一種制備紫花白及原生質(zhì)體的方法及其專用試劑的制作方法
【專利摘要】一種制備紫花白及原生質(zhì)體的方法，包括如下步驟：原生質(zhì)體的分離、原生質(zhì)體的純化、原生質(zhì)體產(chǎn)量的測定、原生質(zhì)體活力率的測定；用于該方法的專用試劑包括酶溶液A、B；酶溶液A包括MES、KCl、Mannitol、CellulaseR10、PectolyaseY-23、BSA、CaCl2和ddH2O，酶溶液B包括MES、KCl、Mannitol、BSA、CaCl2和ddH2O。本發(fā)明簡單易行，實驗成本低，可重復(fù)性高；利用紫花白及葉片得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量可達4.8×106個/g，活力率為92.26%，可為紫花白及體細胞雜交、突變體誘導(dǎo)、細胞器分離、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、生物反應(yīng)器構(gòu)建提供良好材料基礎(chǔ)。
【專利說明】一種制備紫花白及原生質(zhì)體的方法及其專用試劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備紫花白及原生質(zhì)體的方法及其專用試劑，具體為用紫花白及的組培苗葉片獲取原生質(zhì)體的方法，屬于植物細胞工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]紫花白及striata (Thunb.) Reichb.f.具有收斂止血、消腫生肌等功效，用于治療咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等癥，也具有抗菌鎮(zhèn)痛、抗腫瘤活性、強身健體、增加機體免疫力，具有藥用功能和保健作用。同時，紫花白及也是工業(yè)、化妝品和園林園藝的重要原材料，在國內(nèi)外均有廣闊市場。通過細胞工程方法對紫花白及進行遺傳改良具有重要的經(jīng)濟價值和社會意義。
[0003]植物原生質(zhì)體是指除去了全部細胞壁后質(zhì)膜包裹的細胞，是用作生物反應(yīng)器和基礎(chǔ)研究的理想材料。分離純化的原生質(zhì)體，可以用于開展植物細胞信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換、細胞壁合成機理、膜的結(jié)構(gòu)與功能、核質(zhì)關(guān)系、突變體誘導(dǎo)、雜交或自交不親和的機理、細胞間的相互作用、植物激素的作用機理、分離各種細胞器、引入細胞器、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入外源基因、生物反應(yīng)器構(gòu)建等方面的研究。
[0004]本發(fā)明人首先搜集了全國多個紫花白及種源地的種質(zhì)資源，用葉片為研究材料進行酶解，釋放得到原生質(zhì)體，純化后獲得了純度高、活力強的原生質(zhì)體，為紫花白及的的種質(zhì)資源拓展、商業(yè)化遺傳育種、基因改良、生物反應(yīng)器制備藥用成分等后續(xù)研究奠定了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:利用紫花白及的葉片獲取純度高、活力強、密度大的原生質(zhì)體的方法以及用于該方法的專用試劑。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種制備紫花白及原生質(zhì)體的方法，包括如下步驟:原生質(zhì)體的分離、原生質(zhì)體的純化、原生質(zhì)體產(chǎn)量的測定、原生質(zhì)體活力率的測定；
(1)原生質(zhì)體的分離:選取紫花白及組培再生苗或野生植株大而飽滿的葉片，在超凈工作臺中將其橫向切割為Irnm的片段，放入60mm培養(yǎng)皿中，將酶溶液A倒入培養(yǎng)皿里，用鑷子將所取材料浸泡入酶溶液A中，pH值為5.7，根據(jù)材料的多少來決定酶溶液A的使用量，酶溶液A與材料比例為10ml: lg，然后用封口膠封口，置于恒溫搖床上黑暗處理4 h，震蕩條件為26-28°C、120rpm，即終止酶解，此時原生質(zhì)體已充分分離出來，用吸頭輕輕吹打葉片，以釋放出全部原生質(zhì)體,獲得原生質(zhì)體酶溶液；
(2)原生質(zhì)體的純化:將原生質(zhì)體酶溶液用200目的細胞篩過濾，再將濾液置于2ml離心管中，在100g/min下離心3min,使原生質(zhì)體沉降,然后棄上清夜,將沉降物緩慢加入酶溶液B中，在100 g/min的轉(zhuǎn)速下離心3_5次，每次3min，最終得到純化的原生質(zhì)體；
(3)原生質(zhì)體產(chǎn)量的測定:將純化的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)入2ml酶溶液B中，輕輕吹打，使原生質(zhì)體分布均勻，用移液槍吸取一滴在血球計數(shù)板上，蓋上蓋玻片，置于倒置顯微鏡下計數(shù)，連續(xù)計數(shù)三次，取平均值；根據(jù)加入酶溶液A中葉片的多少計算出每克葉片得到的原生質(zhì)體的產(chǎn)量，計算結(jié)果以每克葉片原生質(zhì)體數(shù)表示(個/g);
(4)原生質(zhì)體活力率的測定:利用FDA (熒光素雙醋酸酯)透過原生質(zhì)體后，在酯酶的作用下迅速分解，放出熒光素，使有活力的原生質(zhì)體發(fā)出黃綠色的熒光從而來鑒定原生質(zhì)體的活力；計算原生質(zhì)體活力時需在明視野下觀察原生質(zhì)體總數(shù)，然后再轉(zhuǎn)到熒光下記錄有活力的原生質(zhì)體數(shù)，最后計算原生質(zhì)體活力率。
[0007]所述培養(yǎng)皿為直徑60 _、高15 mm的玻璃培養(yǎng)皿。
[0008]一種用于制備紫花白及原生質(zhì)體的方法的專用試劑，包括酶溶液A和酶溶液B ； 所述酶溶液A配比如下:
成分加入量
MES 1.0ml (200 mmol)
KCl 2.5ml (80 mmol)
Mannitol 5.0ml (0.8 mol)
Cellulase RlO 150.0mg
Pectolyase Y-23 50.0mg
BSA 1.0ml (10 mg)
CaCl2 400.0ul (250 mmol)
ddH20 100.0ul
所述酶溶液 A 中成分濃度為:Mannitol 0.16 mol/ml，MES 0.2 mol/ml，KCl 0.032mol/ml, CaCl2 0.625 mol/ml ；
所述酶溶液B配比如下:
成分加入量
MES 1.0ml (200 mmol)
KCl 2.5ml (80 mmol)
Mannitol 5.0ml (0.8 mol)
BSA 1.0ml (10 mg)
CaCl2 400.0ul (250 mmol)
ddH20 100.0ul
所述酶溶液 B 中成分濃度為:Mannitol 0.16 mol/ml，MES 0.2 mol/ml，KCl 0.032mol/ml, CaCl2 0.625 mol/ml。
[0009]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果: 1.本發(fā)明提供的紫花白及原生質(zhì)體誘導(dǎo)與純化技術(shù)體系簡單易行，實驗成本低，可重復(fù)性聞;
2.本發(fā)明首次對紫花白及進行原生質(zhì)體的分離純化后，將為紫花白及的種質(zhì)資源拓展、遺傳育種、基因工程等后續(xù)研究奠定一定的物質(zhì)基礎(chǔ)；
3.本發(fā)明利用紫花白及葉片得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量可達4.8X 16個/g，活力率為92.26%，可為紫花白及體細胞雜交和遺傳轉(zhuǎn)化等生物技術(shù)育種提供良好的受體系統(tǒng)。
[0010]【專利附圖】

【附圖說明】:圖1是本發(fā)明所述紫花白及原生質(zhì)體(10X40)；
圖2是本發(fā)明所述紫花白及經(jīng)4小時酶解后未純化的原生質(zhì)體(10X20)；
圖3是本發(fā)明純化后的紫花白及原生質(zhì)體(10X20)；
圖4是本發(fā)明純化后經(jīng)FDA染色后的紫花白及原生質(zhì)體(10X20)。
[0011]【具體實施方式】:
以下實例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0012]一種制備紫花白及原生質(zhì)體的方法，包括如下步驟:原生質(zhì)體的分離、原生質(zhì)體的純化、原生質(zhì)體產(chǎn)量的測定、原生質(zhì)體活力率的測定；
(1)原生質(zhì)體的分離:取紫花白及的組培再生苗或野生植株，選取大而飽滿的葉片，升汞滅菌后用鑷子撕去表皮，將其橫向切割為Irnm的片段，放入潔凈的培養(yǎng)皿中，將準備好的酶溶液A倒入培養(yǎng)皿里，混合均勻，根據(jù)所取材料的多少來決定需要多少酶溶液A的使用量，以剛好淹沒所取材料為宜，然后用封口膠封口，置于恒溫搖床上黑暗處理4 h，震蕩條件為26-28°C、120 rmp。酶解停止后，用吸管輕吹打葉片，以釋放出全部原生質(zhì)體(附圖1、2)，獲得原生質(zhì)體酶溶液；
(2)原生質(zhì)體的純化:將原生質(zhì)體酶溶液用200目的細胞篩過濾，以除去酶解后留下的殘余碎片，再將過濾好的濾液置于2ml離心管中，在100g/min下離心3min，使原生質(zhì)體沉降，棄上清液后加入酶溶液B,在100g/min下離心3min,漂洗3_5次,最終得到純化的原生質(zhì)體(附圖3)。
[0013](3)原生質(zhì)體產(chǎn)量的測定:向純化的原生質(zhì)體中加入2ml酶溶液B中，輕輕吹打，使原生質(zhì)體分布均勻，將蓋玻片蓋在血球計數(shù)板上的計數(shù)室上面，用移液槍吸取一滴酶溶液B滴在蓋玻片的一側(cè)邊緣，使其沿著蓋玻片和計數(shù)板間的縫隙慢慢深入計數(shù)室內(nèi)，直至酶溶液B充滿計數(shù)室為止；然后將計數(shù)板置于倒置顯微鏡下計數(shù)，計數(shù)時保持顯微鏡載物臺水平，連續(xù)計數(shù)三次，取平均值；根據(jù)加入酶溶液A中葉片的多少計算出每克葉片得到的原生質(zhì)體的產(chǎn)量，計算結(jié)果以每克葉片細胞數(shù)表示(個/g)。
[0014](4)原生質(zhì)體活力率的測定:利用FDA (熒光素雙醋酸酯)透過原生質(zhì)體后，在酯酶的作用下迅速分解，放出熒光素，使有活力的原生質(zhì)體發(fā)出黃綠色的熒光從而來鑒定原生質(zhì)體的活力(附圖4)。計算原生質(zhì)體活力時先在明視野下觀察原生質(zhì)體總數(shù)，然后再轉(zhuǎn)到熒光下記錄發(fā)出黃綠色熒光的原生質(zhì)體數(shù)，最后計算原生質(zhì)體活力率。
[0015]所述培養(yǎng)皿為直徑60 mm、高15 mm玻璃培養(yǎng)皿。
[0016]一種用于制備紫花白及原生質(zhì)體方法的專用試劑，包括酶溶液A和酶溶液B ； 所述酶溶液A配比如下:
成分加入量
MES 1.0ml (200 mmol)
KCl 2.5ml (80 mmol)
Mannitol 5.0ml (0.8 mol)
Cellulase RlO 150.0mg
Pectolyase Y-23 50.0mg
BSA 1.0ml (10 mg)
CaCl2 400.0ul (250 mmol)ddH20 100.0ul
所述酶溶液 A 中成分濃度為:Mannitol 0.16 mol/ml，MES 0.2 mol/ml，KCl 0.032mol/ml, CaCl2 0.625 mol/ml。
[0017]所述酶溶液B配比如下:
成分加入量
MES 1.0ml (200 mmol)
KCl 2.5ml (80 mmol)
Mannitol 5.0ml (0.8 mol)
BSA 1.0ml (10 mg)
CaCl2 400.0ul (250 mmol)
ddH20 100.0ul
所述酶溶液 B 中成分濃度為:Mannitol 0.16 mol/ml，MES 0.2 mol/ml，KCl 0.032mol/ml, CaCl2 0.625 mol/ml。
[0018]所述原生質(zhì)體活力計算方法為:以有活力的原生質(zhì)體占全部觀察原生質(zhì)體的百分數(shù)來表示，即原生質(zhì)體的活力率=(被染色的原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù))X 100%。計數(shù)測量三次，取平均值。
[0019]本發(fā)明為獲取純度高、活力強、密度大的紫花白及原生質(zhì)體提供了行之有效的技術(shù)手段，為白及的種質(zhì)資源拓展、商業(yè)育種、基因改良等后續(xù)研究以及以該原生質(zhì)體作為生物反應(yīng)器奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
盡管上文所述已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，對之作一些修改或改進，可以使這項發(fā)明更具可操作性。因此，在不偏離本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬本發(fā)明要求保護的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種制備紫花白及原生質(zhì)體的方法，其特征是，該方法包括如下步驟:原生質(zhì)體的分離、原生質(zhì)體的純化、原生質(zhì)體產(chǎn)量的測定、原生質(zhì)體活力率的測定； (1)原生質(zhì)體的分離:選取紫花白及組培再生苗或野生植株大而飽滿的葉片，在超凈工作臺中將其橫向切割為Irnm的片段，放入60mm培養(yǎng)皿中，將酶溶液A倒入培養(yǎng)皿里，用鑷子將所取材料浸泡入酶溶液A中，pH值為5.7，根據(jù)材料的多少來決定酶溶液A的使用量，酶溶液A與材料比例為10ml: lg，然后用封口膠封口，置于恒溫搖床上黑暗處理4 h，震蕩條件為26-28°C、120rpm，即終止酶解，此時原生質(zhì)體已充分分離出來，用吸頭輕輕吹打葉片，以釋放出全部原生質(zhì)體,獲得原生質(zhì)體酶溶液； (2)原生質(zhì)體的純化:將原生質(zhì)體酶溶液用200目的細胞篩過濾，再將濾液置于2ml離心管中，在100g/min下離心3min,使原生質(zhì)體沉降,然后棄上清夜,將沉降物緩慢加入酶溶液B中，在100 g/min的轉(zhuǎn)速下離心3_5次，每次3min，最終得到純化的原生質(zhì)體； (3)原生質(zhì)體產(chǎn)量的測定:將純化的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)入2ml酶溶液B中，輕輕吹打，使原生質(zhì)體分布均勻，用移液槍吸取一滴在血球計數(shù)板上，蓋上蓋玻片，置于倒置顯微鏡下計數(shù)，連續(xù)計數(shù)三次，取平均值；根據(jù)加入酶溶液A中葉片的多少計算出每克葉片得到的原生質(zhì)體的產(chǎn)量，計算結(jié)果以每克葉片原生質(zhì)體數(shù)表示(個/g); (4)原生質(zhì)體活力率的測定:利用FDA(熒光素雙醋酸酯)透過原生質(zhì)體后，在酯酶的作用下迅速分解，放出熒光素，使有活力的原生質(zhì)體發(fā)出黃綠色的熒光從而來鑒定原生質(zhì)體的活力；計算原生質(zhì)體活力時需在明視野下觀察原生質(zhì)體總數(shù)，然后再轉(zhuǎn)到熒光下記錄有活力的原生質(zhì)體數(shù)，最后計算原生質(zhì)體活力率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的制備紫花白及原生質(zhì)體的方法，其特征是:所述培養(yǎng)皿為直徑60 mm、高15 mm的玻璃培養(yǎng)皿。
3.一種用于權(quán)利要求1所述的制備紫花白及原生質(zhì)體的方法的專用試劑，包括酶溶液A和酶溶液B ； 所述酶溶液A配比如下: 成分加入量
MES 1.0ml (200 mmol)
KCl 2.5ml (80 mmol)
Mannitol 5.0ml (0.8 mol)
Cellulase RlO 150.0mg
Pectolyase Y-23 50.0mg
BSA 1.0ml (10 mg)
CaCl2 400.0ul (250 mmol)
ddH20 100.0ul 所述酶溶液 A 中成分濃度為:Mannitol 0.16 mo I/ml, MES 0.2 mol/ml, KCl 0.032mol/ml, CaCl2 0.625 mol/ml ； 所述酶溶液B配比如下: 成分加入量
MES 1.0ml (200 mmol)
KCl 2.5ml (80 mmol)Mannitol 5.0ml (0.8 mol) BSA 1.0ml (10 mg)
CaCl2 400.0ul (250 mmol)
ddH20 100.0ul
所述酶溶液 B 中成分濃度為:Mannitol 0.16 mo I/ml, MES 0.2 mol/ml, KCl 0.032mol/ml, CaCl2 0.625 mol/ml。
【文檔編號】C12N5/04GK104130970SQ201410371645
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】徐德林, 錢剛, 張 林, 楊璐萍, 儲士潤, 沈訪 申請人:遵義醫(yī)學(xué)院