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      鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學方法

      文檔序號:484529閱讀:1408來源:國知局
      鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學方法
      【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學領域,具體的說是一種鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學方法,該方法提取總DNA;利用DNA條形碼通用引物擴增雙翅目昆蟲的線粒體COI基因前段序列作為標記;并進行物種鑒別的序列特征比對,從而進行物種鑒定。本發(fā)明方法能對桔小實蠅、果蠅和麗蠅三種害蟲不同生物型以及幼蟲或殘缺個體進行鑒定,具有準確、迅速、便捷和費用低的特點,相比傳統(tǒng)的形態(tài)特征鑒定方法,節(jié)省了時間也降低費用;本方法對使用的儀器設備要求較低,一般的分子生物學實驗室均可進行,比傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒別更準確可靠,并從根本上解決了當前桔小實蠅、果蠅和麗蠅幼蟲在檢疫過程中較難進行準確鑒定的難題,填補了行業(yè)空白,具有重要意義。
      【專利說明】鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學方法

      【技術領域】
      [0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領域,具體的說是一種鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學方 法。

      【背景技術】
      [0002] 桔小實蠅(Bactrocera dorsalis Hendel)是一種世界危害性檢疫害蟲,該蟲寄主 范圍較廣,能取食香蕉,柑橘,楊桃,番石榴,芒果,茄子,辣椒等46個科250多種水果和蔬 菜。該物種主要以幼蟲為害,成蟲產卵于果皮下,幼蟲孵化后靠取食果肉發(fā)育,被危害的果 實會出現(xiàn)腐爛和未熟先黃脫落的癥狀,嚴重影響各種水果果實的質量和品質,甚至失去食 用價值。由于該蟲具有寄主范圍廣,繁殖力高,適應能力強,危害性大的特點,給果蔬業(yè)和花 卉業(yè)造成嚴重的經濟損失,許多國家都將其列為重點檢疫對象,在中國桔小實蠅被列為二 類檢疫性害蟲。
      [0003] 果蠅英文俗名fruit fly或vinegar fly,廣泛存在于全球溫帶及熱帶氣候區(qū),由 于其主食為腐爛的水果,因此在人類的棲息地內如果園、菜市場等地區(qū)內皆可見其蹤跡,與 桔小實蠅一樣,主要以幼蟲為害,成蟲產卵于果皮下,幼蟲孵化后靠取食果肉發(fā)育。除了南 北極外,目前至少有1〇〇〇個以上的果蠅物種被發(fā)現(xiàn),大部分的物種以各種腐爛的水果或植 物體為食,少部分則只取用真菌,樹液或花粉為其食物。對水果的危害主要見于使得櫻桃等 很多水果種類快速腐爛,從而造成經濟損失。
      [0004] 麗蠅是屬于雙翅目麗蠅科。成蟲除在肉、魚、腐肉上產卵外,也可在人、畜的傷口內 產卵,引起蠅蛆癥。這種習性常為偶然現(xiàn)象,但在有些種類中則為固有的特性。一般卵生, 少數(shù)蚴蟲,即產生活的幼蟲,繁殖數(shù)量極大。對人體有危害,除了造成騷擾外,部分種類具醫(yī) 學上的重要性,例如大頭金蠅可機械性地傳播腸道傳染病,蛆癥金蠅是專性蠅蛆癥的病原 昆蟲,引起人畜的蠅蛆癥,在經濟上有重要意義。麗蠅是芒果重要的授粉昆蟲,農民會以無 食用價值的魚頭等,吸引麗蠅前來產卵,并為其授粉,以增加產量。由于引致人類及動物蠅 蛆病的成因主要是來自狂蠅總科、麗蠅及麻蠅科,故此麗蠅很多成為治療此病的研究對象。 單單銅綠蠅在澳大利亞每年就造成超過1. 7億美元的經濟損失。在人類發(fā)生的蠅蛆病主要 分類6種:皮膚及皮下、面部、傷口或創(chuàng)傷、胃腸道、陰道及一般的蠅蛆病。蠅蛆病的幼蟲一 般都是在一齡階段?,F(xiàn)時唯一的治療方法是清除蛆蟲,讓病人自行康復。
      [0005] 由于桔小實蠅、果蠅和麗蠅同屬雙翅目昆蟲,其卵、幼蟲和蛹很難鑒定;傳統(tǒng)的物 種鑒別主要依賴于專業(yè)的昆蟲分類學家花費大量時間和精力整理積累后所描述的形態(tài)特 征,存在較大的局限性,不僅費時費力,而且常受主觀因素干擾,極易混淆出錯。其次,傳統(tǒng) 的鑒別方法難以展開針對三種幼蟲或殘缺個體的鑒別。
      [0006] 快速而準確的物種鑒定是科學經濟的防治害蟲的必要前提和基礎。由于我國大部 分地區(qū)農業(yè)生產均采取間混套作(intercropping/interplanting)模式,且桔小實蠅具有 寄主范圍廣,繁殖力高的特點,使得這三種害蟲常常得以同域混合發(fā)生。因此有必要尋找一 些快捷、準確鑒別這三種害蟲的分子生物學方法,從而應用于檢疫和及時有效地控制其給 能源作物生產帶來的危害。
      [0007] 自2003年DNA條形碼(DNA barcodes)概念出現(xiàn)以來,DNA條形碼技術(DNA barcoding)受到生物分類學領域普遍關注,DNA條形碼,也稱DNA條形編碼,類似于超級 市場商品包裝上用于識別商品的粗細、間隔不同的黑白條紋圖案,線粒體細胞色素氧化酶 亞基I(mtDNA C0I)被用作動物類群的主要條形碼序列,基于該基因片段的昆蟲條形碼研 究在國內外廣泛開展,是利用線粒體DNA的細胞色素 C氧化酶亞基I基因 (Cytochrome C oxidase I,C0I)的前部約650bp長的序列作為標記來實現(xiàn)快速、準確和自動化地對物種進 行鑒定和分類。DNA條形碼快速而精確的特點彌補了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定的諸多不足,使其廣泛應 用于動物分類鑒定中。但是目前國內外尚無利用DNA條形碼作為分子標記區(qū)別鑒定桔小實 蠅、果蠅和麗蠅的報道。
      [0008] 因此,本發(fā)明首次通過DNA條形碼,即擴增測定這三個物種線粒體DNA的C0I基因 序列,結合相關軟件進行分析處理,實行快速簡捷,經濟實惠地對三種雙翅目昆蟲進行物種 鑒定;最終為及時有效的控制桔小實蠅的危害,從而保護其危害的水果和蔬菜等植物,提高 作物產量,降低作物產業(yè)成本提供必要的前提和基礎。


      【發(fā)明內容】

      [0009] 本發(fā)明的目的是針對桔小實蠅、果蠅和麗蠅幼蟲形態(tài)鑒定難,科學鑒別手段缺乏 的不足,提供一種科學有效、簡便快捷、準確的桔小實蠅害蟲的分子生物學鑒定方法。
      [0010] 為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用的技術方案是:一種鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學 方法,其特征在于,包括如下步驟:
      [0011] ⑴提取雙翅目昆蟲總DNA ;
      [0012] (2)利用DNA條形碼通用引物擴增線粒體C0I基因前段序列進行PCR擴增和測序 作為標記;
      [0013] (3)依據(jù)雙翅目昆蟲的核苷酸的序列特征變異位點進行物種鑒別。
      [0014] 進一步的,步驟(1)中,所述提取雙翅目昆蟲總DNA的個體為幼蟲。
      [0015] 進一步的,步驟(2)中,所述通用引物序列為:
      [0016] C0IF :5,-ggaatagtaggaacatcccttagaa-3,
      [0017] COIR :5,-acttctgggtgtccaaagaat-3,。
      [0018] 進一步的,所述PCR反應體系為50μ 1,其中模板DNA約25ng,25ul2XTaq PCR MasterMix,正反向引物各2pM,加去離子水(ddH20)調至終體積50ul ;
      [0019] PCR反應條件如下:95°C預變性2分鐘,94°C變性45秒,50°C復性45秒,72°C延伸 45秒,35個循環(huán)后,72°C延伸10分鐘,4°C保存
      [0020] 本發(fā)明的有益技術效果是:
      [0021] (1)本發(fā)明方法能對桔小實蠅、果蠅和麗蠅三種害蟲不同生物型以及幼蟲或殘缺 個體進行鑒定,具有準確、迅速、便捷和費用低的特點,相比傳統(tǒng)的形態(tài)特征鑒定方法,大大 節(jié)省了時間也減少了費用;
      [0022] (2)本發(fā)明方法對使用的儀器設備要求較低,一般的分子生物學實驗室均可進行, 比傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒別更準確可靠;
      [0023] (3)本鑒別方法從根本上解決了當前桔小實蠅、果蠅和麗蠅幼蟲在檢疫過程中較 難進行準確鑒定的難題,填補了行業(yè)空白,具有重要意義。

      【具體實施方式】
      [0024] 下面將結合本發(fā)明實施例,對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述, 顯然,所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例,而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的 實施例,本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例,都 屬于本發(fā)明保護的范圍。
      [0025] 實施例1
      [0026] 1、采用DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)提取雙翅目昆蟲桔小 實蠅、果蠅和麗蠅總DNA。為了鑒定幼蟲,DNA提取全部測定的是幾種雙翅目昆蟲的幼蟲個 體。
      [0027] 2、利用DNA條形碼通用引物PCR擴增線粒體C0I基因前段序列和序列測定,具體 包括以下步驟:
      [0028] ① PCR擴增和測序所用的引物為:
      [0029]

      【權利要求】
      1. 一種鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學方法,其特征在于,包括如下步驟: (1) 提取雙翅目昆蟲總DNA ; (2) 利用DNA條形碼通用引物擴增線粒體COI基因前段序列進行PCR擴增和測序作為 標記; (3) 依據(jù)雙翅目昆蟲的核苷酸的序列特征變異位點進行物種鑒別。
      2. 根據(jù)權利要求1所述鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學方法,其特征在于,步驟(1)中, 所述提取雙翅目昆蟲總DNA的個體為幼蟲。
      3. 根據(jù)權利要求1所述鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學方法,其特征在于,步驟(2)中, 所述通用引物序列為: COIF :5, -ggaatagtaggaacatcccttagaa~3, COIR :5J _acttctgggtgtccaaagaat_3,〇
      4. 根據(jù)權利要求1或3所述鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學方法,其特征在于,步驟(2) 中,所述PCR反應體系為50μ1,其中模板DNA約25ng,25ul2XTaq PCR MasterMix,正反向 引物各2pM,加去離子水(ddH20)調至終體積50ul ; PCR反應條件如下:95°C預變性2分鐘,94°C變性45秒,50°C復性45秒,72°C延伸45 秒,35個循環(huán)后,72°C延伸10分鐘,4°C保存。
      【文檔編號】C12Q1/68GK104120189SQ201410393538
      【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權日:2014年8月12日
      【發(fā)明者】李地艷, 楊明耀, 吳楠, 徐懷亮, 胡耀東, 姚永芳 申請人:四川農業(yè)大學
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