專利名稱：用于治療血液惡性腫瘤的組合物和方法
用于治療血液惡性腫瘤的組合物和方法發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用于治療血液惡性腫瘤的組合物和方法，并且具體地但非排他性地，涉及融合蛋白及其組合物和使用方法。
發(fā)明背景
免疫系統(tǒng)存在兩個主要的分支，它們由稱為B淋巴細胞和T淋巴細胞(B細胞和T細胞)的不同類型的細胞支持。當B細胞遇見抗原時，它們產(chǎn)生抗體，并且在大多數(shù)情況下，這些抗體是保護性的。然而，在自身免疫性疾病中，這些抗體中的一些與個體的組織進行反應(yīng)。當它們在組織中沉積時，它們引起炎癥反應(yīng)和組織損傷。類似于B細胞，T細胞在遇見抗原時也被活化。隨 著T細胞發(fā)展，它們經(jīng)歷一個稱為“胸腺教育”的過程。在胸腺馴育過程中，多于95%的T細胞死亡。已經(jīng)具有可以識別并且與個體本身的組織(自體抗原)進行反應(yīng)的T細胞受體的T細胞被確切地消除。然而，一些自身反應(yīng)性T細胞逃脫了該消除過程，并且可以啟動導致自身免疫性疾病的免疫應(yīng)答。
T細胞活性的調(diào)節(jié)仍然是在具有免疫病理學T細胞的疾病中的一個重要的治療目標。T細胞受體(TCR)刺激之后的T淋巴細胞的命運由共刺激性和抑制性受體輸入的整合來引導?？乖f呈細胞(APC)上的共刺激性配體觸發(fā)了 T細胞上的同源受體分子，結(jié)果增強了 T細胞增殖、細胞因子分泌以及分化。相比之下，抑制性配體分子至T淋巴細胞上的同源反受體的結(jié)合通過誘導T細胞無應(yīng)答性或程序性細胞死亡(PCD)(又叫做凋亡)而減少了效應(yīng)子功能。在共刺激因子阻斷的存在下展示出增加的抑制劑活性的實驗提示了共刺激性和抑制性受體通路相互作用。
細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)性蛋白4 (CTLA-4 (⑶152))是在活化的T淋巴細胞的表面上表達的一種抑制性受體分子。在與駐留在APC上的B7-1 (⑶80)和/或B7-2 (⑶86)配體接合之后，CTLA-4反受體經(jīng)由締合的SHP-2磷酸酶而抑制T細胞活化。在活化的T細胞上，CTLA-4作為二硫鍵連接的同型二聚體糖蛋白復合物存在。一種重組的、可溶的CTLA-4:免疫球蛋白G (CTLA-4:1g)嵌合蛋白通過競爭性地阻斷⑶80/⑶86分子結(jié)合至T細胞表面上的活化CD28受體而展示出抑制功能。CTLA-4:1g還在具有移植排斥和自身免疫性疾病的動物模型中，通過阻斷經(jīng)由CD28的T細胞共刺激而展現(xiàn)出免疫抑制活性。此外，使用CTLA-4:1g的APC處理拮抗了經(jīng)由⑶28的細胞內(nèi)T細胞存活信號傳導，這可以增加對Fas依賴性PCD的易感性。在美國專利號5，885，776 ;5，885，579 ;5，851，795 ；以及5，968，510中討論了 CTLA-4以及CTLA-4:1g融合蛋白的作用。
凋亡(或P⑶)是細胞死亡的一種獨特形式，它對細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控是至關(guān)重要的。在免疫系統(tǒng)中，F(xiàn)as (⑶95)受體及其配體FasL (⑶95L)，參與了涉及誘導凋亡(包括免疫細胞介導的細胞毒性)、以及調(diào)控細胞免疫應(yīng)答的多個過程。FasL是腫瘤壞死因子超家族中的一個成員，并且是由免疫細胞的一個受限子集來表達，該子集包括單核細胞、NK細胞、以及活化的B和T細胞。在細胞表面上，F(xiàn)asL被定向作為三聚體復合物內(nèi)的II型膜蛋白。膜相關(guān)性FasL的金屬蛋白酶的切割使可溶的FasL (sFasL)三聚體從該膜中釋放。該FasL分子觸發(fā)Fas依賴性P⑶。
分子或分子復合物的化合價可以通過與細胞表面締合來增加。重組sFasL分子的不同編碼序列影響大分子聚集，并且進而又影響sFasL促凋亡功能。具體地說，一種天然加工的sFasL分子形成了三聚體，并且不佳地誘導凋亡。相比之下，一種重組的全長細胞外結(jié)構(gòu)域sFasL多肽形成了更高級的聚集體，并且顯示出高效的凋亡活性。另外，由人293細胞中的重組表達所產(chǎn)生的sFasL的復合物需要交聯(lián)以用于Fas敏感性細胞的溶解。
美國專利號5，830，469披露了單克隆抗體和特異性結(jié)合人Fas抗原的結(jié)合蛋白；這些抗原和抗體中的一些被報道為刺激T細胞增殖、抑制抗FasCH-1I單克隆抗體介導的細胞溶解、以及阻斷Fas配體介導的細胞溶解。還披露了 Fas-Fc融合蛋白。
美國專利號5，242，687 ;5，601，828 ；以及5，623，056披露了含有一個CD8組分的各種融合蛋白，這些融合蛋白結(jié)合至一種細胞但是不掩蔽由該細胞產(chǎn)生的信號。
美國專利號5，359，046披露了多種嵌合蛋白，這些嵌合蛋白包含一個能夠以非MHC限制性方式結(jié)合至配體的細胞外結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域以及一個能夠活化信號傳導通路的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。類似的技術(shù)披露在美國專利號5，686，281中。
發(fā)明概述
背景技術(shù)沒有傳授或建議通過給予對阻斷和信號傳導均有用的嵌合蛋白來治療淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的方法。
本發(fā)明在至少一些實施例中通過提供以下方法克服了背景技術(shù)的這些缺點，即:通過給予對阻斷和信號傳導均有用的嵌合蛋白來治療淋巴瘤和/或多發(fā)性骨髓瘤的方法。
在至少一些實施例中，提供的是含有這類嵌合蛋白、被適配成用于治療淋巴瘤和/或多發(fā)性骨髓瘤的藥用組合物。
“淋巴瘤”意思是淋巴系統(tǒng)中B或T細胞的惡性生長，任選地包括霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
根據(jù)至少一些實施例，該非霍奇金淋巴瘤選自下組，該組由以下各項組成:侵襲性NHL、轉(zhuǎn)化型NHL、惰性NHL、復發(fā)性NHL、難治性NHL、低級非霍奇金淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、NK細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、急性成淋巴細胞性淋巴瘤、以及皮膚T細胞癌，包括蕈樣真菌病/Sezry綜合征。
“惰性”非霍奇金 淋巴瘤是包括淋巴瘤的緩慢生長形式的一個分類。它們包括工作分類(Working Formulation)中的所謂的低級和一些類別的中級NHL。惰性NHL有時不應(yīng)答于常規(guī)的癌癥療法，如化學療法和放射療法。惰性NHL和其他惡化前形式的NHL也可以發(fā)展成NHL。對于該疾病的惡化前或良性形式，可任選地可以應(yīng)用這些組合物及其方法用于預(yù)防(除治療之外或代替治療)，例如可任選地以停止該疾病進展成惡性形式的NHL。
“轉(zhuǎn)化型”非霍奇金淋巴瘤是有時用來描述獲得侵襲性的方面并且變得對標準化學療法更具應(yīng)答性的惰性NHL的一個分類。
“多發(fā)性骨髓瘤”是指特征在于終末分化的B細胞(漿細胞)在骨髓中累積的任何類型的B細胞惡性腫瘤。
根據(jù)至少一些實施例，多發(fā)性骨髓瘤選自下組，該組由以下各項組成:產(chǎn)生K型輕鏈和/或λ型輕鏈的多發(fā)性骨髓瘤癌癥；和/或侵襲性多發(fā)性骨髓瘤，包括原發(fā)性漿細胞白血病(PCL);和/或可任選地包括良性漿細胞病癥，如MGUS (意義不明的單克隆丙種球蛋白病)和/或可發(fā)展成多發(fā)性骨髓瘤的瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥(WaldenstrGm’smacroglobulinemia)(麗，又稱為淋巴漿細胞性淋巴瘤);和/或燜燃型多發(fā)性骨髓瘤(SMM)、和/或惰性多發(fā)性骨髓瘤、也可發(fā)展成多發(fā)性骨髓瘤的多發(fā)性骨髓瘤的惡化前形式；和/或原發(fā)性淀粉樣變性。對于該疾病的惡化前或良性形式，可任選地可以應(yīng)用這些組合物及其方法用于預(yù)防(除治療之外或代替治療)，例如可任選地以停止該疾病進展成惡性形式的多發(fā)性骨髓瘤。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例，提供的是一種治療選自下組的白血病的方法，該組由以下各項組成:急性非淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性粒細胞性白血病、慢性粒細胞性白血病、急性早幼粒細胞性白血病、成人T細胞白血病、非白血性白血病、白血性白血病(leukocythemic leukemia)、嗜堿細胞性白血病、母細胞白血病、牛白血病、慢性髓細胞性白血病、皮膚白血病、胚細胞性白血病(embryonal Ieukemia)、嗜酸細胞性白血病、格羅斯白血病(Gross’ leukemia)、毛細胞白血病、成血細胞性白血病(hemoblasticleukemia)、血胚細胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、組織細胞性白血病、干細胞白血病(stem cell leukemia)、急性單核細胞白血病、白細胞減少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞性白血病、淋巴原性白血病(lymphogenous leukemia)、淋巴樣白血病(lymphoid leukemia)、淋巴肉瘤細胞白血病、肥大細胞白血病、巨核細胞性白血病、小原粒型白血病(micromyeloblastic leukemia)、單核細胞性白血病、成髓細胞性白血病、髓細胞性白血病、髓樣粒細胞性白血病、髓單核細胞白血病、內(nèi)格利型白血病(Naegeli leukemia)、漿細胞白血病、漿細胞性白血病、早幼粒細胞性白血病、里德爾氏細胞性白血病(Rieder cell leukemia)、希林氏白血病(Schilling，s leukemia)、干細胞白血病、亞白血性白血病、以及未分化細胞白血病。
在至少一些實施例中，提供的是含有這類嵌合蛋白、被適配成用于治療選自上組的白血病的藥用組合物。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例，該嵌合蛋白選自下組，該組由CTLA4_FasL和CD40-FasL蛋白組成。
2009年8月4日授權(quán)于Tykocinski等人的美國專利號7，569，663 (其猶如在此完全陳述而通過引用結(jié)合在此)描述了同時充當阻斷蛋白和信號傳導蛋白的嵌合蛋白。這類嵌合蛋白包括CTLA4-FasL和⑶40-FasL蛋白。在此專利中還提供了這樣的數(shù)據(jù):它證實了 CTLA-4-FasL嵌合蛋白抑制人外周血T細胞針對促有絲分裂抗CD3抗體的多克隆增殖的功效。還描述了使用和生產(chǎn)的方法。
如在此所使用，術(shù)語“治療”是指提供來減輕疾病的護理，并且是指治療性治療或預(yù)防性(prophylactic/preventative)措施,其中目的是預(yù)防或減緩(減少)目標病理病狀或病癥。需要治療的那些包括已經(jīng)具有該病癥的那些，以及傾向于具有該病癥的那些或其中該病癥有待被預(yù)防的那些。如在此所使用的術(shù)語治療還指代“維持療法”，該維持療法是一種提供來阻止病理病狀或病癥在初始療法后已經(jīng)消失之后復發(fā)的治療。
術(shù)語“治療有效量”是指根據(jù)本發(fā)明的試劑的有效治療哺乳動物的疾病或病癥的量。
根據(jù)嵌合蛋白 和/或其藥用組合物(單獨或結(jié)合其他治療學或藥品(用于組合療法))的任何以上所述的實施例，根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例提供了用于治療如在此所述的血液惡性腫瘤的組合物及其治療方法。這樣的一種或多種另外的治療學或藥品可以容易地由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來選擇。
如在此所使用的術(shù)語“組合療法”是指同時或連續(xù)給予兩種或更多種藥物或療法類型來治療一種單一的疾病，優(yōu)選地具有一種協(xié)同效應(yīng)。具體地說，該術(shù)語是指根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例的任何嵌合蛋白或藥用組合物與至少一種另外的藥物或療法的組合使用。因此，使用根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例的試劑進行的疾病治療可以與本領(lǐng)域熟知的多種療法相結(jié)合，這些療法包括但不限于放射療法、抗體療法、化學療法或手術(shù)，或處于與其他生物劑、常規(guī)藥品、抗癌劑、免疫抑制劑、用于癌癥的細胞毒性藥品、化療劑的組合療法中。
根據(jù)至少一些實施例，使用根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例的試劑進行的多發(fā)性骨髓瘤的治療可以結(jié)合這樣的試劑，包括但不限于:美法侖(Melphalan)、沙利度胺(MPT)、或組合硼替佐米(Bortezomib)(萬河(Velcade))、美法侖(melphalan)、潑尼松(VMP)、或來那度胺(Lenalidomide)加低劑量地塞米松的組合；和/或生物磷酸鹽類；化學療法(例如，燒化劑、長春新堿、阿霉素)；自體干細胞移植；以及皮質(zhì)激素類(例如潑尼松和地塞米松)。
根據(jù)至少一些實施例，使用根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例的試劑進行的白血病的治療可以結(jié)合這樣的試劑，包括但不限于:α-干擾素；白細胞介素-2 ;阿糖胞苷和米托蒽醌；阿糖胞苷和柔紅霉素和6-硫鳥嘌呤；環(huán)磷酰胺和2-氯-2’-脫氧腺苷；VP-16和阿糖胞苷和埃得霉素或米托蒽醌；氟達拉濱和阿糖胞苷和Y-CSF ;苯丁酸氮芥；環(huán)磷酰胺和長春新堿和(潑尼松龍或潑尼松)和可任選的阿霉素；酪氨酸激酶抑制劑；以及抗體；谷氨酰胺；氯貝酸；全反式維甲酸；人參二炔類似物；KRN8602(蒽環(huán)霉素藥品);替莫唑胺和聚(ADP-核糖)聚合酶抑制劑；利索茶堿(Iysofylline);阿糖胞苷；chlythorax和富集中鏈甘油三酯的要素經(jīng)腸飲食(elemental enteral diet);氨磷??；以及gilvusmycin。
根據(jù)至少一些實施例，使用根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例的試劑進行的淋巴瘤的治療可以結(jié)合這樣的試劑，包括但并不限于:長春花生物堿，如長春新堿、長春堿、長春地辛、或長春瑞賓；蒽環(huán)霉素， 如阿霉素；組合，如CHOP (長春新堿、環(huán)磷酰胺、阿霉素以及潑尼松)；以及其他合適的生物堿類，包括但不限于鬼白樹脂類、鬼白毒素類、及其衍生物(例如，依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷等)、喜樹堿類(例如，伊立替康、托泊替康等)、紫杉烷類(紫杉酚等)、及其衍生物。
如在此所使用，術(shù)語“協(xié)同效應(yīng)”或“協(xié)同作用”是指使用多種治療劑、包括至少一種根據(jù)本發(fā)明的任何實施例的治療劑的組合所見到的更大的作用，其中該治療作用大于這多種試劑在單獨給予時的相加作用。“更大的治療作用”是指更大的癌癥作用和/或一種或多種副作用的減少。
如在此所使用，術(shù)語“受試者”包括任何人或非人動物。術(shù)語“非人動物”包括所有的脊椎動物，例如，哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類動物、羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。
附圖簡要說明


圖1.T和B惡性細胞系上的融合蛋白反受體的表達。將表達⑶40L的(J-⑶40L+)和不表達⑶40L的(J⑶40L-)惡性T細胞系、以及Raji和Daudi惡性B細胞系，使用結(jié)合FITC的抗⑶95、抗⑶80、抗⑶86或抗⑶40L單克隆抗體(黑色)、或使用同種型對照抗體(白色)進行免疫染色，并且然后通過流式細胞術(shù)進行分析，如在方法中所述。
圖2.J-CD40L+ 和 J-CD40L-細胞對 CTLA-4.FasL 和 CD40.FasL 的易感性取決于相關(guān)反受體的表達。A.將表達⑶40L的(J-⑶40L+)和不表達⑶40L的(J-⑶40L-)惡性T細胞(上兩排)、以及Raji和Daudi惡性B細胞(下兩排)，在存在或不存在CTLA-4.FasL,CD40.FasL、或 sFas (各 30ng/ml)、或 CTLA-4.Ig 或 OMO-Fc (各 100ng/ml )、或指定的組合的情況下，鋪(0.5x105個)在圓底96孔板中。細胞用[3H]胸苷脈沖處理并孵育18h。測定重復進行三次。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為生長培養(yǎng)基中孵育的細胞的[3H]胸苷摻入的百分比。顯示的結(jié)果對于每種細胞系總結(jié)了 3個獨立的實驗。*P〈0.05相對對照物，**P〈0.0l相對對照物。B.將0.5x105個Raji細胞使用(黑條)或不使用(白條)CTLA-4.FasL (30ng/ml),在抗CD80或抗CD86抗體(B7阻斷劑)或它們的組合的存在下孵育18小時。增殖如在A中測定并呈現(xiàn)。這些結(jié)果總結(jié)了三個獨立的實驗。p〈0.05，**p〈0.01相對培養(yǎng)基。
圖3.J-CD40L+ 和 J-CD40L-細胞對由 CTLA-4.FasL 和 CD40.FasL 引起的凋亡誘導的易感性取決于它們的相關(guān)反受體的表達。將J-CD40L+、CD40L (J-CD40L-)、Raji以及Daudi 細胞，在存在或不存在CTLA-4.FasUOMO *FasL、或 sFas(各 30ng/ml)、或CTLA-4 *Ig或CD40-Fc (各100ng/ml)、或指定的組合的情況下，孵育4h (T細胞)或16h (B細胞)。收獲26個細胞、用膜聯(lián)蛋白V和PI共染色、并且通過流式細胞術(shù)進行分析。A.在存在或不存在CTLA-4.FasL或⑶40.FasL的情況下的這些細胞系的代表性點陣圖分析。B-C.從Jurkat惡性T細胞系(B)、Raji和Daudi惡性B細胞系(C)的FACS分析中獲得的死亡細胞(膜聯(lián)蛋白V+/P1-+膜聯(lián)蛋白V+/PI+)的百分比。顯示了三個獨立實驗的總結(jié)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均值土 SD。**ρ〈0.01相對培養(yǎng)基。
圖4.CTLA-4.FasL和CD40.FasL各自影響凋亡和抗凋亡信號通路元素。將J-CD40L+、J-CD40L-、Raji 以及 Daudi 細胞，在存在或不存在 CTLA4.FasL、CD40.FasL、sFas、CTLA-4 UgXD^-Fc或如指示的它們的組合的情況下，孵育90分鐘。收集細胞，將全細胞溶解產(chǎn)物用10%SDS-PAGE分離，并且用指定的抗體進行免疫印跡。A.Jurkat惡性T細胞系以及Raji和Daudi惡性B細胞系的代表性免疫印跡。顯示的數(shù)據(jù)是對于每種細胞系的至少三個獨立實驗的代表性實驗。B-C.使用針對Raji (B)和Jurkat (C)細胞系的指定抗體的三個獨立實驗的總結(jié) 。顯示了半胱天冬酶3、9以及8的活性形式。數(shù)據(jù)相對GAPDH進行標準化。在培養(yǎng)基(對照物) 中孵育的細胞中的蛋白質(zhì)的表達被視為100%。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均值土SD。*p〈0.05相對培養(yǎng)基，**p〈0.01相對培養(yǎng)基。
圖5.CTLA4.FasL在JY惡性B細胞中增加凋亡信號并且減少抗凋亡蛋白cFLIP。將JY細胞在存在或不存在CTLA-4.FasL、⑶40.FasL或抗Fas抗體(CHlI)的情況下孵育90分鐘。收集細胞，將全細胞溶解產(chǎn)物用10%SDS-PAGE分離，并且用指定的抗體進行免疫印跡。A.對于每種細胞系的三個獨立實驗的代表性免疫印跡。B.具有cFLIPs和抗半胱天冬酶8抗體的JY惡性B細胞系的三個獨立實驗的總結(jié)。C.具有抗半胱天冬酶9和3抗體的JY惡性B細胞系的三個獨立實驗的總結(jié)。在培養(yǎng)基(對照物)中孵育的細胞中的蛋白質(zhì)的表達被視為100%。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均值土SD。*p〈0.05相對培養(yǎng)基，林p〈0.01相對培養(yǎng)基。
圖6.CTLA-4.Ig減少了表達B7的細胞的增殖并且影響它們半胱天冬酶和cFLIP的表達。A.將Raji惡性B細胞在CTLA-4 -FasL存在或不存在下，在用CTLA-4.Ig預(yù)孵育過夜的平底96孔板上進行孵育。測定重復進行三次。細胞用[3H]胸苷脈沖處理、孵育24小時、并且然后評估[3H]胸苷的摻入。將培養(yǎng)基(對照物)中的細胞的[3H]胸苷摻入指定為100%，并且其余的呈現(xiàn)為對照物的％—均值土SD。*P〈0.05相對對照物，**P〈0.01相對對照物。顯示的數(shù)據(jù)是三個獨立實驗的總結(jié)。B-C.將Raji細胞在預(yù)涂有CTLA-4.Ig的24孔板上孵育90分鐘。收集細胞，將全細胞溶解產(chǎn)物用10%SDS-PAGE分離，并且用指定的抗體進行免疫印跡。B.使用指定抗體的代表性免疫印跡。C.三個獨立實驗的總結(jié)。顯示了半胱天冬酶3、9以及8的活性形式。數(shù)據(jù)相對GAPDH進行標準化。在培養(yǎng)基(對照物)中孵育的細胞中的蛋白質(zhì)的表達被視為100%。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均值土SD。*p〈0.05相對培養(yǎng)基。
圖7和8示出，CTLA4_FasL以劑量依賴性方式誘導Raji和JY (B細胞淋巴癌細胞系)的死亡。
圖9 示出了 CTLA4_FasL 對 RPMI8226 的作用。
圖10示出了 CTLA4_FasL對早幼粒細胞性白血病細胞的作用。
圖11-14涉及在不同細胞系中結(jié)合CTAL4的⑶80和⑶86的表面表達、以及⑶95(Fas受體，它結(jié)合FasL)的表達。
圖15示出，CTLA4-FasL展現(xiàn)出針對SK-H印I肝癌細胞的細胞毒性作用。
圖16示出，泛半胱天冬酶抑制劑zVAD完全廢除了 CTLA4_FasL效應(yīng)。
示例性實施方案的說明
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例，提供了通過給予對阻斷和信號傳導均有用的嵌合蛋白來治療淋巴瘤和/或多發(fā)性骨髓瘤的方法。
根據(jù)至少一些實施例，該嵌合蛋白被提供于包含該蛋白以及藥學上合適的載體的藥用組合物中。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例的藥用組合物可以經(jīng)由一種或多種給藥途經(jīng)、使用本領(lǐng)域已知的一種或多種不同的方法來給予。如將為熟練的業(yè)內(nèi)人士所理解，給藥途經(jīng)和/或方式將隨所希望的結(jié)果而改變。用于本發(fā)明的治療劑的優(yōu)選給藥途經(jīng)包括血管內(nèi)遞送(例如，注射或輸注)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、經(jīng)脊柱、口服、腸內(nèi)、經(jīng)直腸、經(jīng)肺(例如，吸入)、經(jīng)鼻、局部(包括，透皮、經(jīng)頰和舌下)、膀胱內(nèi)、玻璃體內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)陰道、腦遞送(例如腦室內(nèi)、腦內(nèi)、以及對流增強擴散)、CNS遞送(例如,鞘內(nèi)、脊柱周(perispinal)、以及脊柱內(nèi))或腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)以及皮內(nèi))、透粘膜(例如，舌下給藥)、給予或經(jīng)由植入物的給予、或其他腸胃外給藥途徑，例如通過注射或輸注、或本領(lǐng)域已知的其他遞送途經(jīng)和/或給藥形式。如在此所使用的短語“腸胃外給藥”是指非腸內(nèi)和局部給予的、通常是通過注射的給予方式，并且包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眼眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外以及胸骨內(nèi)注射和輸注。
如在此所使用，“藥學上可接受的載體”包括生理上相容的任何以及所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、以及類似物。優(yōu)選地，該載體適合用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、經(jīng)脊柱或表皮給藥(例如，通過注射或輸注)。根據(jù)給藥途經(jīng)，嵌合蛋白可被包覆在一種材料中以保護該蛋白免受酸和其他可以使該蛋白滅活的天然條件的作用。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例的藥用組合物還可以包括一種藥學上可接受的抗氧化劑。藥學上可接受的抗氧化劑的實例包括:(I)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。可以在根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例的藥用組合物中采用的合適的水性和非水性載體的實例包括水、乙醇、多元醇類(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、及其合適的混合物、植物油(如橄欖油)、以及可注射的有機酯類,如油酸乙酯。適當?shù)牧鲃有钥梢酝ㄟ^以下方式來維持,例如,通過使用包衣材料(如卵磷脂)、在分散液的情況下通過維持所要求的粒徑、以及通過使用表面活性劑。
這些組合物還可以含有佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑以及分散劑。預(yù)防微生物存在可以通過在前的滅菌程序、以及通過包含各種抗細菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等來確保。還可能希望的是將等滲劑，如糖類、氯化鈉等包括至這些組合物中。此外，可以通過包含延遲吸收的試劑，如單硬脂酸鋁和明膠來引起可注射藥物形式的延長吸收。
藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液以及用于臨時制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。這類介質(zhì)和試劑用于藥學上活性物質(zhì)的用途在本領(lǐng)域中是已知的。只要任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物相容，就考慮其在根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例的藥用組合物中的使用。補充性的活性化合物也可以被并入這些組合物中。
治療組合物典型地在制造和儲存條件下必須是無菌且穩(wěn)定的。該組合物可被配制為溶液、微乳液、脂質(zhì)體、或適合于高藥品濃度的其他有序結(jié)構(gòu)。載體可以是含有，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、以及液體聚乙二醇等)、及其合適的混合物的一種溶劑或分散介質(zhì)。適當?shù)牧鲃有钥梢酝ㄟ^以下方式來維持，例如，通過使用一種包衣(如卵磷脂)、在分散液的情況下通過維持所要求的粒徑、以及通過使用表面活性劑。在許多情況下，將優(yōu)選的是在該組合物中包括等滲劑，例如，糖類、多元醇類如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯化鈉?？梢酝ㄟ^在該組合物中包括一種延遲吸收 的試劑(例如，單硬脂酸鹽類和明膠)來引起這些可注射組合物的延長吸收。無菌可注射溶液可以根據(jù)需要通過在具有以上所列舉的成分中的之一或組合的適當溶劑中以所要求的量并入該活性化合物，隨后進行滅菌微孔過濾來制備。通常，分散液是通過將該活性化合物并入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)以及來自以上所列舉的那些的所要求的其他成分的無菌媒介物中來制備。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，這些干燥產(chǎn)生了活性成分加來自其先前經(jīng)無菌過濾的溶液的任何另外的所希望成分的粉末。
無菌可注射溶液可以根據(jù)需要通過在具有以上所列舉的成分中的之一或組合的適當溶劑中以所要求的量并入該活性化合物，隨后進行滅菌微孔過濾來制備。通常，分散液是通過將該活性化合物并入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)以及來自以上所列舉的那些的所要求的其他成分的無菌媒介物中來制備。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，這些干燥產(chǎn)生了活性成分加來自其先前經(jīng)無菌過濾的溶液的任何另外的所希望成分的粉末。
可以與載體材料相組合產(chǎn)生一種單一劑型的活性成分的量將根據(jù)正被治療的受試者、以及具體的給藥方式而改變?？梢耘c載體材料相組合產(chǎn)生一種單一劑型的活性成分的量將通常是產(chǎn)生治療作用的組合物的那個量。通常，基于100%，與藥學上可接受的載體相組合，此量的范圍將為從約0.01%至約99%的活性成分、可任選地從約0.1%至約70%、可任選地從約1%至約30%的活性成分。
調(diào)整給藥方案以提供最佳的希望應(yīng)答(例如，治療應(yīng)答)。例如，可以給予快速灌注齊U、可以隨著時間的推移給予多個分次劑量、或可以如治療情況的緊急狀態(tài)所指示而按比例減少或增加該劑量。為了便于給藥和劑量一致性，尤其有利的是配制處于劑量單位形式的腸胃外組合物。如在此使用的劑量單位形式是指適合作為用于待被治療的受試者的單元劑量的物理上離散的單位；每個單位含有經(jīng)計算與所要求的藥物載體聯(lián)合產(chǎn)生所希望的治療作用的預(yù)定量的活性化合物。根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例的劑量單位形式的規(guī)格受以下兩項支配并且直接取決于這兩項:(a)該活性化合物的獨特特征和有待獲得的具體治療作用、以及(b)在復配這種活性化合物以用于治療個體敏感性的領(lǐng)域中所固有的限制。
對于嵌合蛋白的給予，劑量范圍為從約0.0001至100mg/kg宿主體重、并且更通常是0.01至5mg/kg宿主體重。例如，齊Li量可以是0.3mg/kg體重、lmg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重或在l-10mg/kg范圍內(nèi)。一個示例性的治療方案要求每周給予一次、每兩周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3個月一次或每三至6個月一次。
可替代地，該嵌合蛋白可以作為緩釋配制品給予，在此情況下要求不太頻繁的給予。劑量和頻率根據(jù)患者體內(nèi)的嵌合蛋白的半衰期而改變。給予劑量和頻率可以根據(jù)治療是預(yù)防性的或治療性的而改變。在預(yù)防性應(yīng)用中，在長時間段內(nèi)在相對不頻繁的間隔下給予相對低的劑量。一些患者在他們的余生中繼續(xù)接受治療。在治療性應(yīng)用中，有時要求在相對短的間隔下的相對高的劑量，直到疾病的進展被降低或終止為止、并且優(yōu)選直到患者顯示出疾病癥狀的部分或完全改善為止。此后，可以給予患者預(yù)防性方案。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例的藥用組合物中的活性成分的實際劑量水平可以改變，以便獲得針對具體患者、組合物、以及給藥方式而有效達到所希望的治療應(yīng)答，而不對該患者產(chǎn)生毒性的活性成分的量。選擇的劑量水平將取決于各種藥代動力學因素，包括:所采用的根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例的具體組合物、或其酯、鹽或酰胺的活性，給藥途徑，給藥時間，所采用的具體化合物的排泄率，治療的持續(xù)時間，與所采用的具體組合物組合使用的其他藥品、化合物和/或材料，正`被治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康狀況和先前病史，以及在醫(yī)學領(lǐng)域中熟知的類似因素。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例的嵌合蛋白的“治療有效劑量”優(yōu)選地導致疾病癥狀的嚴重度的降低、無疾病癥狀的時期的頻率和持續(xù)時間的增加、壽命增加、疾病緩解、或由疾病痛苦引起的損傷或失能的預(yù)防。例如，對于多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤和/或白血病的治療，相對于未治療的受試者而言，“治療有效劑量”可任選地將細胞生長或腫瘤生長抑制了至少約20%、40%、60%、80%。一種化合物的抑制腫瘤生長的能力可以在一種預(yù)測在人腫瘤中的功效的動物模型系統(tǒng)中進行評估。可替代地，可以通過經(jīng)由熟練的從業(yè)者已知的測定來檢測化合物抑制能力、如體外抑制的能力來評估組合物的此特性?？商娲鼗蛄硗獾?，合適的量或劑量還可以任選地至少部分地根據(jù)一種或多種另外的多發(fā)性骨髓瘤治療的給予來選擇，這些治療的給予可以任選地并且優(yōu)選地具有一種協(xié)同效應(yīng)并且因此可任選地使該給藥量得以調(diào)整。這樣的一種或多種另外的治療可以容易地由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來選擇。
可替代地或另外地，“治療有效劑量”優(yōu)選引起至少穩(wěn)定的疾病、優(yōu)選部分應(yīng)答、更優(yōu)選完全應(yīng)答，如由WHO或RECIST標準對于腫瘤應(yīng)答所評定(《國家癌癥研究所》(NatlCancer Inst) 1999;91:523-8 以及《癌癥》(Cancer) 1981;47:207-14)。
治療有效量的治療化合物可以減小腫瘤大小、或以其他方式改善受試者的癥狀、或以其他方式支持部分或完全穩(wěn)定的疾病和/或部分或完全的應(yīng)答，如上文所確定。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將能夠根據(jù)這類因素，如受試者的體型、受試者癥狀的嚴重度、以及所選擇的具體組合物或給藥途經(jīng)來確定這些量。
治療組合物可以用本領(lǐng)域已知的醫(yī)療裝置進行給予。例如，在一個優(yōu)選實施例中，根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例的治療組合物可以使用無針皮下注射裝置，如披露在美國專利號 5，399，163 ;5，383，851 ;5，312，335 ;5，064，413 ;4，941，880 ;4，790，824 ；或4，596，556中的裝置進行給予。在本發(fā)明中有用的眾所周知的植入物和模塊的實例包括:美國專利號4，487，603，該專利披露了一種用于以受控速率分配藥物的可植入微型輸注泵；美國專利號4，486，194，該專利披露了一種用于通過皮膚給予藥劑的治療裝置；美國專利號4，447，233，該專利披露了一種用于以精確輸注速率遞送藥物的藥物輸注泵；美國專利號4，447，224，該專利披露了一種用于連續(xù)藥品遞送的可變流量可植入輸注設(shè)備；美國專利號4，439，196，該專利披露了一種具有多腔室的滲透性藥品遞送系統(tǒng)；以及美國專利號4，475，196，該專利披露了一種滲透性藥品遞送系統(tǒng)。這些專利通過引用結(jié)合在此。許多其他的這類植入物、遞送系統(tǒng)、以及模塊是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所已知的。
在某些實施例中，根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例的嵌合蛋白可以被配制來確保在體內(nèi)的適當分布。例如，血腦屏障(BBB)排斥許多高度親水性化合物。為了確保根據(jù)本發(fā)明的至少一些實施例的治療化合物穿過BBB (如果需要的話)，可以將它們配制在例如脂質(zhì)體中。對于 制造脂質(zhì)體的方法，參見，例如美國專利號4，522，811 ;5，374，548 ;以及5，399，331。這些脂質(zhì)體可以包含一個或多個部分，這些部分選擇性地被輸送到特定的細胞或器官中，從而增強靶向藥品遞送(參見，例如拉納德(V.V.Ranade) (1989)《臨床藥理學雜志》(J.Clin.Pharmacol).29:685)。示例性祀向部分包括葉酸或生物素(參見,例如婁(Low)等人的美國專利號5，416，016);甘露糖苷(梅澤(Umezawa)等人，(1988)《生物化學與生物物理研究通訊》(Biochem.Biophys.Res.Commun.) 153:1038);抗體(布羅曼(P.G.Bloeman)等人(1995) ((FEBS 快報》(FEBS Lett.) 357:140 ;烏韋斯(M.0wais)等人(1995)《抗微生物劑化學療法》(Antimicrob.Agents Chemother.)39:180);表面活性蛋白A受體(布里斯科(Briscoe)等人(1995)《美國生理學雜志》(Am.J Physiol.) 1233:134)；pl20 (施雷爾(Schreier)等人(1994)《生物化學雜志》(J.Biol.Chem.> 269:9090);還參見凱納寧、勞卡寧(K.Keinanen;M.L.Laukkanen) (1994)《FEBS 快報》346:123 ;基利昂、菲德勒(J.J.Killion; 1.J.Fidler) (1994)《免疫方法》(Immunomethods) 4:273。
以下實例僅僅出于說明的目的而提供，并且不意在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在本說明書中引用的所有專利和文獻參考通過弓I用以其全部內(nèi)容結(jié)合在此。
實例1-嵌合蛋白用于治療血液惡性腫瘤的功效
材料和方法
細胞、抗體(Ab)、試劑以及融合蛋白
Daudi,Raji和JY以及293人腎細胞系最初是從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(美國馬里蘭州貝塞斯達)獲得。兩個Jurkat亞系(J-CD40L+和J-CD40L-)由約翰法延(JohnFayen)博士(美國俄亥俄州克利夫蘭凱斯西儲大學(CWRU，Cleveland, OH, USA))惠贈。每周對所有的細胞系進行隨訪，以驗證它們保留了其原有的外觀和生長速率，并保持無污染。
而且，反復測試細胞以驗證預(yù)期的表面分子的持續(xù)表達。如果疑似出現(xiàn)任何變化，則解凍新的批次。使用商用PCR試劑盒(以色列生物產(chǎn)業(yè)公司(BiologicalIndustries, Israel))測試培養(yǎng)基的支原體污染。
對⑶40L、⑶80、⑶86以及⑶95特異的FITC結(jié)合熒光抗體，連同它們的相匹配的FITC結(jié)合IgG同種型，從PharMingen公司(美國加利福尼亞州圣地亞哥購買。重組人CTLA-4.Ig (CTLA-4/Fc)和sFasL分別從安迪生物公司(R & D Systems)(美國明尼蘇達州)和Alexis生化公司(AlexisBiochemicals)(加利福尼亞州圣地亞哥)購買。OMO-Fc融合蛋白從Calbiochem公司(德國達姆斯塔特(Darmstadt, Germany))購買。抗人B7-1&B7-2(⑶80和86)抗體從安迪生物公司購買。對于蛋白質(zhì)印跡分析，抗-β肌動蛋白抗體和抗鼠GAPDH抗體分別從西格瑪奧瑞奇公司(Sigma-Aldrich)和Chemicon國際公司(ChemiconInternational)購買?？笷LIPS/L和抗半胱天冬酶8多克隆抗體(pAb)分別從圣克魯斯生物技術(shù)公司(Santa Cruz Biotechnology)(美國加利福尼亞州圣克魯斯)和MBL (美國醫(yī)學生物學實驗室有限公司(Medical&Biological Laboratories Co, USA))購買?？拱腚滋於?&9多克隆抗體從細胞信號傳導技術(shù)公司(Cell Signaling Technology)(麻薩諸塞州丹弗斯)購買。
用于所有實驗的培養(yǎng)基 是RPMI1640 (以色列生物產(chǎn)業(yè)公司)，補充有10%FBS (加利福尼亞州英杰生命技術(shù)公司(Invitrogen Life Technologies, CA))、2mM L-谷氨酰胺、以及100U/ml青霉素/鏈霉素(生物產(chǎn)業(yè)公司)。
分別如先前在以下各項中所述來制備CTLA-4.FasL的帶六聚組氨酸標簽的衍生物(his6CTLA-4.FasL)(該標簽附接至氨基末端)、以及CD40.FasL:黃(Huang JH)和泰科欽斯基(Tykocinski ML) (CTLA-4-Fas配體充當在橋聯(lián)抗原遞呈細胞和T細胞中的反式信號轉(zhuǎn)換器蛋白(CTLA-4-Fas ligand functions as a trans-signal converterprotein in bridging antigen-presenting cells and T cells,〈〈國際免疫學雜志〉〉(Int Immunol) 2001，13:529-539));阿爾哈萊爾(Elhalel MD)等人(CTLA-4.FasL 誘導同種抗原特異性應(yīng)答不足(CTLA-4.FasL induces alloantigen-specifichyporesponsiveness),《免疫學雜志》(J Immunol) 2003，170:5842-5850);以及德拉尼特茨基-阿爾哈萊爾(Dranitzk1-Elhalel M)等人(CD40.FasL抑制人T細胞:自抑制性環(huán)回機制的證據(jù)(CD40.FasL inhibits human T cells:evidence for an auto-1nhibitory loop-backmechanism),國際免疫學雜志(Int Immunol) 2007，19:355-363)。
增殖測定
將處于指數(shù)生長期的Jurkat、Daudi或Raji細胞洗漆兩次并且以1x106細胞/ml再懸浮在培養(yǎng)基中。將50 μ I細胞懸浮液添加至圓底96孔組織培養(yǎng)板的各個孔中。將CTLA-4.FasL、CD40.FasL、sFasL、CTLA-4.Ig 或 CD40.Fe、或后三項的組合以不同的濃度添加。總培養(yǎng)體積為200 μ I/孔。在一些實施例中，在添加CTLA-4 -FasL20分鐘之前添加抗⑶80或抗⑶86抗體。在其他實驗中，將PBS中的CTLA4 *Ig添加至平底96孔板中并且在37° C下孵育lh，并且然后在40° C下孵育過夜，以便用CTLA4.Ig預(yù)涂覆這些板。第二天，將板用PBS洗滌4次，并且將5x104個Raji細胞添加至每個孔中并孵育24h。培養(yǎng)物然后用0.5 μ Ci的[3Η]胸苷(美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆珀金埃爾默公司(PerkinElmer，Waltham, Massachusetts, USA))脈沖處理，并且在 37。C、6%C02 以及 95% 濕度下孵育 18-24小時。隨后將細胞收獲到玻璃纖維過濾器上以用于閃爍計數(shù)。所有的增殖測定重復進行三次。
流式細胞術(shù)
將細胞用FACS緩沖液(在IxPBS中的0.5%BSA/0.02%疊氮化鈉)洗滌兩次，并且在冰上使用以下各項之一孵育30-45分鐘:FITC結(jié)合的抗⑶40L抗體、抗⑶80抗體、抗⑶86抗體、抗CD95抗體、或它們的相匹配的同種型對照物，所有項從PharMingen公司(美國加利福尼亞州圣地亞哥)購買。流式細胞術(shù)使用FACSCalibur流式細胞儀(美國加利福尼亞州圣何塞 BD 公司(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA))來進行，并且數(shù)據(jù)使用 CellQuest 軟件(BD公司)進行分析。對于每個樣品收集總計1x105個事件。
為了追蹤經(jīng)歷凋亡的細胞，將1x106個Jurkat T細胞或1.5x106個Raji或Daudi B細胞以Iml的總體積在24孔板中、在以下各項的存在或不存在下進行孵育:CTLA-4.FasL、CD40.FasL、sFasL、CTLA4.Ig 或 CD40.Fe 或后三項的組合。4h (T 細胞)或16h (B細胞)之后，收集細胞并用冷FACS緩沖液(在Ix PBS中的0.5%BSA/0.02%疊氮化鈉)洗滌兩次。為了檢測凋亡和壞死，按照制造商的實驗方案，使用試劑盒(MBL，美國醫(yī)學生物學實驗室有限公司)利用碘化丙啶(PI)和膜聯(lián)蛋白-VFITC對細胞進行共染色。使用FACSCalibur流式細胞儀進行流式細胞術(shù)，并且使用CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。對于每個樣品收集總計1x105個事件。全細胞溶解產(chǎn)物和蛋白質(zhì)印跡分析
將處于指數(shù)生長期的Jurkat、Raj1、JY或Daudi細胞洗滌兩次，并且以5x106細胞/ml再懸浮在培養(yǎng)基中，并且以Iml的總體積鋪在24孔板中。將CTLA-4.FasUOMO -FasL,sFasL、CTLA4.Ig或⑶40_Fc、或后三項的組合以不同的濃度添加。90分鐘后，收集細胞、用冰冷的PBS洗滌兩次、并且在溶解緩沖液(0.5%Nonidet P_40、50mM Tris-HCl (pH8.0)、IOOmM NaClUmM PMSF、ImM原釩酸鈉、10 μ g/ml亮肽素、以及10 μ g/ml抑肽酶)中在冰上溶解20-30分鐘。全細胞溶解產(chǎn)物的蛋白濃度根據(jù)制造商的實驗方案，使用Bio-Rad蛋白測定試劑盒(加利福尼亞州里士滿Bio-Rad公司(Bio-Rad, Richmond, CA))來測定。將全細胞溶解產(chǎn)物與Laemmli樣品緩沖液(Bio-Rad公司)以1:1的比例混合、在95° C下加熱10分鐘，并且將等量的蛋白質(zhì)加載到10%SDSPAGE上。
電泳后，將凝膠印跡到硝酸纖維素膜(Schleicher & Schuell公司)上、用5%牛奶/PBS封閉、并用初級抗體探測過夜。充分洗滌之后，將印跡用HRP結(jié)合的相匹配的次級抗體(Bio-Rad公司)孵育，并在暴露于X射線膠片之前用增強型化學發(fā)光底物(西格瑪奧瑞奇公司)顯影。掃描膠片并通過ImageMaster VDS-CL (安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司(AmershamPharmacia Biotech))來量化。將所有的膜用抗_β肌動蛋白單克隆抗體(mAb)或抗GAPDH單克隆抗體再印跡，以驗證相似量的蛋白質(zhì)被加載到凝膠上。
結(jié)果
融合蛋白介導的 對細胞增殖的抑制是取決于同源受體的表面表達
作為第一步，確立CTLA-4 -FasL和⑶40 -FasL融合蛋白的組成部分的功能性。為此，使用在針對這些融合蛋白元素的反受體一即B7 (⑶80和⑶86)、⑶40配體(⑶40L)以及Fas受體(CD95) —的表達方面不同的惡性B (Raj1、JY以及Daudi)和T (Jurkat)細胞。在Jurkat的情況下，使其CD40L (J-CD40L+對比J_CD40L_)26的表達不同的兩個亞系成對。開始，通過免疫熒光法和流式細胞術(shù)來驗證在這些不同細胞系上的分子的表面表達(圖1)。如所預(yù)期，這些B和T細胞系分別對B7分子呈陽性和陰性，并且Daudi細胞表達出可忽略不計的Fas受體水平。J-⑶40L+和J-⑶40L-T細胞亞系之間的⑶40L表達的差異也得到證實。
接著，確定同源表面受體表達方面的差異是否與CTLA-4.FasL和⑶40.FasL抑制腫瘤系增殖的能力有關(guān)系(圖2A)。確切來說，在CTLA-4 ^FasUOMO WasUCTU^.Ig、⑶40-Fc、sFasL、或后三項的不同組合的存在或不存在下，將這些不同的細胞系用[3H]胸苷脈沖處理16_20h。如所預(yù)期，表達了極少的Fas受體的Daudi細胞的增殖既未被含F(xiàn)asL的融合蛋白一CTLA-4.FasL和⑶40.FasL中的任一個抑制，也未被sFasL抑制(圖2A，最底排)，從而突出了它們的抑制活性的Fas依賴性。相比之下，這些融合蛋白顯著抑制了其他兩種惡性B細胞系一Raj (圖2A)和JY (未顯示)的增殖，這兩種細胞系確實表現(xiàn)出Fas死亡受體。在抑制表達B7的惡性B細胞的增殖方面，CTLA-4.FasL實質(zhì)上比單獨的或組合的sFasL和CTLA4.Ig更有力。事實上，CTLA4.Ig在高達100ng/ml的濃度下對增殖沒有作用。
應(yīng)注意，針對B細胞系(它們對CD40L呈陰性)，CTLA_4FasL比CD40FasL顯著更有效。實際上，在高達30ng/ml的濃度下，⑶40FasL對B細胞系沒有抑制作用。
為了進一步探索針對⑶40 -FasL活性而言對于靶細胞上的⑶40L表達的要求，利用了在CD40L表達方面不同的Jurkat T細胞衍生系(J-CD40L+對比J-CD40L-)。與RajiB細胞相比，這兩種T細胞系均受到sFasL和含F(xiàn)asL的融合蛋白的更大程度的抑制(圖2A，上兩排)，其中J⑶40L-系是最敏感的。有趣的是，如先前所示，雖然在更高的⑶40.FasL濃度(例如，>100ng/ml)下，所有表達Fas的細胞都受到某種程度的抑制(未顯示)，但只有表達CD40L (J-CD40L+)的細胞受到低濃度的CD40.FasL的影響。
鑒于T細胞對所有形式的sFasL都高度敏感，不可能將它們用作B7陰性對照物來確立在CTLA-4.FasL活性方面對于B7表面表達的要求。因此，使用B7陽性B細胞作為靶標來進行抗體阻斷實驗。具體來說，比較了在不存在或存在針對CD80和CD86的拮抗性抗體下的CTLA-4.FasL的抑制作用(圖2B)。抗CD80阻斷抗體(0.5或I μ g/ml)顯著減弱了 CTLA-4.FasL (30ng/ml)的抑制作用。相比之下,抗⑶86抗體在相同的濃度下，對Raji細胞增殖的CTLA-4 -FasL抑制沒有作用。這兩種阻斷抗體的組合添加完全廢除了CTLA-4 -FasL的抑制作用?？傊@些數(shù)據(jù)顯示，當靶惡性淋巴樣系對于每個融合蛋白的兩個結(jié)構(gòu)域表達同源反受體時，CTLA-4.FasL和⑶40.FasL展現(xiàn)出極大的抑制效力。
融合蛋白介導的對凋亡的誘導是取決于同源受體的表面表達
先前的研究已經(jīng)確立，CTLA-4.FasL和0)40.FasL均經(jīng)由Fas介導的凋亡來誘導它們的抑制作用。然后考慮的是，當靶細胞共表達可以結(jié)合各自蛋白質(zhì)的兩端的表面分子時，由這些融合蛋白引起的凋亡誘導是否伴有更有效的增殖抑制。為此，將同組的惡性細胞系在CTLA-4.FasUOM0.FasL、CTLA4-1g、CD40-Fc、sFasL、或后三項的不同組合的存在或不存在下孵育4 (T細胞)或16 (B細胞)小時。在處理期結(jié)束時，使用Annexine/PI染色和流式細胞術(shù)評定細胞的凋亡和壞死。再次如所預(yù)期，含F(xiàn)asL的融合蛋白或sFasL對缺乏Fas受體的Daudi B細胞沒有作用，并且CTLA-4.Ig或⑶40_Fc也不誘導Daudi細胞中的凋亡(圖3A，B)。相比之下，并且與增殖測定中的情況相同，CTLA-4.FasL在第16h顯著增加了凋亡或壞死的Raji細胞的百分比(圖3A，B)。而且，與sFasL、CTLA_4_Ig或這后兩項的組合形成對照，當用CTLA-4.FasL孵育Raji細胞時，檢測到更多的凋亡。⑶40.FasL沒有誘導Raji細胞的顯著凋亡(圖3A，C)。
當用CTLA-4.FasL 孵育 Jurkat T 細胞(J-CD40L+ 或 J-CD40L-)時，隨之發(fā)生了顯著的凋亡，盡管與J-CD40L-相比，J-CD40L+受到較小的影響(圖3A，C)。當使用sFasL或抗Fas抗體CHll (未顯示)時，這些成對的細胞系之間的在對凋亡誘導的易感性方面的相同差異是明顯的。然而，當在CD40.FasL的存在下孵育Jurkat細胞系時，僅可以在J-CD40L+細胞中檢測到顯著的凋亡，盡管事實是，sFasL在誘導J-CD40L-細胞中的凋亡方面更加有力(圖3A，C)。這組實驗突出了每種各自融合蛋白的兩端對于有效的凋亡誘導的功能上的重要性。
促凋亡和抗凋亡通路均受到CTLA-4.FasL和CD40.FasL的影響
然后考慮這種可能性:CTLA-4FasL和⑶40Fas的凋亡誘導活性可能不僅僅依賴于Fas死亡受體的觸發(fā)。為了測試這種假設(shè)，將T和B細胞系用CTLA-4.FasL、⑶40.FasL、sFasL、CTLA-4.Ig、⑶40或后三項的組合孵育90-180分鐘。在孵育期結(jié)束時，通過免疫印跡來評估全細胞溶解產(chǎn)物的抗凋亡蛋白cFLIP、半胱天冬酶8 (作為外源性通路的標志物)、半胱天冬酶9 (作為內(nèi)源性、線粒體通路的標志物)、以及半胱天冬酶3的表達。應(yīng)注意，半胱天冬酶原形式(未顯示)和裂解的、活性半胱天冬酶形式都被檢測。一個代表性實驗顯示在圖4A中，并且使用不同細胞系進行的3個獨立實驗的總結(jié)顯示在圖4B-D中。
Daudi B細胞系(具有可忽略不計的Fas受體)中不同半胱天冬酶的表達在使用含F(xiàn)asL的蛋白進行孵育后沒有改變(圖4A)。另外，當用CTLA-4 -1gXD^-Fc或后者與sFasL的組合孵育Daudi細胞時，沒有發(fā)現(xiàn)變化(圖4A)。相比之下，共表達B7分子和Fas受體的B細胞系產(chǎn)生了完全不同的圖像。在CTLA-4.FasL的存在下孵育90或180分鐘之后，cFLIPL表達被消除，并且觀察到這些半胱天冬酶中的兩種(9和3)的活化(裂解)形式的明顯增加。因為發(fā)現(xiàn)半胱天冬酶8在這些細胞中主要處于其活性的、切割的形式，即使當Fas受體未被觸發(fā)并且cFLIP基礎(chǔ)水平為非常低時，將另一種也共表達B7分子和Fas受體的惡性B細胞系JY考慮在內(nèi)。
當用CTLA-4.FasL孵育時，存在cFLIP豐度的明顯降低、和半胱天冬酶3、9、以及8的活化形式的顯著增加(圖5A-C)。相比之下，CD40.FasUsFasUCTLAI *Ig或CD40-Fc對惡性B細胞系的任一種中的cFLIP表達或半胱天冬酶活化都沒有作用(圖4和5)。
下一個焦點是具有一個適當?shù)募毎袠薐-CD40L+的CD40FasL。當用CTLA-4 -FasL或CD40.FasL孵育J-CD40L+和J-CD40L-T細胞系時，凋亡和抗凋亡蛋白表達的模式表達與在B細胞系中所見到的那種截然不同(圖4A，上兩排；圖4C)。在兩種表達Fas的Jurkat細胞系中，CTLA-4.FasL和⑶40.FasL各自活化半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)，顯示出活化形式的半胱天冬酶9和3的增加的豐度。
半胱天冬酶8在這些細胞系中呈現(xiàn)其活化形式。沒有注意到cFLIP豐度的變化。然而，雖然J-CD40L+細胞對CTLA-4.FasL不如對J-CD40L-敏感(如在半胱天冬酶9和3的活化形式的更少的增加中所反映的)，但它對CD40-FasL處理應(yīng)答出cFLIP豐度的顯著減少、以及半胱天冬酶8、3以及9的另外的活化。⑶40-FasL在這方面比⑶40-Fc、sFasL或這兩項的組合更有力?？傊@些實驗確立了 CTLA-4.FasL和⑶40.FasL各自對凋亡(半胱天冬酶)和抗凋亡(cFLIP)通路具有雙重和增強作用。
CTLA-4 *Ig抑制B細胞系增殖并且降低cFLIP水平。對這些融合蛋白的特殊特性(對抗凋亡信號傳導具有獨特影響)的一個可能的解釋是，通過對于這些融合蛋白組分的非Fas表面反受體的回信號傳導(back-signaling)。事實上,通過‘共刺激性配體’ B7 (在抗原遞呈細胞上)和⑶40L (在T細胞上)的回信號傳導已經(jīng)由其他人予以記錄。因此考慮，與Fas受體觸發(fā)同時發(fā)生的、分別通過B7和⑶40L的回信號傳導，是否可以至少部分解釋CTLA-4 *FasL和⑶40 -FasL融合蛋白的異常效力。出于那個目的，在板結(jié)合的CTLA-4 *Ig的存在或不存在下，將Raji B細胞用CTLA-4.FasL處理24h，并且評定增殖。如圖6A所示，板結(jié)合的CTLA-4.Ig獨自顯著 抑制了 Raji細胞增殖。在板結(jié)合的CTLA-4.Ig的存在下，CTLA-4.FasL介導的對Raji細胞增殖的抑制被減弱，這表明對CTLA-4.FasL結(jié)合至B7造成干擾(圖6B)。重要的是，類似于CTLA-4.FasL，板結(jié)合的CTLA-4.Ig減少了 Raji細胞中的cFLIP表達，并且增加了這些細胞中的半胱天冬酶9和3的表達(圖6C)。這些發(fā)現(xiàn)表明，CTLA-4.Ig可以將抑制性回信號遞送至惡性B細胞，并且減少這些細胞中的抗凋亡性cFLIP。
考慮了⑶40.FasL是否可以介導通過⑶40L的類似的回信號傳導。為了測試這一可能性，用CD40-Fc孵育J-CD40L+細胞。CD40_Fc將J-CD40L+的增殖增加了約20% (未顯示)。然而，當在高達1200ng/ml的濃度下使用⑶40_Fc時，沒有觀察到對凋亡和抗凋亡蛋白的表達的作用(數(shù)據(jù)未顯示)。
討論
在此研究中，已經(jīng)考慮了兩種融合蛋白CTLA-4.FasL和⑶40.FasL作為惡性淋巴樣細胞系中的凋亡誘導物的獨特功能特性，焦點為相關(guān)的細胞內(nèi)信號傳導級聯(lián)反應(yīng)。不希望受單一假設(shè)或封閉列表的限制，這些發(fā)現(xiàn)包括:l)CTLA-4.FasL和⑶40.FasL誘導B和T譜系的表達Fas受體的惡性淋巴樣系中的死亡；2)與⑶40.FasL相比，CTLA-4.FasL更具效力地誘導表達B7的B細胞系中的凋亡；3)⑶40.FasL以⑶40L依賴性方式誘導表達CD40L的J-CD40L+T細胞中的凋亡；4)CTLA_4.FasL在表面上共表達B7和Fas受體的細胞中降低cFLIP表達并且活化半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)；5)⑶40.FasL在共表達⑶40L和Fas受體的細胞中降低cFLIP表達并且活化半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)；以及6) CTLA-4.FasL和⑶40.FasL在誘導凋亡方面，各自比它們的任何組成部分(單獨或組合)更有效。
這些發(fā)現(xiàn)合起來確認了這些獨特的融合蛋白的更高級功能性，并且提示它們可以通過協(xié)調(diào)地影響凋亡和抗凋亡通路而具有誘導惡性淋巴樣細胞中的凋亡的特殊優(yōu)勢。使惡性細胞能夠逃脫凋亡，并且從而保持治療難治性的機制之一是抗凋亡蛋白的上調(diào)。內(nèi)源性(作為cFLIP)或外源性(作為vFLIP)表達的FLIP在若干惡性淋巴瘤中已經(jīng)作為關(guān)鍵抗凋亡蛋白而受到牽連。先前已經(jīng)表明，CTLA-4.FasL阻止通常伴有T細胞活化的cFLIP表達的上調(diào)。通過消除這種抗凋亡蛋白的上調(diào)，CTLA-4.FasL能夠相比sFasL在更早的時期誘導活化的T細胞中的凋亡。本研究將CTLA-4.FasL的此功能特征延伸到轉(zhuǎn)化細胞。
對于在此研究的大多數(shù)細胞系(B卩，J-CD40L+、J-CD40L-以及JY細胞)而言，cFLIP表達的減少與半胱天冬酶3、8以及9的活化有關(guān)系。半胱天冬酶8的活化取決于其與死亡復合物FADD的結(jié)合。此結(jié)合引起半胱天冬酶3和Bid的活化，這進而導致細胞色素c和半胱天冬酶9活化。半胱天冬酶9的活化然后引起更多的半胱天冬酶3活化和有效的凋亡。cFLIP蛋白通過與半胱天冬酶8競爭以結(jié)合死亡復合物FADD而抑制半胱天冬酶8活化的能力是廣為人知的。
關(guān)于cFLIP的兩個剪接變體:cFLIP短(cFLIPs )和cFLIP長(cFLIPL)的作用，在文獻中存在矛盾的數(shù)據(jù)。cFLIPL在系統(tǒng)中的作用似乎更加復雜，數(shù)據(jù)指示，高水平的表達導致凋亡，而中度水平產(chǎn)生相反結(jié)果，即，在體外和體內(nèi)抑制Fas介導的凋亡。然而，在cFLIPL低表達的情況下，數(shù)據(jù)更清晰在于，cFLIPL mRNA的選擇性沉默加強了半胱天冬酶8招募、活化、加工、以及從死亡復合物的釋放，并因此增強凋亡。在Raji B細胞系中僅檢測到cFLIPL剪接變體，并且能夠結(jié)合這些細胞上的B7-1 (⑶80)和Fas受體(⑶95)的CTLA-4 FasL降低了此cFLIP亞型的表達。重要的是，不顧這些Raji細胞中的半胱天冬酶8的活化形式的組成型表達，CTLA-4.FasL驅(qū)使的cFLIPL減少與半胱天冬酶9和3的活化以及有效的凋亡誘導有關(guān)系。不希望受單一假設(shè)的限制，CTLA-4.FasL和⑶40.FasL引起的c-FLIP的減少可以在轉(zhuǎn)化的淋巴樣細胞中導致促凋亡和抗增殖作用。
通過將FasL嵌合至CTLA-4和⑶40，創(chuàng)造了引人注目的分子橋聯(lián)可能性。轉(zhuǎn)化的B細胞引入了一種新的情境，其中同一融合蛋白可以潛在地橋聯(lián)被共表達在同一細胞上的反受體。CTLA-4 -FasL和CD40 -FasL引起的細胞間和細胞內(nèi)橋聯(lián)必定不是相互排斥的，并且人們可以預(yù)想在局部腫瘤生長的背景下兩者都發(fā)生。
順式環(huán)回自信號傳導(cis loop-back auto-signaling)機制可以基于多種依據(jù)而導致更有效的抑制。首先，這些融合蛋白用于將FasL拴系到膜上，這是經(jīng)由B細胞上的CTLA-4:B7結(jié)合或T細胞上的⑶40:⑶40L結(jié)合。表面錨定的FasL的效力已經(jīng)在將其外生地引入到APC表面上以產(chǎn)生缺失的APC56-59的背景中清楚地確立。因此人們將期望融合蛋白栓系的FasL在自信號傳導(auto-signaling)模式中同樣具有高度功能性。其次，CTLA-4.FasL和⑶40.FasL均具有通過觸發(fā)同一細胞表面上的鄰近反受體而充當雙重信號傳導劑的潛力。
通過B7分子⑶80和⑶86的回信號傳導已經(jīng)對于B細胞23予以描述，在⑶80的情況中引起了對B細胞的增殖抑制，而對于⑶86，情況相反。由于CTLA-4對⑶80具有更高的親合力，人們可以預(yù)期對于CTLA-4.FasL,與⑶80相關(guān)的作用占主導。在此顯示CTLA-4.Ig抑制表達⑶80的 Raji細胞的增殖的數(shù)據(jù)與此回信號傳導功能相一致。
對于T細胞上的⑶40L，回信號傳導也得以證實，并且因此也有助于⑶40.FasL的所觀察到的功效。在⑶40.FasL、但非⑶40-Fc的情況中，⑶40部分被呈現(xiàn)在一個細胞結(jié)合模式(經(jīng)由FasL:Fas錨定)中，并且具有處于三聚體或兩個三聚體配置(相對于假定的⑶40-Fc 二聚體)中的可能性。
事實上，已經(jīng)顯示，與⑶40的低聚物相比，⑶40-FC具有對于⑶40L的更低的親和力，并且此更高的親和力伴有更強的生物活性。總之，但是不希望受單一假設(shè)的限制，這些不同的數(shù)據(jù)表明，不是只有CTLA-4.FasL和⑶40.FasL各自可以在相同的細胞上遞送雙重信號，而是在兩種情況中，F(xiàn)as信號傳導也可以通過經(jīng)由其他反受體(B7-1或⑶40L)的回信號傳導得以加強。
應(yīng)注意，CTLA-4.FasL被發(fā)現(xiàn)是Jurkat T細胞中凋亡的有力誘導物，即使這些細胞對于B7蛋白呈陰性。這有可能反映了它們對可溶的FasL介導的凋亡的整體更高的易感性，如由它們(尤其是J-CD40L-亞系)對sFasL和激動型(agonistic)抗Fas抗體(CH11 ;數(shù)據(jù)未顯示)的高敏感性所證實。
本研究突出了適當配置的融合蛋白的功能豐富度。CTLA-4.FasL和⑶40.FasL融合蛋白調(diào)節(jié)正常和轉(zhuǎn)化的淋巴樣細胞、用于細胞間和細胞內(nèi)地橋聯(lián)分子、設(shè)置人工順式環(huán)回自信號傳導回路、并且遞送正在增強的雙重信號。這兩種蛋白均可以下調(diào)抗凋亡cFLIP亞型一用于加強由這些相同蛋白所遞送的FasL促凋亡信號的一種作用。因此，人們可以利用融合蛋白來同時傳遞死亡信號并且使這些細胞對此信號敏感。
實例2-用于治療血液惡性腫瘤的嵌合蛋白的臨床試驗
在此所述的針對患有選自下組的血液惡性腫瘤的受試者的嵌合蛋白(治療劑)的I期試驗可被設(shè)計來評估對疾病進展和可能毒性的兩種作用，該組由以下各項組成:淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤以及在此所述的白血病。如在本領(lǐng)域中眾所周知的，患有疑似血液惡性腫瘤的受試者可以在該血液惡性腫瘤的陽性診斷之后登記在內(nèi)。
治療可以作為單一療法來提供或與公認的治療組合來提供。例如，對于多發(fā)性骨髓瘤的治療策略被評述在拉季庫馬爾(Rajkumar)等人，2002，梅奧臨床學報(Mayo Clin.Proc).77:814中，該案通過引用以其全部內(nèi)容結(jié)合在此)。對該疾病急性或不尋常的進展的識別可能會停止給予治療劑。
初始受試者接受合適劑量的治療劑，該治療劑是例如作為I小時靜脈輸注來給予、或適當時單獨或與如將由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所選擇的一種或多種其他已知的試劑結(jié)合而給予。如果有足夠的耐受性，則將在隨后的受試者中逐步增加劑量。此外，給藥方法可改變?yōu)閺椡枋阶⑸洹?br> 根據(jù)世界衛(wèi)生組織毒性標準，在受試者中評估治療劑的毒性:在輸液過程中，每隔10分鐘監(jiān)測一次血壓、體溫以及心率，然后每隔一小時一次持續(xù)3小時、并且最后每隔3小時一次持續(xù)24小時進行監(jiān)測。每隔一天進行血液、腎和肝功能試驗，持續(xù)一個星期；并且在注射后第15、30、60和120天進行這些試驗。
血清和/或組織樣品每周取一次，持續(xù)兩個月，以使得該治療劑的效果可以通過本領(lǐng)域已知的方法來確定，例如，M蛋白的血清濃度的變化、血紅蛋白值的變化、溶骨性病變的存在/消退等。病理 研究將評定對與血液惡性腫瘤相關(guān)聯(lián)的組織損傷的治療作用。
實例3-對腫瘤細胞系的作用
材料和方法.
除非另外說明，否則所有的化學品均從西格瑪公司(SIGMA)(以色列)獲得。DMEM培養(yǎng)基、FBS、PBS、胰蛋白酶-EDTA、青霉素、鏈霉素以及L-谷氨酰胺是獲得自生物產(chǎn)業(yè)公司(以色列 Beit Haemek)ο
細胞系.Raji (EBV轉(zhuǎn)化的B細胞淋巴瘤系)、JY (EBV轉(zhuǎn)化的B細胞淋巴瘤系)、Daudi (EBV轉(zhuǎn)化的B細胞淋巴瘤系)、RPMI8226 (人多發(fā)性骨髓瘤細胞系)、HL60 (人早幼粒細胞性白血病細胞)購自ATCC (美國)。SK-HEP-1 (HTB-52 ;肝腺癌細胞系)購自ATCC(美國)。最初來自ATCC的H印G2、Huh7肝細胞癌細胞系是由以色列耶路撒冷的哈達薩希伯來大學醫(yī)學中心的肝臟病學組(Hepatology Unit, Hadassah Hebrew University MedicalCenter in Jerusalem, Israel)惠贈。除非另外說明，否則所有細胞系在補充有l(wèi)OU/ml青霉素、0.111^/1111鏈霉素以及292 4 8/1111 L-谷氨酰胺的10%FBS DMEM中生長。所有細胞系在37° C下在6%C02中培養(yǎng)，并且使用EZ-PCR支原體測試試劑盒(生物產(chǎn)業(yè)公司)來定期測試培養(yǎng)物的支原體污染。
活性測定.為了評定KAHR-102 (CTLA4_FasL)活性，將0.2x106個細胞/ml重復三次接種在96孔板(NUNC，丹麥羅斯基勒(Roskilde，Denmark))中并且在使用或不使用不同濃度的KAHR-102的帶組氨酸標簽的版本(his6CTLA4-FasL)下來培養(yǎng)；細胞用指定的蛋白濃度在37° C下在6%C02中孵育24h ;并且使用MTS測定(美國麥迪遜普洛麥格公司(Promega, Madison, USA))來評估細胞活力。
流式細胞術(shù).為了評定凋亡，將0.2x106個細胞/ml重復兩次接種在24孔培養(yǎng)板(NUNC)中并且在使用或不使用不同濃度的his6CTLA4-FasL (KAHR-102)、可溶FasL、CTLA4-Fc或組合的后者下孵育24小時。然后收獲細胞，并根據(jù)制造商的實驗方案，使用膜聯(lián)蛋白V/PI MEBCYT0凋亡試劑盒(MBL，日本名古屋(Nagoya))，通過流式細胞計量分析來檢測凋亡細胞。使用FACSCalibur流式細胞儀(美國加利福尼亞州圣何塞BD公司)來計數(shù)每個樣品的20，000個事件,并且使用CellQuest軟件(BD公司)來分析數(shù)據(jù)。
為了檢測在不同細胞系中的Fas受體和B7分子(⑶80和⑶86)的表達，將細胞取回，在染色緩沖液(含1% BSA和0.1 %疊氮化鈉的PBS)中洗滌，并且在由生產(chǎn)商CeBioscience公司)建議的濃度下，使用對以上提及的分子具有特異性的藻紅蛋白標記的單克隆抗體或相關(guān)對照抗體進行染色。流式細胞術(shù)使用FACSCalibur流式細胞儀(BD公司)來進行，并且使用CellQuest軟件(BD公司)來分析數(shù)據(jù)。對于每個樣品收集總計20，000個事件。
統(tǒng)計分析.數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均值土 SD。通過雙尾未配對的學生t檢驗進行均值的統(tǒng)計比較。p〈0.05的差異被認為是統(tǒng)計學上有意義的。
腫瘤異種移植物的確立.將使用4-6周齡的、維持在確定的菌群條件下在希伯來大學無病原體動物設(shè)施中的無胸腺的B ALB/c nu/nu裸雄性小鼠(以色列哈倫(Harlan))。所有實驗都由希伯來大學動物保健委員會(Animal Care Committee of the HebrewUniversity)批準。將Raj1 、JY或RPMI8226生長至80%匯合、收獲、用PBS洗滌、并皮下注射(2x107/小鼠)到小鼠的右側(cè)或經(jīng)腹膜內(nèi)給予。一旦可觸知，對于皮下腫瘤，將使用測微計測量腫瘤它們的寬度和長度，并計算腫瘤體積(《2χ長度/2)，或者，對于腹膜內(nèi)腫瘤，將測量腹部直徑，并且將稱量小鼠。每天以皮下注射his6CTLA4-FasL (KAHR-102) (200 μ g)來治療老鼠，持續(xù)8天。如果腫瘤再生長或重新出現(xiàn)，另一種治療將在兩個星期內(nèi)跟進。對照組將被注射類似體積的his6CTLA4-FasL (KAHR-102)稀釋緩沖液。腫瘤體積將監(jiān)測約3個月，或者直到腫瘤大小超過了需要動物犧牲的閾值為止。實驗結(jié)束時，將犧牲小鼠，并且腫瘤將被收獲、測量及稱重，并且分析。
結(jié)果
針對不同的淋巴瘤細胞，評估CTLA4_FasL的細胞毒性活性。如圖7和8所示，CTLA4-FasL以劑量依賴性方式誘導Raji和JY的死亡，這兩種細胞都是B細胞淋巴癌細胞系。應(yīng)注意，在低至0.lng/ml的濃度下檢測到顯著的細胞死亡,該濃度對應(yīng)于0.4nmol/l的EC50。細胞死亡在第24h時檢測到，并且在第48h時更強烈，而在3ng/ml CTLA4_FasL下幾乎沒有活細胞可檢測到。重要的是，取自健康志愿者的原代B細胞對CTLA4-FasL的毒性活性具有抗性(未顯示)。
然后測試人骨髓瘤細胞系RPMI8226，并且如在圖9中所見，發(fā)現(xiàn)，盡管它們對CTLA4-FasL的敏感性低于B細胞淋巴瘤細胞系對此的敏感性，但它們確實應(yīng)答于更高濃度的CTLA4-FasL。相比之下，早幼粒細胞性白血病細胞對CTLA4_FasL的細胞毒性作用具有抗性(圖10)。
對CTLA4_FasL的作用的易感性方面的差異可以通過能夠結(jié)合融合蛋白的表面分子的不同表達來解釋。然后在這四種細胞系上測試結(jié)合CTAL4的⑶80和⑶86的表達、以及⑶95 (Fas受體，它結(jié)合FasL)的表達。如可在圖11_14中所見，這兩種高度敏感的細胞系，即Raji和JY，表達所有三種表面分子。顯示出對CTLA4-FasL的中等敏感性的人多發(fā)性骨髓瘤細胞系RPMI8226表達Fas受體和⑶86 (但表達水平低于B細胞系)，并且完全不表達⑶80。不受CTLA4-FasL影響的早幼粒細胞性白血病細胞顯示出低水平的⑶86表達、和非常低水平的Fas受體。
將此分析延伸到其他癌細胞系，S卩，SK-Hepl肝癌細胞。如可在圖15中所見，CTLA4-FasL展現(xiàn)出針對這種腫瘤系的細胞毒性作用，盡管具有稍微不同的動力學；CTLA4-FasL比CTAL4_Fc、可溶FasL或后者的組合遠遠有效得多。使用這種細胞系，測試了由半胱天冬酶介導的凋亡抑制對CTLA4-FasL的作用的影響。如圖16中所示，泛半胱天冬酶抑制劑zVAD完全廢除了 CTLA4-FasL效應(yīng)，這表明它的細胞毒性作用是基于凋亡的。
雖然出于說明的目的已經(jīng)在上文描述了本發(fā)明的具體實施例，但對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言將明顯的是，在并不脫離由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的情況下，本發(fā)明的細節(jié)可做出諸多改變。
應(yīng)理解，出于清楚而在多 個單獨的實施例的背景中描述的本發(fā)明的某些特征還可以結(jié)合在一個單一的實施例中來提供。相反地，出于簡潔而在一個單一的實施例的背景中描述的本發(fā)明的不同的特征還可以單獨地或以任何合適的子組合來提供。
盡管本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合其具體的實施例進行描述，但很明顯很多替代方案、修改和變化對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將是清楚的。因此，意在包含所有落入所附權(quán)利要求書的精神和寬的范圍內(nèi)的所有這類替代方案、修改和變化。
在本說明書中提及的所有出版物、專利、以及專利申請通過引用以其全部內(nèi)容在此結(jié)合在本說明書中，其程度如同是每個單獨的出版物、專利、或?qū)＠暾埍淮_切地且單獨地指出為通過引用結(jié)合在此。此外，在本申請中引用或識別的任何參考文獻不應(yīng)被解釋為承認這個參考文獻作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)是可得的。
權(quán)利要求
1.一種選自由CTLA4-FasL和⑶40_FasL蛋白組成的組中的嵌合蛋白用于治療包括淋巴瘤的病癥的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述淋巴瘤包括淋巴系統(tǒng)中B或T細胞的惡性生長一霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其中該非霍奇金淋巴瘤選自下組，該組由以下各項組成:侵襲性NHL、轉(zhuǎn)化型NHL、惰性NHL、惡化前NHL、復發(fā)性NHL、難治性NHL、低級非霍奇金淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、NK細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、急性成淋巴細胞淋巴瘤、皮膚T細胞癌、以及蕈樣真菌病/Sezry綜合征。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其中所述惰性非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括淋巴瘤的緩慢生長形式，低級NHL或中級NHL。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，該用途是停止該病癥進展成多發(fā)性骨髓瘤的惡性形式。
6.一種選自由CTLA4-FasL和⑶40_FasL蛋白組成的組中的嵌合蛋白用于治療包括多發(fā)性骨髓瘤的病癥的用途。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其中所述多發(fā)性骨髓瘤選自下組，該組由以下各項組成:產(chǎn)生K型輕鏈和/或λ型輕鏈的多發(fā)性骨髓瘤癌癥；侵襲性多發(fā)性骨髓瘤；良性漿細胞病癥；燜燃型多發(fā)性骨髓瘤(SMM)、惰性多發(fā)性骨髓瘤、也可發(fā)展成多發(fā)性骨髓瘤的多發(fā)性骨髓瘤的惡化前形式；以及原發(fā)性淀粉樣變性。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其中所述良性漿細胞病癥選自下組，該組由以下各項組成:MGUS (意義不明的單克隆丙種球蛋白病)和/或可發(fā)展成多發(fā)性骨髓瘤的瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥(麗，又稱為淋巴漿細胞性淋巴瘤)。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，該用途是停止該病癥進展成多發(fā)性骨髓瘤的惡性形式。
10.如權(quán)利要求7所述的用途，其中所述侵襲性多發(fā)性骨髓瘤是原發(fā)性漿細胞白血病(PCL)0
11.一種選自由CTLA4-FasL和⑶40_FasL蛋白組成的組中的嵌合蛋白用于治療包括選自下組的白血病的病癥的用途，該組由以下各項組成:急性非淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性粒細胞性白血病、慢性粒細胞性白血病、急性早幼粒細胞性白血病、成人T細胞白血病、非白血性 白血病、白血性白血病、嗜堿細胞性白血病、母細胞白血病、牛白血病、慢性髓細胞性白血病、皮膚白血病、胚細胞性白血病、嗜酸細胞性白血病、格羅斯白血病、毛細胞白血病、成血細胞性白血病、血胚細胞性白血病、組織細胞性白血病、干細胞白血病、急性單核細胞白血病、白細胞減少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞性白血病、淋巴原性白血病、淋巴樣白血病、淋巴肉瘤細胞白血病、肥大細胞白血病、巨核細胞性白血病、小原粒型白血病、單核細胞性白血病、成髓細胞性白血病、髓細胞性白血病、髓樣粒細胞性白血病、髓單核細胞白血病、內(nèi)格利型白血病、漿細胞白血病、漿細胞性白血病、早幼粒細胞性白血病、里德爾氏細胞性白血病、希林氏白血病、干細胞白血病、亞白血性白血病、以及未分化細胞白血病。
12.如以上權(quán)利要求中任一項所述的用途，進一步包括通過將所述嵌合蛋白給予已經(jīng)患有所述病癥、傾向于患所述病癥的受試者來使用、或用作維持療法、或用于停止該病癥的進展。
13.一種藥用組合物，包含選自由CTLA4-FasL和⑶40_FasL蛋白組成的組中的嵌合蛋白、以及藥物載體，該組合物被適配成用于治療淋巴瘤。
14.如權(quán)利要求13所述的藥用組合物，其中所述淋巴瘤包括淋巴系統(tǒng)中B或T細胞的惡性生長一霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
15.如權(quán)利要求14所述的藥用組合物，其中該非霍奇金淋巴瘤選自下組，該組由以下各項組成:侵襲性NHL、轉(zhuǎn)化型NHL、惰性NHL、惡化前NHL、復發(fā)性NHL、難治性NHL、低級非霍奇金淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、NK細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、急性成淋巴細胞淋巴瘤、皮膚T細胞癌、以及蕈樣真菌病/Sezry綜合征。
16.如權(quán)利要求15所述的藥用組合物，其中所述惰性非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括淋巴瘤的緩慢生長形式，低級NHL或中級NHL。
17.如權(quán)利要求15所述的藥用組合物，用于停止該病癥進展成多發(fā)性骨髓瘤的惡性形式。
18.一種藥用組合物，包含選自由CTLA4-FasL和⑶40_FasL蛋白組成的組中的嵌合蛋白、以及藥物載體，該組合物被適配成用于治療多發(fā)性骨髓瘤。
19.如權(quán)利要求18所述的藥用組合物，其中所述多發(fā)性骨髓瘤選自下組，該組由以下各項組成:產(chǎn)生K型輕鏈和/或λ型輕鏈的多發(fā)性骨髓瘤癌癥；侵襲性多發(fā)性骨髓瘤；良性漿細胞病癥；燜燃型多發(fā) 性骨髓瘤(SMM)、惰性多發(fā)性骨髓瘤、也可發(fā)展成多發(fā)性骨髓瘤的多發(fā)性骨髓瘤的惡化前形式；以及原發(fā)性淀粉樣變性。
20.如權(quán)利要求19所述的藥用組合物，其中所述良性漿細胞病癥選自下組，該組由以下各項組成=MGUS (意義不明的單克隆丙種球蛋白病)和/或可發(fā)展成多發(fā)性骨髓瘤的瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥(WM，又稱為淋巴漿細胞性淋巴瘤)。
21.如權(quán)利要求20所述的藥用組合物，用于停止該病癥進展成多發(fā)性骨髓瘤的惡性形式。
22.如權(quán)利要求19所述的藥用組合物，其中所述侵襲性多發(fā)性骨髓瘤是原發(fā)性漿細胞白血病(PCL)。
23.一種藥用組合物，包含選自由CTLA4-FasL和⑶40_FasL蛋白組成的組中的嵌合蛋白、以及藥物載體，該組合物被適配成用于治療選自下組的白血病，該組由以下各項組成:急性非淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性粒細胞性白血病、慢性粒細胞性白血病、急性早幼粒細胞性白血病、成人T細胞白血病、非白血性白血病、白血性白血病、嗜堿細胞性白血病、母細胞白血病、牛白血病、慢性髓細胞性白血病、皮膚白血病、胚細胞性白血病、嗜酸細胞性白血病、格羅斯白血病、毛細胞白血病、成血細胞性白血病、血胚細胞性白血病、組織細胞性白血病、干細胞白血病、急性單核細胞白血病、白細胞減少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞性白血病、淋巴原性白血病、淋巴樣白血病、淋巴肉瘤細胞白血病、肥大細胞白血病、巨核細胞性白血病、小原粒型白血病、單核細胞性白血病、成髓細胞性白血病、髓細胞性白血病、髓樣粒細胞性白血病、髓單核細胞白血病、內(nèi)格利型白血病、漿細胞白血病、漿細胞性白血病、早幼粒細胞性白血病、里德爾氏細胞性白血病、希林氏白血病、干細胞白血病、亞白血性白血病、以及未分化細胞白血病。
24.如以上權(quán)利要求中任一項所述的用途或藥用組合物，其中所述嵌合蛋白的作用包括抗增殖作用或凋亡作用、或其組合。
25.如權(quán)利要求24所述的用途或藥用組合物，其中所述作用進一步包括通過所述嵌合蛋白使癌細胞對嵌合蛋白的所述作用敏 感。
全文摘要
一種選自由CTLA4-FasL和CD40-FasL蛋白組成的組中的嵌合蛋白用于治療如在此所述的淋巴瘤和/或多發(fā)性骨髓瘤和/或白血病的用途、以及其藥用組合物和治療方法。
文檔編號A61P35/00GK103153332SQ201180046070
公開日2013年6月12日 申請日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者邁克爾·德蘭尼茨基埃爾哈勒 申請人:卡爾醫(yī)療有限公司, 哈達斯特醫(yī)療研究服務(wù)和開發(fā)有限公司