug gta tea eta gga ggc cca gat gac gga 439 Ser Pro Asn Asp Leu Tyr Leu Val Ser Leu Gly Gly Pro Asp Asp Gly 120 125 130 135
agt gtg gtg gtg tgg age aU gcc aag aga gat gcc ate tgt ggc age 487 Ser Val Val Val Trp Ser lie Ala Lys Arg Asp Ala lie Cys Gly Ser 140 1" 150
cct gca gcc ggc etc aat gU ggc aat gcc acc aat gtg ate ttc tec 535 Pro Ala Ala Gly Leu Asn Val Gly Asn Ala Thr Asn Val lie Phe Ser 155 160 165
agg tgc egg gat gag atg ttt atg act get gga aat ggg aca att cga 583 Arg Cys Arg Asp Glu Met Phe Met Thr Ala Gly Asn Gly Thr lie Arg170 175 180
gta tgg gaa Ug gat ctt cca aat aga aaa ate tgg cca act gag tgc 631
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185 190 195
caa aca gga cag ttg aaa aga ata gtc atg agt att gga gtg gat gat 679
Gin Thr Gly Gin Leu Lys Arg lie Val Met Ser lie Gly Val Asp Asp
200 205 210 215
gat gat age ttt ttc tac ctt ggc acc acg act gga gat att eta aaa 727
Asp Asp Ser Phe Phe Tyr Leu Gly Thr Thr Thr Gly Asp lie Leu Lys
220 225 230
atg aac ccc agg act aaa ctg ctg aca gat gtt ggg cct gcg aag gac 775
Met Asn Pro Arg Thr Lys Leu Leu Thr Asp Val Gly Pro Ala Lys Asp
235 240 245
aaa ttc agt Ug gga gtg tea get ate agg tgc ctg aag atg ggg ggt 823
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ttg ttg gtg ggc tct gga gcc gga ctg ctg gtc Uc tgt aaa age cct 871
Leu Leu Val Gly Ser Gly Ala Gly Leu Leu Val Phe Cys Lys Ser Pro
265 270 275
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Gly Tyr Lys Pro lie Lys !>ys lie Gin Leu Gin Gly Gly lie Thr Ser
280 285 290 295
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lie Thr Leu Arg Gly Glu Gly His Gin Phe Leu Val Gly Thr Glu Glu
300 305 310
teg cac att Ut cgt gtc age Uc acg gat ttc aaa gag acg etc ata 1015
Ser His lie Tyr Arg Val Ser Phe Thr Asp Phe Lys Glu Thr Leu lie
315 320 325
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Ala Thr Cys His Phe Asp Ala Val Glu Asp lie Val Phe Pro Phe Gly 330 335 340
act get gag eta ttt gca acc tgt gcc aag aag gat ate agg gtg tgg 1111
Thr Ala Glu Leu Phe Ala Thr Cys Ala Lys Lys Asp lie Arg Val Trp
345 350 355
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360 365 370 375
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380 385 390
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395 400 405
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Leu Met Tyr Val lie Asn Asn Ala His Arg lie Gly Val Thr Ala lie 410 415 420
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Ala Thr Thr Ser Asp Cys Lys Arg Val lie Ser Gly Gly Gly Glu Gly
425 430 435
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Glu Val Arg Val Trp Gin lie Gly Cys Gin Thr Gin Lys Leu Glu Glu
440 445 450 455
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Ala Leu Lys Glu His Lys Ser Ser Val Ser Cys lie Arg Val Lys Arg
79460465470
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agaactUta ;acattttgaa UaattcttagttgttggU2152
<210〉 <211> <212> : <213> .2 620 PRT 人(Homo :sapiens)
<400> Met Asp 12 AsnLyslieSerProGluAlaGin 10ValAlaGluLeu Glu 15Leu
Asp AlaVallie 20GlyPheAsnGlyHis 25ValProThrGly Leu Lys 30Cys
His ProAsp 35GinGluHisMetlie 40TyrProLeuGlyCys 45Thr ValLeu
J]e Gin 50AlalieAsnThrLys 55GluGinAsnPheLeu 60Gin Gly HisGly
Asn Asn 65ValSerCysLeu 70AlalieSerArgSer 75GlyGlu Tyr lieAla 80<formula>formula see original document page 81</formula>Ser Cys lie Arg Val Lys Arg Asn Asn Glu Glu Cys Val Thr Ala Ser
465 470 475 480
Thr Asp Gly Thr Cys lie lie Trp Asp Leu Val Arg Leu Arg Arg Asn
485 490 495
Gin Met lie Leu Ala Asn Thr Leu Phe Gin Cys Val Cys Tyr His Pro
500 505 510
Glu Glu Phe Gin lie lie Thr Ser Gly Thr Asp Arg I>ys lie Ala Tyr 515 520 525
Trp Glu Val Phe Asp Gly Thr Val lie Arg Glu Leu Glu Gly Ser Leu
530 535 540
Ser Gly Ser lie Asn Gly Met Asp lie Thr Gin Glu Gly Val His Phe
545 550 555 560
Val Thr Gly Gly Glu Val
Gly Asn 565
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Leu Val
Val
Gly 585
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Gin 600
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<210> 3
<211> 2744
<212> DNA
<213〉 人(Homo sapiens)
<220>
<221> CDS
<222>(343). . (1845)
<223>
<400> 3
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Gly Leu 丁hr Val Gin Arg Lys Ser Arg Thr Arg Lys Lys Asn Gly Glu
105 110 115
aag gaa gU Uc ccg cct aag gag gca ccc cga aag ggg aag cga ggc 738
Lys Glu Val Phe Pro Pro Lys Glu Ala Pro Arg Lys Gly Lys Arg Gly 120 125 130
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Arg Arg Pro Ser Lys Pro Arg lxu lie Pro Arg Gin Thr Ser Gly Gly 135 140 145
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Pro lie Cys Pro Asp Cys Gly Cys Thr Phe Pro Asp His Gin Ala Leu 150 155 160
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Glu Ser His Lys Cys Ala Gin Asn Leu Lys Lys Pro Tyr Pro Cys Pro 165 170 175 180
gac tgt ggg cgc cgc ttt tec Ut cca tec ctg ctg gtc agt cac egg 930
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185 190 195
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Arg Phe Ser Gin Arg Lys Asn Leu Ser Gin His Gin Val lie His Thr 215 220 225
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Ser Arg Ser Leu Ala Asn His Arg Thr Thr His Thr Gly Glu Lys Pro 245 250 255 260
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265 270 275
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gag tgc aac cgc cgc ttc cgc cag cgc acg gcc etc gtc ate cac cag 1266
Glu Cys Asn Arg Arg Phe Arg Gin Arg Thr Ala Leu VaL lie His Gin 295 300 305
cgc ate cac acg ggc gag aag ccc tac ccg tgc ccg gac tgc gag egg 1314
Arg lie His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Pro Cys Pro Asp Cys Glu Arg 310 315 320
cgc ttc tec tec tec tct cgc ctg gtc agt cac egg cgt gtg cac tct 1362
Arg Phe Ser Ser Ser Ser Arg Leu Val Ser His Arg Arg Val His Ser 325 330 335 340
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345 350 355cgc age acg ctg etc cag cac cag etc Ug cac acc gga gag aag ccc 1458 Arg Ser Thr Leu Leu Gin His Gin Leu Leu His Thr Gly Glu Lys Pro 360 365 370
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gac tgt ggt cgc cgc tU gcc Uc ccc tea ctg ctg gcc age cac egg 1602 Asp Cys Gly Arg Arg Phe Aia Tyr Pro Ser Leu I>eu Ala Ser His Arg 405 410 415 420
cgc gtg cac teg ggc gag egg ccc Ut gcc tgc gac ctt tgc tec aag 1650 Arg Vai His Ser Gly Glu Arg Pro Tyr Ala Cys Asp Leu Cys Ser Lys 425 430 435
cgt Ut get cag tgg age cac ctg gcc cag cac cag ctg ctg cac acg 1698 Arg Phe Ala Gin Trp Ser His Leu Ala Gin His Gin Leu Leu His Thr 440 445 450
ggg gag aag cct ttc ccc tgc etc gag tgt ggc egg tgc Uc cgc cag 1746 Gly Glu Lys Pro Phe Pro Cys Leu Glu Cys Gly Arg Cys Phe Arg Gin 455 460 465
agg tgg tct ctg get gtc cac aag tgt age ccc aag gcc aac tgt 1794 Arg Trp Ser Leu Ala Val His Lys Cys Ser Pro Lys Ala Pro Asn Cys 470 475 480
age cct aga Ser Pro Arg 485tct get ate ggg ggc ' Ser Ala lie Gly Gly〗 490[cc agt cag Ser Ser Gin 495agg ggc aac Arg Gly Asngcc cat .Ala His 5001842
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gagccccaggtcaUcagggcagagtcagaactaaacccgggtctcctgc1955
tgeacagagetg^ctUgtatcttgcaatgcgctggctgcctccctgtgcgtgtctgga2015
acagtcccattaggagaggtgaegtcatttgettaaagttt tccaagcUcccUtccta2075
aaaUgt UgtgtggatatcagggcUaaagttctccccatcUttttaggggctgtctg2135
ctutctagtctg tccacacagggat Ucctgtcatcttgcatgeaateaggagaatctc2195
"aggggcaggacct tccccUctctgcctcttcctccatacUggttggaaaaatctgg2255
11 tagcccac111 Ugcaacactcctgccaagtggtcttctacccattgc2315
ctcttgacagggagctcactacctcacaaggcaggtcatttc"tgtggg2375
ggtUagUccacattctcctcUaacct tgccUcgacatgtttaatact tcatcUca2435
tagcagcccttcagaUatcacaaccact ttgcccccaagUUcaggUaagUgcatg2495
aatttggtcat tcct Uaag織gggt ttcaat t tccacacatgatctctgcaaacaggc2555
actgggttttcagtgtccttUtgaagggtcatataaaaataaggtaacaccacagtgcc2615
acUcacct tctggggctggacttgUtcagcagctttggUgcactgaatttgggggag2675
ctgcatgguccaggggtttattgggttgcagatatataaatgccctaaacttaaaaaaa2735
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Asp Gly Leu Lys Glu
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Thr
Val
Pro 135
Cys
His
Gly
His
Ser 215
Lys
Ser
Cys
His
Asn 295
His Ser
Leu Pro Arg
Pro 40
Asp
Gly
Trp
Val
Phe 120
Ser Pro Lys Arg
Ser 200
Gin
Arg 25
Glu Val Pro Glu
Pro
Leu
Pro
Gin 280
Arg Thr Ser
Gin 105
Pro
Lys
Asp
Cys
Arg 185
Gly
Arg
Tyr
Ala
Ser 265
Arg Arg Gly Ser
Arg Pro
Tyr 345
Thr Leu Leu 360
Ala 10
Pro
Glu
Met
Lys
Pro 90
Arg
Pro
Pro
Cys
Ala 170
Phe
Glu
Lys
His
Asn 250
Cys
Thr
Phe
Glu
Ser 330
Ala Gin
Gin
Arg
Trp
Arg
Pro 75
Ala Lys Lys Arg
Gly 155
Gin
Ser Cys Asn
Cys 235
His
Gly
His
Arg
Lys 315
Arg Cys His
Gly
Ala
Gly
Glu 60
Ala Ala Ser Glu
Pro
Leu
Cys 45
Thr Leu Leu Arg
Ala 125
Leu 140
Tyr
Pro
Leu 220
Pro
Arg
Arg
Thr
Gin 300
Pro Leu Glu Gin
Gly
Lys 30
I>eu
Tyr
lie
Asp
Thr 110
Pro Pro
lie Cys Thr Phe Asn Leu Lys Pro
Tyr 205
Ser
Asp
Thr
Arg
Gly 285
Arg Tyr Val His
Leu 365
Ser 190
Val
Gin
Cys
Thr
Phe 270
Glu Thr Pro Ser
Cys 350
Leu
Lys 15
Phe
Gly
Ser
Pro 95
Arg Arg Arg Pro
Lys 175
Leu
Cys
His
Gly
His 255
Ala Lys Ala Cys
His
335
Glu His
Ala Val Pro His
Trp 80
Gin
Lys
Lys
Gin
Asp 160
Pro Leu Asp Gin
Arg 240
Thr
Tyr
Pro
Leu
Pro 320
Arg Ala ThrGly GLu 370
Ser Gly 385
His Ala Ala Ser Leu Cys
Lys Ser Cys His
Pro Tyr Pro
Leu Leu 450
Cvs Phe 465
Leu Asp
420
Ser 435
Lys His Thr Arg Gin
Ala Pro Asn Cys
Tyr
Ala
Asp 405
Arg Arg Gly Arg
Ser 485
lie 390
Cys Val Phe Glu
Trp 470
Pro
Cys Pro Asp Cys 375
His Arg Ser Thr
Gly Arg Arg Phe 410
His Ser Gly Glu 425
Ala Gin Trp Ser 440
Lys Pro Phe Pro 455
Ser Leu Ala Val
Arg Ser Ala lie 490
GLy Arg 380
His Thr 395
AU Tyr Arg Pro His Leu
Ala Glu Pro Tyr
Ala 445
Cys Leu 460
His Lys 475
Glu Cys Gly Gly Ser
Phe
Glu
Ser
Ala 430
Gin
Cys Ser Ser
Arg
Lys
Leu 415
Cys His Gly Pro
Gin 495
Arg
Leu 400
Leu Asp Gin Arg
Lys 480
Arg
Gly Asn Ala
His 500
<210> 5
<211> 1706
<212> 畫
<213> 人(Homo sapiens) <220>
<221> CDS
<2 2 2> (205). . (705)
<223〉
<憎〉5
tgttcttgag cccagcttct tctcgtctcc caccccagct tcccggcatt ggaagaaggg 60
accgtcctct tccttgtctt ggccacccaa atcctggtat cgaaagggtt gaacggaccg 120
gaagtgtgca geagegaegg gtccccagct aatcgacgcc ggaagtagca attactagac 180
aagcattccg ccgccggctt cgct atg gcg gca att ccc cca gat tec tgg 231
Met Ala Ala lie Pro Pro Asp Ser Trp 1 5
cag cca ccc aac gtt tac ttg gag acc age atg gga ate a" gtg ctg 279 Gin Pro Pro Asn Val Tyr Leu Glu Thr Ser Met Gly lie lie Val Leu 10 15 20 25
gag ctg tac tgg aag cat get cca aag acc tgt aag Glu Leu 丁yr Trp Lys His Ala Pro Lys Thr Cys Lys 30 35
aac "t get gag Asn Phe Ala Glu 40
327
Ug get cgt cga ggt tac tac aat ggc aca aaa Uc cac aga att ate 375 Leu Ala Arg Arg Gly Tyr Tyr Asn Gly Thr Lys Phe His Arg lie lie 45 50 55
aaa gac ttc atg ate caa gga ggt gac cca aca ggg aca ggt cga ggt 423
Lys Asp Phe Met lie Gin Gly Gly Asp Pro Thr Gly Thr Gly Arg Gly
60 65 70
ggt gca tct. ate tat ggc aaa cag ttt gaa gat gaa ctt cat cca gac 471
Gly Ala Ser lie Tyr Gly Lys Gin Phe Glu Asp Glu Leu His Pro Asp
75 80 85
ttg aaa "c acg ggg get gga att etc gca atg gec aat gcg ggg "a 519
Leu Lys Phe Thr Gly Ala Gly He Leu Ala Met Ala Asn Ala Gly Pro
90 95 100 105gat acc aat ggc age cag ttc ttt gtg acc etc gcc ccc acc cag tgg 567
Asp Thr Asn Gly Ser Gin Phe Phe Val Thr Leu Ala Pro Thr Gin Trp '
110 115 120
ctt gac ggc aaa cac acc att ttt ggc cga gtg tgt cag ggc ata gga 615
Leu Asp Gly Lys His Thr lie Phe Gly Arg Val Cys Gin Gly Ie Gly
125 130 135
atg gtg aat cgc gtg gga atg gta gaa aca aac tec cag gac cgc cct 663
Met Val Asn Arg Val Gly Met Val Glu Thr Asn Ser Gin Asp Arg Pro
140 145 150
gtg gac gac gtg aag ate "t aag Val Asp Asp Val Lys lie lie l>ys 155 160gca Uc cct Ala Tyr Protct ggg Ug Ser Gly 165705
act tgetacectcttgagcagctcttctgagatggccccagtgaaccagcUctagatga765
tagaatgacatgUatgctaa311 teattttggctUgcaagtcatgaagctuggag825
gcctggcatcttgggtgagtUgagatggaaataggatgeUcttUctc885
t tcccccagtgccUggttgccagagcatttgcacaaatgCCCCtgttUtcaaUggtg945
actact tactacacatgaaccaUatgctgcttcttgtgcatgtctgctctgaUUcgt1005
cgaacaa tgtagcagccactgtcatttctcagtggttttgcctaacc^iaact tct tccU1065
UUctggccUcacagcagtccttgatggctgacagccacagaattcca1125
aaccaagtagtgtctgtcagccctct taactctgtgcacgccctat t teagtct uuca1185
tUgUcttcUgggaatgtatgeatctetataUUtt ttccctctcaaaaccagaaca1245
tcaacagtgctgtttctgacacttcagacatcccacgcaaagccac汪Ugaat 11 Ugcc1305
aaa tgaa_aa_acacatccaacaatcaagtttcUagaaggtgtcaagtggggaataaUat1365
aatcaagaaaUagUUttaaaeiggaagcagaagcattgaccatttttt1425
cccagagaagaggagaaatctgUgtgagcaaaggacagaccatgaatcctccttgagaa1485
gtagUctctcagaaaggagaagcgccactc汪agttctttUacccaagact tUgagaa1545
a ttaggtccaagattt tutatgttcagttgtUatgUtaaaaataaxtUctggatU1605
tgtggggaggagcaggagaggaaggaagttaaUcctatgtaaUca Ugaaact tccac1665
taaaa tgccattgatggttgaaasaaaaaaaaaaaaaaa1706
<210> 6
<211> 166
<212〉 PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 6
Met Ala Ala lie Pro Pro Asp Ser Trp Gin Pro Pro 1 5 10
Glu Thr Ser Met Gly lie lie Val Leu Glu Leu Tyr 20 25
Pro Lys Thr Cys Lys Asn Phe Ala Glu Leu Ala Arg 35 40
Asn Gly Thr Lys Phe His Arg lie lie Lys Asp Phe 50 55 60
Gly Asp Pro Thr Gly Thr Gly Arg Gly Gly Ala Ser
Asn Val Tyr Leu 15
Trp Lys His Ala 30
Arg Gly Tyr Tyr 45
Met lie Gin Gly lie Tyr Gly Lys
8765 70 75 80
Gin Phe Glu Asp Glu Leu His Pro Asp Leu Lys Phe Thr Gly Ala Gly 85 90 95
lie Leu Ala Met Ala Asn Ala Gly Pro Asp Thr Asn Gly Ser Gn Phe 100 105 110
Phe Val Thr Leu Ala Pro Thr Gin Trp Leu Asp Gly Lys IUs Thr lie 115 120 125
Phe GLy Arg Val Cys Gin Gly lie Gly Met Val Asn Arg Val Gly Met 130 135 140
Val Glu Thr Asn Ser Gin Asp Arg Pro VaL Asp Asp Val Lys lie lie 145 1 50 1 55 160
Lvs Ala Tyr Pro Ser Gly . 165
<210> 7
<211〉 2607
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens) <220>
<221> CDS
<222〉 (354).. (1898)
<223>
<400〉 7gagacgctgcagctgcggtggcggtggcggccactgcagctcagagcggc60
gcacgcggcggccggggcgggacgcggggccgggcgcggagaagtcggggcgggcggcag120
agaggccgggacgcggaccgggccggggcgcccacagccgcccgscggcgcccagagagc180
gcgcgccccgcagccccgcgCCt3gCCCgCcgggcatggggcgcgcggcagccgcctgaa240
gccccggcctggcccggccgcacccggccggaggggagggcagagcgcgcgcccagttgc300
ccgggcaccacggcgtgcgggagggcccagagcaggactggaa atg356
Met 1
tec tgg ccg cgc cgc etc ctg "c aga Uc ctg ttc ccg gcc etc ctg 404
Ser Trp Pro Arg Arg Leu Leu Leu Arg Tyr Leu Phe Pro AU Leu Leu
5 10 15
ctt cac ggg ctg gga gag ggt tct gcc etc ctt cat cca gac age agg 452
Leu His Gly Leu Gly Glu Gly Ser Ala Leu Leu His Pro Asp Ser Arg 20 25 30
tct cat cct agg tec tu gag aaa agt gcc tgg agg get ttt aag gag 500
Ser His Pro Arg Ser Leu Glu Lys Ser Ala Trp Arg Ala Phe Lys Glu 35 40 45
tea cag tgc cat cac atg etc aaa cat etc cac aat ggt gca agg ate 548
Ser GLn Cys His His Met Leu Lys His Leu His Asn Gly Aia Arg Ite 50 55 60 65
aca gl:g cag atg cc;a cct aca ate gag ggc cac tgg gtc tec aca ggc 596
Thr Val Gin Met Pro Pro Thr lie Glu Gly His Trp Val Ser Thr Gly
70 75 80
tgt gaa gta agg tea ggc cca gag ttc ate aca agg tec tac aga ttc 644
Cvs Giu Val Arg Ser Gly Pro GJu Phe lie Thr Arg Ser Tyr Arg Phe
90 95
tac cac aat aac acc ttc aag gcc tac caa ttt tat tat ggc age aac 692
Tyr His Asn Asn Thr Phe Lys Ala Tyr GLn Phe Tyr Tyr Gly Ser Asn100 105 110
egg tgc aca aat ccc act Ut act etc ate ate egg ggc aag ate cgc 740
Arg Cys Thr Asn Pro Thr Tyr Thr Leu lie lie Arg Gly Lys lie Arg 115 120 125
etc cgc cag gcc tec tgg ate ate cga ggg ggc acg gaa gcc gac tac 788
Leu Arg Gin Ala Ser T卬lie lie Arg Gly Gly Thr Glu Ala Asp Tyr
130 135 140 145
cag ctg cac aac gtc cag gtg ate tgc cac aca gag gcg gtg gcc gag 836
GLn Leu His Asn Val Gin Val lie Cys His Thr Glu Ala Val AU Glu
150 155 160
aag etc ggc cag cag gtg aac cgc aca tgc ccg ggc Uc etc gca gac 884
Lys Leu Gly Gin Gin Val Asn Arg Thr Cys Pro Gly Phe Leu Ala Asp
165 170 175
ggg ggt ccc tgg gtg cag gac gtg gcc tat gac etc tgg cga gag gag 932
Gly Gly Pro Trp Val Gin Asp Val Ala Tyr Asp Leu Trp Arg Glu Glu
180 185 190
aac ggc tgt gag tgc acc aag gcc gtg aac ttt gcc atg cat gaa ctt 980
Asn Gly Cys Glu Cys Thr Lys Ala Vai Asn Phe Ala Met His Glu Leu 195 200 205
cag etc ate egg gtg gag aag cag tac ctt cac cac aac etc gac cac 1028
Gin Leu lie Arg Val Glu Lys Gin Tyr Leu His His Asn Leu Asp His
210 215 220 225
ctg gtc gag gag etc ttc ctt ggt gac att cac act gat gcc acc cag 1076
Leu Val Glu Glu Leu Phe Leu Gly Asp lie His Thr Asp Ala Thr Gin
230 235 240
agg atg ttc tac egg ccc tec agt tac cag ccc cct ctg cag aat gcc 1124
Arg Met Phe Tyr Arg Pro Ser Ser Tyr Gin Pro Pro Leu Gin Asn Ala
245 250 255
aag aac cac gac cat gcc tgc ate gcc tgt egg ate ate Ut egg tea 1172
Lys Asn His Asp His Ala Cys lie Ala Cys Arg lie lie Tyr Arg Ser
260 265 270
gac gag cac cac cct ccc ate ctg ccc cca aag gca gac ctg acc ate 1220
Asp Glu IHs His Pro Pro lie Leu Pro Pro Lys Ala Asp Leu Thr lie 275 280 285
ggc ctg c汪c ggg gag tgg gtg age cag cgc tgt gag gtg cgc ccc gaa 1268
Cly Leu His Gly Glu Trp Val Ser Gin Arg Cys Glu Val Arg Pro Glu
290 295 300 305
gtc etc ttc etc acc cgc cac ttc ate ttc cat gac aac aac aac acc 1316
Val Leu Phe Leu Thr Arg His Phe lie Phe His Asp Asn Asn Asn Thr
310 315 320
tgg gag ggc cac tac Uc cac tac tea gac ccg gtg tgc aag cac ccc 1364
Trp Glu Gly His Tyr Tyr His Tyr Ser Asp Pro Val Cys Lys His Pro
325 330 335
acc Uc tec ate tac gcc egg ggc cgc Uc age cgc ggc gtc etc teg 1412
Thr Phe Ser lie Tyr Ala Arg Gly Arg Tyr Ser Arg Gly Val Leu Ser
340 345 350
tec agg gtc atg gga ggc acc gag Uc gtg ttc aaa gtg aat cac atg 1460
Ser Arg Val Met Gly Gly Thr Glu Phe Val Phe Lys Val Asn His Met 355 360 365
aag gtc acc ccc atg gat gcg gcc aca gcc tea ctg etc aac gtc ttc 1508
Lys Val Thr Pro Met Asp Ala Ala Thr Ala Ser Leu Uu Asn Val Phe
370 375 380 385
aac ggg aat gag tgc ggg gcc gag ggc tec tgg cag gtg ggc ate cag 1556
Asn Gly Asn Glu Cys Gly Ala Glu Gly Ser Trp Gin Val Gly lie Gin
89390
395
400
cag gat gtg acc cac acc aat ggc tgc gtg gcc ctg ggc ate aaa eta Gin Asp Val Thr His Thr Asn Gly Cys Val Ala Leu Gly lie Lys Leu 405 410 415
1604
c;" cac acg gag tac gag ate ttc aaa atg gaa cag gat gcc egg ggg Pro His Thr Glu Tyr Glu lie Phe Lys Met Glu Gin Asp Ala Arg Gly 420 425 430
1652
cgc tat ctg ctg ttc aac ggt cag agg ccc age gac ggg tec age cca Arg Tyr Leu Leu Phe Asn Gly Gin Arg Pro Ser Asp Gly Ser Ser Pro 435 440 445
1700
gac agg cca gag aag aga gcc acg tec tac cag atg ccc ttg gtc cag Asp Arg Pro Glu Lys Arg Ala Thr Ser Tyr Gin Met Pro Leu Val Gin 450 455 460 465
1748
tgt gcc tec tct tcg ccg agg gca gag gac etc gca gaa gac agt gga Cvs Ala Ser Ser Ser Pro Arg Ala Glu Asp Leu Ala Glu Asp Ser Gly 470 475 480
1796
age age ctg tat ggc egg gcc cct ggg agg cac acc tgg tec ctg ctg Ser Ser Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gly Arg His Thr Trp Ser Leu Leu 485 490 495
1844
ctg get gca ctt gcc tgc ctt gtc cct ctg ctg cat tgg aac ate cgc Leu Ala Ala Leu Ala (Jys Leu Val Pro Leu Leu His Trp Asn lie Arg 500 505 510
1892
aga tag aagttttaga aagUcta" ttttccaaac caggattcct tactattgac Arg
1948
aga 11t.gcttaaagacatttattcttttgatgcact tgaatgccagagaa2008
ctgtccttct11 ttctcctctccctccctcccagcccctgagtcatgaacagcaaggagt2068
gtttgaagtttetgett tgaactccgtccagcctgatccctggectgageaact tcacaa2128
cagtaa t tgcac 11 Uagacagee tagagttctggacgagcgtgtUggtagcagggatg2188
磁gctagggcctct ta111UttctctUat tat tat utaUtctgagttaaac;ttag2248
UtcaagctacaacU t tectgecattttectgtggttgcagcctgtcu2308
cctt tgaaa ttgttttactctctgagt 111aUtgctggaa tecastgesgagttggUt2368
gggactgtgatcaagacaccaaagaagagacacaggtgUgatatgtaU2428
Ucaaaaagatgtacggtctggccaaacc;accttcccagcettutgeaaaaaaagggga2488
gaatcasugc11 teat tteagaaatgttgcgtggaaaagtatctgtaattaaagtttcga2548
agtaat t taaaasaaa^aaaa38888aaa2607
<210> 8
<211〉 514
<212> PR丁
<213> 人(Homo sapiens)
<楊〉8
Met Ser Trp Pro Arg Arg Leu Leu Leu Arg Tyr 1 5 10
Leu Phe Pro Ala Leu
15
Leu Leu His Gly Leu Gly Glu Gly Ser Ala Leu 20 25
Leu His Pro Asp Ser 30
Arg Ser His Pro Arg Ser Leu GU Lys Ser Ala Trp Arg Ala Phe Lys 35 40 45<image>image see original document page 91</image>Gly Arg Tyr Leu Leu Phe Asn Gly Gin Arg Pro Ser Asp Gly Ser Ser 435 440 445
Pro Asp Arg Pro Glu Lys Arg Ala Thr Ser Tyr Gin Met Pro Leu Val 450 455 460
Gin Cys Ala Ser Ser Ser Pro Arg Ala Glu Asp Leu Ala Glu Asp Ser 465 470 475 480
Gly Ser Ser Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gly Arg His Thr Trp Ser Leu 485 490 495
Leu Leu Ala Ala Leu Ala Cys Leu Val Pro Leu Leu His Trp Asn lie 500 505 510
Arg Arg
<210〉 9
<211〉 27
<212> 腿
<213> 人工的
<220〉
<223> 人工合成的引物序列 <400> 9
Cilggtgg3aa tg3CC"Ctg gtC333g 27
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220〉
<223> 人工合成的引物序列 <糊> 10
catcagcttc aggaggtaU tggUc 26
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 人工合成的引物序列
<400〉 11
gtggcactgt ggtgtucct Ut
<210> 12
<211> 23
<212> 隨
<213> 人工的
<220〉
<223> 人工合成的引物序列 <400> 12
cctctaaacc tttgcctacg act 23
<210> 13 <211> 28 <212> DNA<213> 人工的 <220>
<223> 人工合成的引物序列 <400> 13
ttaccgtcgt tccatgctga aatgatgc 28
<210> 14
<211> 35
<212〉 DNA
<213> 人工的
<220>
<223〉 人工合成的引物序列 <400> 14
ggggtaccac catggataac aaaatttcgc cggag 35
<210> 15
<21]〉 35
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223〉 人工合成的引物序列
<400〉 15
cggaattctc aggaggUU tgggtacttc catgc 35
<210〉 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 人工合成的S-寡核苷酸
<400〉 16
ggcctcacca ttgaag 16
<210〉17
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220〉
<223>人工合成的S-寡核苦i
<400>17
cttcaatggt gaggcc<210>18
<211〉22
<212>陽
<213>人工的
<220〉
<223>人工合成的引物序列
<400〉18
tggtagccaa gtgcaggtu U<210〉19
<211〉22
16
22
93<212> DNA <213> 人工的
<220>
<22 3> 人工合成的引物序列 <400〉 19
ccaaagggtt tctgcagttt ca 22
<210〉 20
<211> 30
<212> DNA
<213〉 人工的
<220>
<223> 人工合成的引物序列
<400> 20
tgcggatcca gagcagattg tactgagagt 30
<210> 21
<211〉 29
<212> DNA
<213> 人工的
<220〉
<223> 人工合成的引物序列
<400> 2〗
ctctatctcg agtgaggcgg aastgaacca 29
<210〉 22
<211〉 47
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 人工合成的引物序列
<400> 22
Utaagcttg aagaccattt ttggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaac 47
<210> 23
<211> 34 <212〉,
<213> 人工的
<220〉
<223> 人工合成的引物序列
<400> 23
Utaagcttg aagacatggg aaagagtggt ctca 34
<210〉 24
<211> 55
<212〉 隨
<213> 人工的
<220>
<223〉 用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400> 24
cacc3"gtg "cttctcca ggtgcttcaa gagagcacct ggagaagatc sicatt 55
<210> 25
94頁
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400〉 25
aaaaaatgtg atcttctcca ggtgctctct tgaagcacct ggagaagatc acatt 55
<210> 26
<211〉 55
<212〉 腿
<213> 人工的
<220>
<223> 用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400> 26
caccaaggac accagtttct cgUgUcaa gagacUcga gaaactggtg tcctt 55
<210> 27
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工的
<220〉
<223> 用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400> 27
aaaaaaggac accagtttct cgtagtctct tgaactacga gaaactggtg tcctt 55
<210> 28
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于siRNA的人工合成的寡核普酸
<400〉 28
caccaaagag acgctcatag cgactttcaa gagaagtcgc tatgagcgtc tcttt 55
<210> 29
<211> 55
<212> DM
<213> 人工的
<220>
<223> 用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400> 29
aaaaaaagag acgctcatag cgacttctct tgaaagtcgc tatgagcgtc tcttt 55
<210〉 30
<211> 55
<212〉 DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于siRNA的人工合成的寡核苦酸
<400〉 30
caccaacgac ggtaaaatcc gagccttcaa gagaggctcg gaUUaccg tcgtt 55<210> 31
<211> 55 <212〉,
<213> 人工的
<220>
<223> 用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400> 31
aaaaaacgac ggtaaaatcc gagcctctct tgaaggctcg gattttaccg tcgtt 55
<210> 32
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223〉 an人工的ly synthesized oligonucleotide
<400> 32
caccgaagca gcacgacttc Ucttcaaga gagaagaagt cgtgctgcU c 51
<210> 33
<211〉 51
<212> 腿
<213> 人工的
<220>
<223> an人工的ly synthesized oligonucleotide
<400〉 33
aaaagaagca gcacgacttc Uctctcttg aagaagaagt cgtgctgcU c 51
<210> 34
<211> 28
<212> 薩
<213> 人工的
<220>
<223〉 人工合成的引物序列
<400> 34
Ugattctgg gcgcacttgt ggctctcc 28
<210> 35
<211〉 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223〉 人工合成的引物序列
<400〉 35
ggggtaccac catggcgcca ccUcg 26
<210> 36
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 人工合成的引物序列
<400> 36
cggaattcat gggcgttgcc cctctgactg g 31<210> 37
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223〉人工合成的S-寡核苷酸
<400> 37
ggcctcaccg agcgcg 16
<210> 38
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400> 38
cgcgctcggt gaggcc 16
<210> 39
<211> 19
<212〉 畫
<213> 人工的
<220>
<223> 人工合成的引物序列
<400> 39
ggacaggtcg aggtggtgc 19
<210> 40
<211> 20 <212〉 廳 <213> 人工的
<220>
<223〉 人工合成的引物序列 <400> 40
ctcgacgagt tctcccatcg 20
<210> <211〉 <212〉 <213〉
<220>
<223>
41 22 DNA
人工的
人工合成的引物序列
<400> 41
agacaagctt tccgccgccg gc 22
<210> 42
<211> 33
<212> 隨
<213〉 人工的
<220〉
<22 3> 人工合成的引物序列 <400> 42gtctctcgag aagggtatgc cttaatgatc ttc
33
<210> <211> <212> <213>
43 16 腿
人工的
<220>
<223> 人工合成的S-寡核苷酸
<400> 43 cttcgctatg gcggca
16
<210〉 <211〉 <212〉 <213〉
44 16 隨
人工的
<220〉
<22 3〉 人工合成的S-寡核苷酸
<400〉44
tgc.c.gccatagcgaag
<21(J>45
<211〉34
<212〉隱
<213〉人工的<220〉
<223>人工合成的引物序列<220〉
<221>mi sc:—f eature
<222〉(7)..(7)
<223〉q
<41)0>45
tgggaanttccggaagaaga tggcgctcac
<210〉46
<211〉35
<212>DNA
<213〉人工的16
34
<220〉
<22 3〉 人工合成的引物序列 <400> 46
gtgcctcgag cttcctcctc Ucttgcctt catgc
35
<210>47
<211〉51
<212>DNA
<213〉人工的
<220>
<22 3>用于si
<400〉47
用于siRNA的人工合成的寡核苷酸 47
tc.ccgcatgc tccaaagacc tgtttcaaga gaacaggtct ttggagcatg
51
<210> 48 <211> 51<212> 歸
<213〉 人工的
<22(J>
<22 3> 用于siRNA的人工合成的寡核脊酸
<400> 48
aaaagcatgc tccaaagacc tgttctcttg aaacaggtct ttggagcatg c 51
<210〉 49
<211〉 51
<212> DNA
<213> 人工的
<220〉
<223〉 用于siRNA的人工合成的寡核香酸
<400> 49
tcccagactt catgatccaa ggattcaaga gatccttgga tcatgaagtc t 51
<210> 50
<211> 51
<212〉 DNA
<213〉 人工的
<220〉
(223> 用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400> 50
aaaaagactt catgatccaa ggatctcUg aatccttgga tcatgaagtc t 51
<210> 51
<211> 51
<212〉 瞎
<213> 人工的
<220〉
<223> 用于siRNA的人工合成的寡核香酸
<400〉 51
tccctggcag ccagUcttt gtgUcaaga gacacaaaga actggctgcc a 51
<210> 52
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400〉 52
aaaatggcag ccagttcttt gtgtctcttg aacacaaaga actggctgcc a 51
<210> 53
011> 32
<212> 腿
<213> 人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<憎> 53
cgccggatcc gctatggcgg caattccc.cc ag 32
010〉 54
99<211> 35
<212> ,
<213〉 人工的
<220>
<22 3> 人工合成的引物序列
<400> 54
agcactcgag cccagaaggg tatgccttaa tgatc 35
<210> 55
<211> 35
<212> DNA
<213〉 人工的
<220〉
<22 3> 人工合成的引物序列
<210> 56
<211> 32
<212> 陽
<213> 人工的
<220>
<223> 人工合成的引物序列
<400> 56
aatctcgagg tcagcttcag tctcgtcagc ag 32
<210〉 57
<211> 36
<212> DNA
<213〉 人工的
<220>
<223> 人工合成的引物序列
<210> 58
<211> 32
<212〉 DNA
<213> 人工的
<220〉
<22 3> 人工合成的引物序列
<400> 58
aatctcgagg tcagcttcag tctcgtcagc ag 32
<210〉 59
<211> 36
<212> DNA
<213〉 人工的
<220>
<223> 人工合成的引物序列
<400> attgg
55
tacca tggagctgat tctcagccct cggtc
<400> attgg
57
tacca tggttccaga attccccctt tcccct
<400> 59
attggtacca tggatctttc cctggaggaa attcag
<210> 60<211〉 32 <212〉 腿 <213> 人工的
<220>
<22 3> 人工合成的引物序列 <400> 60
aatctcgagg tcagcttcag tctcgtcagc ag 32
<210> 61
<211> 35
<212〉 DNA
<213〉 人工的
<220>
<223〉 人工合成的引物序列
<400〉 61
attggtacca tggctgaggt cttgaagcag ctggc 35
<210> 62
<211> 32
<212> 隨
<213> 人工的
<220〉
<223> 人工合成的引物序列 <400〉 62
aatctcgagg tcagcttcag tctcgtcagc ag 32
<210〉 63
<211> 34
<212〉 隱
<213〉 人工的
<220>
<223> 人工合成的引物序列
<400> 63
attggtacct tcaccatggc ttcttctgat atcc 34
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213〉 人工的
<220>
<22 3> 人工合成的引物序列 <400> 64
aatctcgagg cgtctttctt ctgcagcttc 30
<210> 65
<211> 31
<212> 腿
<213〉 人工的
<220>
<22 3> 人工合成的引物序列
<400> 65
ctggagaagc gtgccgcagg ccaggctttt g 31
<210> 66
101<211> 31 <212> 隨 <213> 人工的
<220>
<223> 人工合成的引物序列 <400> 66
caaaagcctg gcctgcggca cgcttctcca g 31
<210> 67
<211> 40
<212〉 腿
<213〉 人工的
<220>
<22 3> 人工合成的引物序列
<400> 67
gcttttgagc tgattctcgc ccctcggtca aaagaatctg 40
<210> 68
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<22 3> 人工合成的引物序列
<400> 68
cagattcttt tgaccgaggg gcgagaatca gctcaaaagc 40
<210> 69
<211> 33
<212> 陽
<213> 人工的
<220>
<223〉 人工合成的引物序列
<400> 69
ccagaattcc cccttgcccc tccaaagaag aag 33
<210> 70
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 人工合成的引物序列 <400〉 70
cttcttcttt ggaggggcaa gggggaauc tgg 33
<210> 71
<211> 33
<212> DM
<213> 人工的
<220>
<223> 人工合成的引物序列
<400〉 71
cagaagaaag acgcaaggcc c'dtgaag"g agg "
<210〉 72
1<211> 33 <212> DNA <213> 人工的
<22 0>
<22 3> 人工合成的引物序列 <400〉 72
cctcagcttc atgggccttg cgtcUUctt ctg 33
<210> 73
<211> 21
<212〉 腿
<213〉 人工的
<220>
<22 3> 人工合成的引物序列
<400> 73
ggaUatcta tcggtcagac g 21
<210〉 74
<211> 21
<212> 腿
<213> 人工的
<220>
<223> 人工合成的引物序列 <400> 74
tgggtcacat cctgctggat g 21
<210> 75
<211> 24 (212〉, (213〉.人工的
<220>
<22 3> 人工合成的引物序列 <400> 75
gctcgtctga ccgatagatg atcc 24
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220〉
<223> 人工合成的引物序列 <400> 76
aaggatccgc gtggacaatg gctactcaag 30
<210〉 77
<211> 34
<212> DM
<213> 人工的
<220〉
<223〉 人工合成的引物序列 <400〉 77
ggactcgaga caggtcagta tcaaaccagg ccag 34
<210〉 78
103<211〉 32 <212> DNA
<213> 人工的 <220〉
<223〉 人工合成的引物序列 <400> 78
aagaattctg ctggtgggtg aaaaaaaaat gc
32
<210> 79
<211> 34
<212> 腿
<213〉 人工的
<220>
<22 3> 人工合成的引物序列
<400〉 79
ctactcgagt tctaaagact tggtgacgag cgac 34
<210> 80
<211〉 35
<212〉 DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 人工合成的引物序列
<400> 80
aggaattcgt gcatcatggt cccaccacat catac 35
<210> 81
<211> 7
<212> 飄
<213〉 人工的
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 81 ctttggc
<210> 82
<211〉 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220〉
<223〉 人工合成的探針序列
<400> 82 gctttgattg tggtga
<210> 83
<211> 16
<212〉 DNA
<213> 人工的
<220>
<22 3〉 人工合成的探針序列
<400〉 83
tcaccacaat caaagc 16<image>image see original document page 105</image><210> 90
<211> 16
<212> 陽
<213> 人工的
<220>
<22 3> 人工合成的S-寡核苦酸
<400> 90 tacaggaccg gcgcgg
<210> 91
<211〉 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 人工合成的S-寡核苷酸
<400> 91 atctggtccg gcgcgg
<210> 92
<211> 16
<212〉 隨
<213〉 人工的
<220>
<22 3> 人工合成的S-寡核苷酸
<400> 92 gttgcacagc gacgca
<210> 93 <211> 21 <212> 畫
<213> 人(Homo sapiens) <400〉 93
aatgtgatct tctccaggtg c 21
<210> 94 <211> 21 <212> 腿
<213> 人(Homo sapiens) <400> 94
aaggacacca gtttctcgU g 21
<210〉 95 <211> 21 <212> D A
<213> 人(Homo sapiens) <400> 95
aaagagacgc tcatagcgac t 21
<210> 96 <211> 21 <212〉 觀
<213> 人(H咖o sapiens) <400> 96
aacgacggta aaatccgagc c 21<210> 97 <211〉 21 <212> 腿
<213> 人(Homo sapiens) <400> 97
aacgaaacac cgatgactgg g
<210> 98 <211> 21 <212> 廳
<213> 人(Homo sapiens) <400> 98
aatcaccgga ccacacacac a
<210> 99 <211> 22 <212> 陽
<213> 人(Homo sapiens) <400〉 99
aaaccttgcc tacgacatgt tt
<210> 100 <211> 21 <212> DNA
<213> 人(Homo sapiens) <400> 100
aaaaggtttc cgttagcccc g
<210> 101 <211> 20 <212> 畫
<213> 人(Homo sapiens) <400> 101
gcatgctcca aagacctgtt
<210> 102 <211> 20 <212> DNA
<213> 人(Homo sapiens) <糊> 102
agacttcatg atccaaggat
<210> 103 <211> 20 <212> DNA
<213> 人(Homo sapiens) <400> 103
tggcagccag ttctttgtgt
<210> 104
<211> 55
<212> 醒
<213> 人工的
<220>
<223> siRNA的人工合成靶序列
21
21
22
21
20
20
20
107<400> 104
caccaacgaa acaccgatga ctgggttcaa gagacccagt catcggtgtt tcgtt 55
<210> 105
<211> 55
<212> 腿
<213> 人工的
<22 0>
<223〉 siRNA的人工合成fe序列 <楊〉105
aaaaaacgaa acaccgatga ctgggtctct tgaacccagt catcggtgtt tcgtt 55
<210> 106
<211> 55
<212> DNA
<213〉 人工的
<220〉
<223> siRNA的人工合成把序列
<權(quán)> 106
caccaatcac cggaccacac acacattcaa gagatgtgtg tgtggtccgg tgatt 55
<210〉 107
<211> 55
<212〉 DNA
<213> 人工的
<220>
<223> siRNA的人工合成靶序列
<400〉 107
aaaaaatcac cggaccacac acacatctct tgaatgtgtg tgtggtccgg tgatt 55
<210> 108
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> siRNA的人工合成革巴序列
<400> 108 ^ caccaaacct tgcctacgac atgttttcaa gagaaacatg tcgtaggcaa ggttt 55
<210> 109
<211> 55
<212> 陽
<213〉 人工的
<220>
<223> siRNA的人工合成靶序列
<400〉 109
aaaaaaacct tgccUcgac atgtttctct tgaaaacatg tcgtaggcaa ggttt 55
<210〉 110
<211〉 55
<212〉 腿
<213> 人工的
<220〉
<22 3> stRNA的人工合成靶序列<400> 110
caccaaaagg tttccgttag ccccgttcaa gagacggggc Uacggaaac ctttt 55
<210> 111
<211> 55
<212> 腿
<213> 人工的
<220>
<223> siRNA的人工合成把序列
<400> 111
aaaaaaaagg tttccgttag ccccgtctct tgaacggggc Uacggaaac ctttt 5權(quán)利要求
1. 診斷細(xì)胞增殖性疾病的方法，所述方法包括下述步驟(a)檢測樣本的生物樣品中編碼氨基酸序列SEQ ID NO2的基因的表達(dá)水平；和(b)將表達(dá)水平的升高與所述疾病相關(guān)聯(lián)。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中通過選自下列的任一種方法檢測表達(dá)水平(a) 檢測編碼氨基酸序列SEQ ID NO: 2的mRNA;(b) 檢測含有氨基酸序列SEQIDNO: 2的蛋白質(zhì)；和(c) 檢測含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2的蛋白質(zhì)的生物活性。
3. 選自下列的基本上純的多肽(a) 多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:^(b) 多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO: 2，其中的一個或多個氨基酸 被取代、缺失、插入和/或添加，并且具有與由氨基酸序列SEQ IDNO: 2組 成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(c) 多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO: l組成的多 核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由SEQ ID NO: 2中任一 氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
4. 分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求3的多肽。
5. 載體，其含有權(quán)利要求4的多核苷酸。
6. 宿主細(xì)胞，其攜有權(quán)利要求4的多核苷酸或權(quán)利要求5的載體。
7. 產(chǎn)生權(quán)利要求3的多肽的方法，所述方法包括下述步驟(a) 培養(yǎng)權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞；(b) 使宿主細(xì)胞表達(dá)所述多肽；和(c) 收集所表達(dá)的多肽。
8. 抗體，其與權(quán)利要求3的多肽結(jié)合。
9. 多核苷酸，它與權(quán)利要求4的多核苷酸或其互補鏈互補，并且含有 至少15個核苷酸。
10. 反義多核苷酸或小的干擾RNA，其針對權(quán)利要求4的多核苷酸。
11. 權(quán)利要求10的反義多核苷酸，其中所述核苷酸序列含有核苷酸序列SEQ ID NO: 16。
12. 權(quán)利要求10的小的干擾RNA，其有義鏈選自含有核苷酸序列SEQ ID NO: 93, 94, 95， 96的核苷酸。
13. 篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，所述方法包括下述步驟(a) 使受試化合物與選自下列的多肽接觸(1) 多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2;(2) 多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO: 2，其中的一個或多個氨基酸 被取代、缺失、插入和/或添加，并且具有與由氨基酸序列SEQ ID NO: 2組 成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(3) 多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO: l組成的多 核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO: 2組成的多肽等同的生物活性；(b) 檢測所述多肽與受試化合物之間的結(jié)合活性；和(c) 選擇與所述多肽結(jié)合的化合物。
14. 篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，所述方法包括下述步驟a) 使候選化合物與細(xì)胞接觸，所述細(xì)胞表達(dá)由核苷酸序列SEQ ID NO: l組成的多核苦酸；和b) 選擇與缺乏受試化合物時檢測到的表達(dá)水平相比，能降低由核苷酸 序列SEQ ID NO: l組成的多核苷酸的表達(dá)水平的化合物。
15. 篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，所述方法包括下述步驟(a)使受試化合物與選自下列的多肽接觸(1) 多肽，含有氨基酸序列SEQIDNO:2;(2) 多肽，含有氨基酸序列SEQIDNO: 2，其中的一個或多個氨基酸被 取代、缺失、插入和/或添加，并且具有與由氨基酸序列SEQIDNO.'2組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(3) 多肽，由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO: l組成的多核 苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO: 2組成的多肽等同的生物活性；(b) 檢測步驟(a)的多肽的生物活性；和(c) 選擇與缺乏受試化合物時^r測到的生物活性相比，能抑制所述多肽 生物活性的化合物。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中生物活性是細(xì)胞-增殖活性。
17. 篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，所述方法包括下述步驟a) 使候選化合物與已導(dǎo)入載體的細(xì)胞接觸，所述載體含有標(biāo)記基因的 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制之下表達(dá)的報道基因，其中標(biāo)記基因含有 核苷酸序列SEQIDNO: 1，b) 測定所述報道基因的活性；和c) 選擇與對照相比能降低所述報道基因的表達(dá)水平的化合物。
18. 針對編碼選自下列之多肽的多核苦酸的反義多核普酸或小干擾 RNA用于制備治療細(xì)胞增殖性疾病的藥物組合物的用途(a) 多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2;(b) 多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO: 2且其中一個或多個氨基酸被 取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO:2組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(c) 多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO: l組成的多 核苦酸雜交的多核普酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO: 2組成的多肽等同的生物活性。
19. 抗選自下列之多肽的抗體用于制備治療細(xì)^^增殖性疾病的藥物組 合物的用途(a) 多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2;(b) 多肽，含有氨基酸序列SEQ ID NO: 2且其中一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO: 2組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(c)多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO: l組成的多 核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO: 2組成的多肽等同的生物活性。
20.選自(a)-(c)的多肽或編碼所述多肽的多核苷酸用于制備治療細(xì)胞 增殖性疾病的藥物組合物的用途(a) 多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQIDNO: 2;(b) 多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQIDNO: 2且其中一個 或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基 酸序列SEQ ID NO: 2組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(c) 多肽或其片段，所述多肽由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO: l組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨 基酸序列SEQ ID NO: 2組成的多肽等同的生物活性。
21. 權(quán)利要求18-20中任一項的用途，其中所述細(xì)胞增殖性疾病是癌癥。
22. 選自(a)-(c)的多肽用于制備誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的藥物組合物的用途(a) 多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQIDNO:2;(b) 多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQIDNO: 2且其中一個 或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基 酸序列SEQ ID NO: 2組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(c) 多肽或其片段，所述多肽由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO: l組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨 基酸序列SEQ ID NO: 2組成的多肽等同的生物活性。
全文摘要
本申請?zhí)峁┝诵碌娜嘶騑DRPUH和KRZFPUH以及PPIL1，與相應(yīng)的非癌組織相比，所述基因分別在絕大多數(shù)HCC和結(jié)腸癌中有顯著提高的表達(dá)，本申請還提供了新的人基因APCDD1，它在原發(fā)性結(jié)腸癌中的表達(dá)提高，將野生型APC1轉(zhuǎn)導(dǎo)至結(jié)腸癌細(xì)胞后，APCDD1的表達(dá)被下調(diào)。所述基因和由其編碼的多肽可用于例如診斷細(xì)胞增殖性疾病，并用作開發(fā)針對所述疾病的藥物的靶分子。
文檔編號C12N15/12GK101532060SQ20091013301
公開日2009年9月16日 申請日期2003年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月6日
發(fā)明者中村佑輔, 古川洋一 申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司