一種與肝癌相關(guān)的血液miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與人類肝癌相關(guān)的血液miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用。該標(biāo)志物為人類血液中腫瘤源性exosome來源的miRNA-26a和miRNA-199a的組合。本發(fā)明首先分離純化了肝癌患者和肝臟良性疾病患者人群外周血中腫瘤源性exosome，并進行了miRNA芯片分析篩選出了上述兩種表達差異的miRNA，并且上述結(jié)論經(jīng)過了QPCR驗證。本發(fā)明的標(biāo)志物及其檢測試劑可用于制備診斷試劑盒，用于肝癌的早期診斷。
【專利說明】-種與肝癌相關(guān)的血液miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種與人類肝癌相關(guān)的血液miRNA標(biāo)志物及 其應(yīng)用；具體涉及人類血液中腫瘤源性的exosome來源的miRNA-26a和miRNA-199a的組合 及其在診斷肝癌中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 微小RNA (micro RNA，簡稱miRNA)是一類短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的單鏈 小分子RNA，長約18-24nt。微小RNA來源于長度約為lOOObp的長鏈RNA初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 (Pri-miRNA)，Pri-miRNA分子在細胞核中經(jīng)Drosha酶剪切形成長度約60-80nt的具有莖 環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體（Pre-miRNA)。miRNA前體轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)后，被進一步加工成miRNA。
[0003] 微小RNA在動植物細胞中通過對目標(biāo)mRNA的切割和轉(zhuǎn)錄抑制發(fā)揮重要作用，參 與細胞生長、組織分化和腫瘤形成等多種過程。miRNA在物種間具有高度的保守性、時續(xù) 性和組織特異性。目前認為miRNA在細胞凋亡、增殖、分化、血管生成及腫瘤形成等方面均 具有重要的調(diào)節(jié)作用，參與人體大約30%的基因調(diào)節(jié)，與腫瘤、心血管疾病、肝病、免疫紊亂 及代謝紊亂等多種發(fā)病有關(guān)。在上述疾病中，miRNA與腫瘤的關(guān)系是很多研究的重點。已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)若干miRNA通過負調(diào)控基因的表達與慢性淋巴細胞性白血病、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸 癌高度相關(guān)。miRNA的正調(diào)控靶基因現(xiàn)象是最近的發(fā)現(xiàn)，具體機制還不明確。有學(xué)者提出 了"癌microRNA"（OncomiRs) "的觀點即認為某些miRNA的異常表達在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過 程中充當(dāng)了類似癌基因的角色。miRNA的表達主要由miRNA基因首先表達為miRNA前體 (pri-miRNA)，pri-miRNA 經(jīng)轉(zhuǎn)運出核后，由 Dicer 酶剪切成為 pre-miRNA，pre-miRNA 表現(xiàn) 為典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖部序列不完全互補配對。其莖部序列經(jīng)剪切后成為成熟體miRNA從 而發(fā)揮生物學(xué)功能。
[0004] Exosomes是一種納米級的小囊泡狀結(jié)構(gòu)，存在于血液或其他生物體液中。它形 成于眾多細胞（包括樹突狀細胞和腫瘤細胞）的胞吐作用。Exosomes的外膜是由脂質(zhì)雙 分子層組成，其成分包含有選擇性蛋白、mRNA和miRNA。在Exosomes中包含有大于120種 的miRNA, exosome中的miRNA可以影響干細胞變異（let-7)、器官形成（miR-1)、造血作用 (miR-181)、腫瘤發(fā)生（miR-17、miR-18、miR-19a、miR-20、miR-19b-l、miR-93-l)以及新陳 代謝。
[0005] 肝癌是世界上第五大常見的癌癥，也是死亡率排行第三的癌癥。80%的肝癌常與 慢性乙型肝炎病毒和/或丙型肝炎病毒感染有關(guān)。如此高的致死率是因為缺乏敏感而特異 的無創(chuàng)性指標(biāo)來進行早期診斷。由于早期肝癌癥狀不明顯，通常在晚期才得以確診，那時， 由于大多存在癌細胞肝內(nèi)或/及肝外轉(zhuǎn)移，病人已經(jīng)喪失了手術(shù)切除病灶的機會。目前，肝 癌的診斷主要依賴于影像學(xué)上發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)腫物，包括超聲、CT、核磁共振（MRI)等，同時結(jié)合 血清中的腫瘤標(biāo)志物如AFP等。但是，這兩種方法的敏感性及特異性都不是十分令人滿意。 因此開發(fā)一種高敏感性和特異性的肝癌診斷方法是亟待解決的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種與人類肝癌相關(guān)的血液miRNA標(biāo)志 物，所述標(biāo)志物是exsome來源的miRNA_26a和miRNA_199a的組合，miRNA_26a的序列信息 如SEQ ID NO. 1所示；miRNA-199a的序列信息如SEQ ID N0. 2所示。使用本發(fā)明的miRNA 標(biāo)志物來進行肝癌的早期診斷，靈敏性和特異性均優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。
[0007] 本發(fā)明還提供了與人類肝癌相關(guān)的血液miRNA標(biāo)志物在制備診斷人類肝癌的試 劑盒中的應(yīng)用，所述標(biāo)志物是exsome來源的miRNA-26a和miRNA-199a的組合，miRNA-26a 的序列信息如SEQ ID NO. 1所示；miRNA-199a的序列信息如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 本發(fā)明還提供了上述與人類肝癌相關(guān)的血液miRNA標(biāo)志物的檢測試劑。所述試劑 包括QPCR實驗中使用的反轉(zhuǎn)錄引物和/或擴增引物；所述反轉(zhuǎn)錄引物為Oligo(dT)特異性 的RT引物；對于miRNA-26a來說，所述擴增引物的上游引物序列如SEQ ID N0. 3所示，所述 擴增引物的下游引物為通用反向引物；對于miRNA-199a來說，所述擴增引物的上游引物序 列如SEQ ID N0. 4所示，所述擴增引物的下游引物為通用反向引物。在本發(fā)明的一個具體 的實施方案中，所述通用反向引物購自北京曠博生物技術(shù)有限公司。
[0009] 本發(fā)明還提供了與人類肝癌相關(guān)的血液miRNA標(biāo)志物的檢測試劑在制備診斷人 類肝癌的試劑盒中的應(yīng)用，所述試劑包括QPCR實驗中使用的反轉(zhuǎn)錄引物和/或擴增引 物；所述反轉(zhuǎn)錄引物為01 i go (dT)特異性的RT引物；對于miRNA-26a來說，所述擴增引 物的上游引物序列如SEQ ID N0. 3所示，所述擴增引物的下游引物為通用反向引物；對于 miRNA-199a來說，所述擴增引物的上游引物序列如SEQ ID N0. 4所示，所述擴增引物的下游 引物為通用反向引物。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述通用反向引物購自北京曠 博生物技術(shù)有限公司。所述診斷試劑盒包含上述引物序列。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種診斷人類肝癌的試劑盒，所述試劑盒包含與人類肝癌相關(guān)的 血液miRNA標(biāo)志物的檢測試劑，所述試劑包括QPCR實驗中使用的反轉(zhuǎn)錄引物和/或擴增 引物；所述反轉(zhuǎn)錄引物為Oligo(dT)特異性的RT引物；對于miRNA-26a來說，所述擴增引 物的上游引物序列如SEQ ID N0. 3所示，所述擴增引物的下游引物為通用反向引物；對于 miRNA-199a來說，所述擴增引物的上游引物序列如SEQ ID N0. 4所示，所述擴增引物的下游 引物為通用反向引物。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述通用反向引物購自北京曠 博生物技術(shù)有限公司。
[0011] 優(yōu)選地，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含QPCR常用的試劑和酶，所述常用試劑包含 PCR反應(yīng)緩沖液、核糖核酸酶抑制劑、dNTP等；所述酶包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、poly A多聚酶。 還可以包括標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br> [0012] 具體來說，本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案包括：
[0013] (1)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫和數(shù)據(jù)庫，以標(biāo)準(zhǔn)操作程序采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本， 系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床資料；
[0014] (2)血液中腫瘤源性exosome來源的miRNA差異表達譜分析：選擇肝癌病例和肝 臟良性疾病患者的血液樣本,收集腫瘤源性exosome來源的miRNA，進行芯片分析，篩選差 異表達的miRNA ;
[0015] (3)對已篩選的差異表達miRNA在大樣本人群中進行定量分析。
[0016] 上述步驟（3)中的大樣本定量分析可以采用RT-PCR、QPCR、Solexa測序技術(shù)、 Tapman low densityarray(TLDA)芯片檢測等來完成。在本發(fā)明的具體的實施方案中，采用 QPCR進行驗證。
[0017] 采用QPCR進行差異表達miRNA的驗證，具體的操作步驟為：
[0018] (1)分離純化血液中腫瘤源性的exosome ;
[0019] (2)提取樣本總RNA;
[0020] (3)將步驟⑵獲得的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ;
[0021] (3)在熒光實時定量PCR儀上將miRNA和參照基因進行擴增檢測；
[0022] (4)通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，Λ Λ CT法進行相對定量。
[0023] 步驟⑴具體的操作為：
[0024] a.全血3000*g離心15min，移去細胞和細胞碎片；
[0025] b.取上層液體移入離心管，加入適量exoquick試劑，4°C下反應(yīng)30min ;優(yōu)選 250 μ 1血清中加入63 μ 1 exoquick試劑；
[0026] c. 1500*g 離心混合液 30min (exosome 沉于管下）；
[0027] d.吸出上清，離心1500*g 5min吸出所有上清（不能震動離心管）；
[0028] e.用250 μ 1 PBS溶解全部沉淀，_20°C保存。
[0029] 步驟（2)的具體實施方法為：
[0030] ①加入Trizol，室溫保存5min ;
[0031] ②加氯仿0. 2ml，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5min-10min ;
[0032] ③12000rpm高速離心15min后吸取上層水相（吸70% )到另一新離心管中，注 意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的_20°C預(yù)冷異丙醇，充分顛 倒混勻，置于冰上l〇min ;
[0033] ④12000rpm高速離15min后小心棄掉上清液，按lml/ml Trizol的比例加入75% DEPC乙醇洗滌沉淀（4°C保存），洗滌沉淀物，振蕩混合，4°C下12000rpm高速離心5min ;
[0034] ⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉 淀；
[0035] ⑥用Nan〇dr〇p2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-70°C。
[0036] 步驟（3)將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA可以采用加尾法或莖環(huán)法將總RNA中的miRNA反轉(zhuǎn) 錄成cDNA。
[0037] 加尾法的實驗原理是：在小RNA 3'末端由poly A聚合酶加上一段poly A尾巴， 然后用一個3'末端含有一段poly T的長引物將miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，所得到的cDNA的長 度比較適合進行熒光定量PCR。
[0038] 莖環(huán)法的實驗原理是：該方法應(yīng)用了一個單一的莖環(huán)狀的引物，避免對目的 miRNA進行加尾。反應(yīng)過程分兩步：首先，莖環(huán)狀引物與目的miRNA分子的3'端結(jié)合，引物 3'端與miRNA3'端有6個互補配對的核苷酸，然后用逆轉(zhuǎn)錄酶將之逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。 其次是PCR反應(yīng)。cDNA第一鏈的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)打開后鏈的長度增加了，以其為模板即可進行 傳統(tǒng)的熒光定量PCR。莖環(huán)狀引物的莖部為雙鏈結(jié)構(gòu)，防止引物與pre-miRNA或其他長鏈 RNA的雜交；莖部的堿基堆積增強了 miRNA和DNA異質(zhì)雙鏈的親合力，提高了逆轉(zhuǎn)錄的效 率；且莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)展開后增加了 miRNA的長度，為隨后進行的PCR反應(yīng)提供了合適的模板。
[0039] 在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，使用加尾法將miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。具體 操作步驟為：將10 pg-1 μ g的總RNA模板與2 μ 1 10*緩沖液、2 μ 1 dATP (lOmM)、0. 5 μ 1 polyA多聚酶、0. 5μ 1核糖核酸酶（RNase)抑制劑和無核糖核酸酶水（RNase free water) 混合，體積最后為20yl,37°C孵育1 h。然后反應(yīng)管中加入Ιμ? 0. 5yg/yl Oligo(dT) 特異性RT引物，70°C孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打斷RNA和引物的二級結(jié)構(gòu)。最 后，將上述20 μ 1反應(yīng)混合物與4 μ 1 5*緩沖液、1 μ 1 dNTP (10mM)，0. 5 μ 1 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄 酶，0. 5 μ 1核糖核酸酶（RNase)抑制劑，10 μ 1 polyA反應(yīng)混合液和4 μ 1無核糖核酸酶水 (RNase free water)混合，42°C孵育lh。未稀釋的cDNA模板保存在-20°C以備用。
[0040] 步驟⑷的具體實施方法為：采用25 μ 1反應(yīng)體系，每個樣本設(shè)置3個平行管，所 有擴增反應(yīng)均重復(fù)三次以上以保證結(jié)果的可靠性。配制以下反應(yīng)體系：SYBR Green聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12. 5 μ 1，正向引物（5 μ Μ/μ 1) 1 μ 1，反向引物（5 μ Μ/μ 1) 1 μ 1，模板cDNA 2. 0μ1，無酶水8. 5μ1。各項操作均于冰上進行。擴增程序為：95°C10min，（95°C15s， 60°C 60s) *45個循環(huán)。以SYBR Green作為熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光實時定量PCR 儀上進行PCR反應(yīng)。擴增miRNA-26a的正向引物序列如SEQ ID NO. 3所示，反向引物為通 用反向引物（購自北京曠博生物技術(shù)有限公司）；擴增miRNA-199a的正向引物序列如SEQ ID N0.4所示，反向引物為通用反向引物（購自北京曠博生物技術(shù)有限公司）。以snRNA U6 作為參照基因，其上游引物序列為SEQ ID NO. 5所示，下游引物序列為SEQ ID NO. 6所示。
[0041] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果如下：
[0042] (1)血液中腫瘤源性exosome來源的miRNAs是一種新型生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng) 生物標(biāo)志物，不僅穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測，且定量精確，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異 性，該類小分子RNA生物標(biāo)志物的成功開發(fā)有助于肝癌的輔助診斷，為其他疾病生物標(biāo)志 物的研制提供借鑒。
[0043] (2)通過檢測血液中腫瘤源性exosome來源的miRNAs的表達來診斷人類肝癌是否 發(fā)生的試劑盒是一種系統(tǒng)、全面的診斷和監(jiān)測試劑盒，可用于肝癌患者的輔助診斷，有助于 反映肝癌患者的疾病狀態(tài)，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情、及時采取更具個性化的防 治方案提供支持。
[0044] (3)采用嚴(yán)密的設(shè)計和評價體系，本發(fā)明人初期采用miRNA芯片對miRNAs進行分 析，且應(yīng)用qRT-PCR的方法在大樣本中進行了驗證；以上方法和策略的應(yīng)用加速和保證了 血液中腫瘤源性exosome來源的miRNAs生物標(biāo)志物和診斷試劑盒的應(yīng)用，也為其他疾病生 物標(biāo)志物的研制提供方法和策略上的借鑒。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0045] 圖1顯不利用QPCR驗證血液中腫瘤源性exosome來源的miRNA_26a(圖1A)和 miRNA-199a (圖1B)的表達情況；
[0046] 圖2顯示exosome來源和血液來源的miRNA_26a和miRNA_199a在肝癌患者、肝硬 化和正常人的分布情況，其中A :exosome來源的miRNA_26a ;B :血液來源的miRNA_26a ;C : exosome 來源的 miRNA_199a ;D :血液來源的 miRNA_199a ;
[0047] 圖3顯示利用R0C曲線分析miRNA-26a和miRNA-199分別在區(qū)分肝癌組和正常組 時的敏感性和特異性，其中A :miRNA-26a ;B :miRNA-199a ;
[0048] 圖4顯示利用ROC曲線分析miRNA-26a和miRNA-199a組成的miRNA-panel在區(qū) 分肝癌組和正常組時的敏感性和特異性。
[0049] 具體的實施方式
[0050] 下面結(jié)合具體的實施例進一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施例僅用于解釋本發(fā)明， 并不意味著限制本發(fā)明的保護范圍。
[0051] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0052] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0053] 實施例1與人類肝癌相關(guān)的miRNA的篩選
[0054] 1. 1樣本的收集和樣本資料的整理
[0055] 發(fā)明人于2013年1月在北京腫瘤醫(yī)院收集了大量的肝癌患者和肝臟良性疾病患 者的外周血樣本（用于研究的樣本為同期收集、采樣、分裝、保存條件均一），通過對樣本資 料的整理，發(fā)明人從中選擇了 20例符合同醫(yī)院、盡量同科室隨機收集的肝癌病人血漿（乙 肝-肝硬化-肝癌）和20例同醫(yī)院與實驗組同一時期隨機收集的肝臟良性疾病患者的血 漿，盡量避免采取有肝癌家族史人的血漿的樣本進行miRNA芯片的檢測。
[0056] 1. 2 miRNA 芯片檢測
[0057] 1. 2. 1 exosome的分離與純化
[0058] (1)全血3000*g離心15min，移去細胞和細胞碎片；
[0059] (2)取上層液體移入離心管，加入適量Exoquick試劑，4°C下反應(yīng)30min ;優(yōu)選 250 μ 1血清中加入63 μ 1 Exoquick試劑；
[0060] ⑶l5〇0*g離心混合液3〇min (exosome沉于管下）；
[0061] (4)吸出上清，離心1500*g 5min吸出所有上清（不能震動離心管）；
[0062] (5)用250 μ 1 PBS溶解全部沉淀，_20°C保存。
[0063] 1. 2. 2 總 RNA 的提取
[0064] ①加入Trizol，室溫保存5min ;
[0065] ②加氯仿0. 2ml，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5min-10min ;
[0066] ③12000rpm高速離心15min后吸取上層水相（吸70% )到另一新離心管中，注 意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的_20°C預(yù)冷異丙醇，充分顛 倒混勻，置于冰上l〇min ;
[0067] ④12000rpm高速離15min后小心棄掉上清液，按lml/ml Trizol的比例加入75% DEPC乙醇洗滌沉淀（4°C保存），洗滌沉淀物，振蕩混合，4°C下12000rpm高速離心5min ;
[0068] ⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉 淀；
[0069] ⑥用Nan〇dr〇p2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-70°C。
[0070] 1. 2. 3 miRNA 芯片操作
[0071] miRNA芯片購自ABI公司，按照說明書的指示進行miRNA表達譜的檢測。
[0072] 1.2.4 結(jié)果
[0073] 根據(jù)miRNA芯片的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)肝癌患者腫瘤源性的exosome來源的 miRNA-26a、miRNA-29c、miRNA-199a的表達高于肝臟良性疾病患者，其中以miRNA-26a、 miRNA_29c差異最為明顯。
[0074] 實施例2 QPCR驗證差異表達的miRNA
[0075] 根據(jù)miRNA芯片的檢測結(jié)果，選擇miRNA-26a和miRNA-199a進行大樣本QPCR驗 證。按照實施例1中的樣本收集和樣本資料的整理的方式選擇肝癌組和肝臟良性疾病組各 100例樣本。
[0076] 2. 1 RNA提取過程同實施例1。
[0077] 2. 2 逆轉(zhuǎn)錄：將 10 pg-Ι μ g 的總 RNA 模板與 2 μ 1 10* 緩沖液、2 μ 1 dATP (10mM)、 0. 5μ 1 polyA多聚酶、0. 5μ 1核糖核酸酶（RNase)抑制劑和無核糖核酸酶水（RNase free water)混合，體積最后為20 μ 1,37 °C孵育1 h。然后反應(yīng)管中加入Ιμ? 0.5 μ g/μ 1 Oligo(dT)特異性RT引物，70°C孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打斷RNA和引物的 二級結(jié)構(gòu)。最后，將上述20μ1反應(yīng)混合物與4μ1 5*緩沖液、Ιμ? dNTP(10mM)，0. 5μ1 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，0· 5 μ 1核糖核酸酶（RNase)抑制劑，10 μ 1 polyA反應(yīng)混合液和4 μ 1無核 糖核酸酶水（RNase free water)混合，42°C孵育lh。
[0078] 2. 3QPCR反應(yīng)：采用25 μ 1反應(yīng)體系，每個樣本設(shè)置3個平行管，所有擴增反應(yīng)均 重復(fù)三次以上以保證結(jié)果的可靠性。配制以下反應(yīng)體系：SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系 12. 5 μ 1，正向引物（5 μ Μ/μ 1) 1 μ 1，反向引物（5 μ Μ/μ 1) 1 μ 1，模板 cDNA 2. 0 μ 1，無酶水 8.5以1。各項操作均于冰上進行。擴增程序為：951：1〇1^11，（951：158,6〇1：6〇8)*45個循 環(huán)。以SYBR Green作為熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光實時定量PCR儀上進行PCR反 應(yīng)。擴增miRNA-26a的正向引物序列如SEQ ID N0.3所示，反向引物為通用反向引物（購 自北京曠博生物技術(shù)有限公司）；擴增miRNA-199a的正向引物序列如SEQ ID N0. 4所示，反 向引物為通用反向引物（購自北京曠博生物技術(shù)有限公司）。以snRNA U6作為參照基因， 其上游引物序列為SEQ ID N0. 5所示；下游引物序列為SEQ ID N0. 6所示。通過融解曲線 分析和電泳確定目的條帶，△ △CT法進行相對定量，結(jié)果如圖1所示，與肝臟良性疾病患者 相比，miRNA-26a (圖1A)和miRNA-199a (圖1B)在肝癌患者血液中的含量低，同RNA-sep結(jié) 果一致。
[0079] 實施例3分析miRNA對肝癌發(fā)病的診斷
[0080] 以exosome來源的miRNA-26a、miRNA_199a為研究對象，并與血楽游離的miRNA在 對照組和肝癌組敏感性和特異性上作比較。以肝癌病人為實驗組、肝硬化病人和正常人作 為對照組，首先利用exoquic試劑來提取血楽中的exosome (步驟同實施例1)。選用40例 肝癌血漿樣本、20例肝硬化病人和20例正常人血漿樣本進行miRNA-26a QPCR實驗，求得 各標(biāo)本CT值，利用樣本miRNA-26a CT值比U6 CT值做散點圖（圖2A和圖2B)，實驗證明 exosome組聚集性比血楽組好，exosome組實驗結(jié)果和之前肝癌組織與癌旁組織miRNA_26a 表達趨勢相同，而血楽組不明顯，exosome組肝癌病人血楽與正常人血楽中的miRNA-26a 有統(tǒng)計學(xué)差異，利用R0C曲線分析顯示，miRNA-26a在區(qū)分肝癌組和正常組時，其AUC值是 0. 8537,最佳臨界點時的敏感性為81 %、特異性為61. 45% (圖3A)，而血漿組肝癌病人血漿 和肝硬化病人血漿組無統(tǒng)計學(xué)差異。而實驗結(jié)果顯示exosome中miRNA作為潛在的診斷標(biāo) 志物的靈敏性和特異性都好于血漿組，之后使用同樣的方法測得了 miRNA-199a的表達情 況，exosome中miRNA-199a在肝癌病人血漿和肝硬化病人血漿中有統(tǒng)計學(xué)差異（圖2C和圖 2D)，利用R0C曲線分析顯示，miRNA-199a在區(qū)分肝癌組和正常組時，其AUC值為0. 7853,最 佳臨界點時的敏感性為65%、特異性為63% (圖3B)?；趩蝹€miRNA特異性較差，我們把 兩種miRNA聯(lián)合作為一個miRNA panle，利用spss軟件做逐步回歸分析利用兩種miRNA以 診斷肝細胞性肝癌：以 l〇git(p = HCC) = 4. 117*miRNA-26a-0. 51*miRNA-199a-3. 259 制作 ROC曲線圖。并計算得利用miRNA-panle區(qū)分肝癌組和正常組時，其AUC值為0. 9785,最佳 臨界點時的敏感性為81. 5%、特異性為70% (圖4)，可見miRNA-26a和miRNA-199a聯(lián)合使 用診斷肝癌的敏感性和特異性均高于單獨使用其中任何一種miRNA。
[0081] 上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進 和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
[0082] SEQUENCE LISTING <110>中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院 <120> -種與肝癌相關(guān)的血液miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用 <160> 6 <170> Patcnlln version 3.3 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213>人源 <400 1 uucaaguaau ccaggauagg cu 22 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213>人源 <400> 2 cccaguguut aLatuaccug uuc 23 <210 3 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列
[0083] <400> 3 itcaagtaal ccaggatagg ct 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列 <400> 4 cccaglgtlc agactacclg Uc 23 <210〉 5 <211〉 17 <212> DNA <213>人工序列 <400> 5 cicgcticgg cagcaca 17 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <400> 6 aacgcUcac gaaUlgcgt 20
【權(quán)利要求】
1. 一種與人類肝癌相關(guān)的血液m i RNA標(biāo)志物，其特征在于，所述m i RNA標(biāo)志物是 exosome來源的miRNA_26a和miRNA_199a的組合，所述miRNA_26a的序列信息如SEQ ID NO. 1所示；所述miRNA-199a的序列信息如SEQ ID NO. 2所示。
2. 權(quán)利要求1所述的miRNA標(biāo)志物的檢測試劑，其特征在于，所述試劑包括QPCR實驗 中使用的反轉(zhuǎn)錄引物和/或擴增引物；所述反轉(zhuǎn)錄引物為Oligo(dT)特異性的RT引物；對 于miRNA-26a來說，所述擴增引物的上游引物序列如SEQ ID NO. 3所示，所述擴增引物的 下游引物為通用反向引物；對于miRNA-199a來說，所述擴增引物的上游引物序列如SEQ ID NO. 4所示，所述擴增引物的下游引物為通用反向引物。
3. 權(quán)利要求1所述的miRNA標(biāo)志物在制備人類肝癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求2所述的試劑。
5. 權(quán)利要求2所述的試劑在制備人類肝癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求2所述的試劑。
7. -種人類肝癌診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒包含權(quán)利要求2所述的試 劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒還包含PCR反應(yīng)常 用的試劑和酶。
9. 一種檢測權(quán)利要求1所述的miRNA標(biāo)志物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步 驟： (1)分離純化血液中腫瘤源性的exosome ; ⑵提取樣本總RNA ; (3) 將步驟⑵獲得的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ; (4) 在熒光實時定量PCR儀上將步驟（3)獲得的cDNA和參照基因進行擴增檢測； (5) 通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，Λ ACT法進行相對定量。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA使用的引物序 列為Oligo (dT)特異性的RT引物；對于miRNA-26a來說，所述擴增引物的上游引物序列如 SEQ ID NO. 3所示，所述擴增引物的下游引物為通用反向引物；對于miRNA-199a來說，所述 擴增引物的上游引物序列如SEQ ID NO. 4所示，所述擴增引物的下游引物為通用反向引物。
【文檔編號】C12N15/11GK104152452SQ201410410069
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】肖文華, 王碩, 屈雪玲, 李小梅, 董偉偉, 趙慧霞 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院