Ccl2在預(yù)判及逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種細胞因子CCL2在預(yù)判和胃癌耐藥中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及的細胞因子CCL2，是在對順鉑等化療藥物耐藥的胃癌細胞中經(jīng)細胞因子芯片篩選所獲得的，本發(fā)明系首次證明耐藥型腫瘤細胞中通過自分泌CCL2維持自身耐藥性，且可以通過以細胞因子CCL2為介質(zhì)將耐藥性傳遞給藥物敏感型細胞，使其獲得耐藥性。因此，本發(fā)明為胃癌抗耐藥的治療策略提供了新的靶點，為胃癌耐藥的診斷提供了新的診斷指標(biāo)；并以此為依據(jù)，用以設(shè)計臨床診斷胃癌耐藥的新的標(biāo)志物和開發(fā)直接針對胃癌耐藥的新藥。
【專利說明】
CCL2在預(yù)判及逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種細胞分泌因子CCL2的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]化療是胃癌治療的主要手段之一，但是其臨床療效往往因腫瘤逐漸產(chǎn)生多藥耐藥而大受影響。順鉑是胃癌化療常用藥物，許多胃癌聯(lián)合化療方案中均包含順鉑。順鉑可以通過自由擴散和主動運輸?shù)刃问竭M入細胞，在細胞內(nèi)與DNA形成鏈內(nèi)交聯(lián)和鏈間交聯(lián)，導(dǎo)致DNA損傷而發(fā)揮腫瘤細胞殺傷作用。但腫瘤細胞容易通過前述的各種機制對順鉑產(chǎn)生耐藥性，從而導(dǎo)致化療失敗。
[0003]近來，越來越多的證據(jù)表明腫瘤微環(huán)境中存在的細胞因子可以影響腫瘤細胞對藥物的反應(yīng)，與多種腫瘤細胞的化療耐藥有著密切的聯(lián)系。CCL2是最早被發(fā)現(xiàn)的趨化因子家族成員，在單核細胞、淋巴細胞分化和趨化中發(fā)揮重要作用，通常由內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和單核細胞所分泌。而腫瘤細胞亦可通過自分泌和旁分泌方式分泌CCL2以介導(dǎo)腫瘤耐藥性。如卵巢癌細胞可以通過自分泌CCL2等細胞因子介導(dǎo)對鉑類及紫杉類化療的耐藥。而目前胃癌中缺乏預(yù)判腫瘤耐藥的標(biāo)志物。因此，如果能夠?qū)ふ也l(fā)現(xiàn)作為胃癌耐藥生物標(biāo)志物性的細胞因子，對于提高胃癌治療效果將十分有益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種細胞因子CCL2在判斷及逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥中的用途。
[0005]本發(fā)明涉及的細胞因子CCL2，是在對順鉑等化療藥物耐藥的胃癌細胞中經(jīng)細胞因子芯片篩選所獲得的。
[0006]本發(fā)明首次證明細胞因子CCL2在胃癌細胞對鉑類藥物耐藥性的產(chǎn)生及異質(zhì)性腫瘤細胞間耐藥性的傳遞起著關(guān)鍵性的作用，涉及其作為胃癌耐藥的生物標(biāo)志物的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果在于:本發(fā)明系首次證明耐藥型腫瘤細胞中通過自分泌CCL2維持自身耐藥性，且可以通過以細胞因子CCL2為介質(zhì)將耐藥性傳遞給藥物敏感型細胞，使其獲得耐藥性。因此，本發(fā)明為胃癌抗耐藥的治療策略提供了新的靶點，為胃癌耐藥的診斷提供了新的診斷指標(biāo);并以此為依據(jù)，用以設(shè)計臨床診斷胃癌耐藥的新的標(biāo)志物和開發(fā)直接針對胃癌耐藥的新藥。
【附圖說明】
[0008]圖1說明耐藥型腫瘤細胞可以將耐藥性傳遞給藥物敏感型細胞，其中(A)為順鉑處理后細胞的存活率，其中(B)共培養(yǎng)系統(tǒng)模式圖，其中(C)為免疫印跡法檢測與BGC823或者BGC823/DDP共培養(yǎng)的BGC823細胞，與SGC7901或者SGC7901/DDP共培養(yǎng)的SGC7901細胞，用順鉑處理24小時后PARP-1剪切片段，其中(D)為用TUNEL試驗分析C處理后的BGC823(D)的細胞凋亡情況，其中(E)為用TUNEL試驗分析C處理后的SGC7901 (E)的細胞凋亡情況。(圖2_4的說明類似修改)
[0009]圖2說明CCL2是由耐藥細胞自分泌的傳遞耐藥性的重要細胞因子。(A)用細胞因子微陣列芯片檢測BGC823，BGC823/DDP，SGC7901和SGC7901/DDP細胞培養(yǎng)基中的CCL2含量。(B)用 ELISA 方法驗證 BGC823，BGC823/DDP，SGC7901 和 SGC7901/DDP 細胞培養(yǎng)基中的 CCL2 含量。(C)用ELISA方法檢測轉(zhuǎn)染了CCL2 siRNA的BGC823/DDP和SGC7901/DDP細胞培養(yǎng)基中的CCL2含量。(D)免疫印跡法檢測與敲除CCL2后的耐藥細胞與敏感細胞共培養(yǎng)后的BGC823和SGC7901細胞在接受順鉑處理后PARP-1剪切片段。
[0010]圖3說明外源性CCL2可以抑制順鉑誘導(dǎo)的敏感細胞凋亡。(A和B)順鉑處理過的BGC823(A)和SGC7901(B)在有無重組CCL2蛋白存在情況下的細胞存活率。(C)免疫印跡法檢測A和B處理后的BGC823和SGC7901細胞行PARP-1剪切片段。(D和E)用TUNEL試驗分析在A和B處理后的BGC823(D)和SGC7901(E)細胞的細胞凋亡情況。
[0011]圖4說明CCL2基因敲除使耐藥細胞重獲藥物敏感性。(A和B)CCL2基因敲除前后，經(jīng)順鉑處理的BGC823(A)and SGC7901(B)的細胞存活率。(C)免疫印跡法檢測經(jīng)A和B處理后的BGC823和SGC7901細胞的PARP-1剪切片段表達水平。(D和E)用TUNEL試驗分析在A和B處理后的BGC823(D)和SGC7901(E)細胞的凋亡情況。
【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。
[0013]在先前的研究中，我們建立了 2株順鉑耐藥的胃癌細胞，S卩BGC823/DDP細胞和SGC7901/DDP細胞。為了明確胃癌細胞自分泌的細胞因子與化療耐藥之間的聯(lián)系，ENREF 13我們利用細胞因子微陣列芯片對胃癌細胞進行了細胞因子篩選。我們發(fā)現(xiàn)上述細胞可以通過分泌CCL2這一細胞因子獲得對鉑類藥物的抗藥性。通過我們的實驗，進一步支持CCL2對于化療耐藥的預(yù)測作用。
[0014]耐藥型腫瘤細胞可以將耐藥性傳遞給藥物敏感型細胞:為了明確胃癌細胞自分泌的細胞因子與耐藥性相關(guān)，我們建立了敏感型腫瘤細胞與耐藥型腫瘤細胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)。在1'作118?611聚酯膜細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，耐藥細胞860823/1)0?和3607901/1)0?接種在細胞小室里，敏感細胞BGC823和SGC7901接種于嵌有0.4μπι孔徑聚酯膜的細胞小室下方的6板孔中。圖1A和B中示出了聚酯膜可以實現(xiàn)耐藥細胞與敏感細胞間細胞因子的交流。結(jié)果顯示，順鉑可以誘導(dǎo)與敏感細胞共培養(yǎng)的860823及5607901細胞中？41^1剪切片段的升高。圖1(0中示出了當(dāng)用順鉑處理與耐藥細胞共同培養(yǎng)的敏感細胞時，僅能檢測到較低水平的PARPl剪切片段。(圖1C)同樣，TUNEL實驗也證實將敏感細胞BGC823，SGC7901分別與耐藥細胞BGC823/DDP，SGC7901/DDP共培養(yǎng)時，順鉑誘導(dǎo)的敏感型細胞凋亡將明顯減少。(圖1D和1Ε)上述數(shù)據(jù)顯示，耐藥細胞可以將耐藥性傳遞給敏感細胞。而這種傳遞很有可能是通過耐藥細胞分泌的細胞因子介導(dǎo)的。
[0015]證實CCL2是傳遞藥物耐藥性的重要自分泌細胞因子:為明確與鉑類耐藥相關(guān)的細胞因子，我們用細胞因子抗體微陣列芯片從耐藥細胞的培養(yǎng)基中篩選出可能參與耐藥性傳遞的細胞因子。最終，我們發(fā)現(xiàn)SGC7901 /DDP細胞培養(yǎng)基中的CCL2是SGC7901細胞培養(yǎng)基中的5.6倍。同樣的，BGC823/DDP細胞培養(yǎng)基中的CCL2是BGC823細胞中的1.75倍。(圖2Α)上述結(jié)果得到ELSIA法的驗證(圖2Β)。重要的是，當(dāng)利用siRNA將耐藥細胞CCL2基因敲除后(圖2C)，耐藥細胞傳遞藥物耐藥性的能力隨著CCL2的下降而下降(圖2D)。上述結(jié)果都支持耐藥細胞自分泌的CCL2傳遞耐藥性的主要細胞因子。
[0016]CCL2對于獲得性耐藥的重要性:為了證實CCL2在敏感細胞獲得耐藥性中起的重要作用，我們比較了在添加和不添加CCL2重組蛋白情況下，敏感細胞暴露在順鉑中的生存率及細胞凋亡情況。細胞毒性試驗結(jié)果顯示，加入重組CCL2蛋白可使順鉑誘導(dǎo)的BGC823和SGC7901死亡明顯減少。(圖3A和B)。進一步分析，加入重組CCL2蛋白可以使順鉑誘導(dǎo)的PARPl剪切片段(圖3C)和及DNA斷裂片段(圖3D和E)產(chǎn)生明顯減少。由此證明，外源性CCL2可以誘導(dǎo)敏感細胞產(chǎn)生耐藥性。
[0017]CCL2對于保持藥物耐藥性的重要性:為了進一步驗證CCL2在保持耐藥細胞的耐藥性中起的重要作用，我們利用CCL2 siRNA將耐藥細胞BGC823/DDP和SGC7901/DDP的CCL2基因敲除。結(jié)果顯示順鉑誘導(dǎo)的細胞死亡增加(圖4A和B)。與之一致的是，耐藥細胞中順鉑誘導(dǎo)的PARPl剪切片段的表達和細胞凋亡也隨之顯著增加(圖4C、D和E)。
【主權(quán)項】
1.CCL2在預(yù)判及逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述腫瘤為胃癌。3.—種細胞因子CCL2在預(yù)判和胃癌耐藥中的用途，其特征在于，CCL2可以用以設(shè)計臨床診斷胃癌耐藥的新的標(biāo)志物和開發(fā)直接針對胃癌耐藥的新藥。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細胞因子，其特征在于，所述腫瘤為胃癌。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物，其特征在于，所述劑型為液體注射液，粉針注射劑，注射用乳劑，片劑，丸劑，膠囊劑，膏劑，霜劑，貼劑，擦劑，粉劑，噴霧劑，植入劑，滴劑，栓劑，軟膏劑，糖果劑中的任意一種。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物，其特征在于，所述藥物的給藥途徑包括口服給藥，注射給藥，植入給藥，腔內(nèi)給藥，舌下給藥，肛門給藥，透皮給藥，內(nèi)外敷中的任意一種或多種。
【文檔編號】G01N33/68GK106038590SQ201610290336
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年4月24日
【發(fā)明人】許文俠, 金洪傳, 王嫻, 周建偉, 耿煒, 韓夢嬌, 魏麒
【申請人】許文俠