專利名稱：診斷試劑盒及bfar在制備胃癌早期診斷試劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種診斷試劑盒及BFAR在制備胃癌早期診斷試劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胃癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO) 2008年的統(tǒng)計(世界衛(wèi)生組織年度統(tǒng)計，2008)，在全世界范圍，胃癌病人的死亡率高居第二。在2006年WHO的統(tǒng)計中顯示有接近950，000個新發(fā)病例，同時有約700，000人死于這一種疾病。在我國，每年胃癌新發(fā)患者數(shù)超過30萬，死于胃癌的人數(shù)約16萬，病死率居惡性腫瘤之首，嚴(yán)重威脅人民生命健康(陳竺，全國第三次死因回顧抽樣調(diào)查報告，2008)。為降低死亡率，提高胃癌的療效，關(guān)鍵是胃癌的“三早”工作，即早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早期治療。然而，由 于絕大多數(shù)胃癌患者缺乏特異性的臨床癥狀，故早期胃癌診斷率很低，手術(shù)率不足10% (吳云林外科理論與實踐，2005，10:401);術(shù)后病人的生存期也較短。目前，我國胃癌總體5年生存率為43. 4%，術(shù)后病理分期(pathological M，pTNM) I、II、III、IV期患者的術(shù)后5年生存率分別為75. 65%,58. 73%,28. 01%和8. 42% (劉炳亞中華胃腸外科雜志，2010，13:163)。因此，提高胃癌的早期診斷率非常重要。而一般體檢和影像學(xué)檢查作用有限，待能夠發(fā)現(xiàn)和明確診斷時，往往已到了中、晚期，缺少預(yù)警價值。因此，從長遠(yuǎn)角度看，應(yīng)致力于發(fā)現(xiàn)敏感性和特異性均較好的腫瘤標(biāo)志物。此外，胃癌異質(zhì)性大，預(yù)后及對治療的反應(yīng)性差別較大，對于臨床評估預(yù)后以及對治療反應(yīng)性的預(yù)測與評價，均需良好的腫瘤標(biāo)志物。理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)符合以下條件(1)敏感性高；(2)特異性高；(3)腫瘤標(biāo)志物濃度和腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、惡性程度有關(guān)，能協(xié)助腫瘤分期和判斷預(yù)后；(4)半衰期短，有效治療后濃度很快下降，能較快反映體內(nèi)腫瘤的實際情況；(5)存在于體液，特別是血液中，易于檢測(劉炳亞中華胃腸外科雜志，2010，13:163)。腫瘤血清標(biāo)志物的研究一直是本領(lǐng)域的研究重點?，F(xiàn)已有多種胃癌腫瘤標(biāo)識物如癌胚抗原(CEA)，存在于胃癌及其它腺癌患者的血清中，但對早期胃癌的診斷意義較小，主要用于胃癌治療前后的動態(tài)觀察(Lipkin M:Cancer Research, 1988, 48:235 ；Lipkin: JBC Supplymental, 1992，16:1) ;CA125、CA 19-9, CA50、CA724 以及 CA242 等部分糖抗原在部分胃癌患者中可升高，但其敏感性僅20 40 % (Kodera Y:The Americanjournal of gastroenterology, 1996，91:49 ；Chou M:Disease Markers, 2000，16:105 ；Lai IR etal:Hepato—gastroenterology，2002，49:115 Edip U et al!Advances inTheray, 2008, 25:1075);還有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)糖蛋白抗原_72 (TAG-72)對胃癌的敏感性為69%，特異性為84% (劉軍等實用醫(yī)學(xué)雜志，1999，15:4);糖蛋白抗原MG7_Ag在血清中有40% -60%的陽性檢出率，在胃癌組織中有80% -94%的陽性檢出率(Ren J:Cancer，2000,88 :280);核小體組蛋白類抗原(IP0 — 38)作為胃癌診斷的敏感性為57. 4%，特異性超過90% (Hao Y etal: J Proteome Res, 2008，7:3668)以上這些指標(biāo)均有利于早期胃癌的診斷。某些腫瘤基因，如DDC、C-myC、C-erb-2、p53以及nm23等對胃癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移也有一定意義，但廣泛應(yīng)用于臨床仍受限制(劉倩等，人民衛(wèi)生出版社，2004)。由于現(xiàn)有的胃癌生物標(biāo)識物在靈敏度和特異性上的缺陷，雖然在療效監(jiān)測、提示復(fù)發(fā)、判斷預(yù)后和高危人群的普查中具有一定的價值，但目前仍不能用于胃癌的確診。為了實現(xiàn)對胃癌的早期高靈敏性，高特異性的診斷，急需在分子水平上尋找到更敏感、更特異的胃癌生物標(biāo)志物。我們在前期研究中利用人蛋白質(zhì)組芯片高通量、快速分析的優(yōu)勢，分析了胃癌病人相關(guān)血清101份(胃癌病人37份、高危病人14份、健康人血清50份)，在較短時間內(nèi)比較了患者和健康人樣品中的不同，給出了候選血清生物標(biāo)志物，以期早期診斷和有效治療胃癌。 蛋白BFAR (bifunctional apoptosis regulator)雙功能凋亡調(diào)節(jié)子最早是由Zhang等人發(fā)現(xiàn)的一種多結(jié)構(gòu)域的膜整合蛋白(Zhang H et al :PNAS, 2000, 97:2597),它含有450個氨基酸。BFAR主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，少量分布在線粒體膜(Roth W et al =CellDeath Differ, 2003, 10:1178)，包括4個可識別結(jié)構(gòu)域N末端鋅指結(jié)合RING環(huán)結(jié)構(gòu)域，可結(jié)合泛素連接酶E2s ；SAM結(jié)構(gòu)域，能促進(jìn)Bcl-2和Bcl-X的相互作用，抑制Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；DED結(jié)構(gòu)域,與procaspases-10的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域DED序列同源，有報道稱其直接或間接與caspase8和caspaselO前體相關(guān),阻礙Fas介導(dǎo)的凋亡信號通路；以及C末端跨膜結(jié)構(gòu)域TM，BFAR通過TM定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上(李紅梅等中國科學(xué)，2011，41:1140 )。有研究發(fā)現(xiàn)，BFAR的組織表達(dá)譜有高度特異性，僅在腦組織中高表達(dá)(Roth W et al =Cell DeathDiffer,2003, 10:1178)。目前，未見有將BFAR蛋白質(zhì)作為胃癌生物標(biāo)志物的報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的在于提供一種診斷試劑盒，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的胃癌診斷試劑盒不能實現(xiàn)對胃癌的早期高靈敏性、高特異性的診斷的技術(shù)性問題。本發(fā)明的第二目的在于提供一種BFAR在制備胃癌早期診斷試劑中的應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的胃癌診斷試劑不能實現(xiàn)對胃癌的早期高靈敏性、高特異性的診斷的技術(shù)性問題。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種診斷試劑盒，用于胃癌早期的診斷，所述診斷試劑盒包括酶標(biāo)板、人蛋白質(zhì)BFAR、標(biāo)準(zhǔn)血清、酶標(biāo)試劑、酶底物溶液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液和終止液，其中，所述人蛋白質(zhì)BFAR包被于所述酶標(biāo)板上。優(yōu)選地，所述人蛋白質(zhì)BFAR是從釀酒酵母中過量表達(dá)，親和純化而得到，濃度為10u g/mL0優(yōu)選地,所述標(biāo)準(zhǔn)血清包括0U/mL標(biāo)準(zhǔn)血清I和100U/mL標(biāo)準(zhǔn)血清2,所述0U/mL標(biāo)準(zhǔn)血清I為健康人血清稀釋于樣品稀釋液中；所述100U/mL標(biāo)準(zhǔn)血清2為BFAR抗體為陽性的血清稀釋于樣品稀釋液中。優(yōu)選地，所述酶標(biāo)試劑含HRP- 二抗0. 1-1 u g/mL。優(yōu)選地，所述酶底物溶液為TMB溶液，所述TMB溶液包括顯色劑A和顯色劑B，顯色劑A :500mL溶液中含有醋酸鈉13. 6g、檸檬酸I. 6g和30%雙氧水0. 3mL ;顯色劑B :500mL溶液中含有TMB 350mg、DMS0 20mL和檸檬酸 H205. lg。優(yōu)選地，所述封閉液為0. 5%BSA的0. 01mol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)溶液，即 I 升溶液中含 5g BSA (牛血清白蛋白)、8g NaCUO. 2g KH2PO4,2. 9g Na2HPO4 12H20和 0. 2g KCl。優(yōu)選地，所述樣品稀釋液為0. 01mol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS);所述洗滌液為 0. 01mol/L pH 7. 4 磷酸鹽-NaCl 緩沖液(PBST), PBST 內(nèi)含 0. 05%Tween_20,即 I 升溶液中含 8g NaCl.O. 2g KH2PO4,2. 9g Na2HPO4 12H20、0. 2g KCl 和 0. 5mL Tween-20 ;所述終止液為2mol/L H2SO4溶液。優(yōu)選地，所述試劑盒中的試劑均可加入防腐劑。一種診斷試劑盒，用于胃癌早期的診斷，所述診斷試劑盒采用的是現(xiàn)在臨床廣泛 使用的ELISA技術(shù)，應(yīng)用間接法定性檢測人血清中抗蛋白質(zhì)BFAR的IgA抗體；具體是用人蛋白質(zhì)BFAR抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中依次加入待測血清，再與HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合，形成BFAR-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色，TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，顏色的深淺和樣品中的抗蛋白質(zhì)BFAR的IgA抗體的水平呈正相關(guān)。人蛋白質(zhì)BFAR在制備胃癌早期診斷試劑中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有以下優(yōu)點I、提供一種靈敏、安全、可靠、易操作的商品化試劑盒，定性測定人血清中抗蛋白質(zhì)BFAR的IgA抗體的水平，有助于輔助早期診斷胃癌；2、提供的血清生物標(biāo)志物人蛋白質(zhì)BFAR的特異性為84%，敏感性為85%，具有高特異性和高敏感性的特點。


圖I為銀染鑒定BFAR的表達(dá)濃度、純化狀況的示意圖，圖中I表示標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液濃度為5 u g/mL ；2表示標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液濃度為10 U g/mL ；3表示標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液濃度為25 U g/mL ；4表示標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液濃度為50 U g/mL ；5表示標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液濃度為100 U g/mL ；6表示經(jīng)瓊脂糖親和介質(zhì)(谷胱甘肽)(國家生化工程技術(shù)研究中心)分離純化后的BFAR蛋白質(zhì)樣品(含GST標(biāo)簽)；7表示蛋白質(zhì)分子量marker，從大到小分子量分別是170KD，130KD，95KD，72KD，55KD ；圖2為Western-Blotting鑒定BFAR的表達(dá)、純化狀況的示意圖，圖中I表示經(jīng)瓊脂糖親和介質(zhì)(谷胱甘肽)(國家生化工程技術(shù)研究中心)分離純化后的BFAR蛋白質(zhì)樣品(含GST標(biāo)簽)；2表示蛋白質(zhì)分子量marker，從大到小分子量分別是130KD，95KD，72KD，55KD ；
圖3為健康人、高危、胃癌患者血清中抗蛋白質(zhì)BFAR的IgA抗體的濃度變化曲線圖,注圖中的數(shù)值是健康人、高危、胃癌患者各300份血清樣本中的抗蛋白質(zhì)BFAR的IgA抗體濃度的相對水平。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。I、表達(dá)、純化及鑒定BFAR 蛋白質(zhì)BFAR是由基因工程改造過的釀酒酵母利用半乳糖誘導(dǎo)過量表達(dá)，之后，經(jīng)瓊脂糖親和介質(zhì)(谷胱甘肽)分離純化而得到，對其進(jìn)行銀染定量和Western-Blotting鑒定的結(jié)果分別如圖I和圖2所示。2、血清樣品的準(zhǔn)備 全血標(biāo)本于室溫放置2小時或4°C過夜后于IOOOg離心20分鐘左右，取上清即可立即檢測；或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于_20°C或_80°C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后檢測。所檢測樣品中不能含有NaN3,因為NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。3、ELISA法中各種緩沖液及試劑的配制方法(I)包被緩沖液0. 05M pH 9. 6 的 Na2CO3-NaHCO權(quán)利要求
1.一種診斷試劑盒，用于胃癌早期的診斷，其特征在于，所述診斷試劑盒包括酶標(biāo)板、人蛋白質(zhì)BFAR、標(biāo)準(zhǔn)血清、酶標(biāo)試劑、酶底物溶液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液和終止液，其中，所述人蛋白質(zhì)BFAR包被于所述酶標(biāo)板上。
2.如權(quán)利要求I所述的ー種診斷試劑盒，其特征在于，所述人蛋白質(zhì)BFAR是從釀酒酵母中過量表達(dá)，親和純化而得到，濃度為IOy g/mL。
3.如權(quán)利要求I所述的ー種診斷試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)血清包括OU/mL標(biāo)準(zhǔn)血清I和100U/mL標(biāo)準(zhǔn)血清2,所述OU/mL標(biāo)準(zhǔn)血清I為健康人血清稀釋于樣品稀釋液中；所述100U/mL標(biāo)準(zhǔn)血清2為BFAR抗體為陽性的血清稀釋于樣品稀釋液中。
4.如權(quán)利要求I所述的ー種診斷試劑盒，其特征在干，所述酶標(biāo)試劑含HRP-ニ抗0.1-1μ g/mL0
5.如權(quán)利要求I所述的ー種診斷試劑盒，其特征在于，所述酶底物溶液為TMB溶液，所述TMB溶液包括顯色劑A和顯色劑B，顯色劑A 500mL溶液中含有醋酸鈉13. 6g、檸檬酸1.6g和30%雙氧水O. 3mL ;顯色劑B :500mL溶液中含有TMB 350mg、DMS0 20mL和檸檬酸·Η205.丄g0
6.如權(quán)利要求I所述的ー種診斷試劑盒，其特征在干，所述封閉液為O.5%BSA的O.01mol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)溶液，即I升溶液中含5g BSA (牛血清白蛋白)、8g NaCl、O. 2g KH2PO4,2. 9g Na2HPO4 · 12H20 和 0. 2g KCl。
7.如權(quán)利要求I所述的ー種診斷試劑盒，其特征在干，所述樣品稀釋液為O.Olmol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS);所述洗滌液為O. Olmol/L ρΗ7· 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBST)，PBST 內(nèi)含 O. 05%Tween-20,即 I 升溶液中含 8g NaCl、O. 2g KH2PO4,2. 9gNa2HPO4 · 12Η20、0· 2g KCl 和 O. 5mL Tween-20 ;所述終止液為 2mol/L H2SO4 溶液。
8.如權(quán)利要求I所述的ー種診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中的試劑均可加入防腐剤。
9.一種診斷試劑盒，用于胃癌早期的診斷，其特征在于，所述診斷試劑盒采用的是現(xiàn)在臨床廣泛使用的ELISA技術(shù)，應(yīng)用間接法定性檢測人血清中抗蛋白質(zhì)BFAR的IgA抗體；具體是用人蛋白質(zhì)BFAR抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中加入待測血清，再與HRP標(biāo)記的ニ抗結(jié)合，形成BFAR-抗體-酶標(biāo)ニ抗復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色，TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，顔色的深淺和樣品中的抗蛋白質(zhì)BFAR的IgA抗體的水平呈正相關(guān)。
10.人蛋白質(zhì)BFAR在制備胃癌早期診斷試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種診斷試劑盒及BFAR在制備胃癌早期診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的診斷試劑盒，用于胃癌早期的診斷，所述診斷試劑盒包括酶標(biāo)板、人蛋白質(zhì)BFAR、標(biāo)準(zhǔn)血清、酶標(biāo)試劑、酶底物溶液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液和終止液，其中，所述人蛋白質(zhì)BFAR包被于所述酶標(biāo)板上。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有以下優(yōu)點1、提供一種靈敏、安全、可靠、易操作的商品化試劑盒，定性測定人血清中抗蛋白質(zhì)BFAR的IgA抗體的水平，有助于輔助早期診斷胃癌；2、提供的血清生物標(biāo)志物人蛋白質(zhì)BFAR的特異性為84%，敏感性為85%，具有高特異性和高敏感性的特點。
文檔編號G01N33/96GK102680688SQ20121014916
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者劉炳亞, 朱正綱, 李建芳, 楊麗娜, 燕敏, 王靖方, 郭書娟, 陶生策 申請人:上海交通大學(xué)