一種腫瘤微環(huán)境的體外構(gòu)建方法及其在藥敏篩選中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種腫瘤微環(huán)境體外構(gòu)建的方法及其應(yīng)用，該方法通過構(gòu)建一種類似細(xì)胞體內(nèi)微環(huán)境的三維支架，腫瘤組織全細(xì)胞接種后能促進(jìn)各細(xì)胞生理活性的恢復(fù)，從而建立腫瘤微環(huán)境，用于腫瘤個(gè)性化治療的藥物篩選。
【專利說明】一種腫瘤微環(huán)境的體外構(gòu)建方法及其在藥敏篩選中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種腫瘤微環(huán)境體外構(gòu)建的方法及其應(yīng)用，該方法通過構(gòu)建一種類似 細(xì)胞體內(nèi)微環(huán)境的三維支架，腫瘤組織全細(xì)胞接種后能促進(jìn)各細(xì)胞生理活性的恢復(fù)，從而 建立腫瘤微環(huán)境，用于腫瘤個(gè)性化治療的藥物篩選。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步和人們對(duì)于惡性腫瘤認(rèn)識(shí)的逐漸深入，腫瘤的治愈率在 近二十年來不斷提高（Cancerstatistics2014，CACancerJClin2014;64:9 - 29)，但 惡性腫瘤在35?59歲年齡組中，仍居死因第一位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，到2050年全世界將出現(xiàn)3億 腫瘤患者，其中2億人將因此失去生命。
[0003] 盡管腫瘤的治療取得了很大的進(jìn)展，但腫瘤的異質(zhì)性對(duì)腫瘤的治療提出了新的挑 戰(zhàn)。同一類型的腫瘤在不同個(gè)體間的死亡率、生存率、藥物敏感性等方面存在顯著的差異。 因此，越來越多的學(xué)者參與到腫瘤個(gè)性化治療的研究和實(shí)踐中。關(guān)于腫瘤治療方面的研究 包括基因、蛋白質(zhì)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝通路等，這些都與腫瘤藥物治療的反應(yīng)性、預(yù)后、治療效 果判斷及藥物抵抗、不良反應(yīng)等相關(guān)。目前，以這些疾病分子為基礎(chǔ)開展的基因治療、免疫 治療等腫瘤的個(gè)性化治療已取得了令人鼓舞的結(jié)果。然而，隨著大量的生物靶向性藥物 的臨床應(yīng)用，陸續(xù)出現(xiàn)的毒副作用也越來越受到關(guān)注（CancerTreatmentReviews, 2014; 40:883-891)。這些藥物的毒副作用無(wú)法在臨床應(yīng)用前被發(fā)現(xiàn)，根本原因就是基礎(chǔ)研究和臨 床研究之間的差異性，我們所立足的體外研究平臺(tái)無(wú)法證實(shí)反映腫瘤微環(huán)境的生理狀態(tài)， 因此，成功構(gòu)建接近腫瘤真實(shí)微環(huán)境的研究模型就是解決上述問題的關(guān)鍵途徑之一。
[0004] 臨床上對(duì)腫瘤性質(zhì)的判斷均以形態(tài)病理學(xué)的診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，而病理形態(tài)學(xué)診斷， 除了根據(jù)腫瘤細(xì)胞異型性的改變外，最重要的要結(jié)合腫瘤細(xì)胞所處的組織學(xué)背景，包括各 種腫瘤間質(zhì)成分的特點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞株是我們常用的研究對(duì)象，我們所從事的細(xì)胞學(xué)水平的 研究也基本上是在二維培養(yǎng)狀態(tài)下進(jìn)行，由于體內(nèi)細(xì)胞（不論是貼壁還是非貼壁生長(zhǎng)的細(xì) 胞）均是在一定基質(zhì)支撐下生長(zhǎng)，因此體外的二維培養(yǎng)環(huán)境不能真實(shí)反應(yīng)細(xì)胞的體內(nèi)環(huán) 境。另外，臨床上目前推廣使用的腫瘤化療藥敏篩選試驗(yàn)，也是立足于腫瘤細(xì)胞的二維培養(yǎng) 中實(shí)施的，因此所得到的結(jié)果不能真實(shí)反映腫瘤組織在人體內(nèi)的真實(shí)敏感性。
[0005] 近年來，三維培養(yǎng)技術(shù)逐漸成為細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，其利用各種材料與方 法，使細(xì)胞附著在立體空間內(nèi)生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)更接近于細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)模式，形成類似體內(nèi)的 組織結(jié)構(gòu)，發(fā)揮其生理功能。常見的技術(shù)包括自發(fā)性細(xì)胞聚集、預(yù)置基質(zhì)培養(yǎng)、基質(zhì)覆蓋培 養(yǎng)和微載體培養(yǎng)等。其中，預(yù)置基質(zhì)培養(yǎng)提供了與細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)類似的支架環(huán)境，且操作相 對(duì)簡(jiǎn)單，但關(guān)鍵取決于基質(zhì)材料選擇。目前常用的基質(zhì)來源于膠原蛋白I、明膠或提取的細(xì) 胞外基質(zhì)等動(dòng)物性凝膠，但動(dòng)物性凝膠價(jià)格昂貴且含有很多不確定成分。
[0006] 中國(guó)專利CN102952279A公布了用甲基乙烯基醚/馬來酸共聚物和交聯(lián)劑反應(yīng)制 備水凝膠的方法及其在腫瘤組織培養(yǎng)中運(yùn)用，但由于該基質(zhì)膠中含有大量細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (如表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及組織纖維酶原活化因子），這些細(xì)胞因子對(duì)培養(yǎng) 細(xì)胞作用的不確定性。
[0007] CN101445971A、CN103418029A公開了由絲素蛋白、殼聚糖制成的一種仿生細(xì)胞外 基質(zhì)絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合納米纖維，CN103418029A公開了由絲素蛋白、殼聚糖制成的一 種絲素/殼聚糖復(fù)合多孔支架，為細(xì)胞生長(zhǎng)和組織再生提供最佳的仿生生理環(huán)境。然而其 所制備的絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合納米纖維以及復(fù)合多孔支架的穩(wěn)定性相對(duì)低，難適合于實(shí) 際應(yīng)用。
[0008] CN102010601A、CN101624472A和CN101624473A公開了 由絲素蛋白、半乳糖基化殼 聚糖在交聯(lián)劑的作用下制得一種肝細(xì)胞特異性大孔微載體支架材料，適合于大規(guī)模培養(yǎng)肝 細(xì)胞。其缺點(diǎn)在于制作工藝繁瑣（殼聚糖經(jīng)過糖基化后交聯(lián)，后再用網(wǎng)篩過濾），且所制備 的支架材料屬大孔徑支架，應(yīng)用范圍有限。
[0009] CN102942660A公開了一種天然生物交聯(lián)的納米復(fù)合三維凝膠支架，由丙烯酰胺類 單體、無(wú)機(jī)納米粘土、生物高分子和生物交聯(lián)劑京尼平溶于水原位自由基聚合而成，可用于 醫(yī)用移植、藥物釋放和細(xì)胞培養(yǎng)。其缺點(diǎn)在于所使用的主要材料丙烯酰胺類受高熱分解易 釋放出刺激性氣體；且在酸堿環(huán)境下轉(zhuǎn)變成的丙烯酸對(duì)細(xì)胞有較強(qiáng)的毒性作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明以天然蠶絲或蠶繭殼為原料按特定方法制得 絲素蛋白（silkfibrin，SF)類物質(zhì)，其和殼聚糖（chitosan，CS)以及無(wú)毒性交聯(lián)劑1-乙 基-3-[3-二甲氨基丙基]碳化二亞胺（EDC)和N羥基琥珀酰亞胺（NHS)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，所 制備的三維基質(zhì)接近細(xì)胞體內(nèi)的空間構(gòu)象，將腫瘤組織全細(xì)胞提取種植后能盡快附著、生 長(zhǎng)、構(gòu)建出新的腫瘤微環(huán)境，在此平臺(tái)上可以進(jìn)行各腫瘤藥物敏感性篩選。
[0011] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0012] 本發(fā)明提供了一種腫瘤微環(huán)境的體外構(gòu)建方法，其包括將腫瘤組織全細(xì)胞接種于 三維基質(zhì)支架上進(jìn)行培養(yǎng)的步驟，其中所述的三維基質(zhì)支架是由絲素蛋白類物質(zhì)、殼聚糖 和交聯(lián)劑經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)而制得，其特征在于所述的絲素蛋白類物質(zhì)是由蠶繭殼或蠶絲經(jīng)過脫 膠、溶解、透析、干燥制得絲素粉，絲素粉再經(jīng)如下方法制得所述的絲素蛋白類物質(zhì)：
[0013] (1)將絲素粉溶解于溴化鋰溶液中；
[0014] (2)將步驟（1)的溶解后的絲素溶液用截流分子量為3500Da的透析袋進(jìn)行透析， 制得透析后的絲素溶液；
[0015] (3)將裝有步驟（2)所制得的透析后的絲素溶液的透析袋放入聚乙二醇6000粉中 進(jìn)行濃縮，所得濃縮液離心后取上清液，即得所述的絲素蛋白類物質(zhì)。
[0016] 上述所述的方法，其中所述的交聯(lián)劑為1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳化二亞 胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)。
[0017] 上述所述的方法，其中將所述的絲素蛋白類物質(zhì)、殼聚糖和交聯(lián)劑交聯(lián)反應(yīng)后所 得反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)梯度冷凍得到所述的基質(zhì)支架，所述的梯度冷凍過程如下：
[0018] (1)將反應(yīng)產(chǎn)物先放入_20°C冰箱中預(yù)冷凍12?48h，再放入-80°C低溫冰箱中冷 凍12?48h，最后放入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥24?72h，得到初制的三維支架材料；
[0019] ⑵將步驟⑴制得的初制的三維支架材料浸入無(wú)水甲醇及10%氫氧化鈉（體積 比1:1)溶液浸泡12?48h，用去離子水沖洗后，置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥24?72h后取出 即得。
[0020] 上述所述的方法，其中通過改變絲素蛋白類物質(zhì)、殼聚糖和/或交聯(lián)劑的用量以 制得不同孔徑和構(gòu)象的三維基質(zhì)支架。
[0021] 上述所述的方法，其特征在于包含如下步驟：
[0022] (1).制備絲素蛋白類物質(zhì)的溶液
[0023] 1)將蠶繭殼剪成碎片后加入濃度為0.5 %的碳酸鈉溶液煮沸2 - 3遍，再用去離 子水洗后進(jìn)行烘干；
[0024] 2)將步驟1)制得的干燥絲素加入煮沸的50%氯化鈣溶液攪拌溶解，冷卻后過 濾；
[0025] 3)將濾液裝入透析袋中用去離子水透析制得絲素蛋白溶液，用保鮮袋封裝，依次 放入-20度冰箱、-80度冰箱，最后放入冷凍干燥器中進(jìn)行干燥制得絲素粉；
[0026] 4)稱取步驟3)制得的絲素粉10g，溶解于9M溴化鋰水溶液中，室溫下進(jìn)行攪拌溶 解；
[0027] 5)將步驟4)所制得的溶解后的絲素溶液冷卻至常溫后，倒入截流分子量為 3500Da的透析袋中透析2-4天，以去除絲素溶液中的小分子物質(zhì)；
[0028] 6)將步驟5)制得的透析后的絲素溶液存放于透析袋，放入聚乙二醇6000粉劑 中，干燥濃縮，收集液體，離心取上清液即得；
[0029] (2).制備殼聚糖溶液
[0030] 1)將lmL冰醋酸用去離子水加至100ml得到1 %冰醋酸，將pH調(diào)至4. 6 ;
[0031] 2)稱取殼聚糖（脫乙酰度>90% )加入上述冰醋酸，配制成殼聚糖溶液；
[0032] (3) ?制備交聯(lián)支架
[0033] 1)將步驟（1)所制備的絲素蛋白類物質(zhì)的溶液和步驟（2)所制備的殼聚糖溶液混 合；
[0034] 2)浸入含50臟〇1/1的￡0(：、18臟〇1/1順3的95%乙醇水溶液中，41：下交聯(lián)2411;
[0035] 3)將步驟2)的交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物放入_20°C冰箱中預(yù)冷凍24h，再放入_80°C低溫冰 箱中冷凍24h，最后放入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥48h，得到初制的三維支架材料；
[0036] 4)將步驟3)所制的支架材料浸入無(wú)水甲醇及10%氫氧化鈉（體積比1:1)溶液 浸泡24h，用去離子水沖洗3遍后，置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥48h后取出，即得所述的三維基 質(zhì)支架；
[0037] (4).將腫瘤組織全細(xì)胞接種于步驟（3)制得的三維基質(zhì)支架上進(jìn)行培養(yǎng)。
[0038] 上述所述的方法，其中所述的絲素蛋白類物質(zhì)溶液的濃度為1 %- 5%，所述的殼 聚糖溶液的濃度為1%- 5%。
[0039] 上述所述的方法，其中所述的步驟（4)為：
[0040] 1)取離體30分鐘之內(nèi)的腫瘤組織，用含有雙抗的生理鹽水浸泡5min，沖洗標(biāo)本上 的血污，置DMEM中反復(fù)剪成糊狀；
[0041] 2)收集組織液，去上清后加入組織消化液，于37°C進(jìn)行l(wèi)_2h的酶解，每15min混 勻消化液一次；
[0042] 3)待組織松軟，呈白絮狀時(shí)，通過200目網(wǎng)篩過濾，并用玻璃注射器針心輕輕碾 磨，邊不斷用DMEM培養(yǎng)基沖洗，使組織分散成細(xì)胞懸液；
[0043] 4)置于低速離心機(jī)上離心10min(1500r/min),去上清，加入含20%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度；
[0044] 5)將1ml濃度為1?3X105/ml的混合細(xì)胞液接種于含三維支架的24孔培養(yǎng)板 中培養(yǎng)。
[0045] 本發(fā)明還涉及上述所述的腫瘤微環(huán)境體外構(gòu)建方法在腫瘤藥物篩選中的應(yīng)用。
[0046] 上述所述的應(yīng)用，其中所述的腫瘤藥物制成無(wú)菌速溶型藥膜用于藥物篩選。無(wú)菌 速溶型藥膜的制備，參見本申請(qǐng)發(fā)明人王守立提出的在先專利CN103088102A，
【公開日】2013 年5月8日，該專利申請(qǐng)全部公開內(nèi)容引入本申請(qǐng)作為參考。
[0047] 上述所述的應(yīng)用，其中采用MTT法檢測(cè)藥物的敏感性。
[0048] 本發(fā)明提供了一種腫瘤微環(huán)境體外重建的方法，所述的微環(huán)境是通過構(gòu)建一種類 似細(xì)胞體內(nèi)微環(huán)境的三維支架，腫瘤組織全細(xì)胞接種后能盡快恢復(fù)各細(xì)胞生理活性，從而 重建腫瘤體外的微環(huán)境，用于腫瘤個(gè)性化治療的藥物篩選。
[0049] 本發(fā)明的技術(shù)方案采用特定方法制得的絲素蛋白類物質(zhì)與殼聚糖、交聯(lián)劑進(jìn)行交 聯(lián)反應(yīng)，通過調(diào)整絲素蛋白類物質(zhì)/殼聚糖與交聯(lián)劑的濃度和比例，得到不同孔徑的三維 基質(zhì)支架。將腫瘤組織提取的全細(xì)胞接種于該三維培養(yǎng)體系，用于腫瘤藥物篩選。
[0050] 作為本發(fā)明一具體實(shí)施方案，一種腫瘤微環(huán)境體外重建的方法，其包括如下步 驟：
[0051] 1、制備1%?5%絲素蛋白液
[0052] (1)蠶繭殼剪成碎片后加入濃度為0. 5 %的碳酸鈉溶液煮沸3-2遍，去離子水洗后 烘干。
[0053] (2)將干燥的絲素加入煮沸的50%氯化鈣溶液攪拌，冷卻后過濾。
[0054] (3)將濾液裝入透析袋中用去離子水透析制得絲素蛋白溶液，用保鮮袋封裝，依次 放入-20°C冰箱、-80°C冰箱，最后放入冷凍干燥器中。
[0055] (4)稱取絲素粉10g，溶解于9M溴化鋰水溶液中，室溫下攪拌2小時(shí)進(jìn)行溶解。
[0056] (5)將以上溶解后的絲素溶液冷卻至常溫后，倒入截流分子量為3500Da的透析袋 中透析三天，以去除絲素溶液中的小分子物質(zhì)。
[0057] (6)將絲素蛋白液體存放透析袋，放入聚乙二醇6000粉劑中，干燥濃縮，收集液 體，離心取上清液。
[0058] (7)取3個(gè)稱量瓶編號(hào)洗凈后放入60°C恒溫烘箱中烘干，充分冷卻，稱量三者重 量，記為Ml。各取10ml絲素蛋白液放入稱量瓶，稱重為M2。放入60°C供箱中12h取出， 冷卻后稱重記為M3,按公式絲素蛋白溶液濃度％= (M3-M1V(M2-Ml)xl00%。
[0059] 2、制備1%?5%殼聚糖溶液
[0060] (1)將lmL冰醋酸用去離子水加至100ml得到1 %冰醋酸，將pH調(diào)至4. 6。
[0061] (2)稱取3?5g殼聚糖（脫乙酰度>90% )加入上述冰醋酸。
[0062] 3、制備交聯(lián)支架
[0063] (1)將步驟1所制備的絲素蛋白溶液和步驟2所制備的殼聚糖溶液混合。
[0064] (2)浸入含 50mmol/l的EDC、18mmol/lNHS的 95% 乙醇水溶液中，4°C交聯(lián) 24h。
[0065] (3)放入-20°C冰箱中預(yù)冷凍24h，再放入-80°C低溫冰箱中冷凍24h，最后放入冷 干燥機(jī)冷凍干燥48h，得到初制SF/CS支架材料。
[0066] (4)將所制支架浸入無(wú)水甲醇及10%氫氧化鈉（體積比1:1)溶液浸泡24h,用去 離子水沖洗3遍后，置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥48h后取出鏡檢。
[0067] 4、腫瘤組織全細(xì)胞提取和接種
[0068] (1)腫瘤組織離體30分鐘之內(nèi)用含有雙抗的生理鹽水浸泡5min，沖洗標(biāo)本上的血 污，置DMEM培養(yǎng)基中反復(fù)剪成糊狀。
[0069] (2)收集組織液，去上清后加入組織消化液，于37°C進(jìn)行l(wèi)_2h的酶解，每15min混 勻消化液一次。
[0070] (3)待組織松軟，呈白絮狀時(shí)，通過200目網(wǎng)篩過濾，并用玻璃注射器針心輕輕碾 磨，邊不斷用DMEM培養(yǎng)基沖洗，使組織分散成細(xì)胞懸液。
[0071] (4)置于低速離心機(jī)上離心10min(1500r/min)，去上清，加入20%FBS的DMEM培 養(yǎng)基。細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度。
[0072] (5)將1ml濃度為1?3X105/ml的混合細(xì)胞液接種于含三維支架的24孔培養(yǎng)板 培養(yǎng)。
[0073] 有益效果
[0074] 本發(fā)明以蠶繭殼或蠶絲為原料，經(jīng)過特定的提取工藝制得了天然絲素蛋白類 物質(zhì)，以其作為原料，與天然的殼聚糖（chitosan,CS)原料，運(yùn)用無(wú)毒性交聯(lián)劑1-乙 基-3-[3-二甲氨基丙基]碳化二亞胺（EDC)和N羥基琥珀酰亞胺（NHS)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，所 制得的三維基質(zhì)支架的構(gòu)象接近細(xì)胞體內(nèi)的空間構(gòu)象，細(xì)胞種植后能盡快形成細(xì)胞生長(zhǎng)微 環(huán)境，有利于細(xì)胞盡快適應(yīng)新的生長(zhǎng)環(huán)境并發(fā)揮正常生理功能。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)：
[0075] 1.本發(fā)明從蠶繭殼或蠶絲中制得的絲素蛋白類物質(zhì)和殼聚糖均被證明具有良好 生物相容性和無(wú)毒性，與動(dòng)物性凝膠相比，具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。
[0076] 2.大多數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體內(nèi)和體外均附著于一定的支架而生長(zhǎng)，本發(fā)明所制 得的所述的三維基質(zhì)構(gòu)架既適合于貼壁細(xì)胞也適合非貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。細(xì)胞在此三維環(huán)境 中排除了二維培養(yǎng)中的接觸性抑制效應(yīng)，在此系統(tǒng)中進(jìn)行的細(xì)胞體外研究結(jié)果，更能客觀 反映細(xì)胞生理狀態(tài)的生命活動(dòng)，提高研究結(jié)果的可靠性。
[0077] 3.通過調(diào)整絲素蛋白類物質(zhì)/殼聚糖溶液與交聯(lián)劑的濃度和比例，可得到不同孔 徑和構(gòu)象的三維基質(zhì)支架，根據(jù)培養(yǎng)目的細(xì)胞所在體內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可選用不同孔徑 和不同基質(zhì)構(gòu)象的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，滿足于不同組織來源的細(xì)胞的原代體外培養(yǎng)，應(yīng)用范圍 及其廣泛，可適用于難培養(yǎng)細(xì)胞體的體外擴(kuò)增、組織器官再造和腫瘤藥物篩選。
[0078] 4.本發(fā)明的細(xì)胞三維培養(yǎng)基質(zhì)構(gòu)架材料的構(gòu)象類似于細(xì)胞體內(nèi)微環(huán)境中的纖維 組織構(gòu)象，原代分離的細(xì)胞能盡快適應(yīng)體外生長(zhǎng)環(huán)境，立足于此三維（3D)培養(yǎng)過程中的細(xì) 胞生物學(xué)行為與體內(nèi)接近，減少體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差，具有重大的社會(huì)效益。
[0079] 5.為細(xì)胞三維培養(yǎng)研究提供了一個(gè)新的研究途徑，這一研究的應(yīng)用，將在干細(xì)胞 培養(yǎng)、腫瘤微環(huán)境構(gòu)建、腫瘤藥物篩選、組織器官重建工程等方面起著重要推動(dòng)作用。
[0080] 6.由于本三維基質(zhì)構(gòu)象類似于腫瘤組織體內(nèi)微環(huán)境中的腫瘤間質(zhì)構(gòu)象，原代分離 的細(xì)胞能盡快適應(yīng)體外生長(zhǎng)環(huán)境，立足于此重建腫瘤微環(huán)境的藥敏結(jié)果，減少了藥敏檢測(cè) 的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)誤差，具有重大的社會(huì)效益。
[0081] 7.腫瘤細(xì)胞在此三維環(huán)境中排除了二維培養(yǎng)中的接觸性抑制效應(yīng)，在此系統(tǒng)中進(jìn) 行的體外研究結(jié)果，更能客觀反映細(xì)胞生理狀態(tài)的生命活動(dòng)，提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0082] 圖1.腫瘤微環(huán)境的體外構(gòu)建。
[0083] 圖2本發(fā)明的基質(zhì)支架材料與現(xiàn)有的絲素蛋白制得的支架材料降解性的影響對(duì) 比情況
[0084] 圖3本發(fā)明的基質(zhì)支架材料與現(xiàn)有的絲素蛋白制得的支架材料對(duì)細(xì)胞增殖能力 的影響對(duì)比情況

【具體實(shí)施方式】
[0085] 本發(fā)明提供的腫瘤細(xì)胞體外微環(huán)境構(gòu)建方法是采用絲素蛋白/殼聚糖溶液與交 聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，通過調(diào)整絲素蛋白/殼聚糖溶液與交聯(lián)劑的濃度和比例，得到不同孔 徑的三維基質(zhì)支架，根據(jù)培養(yǎng)腫瘤的組織類型和組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選用不同培養(yǎng)體系，使腫瘤 組織細(xì)胞在類似體內(nèi)微環(huán)境狀態(tài)下生長(zhǎng)。
[0086] 實(shí)施例1 :絲素蛋白三維基質(zhì)構(gòu)建方法
[0087] (1)制備1 %?5%絲素蛋白液
[0088] 1)將蠶繭殼剪成1cm2的碎片，加入濃度為0. 5 %的碳酸鈉溶液浸沒蠶繭殼煮沸 2-3遍，每次至少1個(gè)小時(shí)。
[0089] 2)先用自然水洗2-3次，再用去離子水洗兩次再烘干。
[0090] 3)用50 %的氯化鈣溶液加熱至沸騰（或溶解于9M的溴化鋰溶液中），將干燥的絲 素加入攪拌，使絲素充分溶解，冷卻至室溫用布氏漏斗過濾。
[0091] 4)將濾液裝入透析袋中用去離子水透析3-5天，制得絲素蛋白溶液。
[0092] 5)用保鮮袋封裝，放入-20度冰箱（12個(gè)小時(shí)），再放入-80°C冰箱（6個(gè)小時(shí)）， 最后放入冷凍干燥器中至少24個(gè)小時(shí)。
[0093] 6)稱取絲素粉10g，溶解于9M溴化鋰水溶液中，室溫下攪拌2小時(shí)進(jìn)行溶解。
[0094] 7)將上述絲素溶液冷卻至常溫后，倒入截流分子量為3500Da的透析袋中，用去 離子水4°C冰箱里透析三天，每隔3小時(shí)換水一次，以去除絲素溶液中的小分子物質(zhì)。
[0095] 8)將制得的絲素蛋白液體存放透析袋，放入聚乙二醇6000粉劑中，干燥濃縮， 收集液體，將其以3500r/min離心15min，取上清液，置于4°C冰箱中可保存一周。
[0096] 9)取3個(gè)稱量瓶編號(hào)洗凈后放入60°C恒溫烘箱中烘干，充分冷卻，稱量三者重 量，記為Ml。各取10ml絲素蛋白液放入稱量瓶，稱重為M2。放入60°C供箱中12h取出， 冷卻后稱重記為M3,按公式絲素蛋白溶液濃度％= (M3-M1V(M2-Ml)xl00%
[0097] 10)本實(shí)施例得出的絲素蛋白濃度為約為2%?3%。
[0098] (2)制備1 %?5 %殼聚糖溶液
[0099] 1)將lmL冰醋酸用去離子水加至100ml得到1 %冰醋酸，將pH調(diào)至4. 6。
[0100] 2)稱取3.lg殼聚糖（脫乙酰度>90% )加入上述冰醋酸。
[0101] 3)本實(shí)施例得到的是1 %的殼聚糖溶液。
[0102] (3)制備交聯(lián)支架
[0103] 1)將（1)所制備的絲素蛋白溶液和（2)所制備的殼聚糖溶液混合。
[0104] 2)浸入含50mmol/l的EDC、18mmol/lNHS的95%乙醇水溶液中，4°C下交聯(lián)24h。
[0105] 3)放入-20°C冰箱中預(yù)冷凍24h，再放入-80°C低溫冰箱中冷凍24h，最后放入冷凍 干燥機(jī)冷凍干燥48h，得到初制SF/CS支架材料。
[0106] 4)將所制支架浸入無(wú)水甲醇及10%氫氧化鈉（體積比1:1)溶液浸泡24h，用去離 子水沖洗3遍后，置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥48h后取出鏡檢。
[0107] 5)鏡下觀察圖像結(jié)構(gòu)：光學(xué)顯微鏡（日本OlympusCX21)觀察通過調(diào)整絲素蛋白 /殼聚糖溶液與交聯(lián)劑的濃度和比例，得到不同孔徑的三維基質(zhì)支架（見圖1-1);掃描電子 顯微鏡（荷蘭，PhilipsXL20)電鏡觀察基質(zhì)結(jié)構(gòu)（見圖1-2)
[0108] (4)MTT法檢測(cè)腫瘤組織全細(xì)胞培養(yǎng)后的增殖能力
[0109] 1)肺腺癌（患者病史略）腫瘤組織離體30分鐘之內(nèi)用含有雙抗的生理鹽水浸泡 5min，沖洗標(biāo)本上的血污，置DMEM培養(yǎng)基中反復(fù)剪成糊狀。
[0110] 2)收集組織液，去上清后加入組織消化液，于37°C進(jìn)行l(wèi)_2h的酶解，每15min混 勻消化液一次。
[0111] 3)待組織松軟，呈白絮狀時(shí)，通過200目網(wǎng)篩過濾，并用玻璃注射器針心輕輕碾 磨，邊不斷用DMEM培養(yǎng)基沖洗，使組織分散成細(xì)胞懸液。
[0112] 4)置于低速離心機(jī)上離心10min(1500r/min)，去上清，加入20%FBS的DMEM培 養(yǎng)基。細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度。
[0113] 5)將1ml濃度為1?3X105/ml的混合細(xì)胞液接種于含本發(fā)明實(shí)施例1中上述制 得的三維支架的24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)（稱為三維培養(yǎng)或3D培養(yǎng)），同時(shí)用常規(guī)24孔培養(yǎng)板培 養(yǎng)（稱為二維培養(yǎng)或2D培養(yǎng)）做對(duì)照。
[0114] 6)于上述培養(yǎng)的第3天分別棄去培養(yǎng)液，加500yl/孔MTT培養(yǎng)液 (100iUMTT+400yl培養(yǎng)基），置搖床震蕩充分溶解結(jié)晶物。
[0115] 7)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在0D570nm處測(cè)各孔吸光值，重復(fù)三次，取平均值。
[0116] 8)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肺腺癌腫瘤組織全細(xì)胞接種3D培養(yǎng)基中3天后的生存能力較普 通的2D培養(yǎng)明顯增高（圖1-3)。
[0117] 實(shí)施例2 :大腸癌化療藥物敏感性篩查
[0118] (1)大腸癌腫瘤組織全細(xì)胞提取和接種
[0119] 1)取離體30分鐘之內(nèi)的腫瘤組織，用含有雙抗的生理鹽水浸泡5min，沖洗標(biāo)本上 的血污，置DMEM培養(yǎng)基中反復(fù)剪成糊狀。
[0120] 2)收集組織液，去上清后加入組織消化液，于37°C進(jìn)行l(wèi)_2h的酶解，每15min混 勻消化液一次。
[0121] 3)待組織松軟，呈白絮狀時(shí)，通過200目網(wǎng)篩過濾，并用玻璃注射器針心輕輕碾 磨，邊不斷用DMEM培養(yǎng)基沖洗，使組織分散成細(xì)胞懸液。
[0122] 4)置于低速離心機(jī)上離心10min(1500r/min)，去上清，加入20%FBS的DMEM培 養(yǎng)基。細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度。
[0123] 5)將1ml濃度為1?3X105/ml的混合細(xì)胞液接種于含三維支架的24孔培養(yǎng)板 培養(yǎng)。
[0124] (2)制備無(wú)菌速溶型藥膜（參見發(fā)明人王守立的另一發(fā)明專利，申請(qǐng)公布號(hào)CN 103088102A)，其包括如下步驟：
[0125]1)將成膜材料加入水中，攪拌溶解或加熱溶解。
[0126] 2)加入增塑劑和抗腫瘤藥物，攪拌溶解均勻，采用加熱、靜置或超聲等方式脫氣。
[0127] 3)將上述溶液涂布于制膜設(shè)備，采用熱風(fēng)或冷風(fēng)等方式干燥。
[0128] 4)脫膜，測(cè)定含量，并按照測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分劑量分割。
[0129] 5)將分割后的藥膜采用放射線照射滅菌或環(huán)氧乙烷滅菌，優(yōu)選放射線照射滅菌。
[0130] (3)MTT法檢測(cè)化療藥物的敏感性
[0131] 1)將含有腫瘤全細(xì)胞的三維培養(yǎng)物用PBS漂洗2遍，移入新的24孔板，同時(shí)設(shè)立 重復(fù)孔。
[0132] 2)每孔加入300ul新鮮培養(yǎng)基和20ulMTT溶液，置37°C恒溫箱孵育4h。
[0133] 3)每孔加入200ul二甲基亞砜，置于搖床上低俗震蕩lOmin，使結(jié)晶充分溶解。
[0134] 4)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)0D560nm處的吸光值，計(jì)算平均抑制率（IR)=(用藥組平 均0D值-空白組平均0D值）八對(duì)照組平均00值一空白組平均00值）\100%。
[0135] (4)化療方案及抑制率：結(jié)果見表1。
[0136] 實(shí)施例3 :乳腺癌化療藥物敏感性篩查
[0137] (1)乳腺癌組織全細(xì)胞提取和接種
[0138] 同實(shí)例 2(1)
[0139] (2)制備無(wú)菌速溶型藥膜
[0140] 同實(shí)例 2(2)
[0141] (3)MTT法檢測(cè)化療藥物的敏感性
[0142] 同實(shí)例 2(3)
[0143] (4)化療方案及抑制率
[0144] 見表 2
[0145] 實(shí)施例4 :骨肉瘤化療藥物敏感性篩查
[0146] (1)骨肉瘤組織全細(xì)胞提取和接種
[0147] 同實(shí)例 2(1)
[0148] (2)制備無(wú)菌速溶型藥膜
[0149] 同實(shí)例 2(2)
[0150] (3)MTT法檢測(cè)化療藥物的敏感性
[0151] 同實(shí)例 2(3)
[0152] (4)化療方案及抑制率
[0153] 見表 3
[0154] 實(shí)施例5 :小細(xì)胞肺癌化療藥物敏感性篩查
[0155] (1)小細(xì)胞肺癌組織全細(xì)胞提取和接種
[0156] 同實(shí)例 2(1)
[0157] (2)制備無(wú)菌速溶型藥膜
[0158] 同實(shí)例 2(2)
[0159] (3)MTT法檢測(cè)化療藥物的敏感性
[0160] 同實(shí)例 2(3)
[0161] (4)化療方案及抑制率
[0162] 見表 4
[0163] 實(shí)施例6 :急性髓系白血病化療藥物敏感性篩查
[0164] (1)白血病細(xì)胞提取和接種
[0165] 1)在無(wú)菌技術(shù)下抽取未化療急性髓系白血病患者的骨髓10ml(肝素抗凝）。
[0166] 2)凈化室內(nèi)經(jīng)Ficoll液分離出白血病細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)液洗滌，置于RPMI1640培養(yǎng)體 系中制成IX105/ml的細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液接種于三維培養(yǎng)板。
[0167] (2)制備無(wú)菌速溶型藥膜
[0168] 同實(shí)例 2(2)
[0169] (3)MTT法檢測(cè)化療藥物的敏感性
[0170] 同實(shí)例 2(3)
[0171] (4)化療方案及抑制率
[0172] 見表 5
[0173] 表1.實(shí)施例2大腸癌的化療方案及抑制率
[0174]

【權(quán)利要求】
1. 一種腫瘤微環(huán)境的體外構(gòu)建方法，包括將腫瘤組織全細(xì)胞接種于三維基質(zhì)支架上進(jìn) 行培養(yǎng)的步驟，其中所述的三維基質(zhì)支架是由絲素蛋白類物質(zhì)、殼聚糖和交聯(lián)劑經(jīng)交聯(lián)反 應(yīng)而制得，其特征在于所述的絲素蛋白類物質(zhì)是由蠶繭殼或蠶絲經(jīng)過脫膠、溶解、透析、干 燥制得絲素粉，絲素粉再經(jīng)如下方法制得所述的絲素蛋白類物質(zhì)： (1) 將絲素粉溶解于溴化鋰溶液中； (2) 將步驟（1)的溶解后的絲素溶液用截流分子量為3500Da的透析袋進(jìn)行透析，制得 透析后的絲素溶液； (3) 將裝有步驟（2)所制得的透析后的絲素溶液的透析袋放入聚乙二醇6000粉中進(jìn)行 濃縮，所得濃縮液離心后取上清液，即得所述的絲素蛋白類物質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的交聯(lián)劑為1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基] 碳化二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1 一 2所述的方法，其中將所述的絲素蛋白類物質(zhì)、殼聚糖和交聯(lián)劑交 聯(lián)反應(yīng)后所得反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)梯度冷凍得到所述的基質(zhì)支架，所述的梯度冷凍過程如下： (1) 將反應(yīng)產(chǎn)物先放入_20°C冰箱中預(yù)冷凍12?48h，再放入-80°C低溫冰箱中冷凍 12?48h，最后放入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥24?72h，得到初制的三維支架材料； (2) 將步驟（1)制得的初制的三維支架材料浸入無(wú)水甲醇及10%氫氧化鈉（體積比 1:1)溶液浸泡12?48h，用去離子水沖洗后，置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥24?72h后取出即 得。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1 一 3所述的方法，其中通過改變絲素蛋白類物質(zhì)、殼聚糖和/或交聯(lián) 劑的用量以制得不同孔徑和構(gòu)象的三維基質(zhì)支架。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 一 4所述的方法，其特征在于包含如下步驟： (1) 制備絲素蛋白類物質(zhì)的溶液 1) 將蠶繭殼剪成碎片后加入濃度為0. 5%的碳酸鈉溶液煮沸2 - 3遍，再用去離子水 洗后進(jìn)行烘干； 2) 將步驟1)制得的干燥絲素加入煮沸的50%氯化鈣溶液攪拌溶解，冷卻后過濾； 3) 將濾液裝入透析袋中用去離子水透析制得絲素蛋白溶液，用保鮮袋封裝，依次放 入-20度冰箱、-80度冰箱，最后放入冷凍干燥器中進(jìn)行干燥制得絲素粉； 4) 稱取步驟3)制得的絲素粉10g，溶解于9M溴化鋰水溶液中，室溫下進(jìn)行攪拌溶解； 5) 將步驟4)所制得的溶解后的絲素溶液冷卻至常溫后，倒入截流分子量為3500Da的 透析袋中透析2 - 4天，以去除絲素溶液中的小分子物質(zhì)； 6) 將步驟5)制得的透析后的絲素溶液存放于透析袋，放入聚乙二醇6000粉劑中，干 燥濃縮，收集液體，離心取上清液即得； (2) 制備殼聚糖溶液 1) 將lmL冰醋酸用去離子水加至100ml得到1 %冰醋酸，將pH調(diào)至4. 6 ; 2) 稱取殼聚糖（脫乙酰度>90% )加入上述冰醋酸，配制成殼聚糖溶液； (3) 制備交聯(lián)支架 1) 將步驟（1)所制備的絲素蛋白類物質(zhì)的溶液和步驟（2)所制備的殼聚糖溶液混合； 2) 浸入含50_〇1/1的EDC、18mmol/lNHS的95%乙醇水溶液中，4°C下交聯(lián)24h ; 3) 將步驟2)的交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物放入-20°C冰箱中預(yù)冷凍24h，再放入-80°C低溫冰箱中 冷凍24h，最后放入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥48h，得到初制的三維支架材料； 4)將步驟3)所制的支架材料浸入無(wú)水甲醇及10%氫氧化鈉（體積比1:1)溶液浸泡 24h，用去離子水沖洗3遍后，置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥48h后取出，即得所述的三維基質(zhì)支 架； (4)將腫瘤組織全細(xì)胞接種于步驟（3)制得的三維基質(zhì)支架上進(jìn)行培養(yǎng)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的絲素蛋白類物質(zhì)溶液的濃度為1% - 5%， 所述的殼聚糖溶液的濃度為1 % - 5%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的步驟（4)為： (1) 取離體30分鐘之內(nèi)的腫瘤組織，用含有雙抗的生理鹽水浸泡5min，沖洗標(biāo)本上的 血污，置杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM)中反復(fù)剪成糊狀； (2) 收集組織液，去上清后加入組織消化液，于37°C進(jìn)行l(wèi)_2h的酶解，每15min混勻消 化液一次； (3) 待組織松軟，呈白絮狀時(shí)，通過200目網(wǎng)篩過濾，并用玻璃注射器針心輕輕碾磨，邊 不斷用DMEM培養(yǎng)基沖洗，使組織分散成細(xì)胞懸液； (4) 置于低速離心機(jī)上離心10min(1500r/min)，去上清，加入含20%胎牛血清（FBS) 的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度； (5) 將lml濃度為1?3X 105/ml的混合細(xì)胞液接種于含三維支架的24孔培養(yǎng)板中培 養(yǎng)。
8. 權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的腫瘤微環(huán)境體外構(gòu)建方法在腫瘤藥物篩選中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述的腫瘤藥物制成無(wú)菌速溶型藥膜用于藥物篩 選。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8 - 9所述的應(yīng)用，其中采用MTT法檢測(cè)藥物的敏感性。
【文檔編號(hào)】C12N5/09GK104342405SQ201410411627
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月20日
【發(fā)明者】王守立 申請(qǐng)人:蘇州堪賽爾生物技術(shù)有限公司