診斷傳染病病原體及其藥物敏感性的方法
【專利摘要】本說明書一般涉及檢測(cè)、診斷和/或鑒定病原體例如傳染病病原體以及確定其藥物敏感性和適當(dāng)?shù)闹委煼椒ǖ姆椒ā１景l(fā)明亦一般涉及在單個(gè)受試者以及更大的受試者群體中監(jiān)測(cè)病原體感染的方法。
【專利說明】診斷傳染病病原體及其藥物敏感性的方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)是2011年2月24日提交的題為"診斷傳染病病原體及其藥物敏感性的方 法"的國際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US2011/026092發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)進(jìn)入中國國家階 段獲得的國家申請(qǐng)?zhí)枮?011800206935。
[0003] 本申請(qǐng)要求保護(hù)2010年2月24日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/307, 669和2010 年4月12日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/323, 252的權(quán)益，所述申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過引 用以其整體結(jié)合到本文中。
[0004] 聯(lián)邦贊助的研究或開發(fā)
[0005] 本發(fā)明利用在國立衛(wèi)生研究院授予的獎(jiǎng)助金號(hào)3U54-A1057159-06S1和獎(jiǎng)助金號(hào) A108002下的政府支持進(jìn)行。政府在本發(fā)明中具有一定權(quán)利。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0006] 本發(fā)明尤其涉及檢測(cè)、診斷和/或鑒定病原體例如傳染病病原體和確定其對(duì)已知 或潛在治療的敏感性的方法。
[0007] 發(fā)明背景
[0008] 分子診斷學(xué)的發(fā)展在除傳染病之外的大多數(shù)醫(yī)學(xué)學(xué)科中徹底改革了護(hù)理，在傳 染病中它們未能起到普遍的變革作用。對(duì)慢速培養(yǎng)法的依賴在抗生素抗性的當(dāng)前危機(jī)中 尤其無效，因?yàn)榭焖僭\斷刺激病原體及其抗藥譜的分子工具的開發(fā)將改變細(xì)菌感染、真 菌感染、病毒感染和寄生蟲感染的管理，在試圖降低死亡率、控制衛(wèi)生保健費(fèi)用和改進(jìn)對(duì) 病原體中逐步上升的抗藥性的公共衛(wèi)生控制方面，導(dǎo)向快速、知情的藥物治療。僅在美 國醫(yī)院，每年有170萬人獲得醫(yī)院細(xì)菌感染且死亡99, 000人，這些感染的70 %因細(xì)菌對(duì) 至少一種藥物的抗性所致，估計(jì)每年花費(fèi)450億美元（Klevens等，2002. Public Health R印? 2007 ; 122 (2) :160-6 Elevens 等，Clin Infect Dis. 2008 ;47 (7) :927-30 ;Scott，The Direct Medical Costs of Healthcare-Associated Infection in U.S. Hospitals and the Benefits of Prevention.載于：Division of Healthcare Quality Promotion NCfP, Detection and Control of Infectious Diseases,編輯 Atlanta:CDC, 2009)。然 而，所述問題不限于美國，目前微生物抗藥性在全球影響大多數(shù)普通細(xì)菌感染?？辜籽?西林金黃色葡萄球菌（S. aureus) (MRSA)、多藥耐藥性結(jié)核病（MDR-TB)和漸增的抗藥性 革蘭氏陰性生物的全球傳播，促使制定聚焦于監(jiān)督、預(yù)防和控制、研究及產(chǎn)品開發(fā)的行動(dòng) 計(jì)劃(US action plan to combat antimicrobial resistance. Infect Control Hosp Epidemiol. 2001 ;22 (3) :183-4)。然而，在任何這些前沿獲得了極微的進(jìn)展。
[0009] 及時(shí)給予適當(dāng)抗生素已反復(fù)地顯示使患有嚴(yán)重細(xì)菌感染的患者中的死亡率 降到最低，不論是在帶有諸如屎腸球菌（E. faecium)、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏 菌（K. pneumoniae)、鮑氏不動(dòng)桿菌（A.baumanii)、銅綠假單胞菌（P. aeruginosa)和腸 桿菌（Enterobacter)物種等醫(yī)院病原體的醫(yī)院環(huán)境內(nèi)，或是在帶有諸如結(jié)核病（TB) 等病原體的資源貧乏環(huán)境中（Harbarth 等，Am J Med. 2003; 115 (7) :529-35 ;Harries 等，Lancet. 2001 ;357 (9267):1519-23 ;Lawn 等，Int J Tuberc Lung Dis. 1997; I (5) :485-6)。然而，由于涉及生物的培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的當(dāng)前診斷方法可花費(fèi)數(shù)天或更多天 來正確地鑒定所述生物及其藥物敏感性模式二者，因此醫(yī)師依靠增加使用經(jīng)驗(yàn)的廣譜抗生 素，增加對(duì)抗藥性的選擇壓力并增加相關(guān)的衛(wèi)生保健費(fèi)用?？焖伲ɡ缟儆?小時(shí)）檢測(cè)病 原體及其抗藥譜的護(hù)理診斷要點(diǎn)為迫切需要的并且可引人注目地改變醫(yī)學(xué)實(shí)踐。針對(duì)設(shè)計(jì) 基于DNA的檢驗(yàn)或基于PCR的檢驗(yàn)的一些努力已產(chǎn)生能夠以低檢出限快速鑒定病原體的工 具。然而，這些工具的全球使用目前因費(fèi)用和對(duì)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)施的要求而受限，以及因基于 PCR的方法在粗制樣品的環(huán)境下的固有不靈敏性而受限，所述粗制樣品不易遵循所需酶學(xué)。 確定抗藥性的分子方法甚至更有限，可以非常有限的方式用于一些生物（例如MRSA、TB)， 這基于相對(duì)于已知的賦予抗藥性的突變來確定感染細(xì)菌的基因型。然而此方法需要相當(dāng) 廣泛地鑒定用于檢驗(yàn)的所有抗藥性賦予單核苷酸多態(tài)性（SNP)，以具有高靈敏性（Carroll 等，Mol Diagn Ther. 2008; 12(1): 15-24)。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明至少在某種程度上基于診斷疾病、鑒定病原體和優(yōu)化治療的新方法的發(fā) 現(xiàn)，所述新方法基于在例如粗制的非純化樣品中檢測(cè)mRNA。本文所述方法提供對(duì)樣品例如 臨床樣品中病原體的快速和準(zhǔn)確鑒定，并且允許基于藥物敏感性測(cè)定選擇最佳治療。
[0012] 在一方面，本發(fā)明特征在于確定病原體（例如致病生物，如細(xì)菌、真菌、病毒或寄 生蟲）的藥物敏感性的方法。所述方法包括提供包含病原體的樣品并且使所述樣品與一種 或多種試驗(yàn)化合物接觸例如少于4小時(shí)，以提供試樣?？稍趯RNA自病原體釋放進(jìn)入試樣 的條件下處理所述試樣，并將所述試樣暴露給包含多個(gè)探針子集的多種核酸探針，其中各 子集包含與靶mRNA特異性結(jié)合的一種或多種探針，與抗藥性生物相比，所述靶mRNA在對(duì)試 驗(yàn)化合物敏感的生物中差異表達(dá)，其中所述暴露在使探針和靶mRNA之間的結(jié)合可發(fā)生的 時(shí)間內(nèi)和條件下進(jìn)行。所述方法包括確定探針與靶mRNA之間的結(jié)合水平，從而確定靶mRNA 水平；以及將存在試驗(yàn)化合物時(shí)的靶mRNA水平與參考水平（例如不存在試驗(yàn)化合物時(shí)的靶 mRNA水平）進(jìn)行比較，其中在所述靶mRNA水平相對(duì)于靶mRNA參考水平的差異表明所述病 原體對(duì)試驗(yàn)化合物是敏感的還是抗性的。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，病原體為已知的，例如經(jīng)鑒定的病原體。在一些實(shí)施方案中， 所述方法確定未知病原體（例如，仍待鑒定的病原體）的藥物敏感性。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，使包含病原體的樣品例如同時(shí)地或在相同樣品中與兩種或更 多種試驗(yàn)化合物接觸，例如與已知或潛在的治療化合物接觸，所述化合物例如抗生素、抗真 菌劑、抗病毒劑和抗寄生蟲藥。許多這些化合物為本領(lǐng)域已知的，例如異煙肼、利福平、批 嗪酰胺、乙胺丁醇、鏈霉素、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、紫霉素、恩維霉素、環(huán)丙沙星、左 氧氟沙星、莫西沙星、乙硫異煙胺、丙硫異煙胺、環(huán)絲氨酸、對(duì)氨水楊酸、利福布丁、克拉霉 素、利奈唑胺、氨硫脲、硫利達(dá)嗪、精氨酸、維生素D、R207910、氧氟沙星、新生霉素、四環(huán)素、 merepenem、慶大霉素、新霉素、奈替米星、鏈霉素、妥布霉素、巴龍霉素、格爾德霉素、除賽霉 素、氯碳頭孢、厄他培南、多利培南、亞胺培南/西司他丁、美羅培南、頭孢羥氨芐、頭孢唑 林、頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢丙烯、頭孢呋辛、頭孢克肟、頭 孢地尼、頭孢托侖、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢布烯、頭孢唑肟、頭孢曲 松、頭孢吡肟、頭孢吡普、替考拉寧、萬古霉素、阿奇霉素、地紅霉素、紅霉素、羅紅霉素、醋竹 桃霉素、泰利霉素、大觀霉素、氨曲南、阿莫西林、氨芐西林、阿洛西林、羧芐西林、氯唑西林、 雙氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素、哌拉西林、替卡西 林、桿菌肽、粘菌素、多粘菌素B、依諾沙星、加替沙星、洛美沙星、諾氟沙星、曲伐沙星、格帕 沙星、司帕沙星、磺胺米隆、偶氮磺胺、磺胺醋酰、磺胺甲二唑、磺胺（sulfaniIimide)、柳氮 磺吡啶、磺胺異*唑、甲氧芐啶、甲氧芐啶-磺胺甲嗯唑（復(fù)方新諾明）、地美環(huán)素、多西 環(huán)素、米諾環(huán)素、土霉素、胂凡納明、氯霉素、氯林肯霉素、林可霉素、乙胺丁醇、磷霉素、梭鏈 孢酸、呋喃唑酮、甲硝基羥乙唑、莫匹羅星、呋喃妥因、平板霉素、奎奴普丁 /達(dá)福普汀、利福 平、甲砜霉素、磺甲硝咪唑、頭孢菌素、替考拉寧（teicoplatin)、力百汀、頭孢氨芐、利福霉 素、利福昔明、頭孢羥唑、酮康唑、拉氧頭孢或頭孢甲肟。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，使樣品與化合物接觸少于4小時(shí)，例如少于3小時(shí)、少于2小 時(shí)、少于1小時(shí)、少于30分鐘、少于20分鐘、少于10分鐘、少于5分鐘、少于2分鐘、少于1 分鐘。
[0016] 在另一方面，本發(fā)明特征在于鑒定傳染病病原體（例如細(xì)菌、真菌、病毒或寄生 蟲，如結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis))的方法，例如檢測(cè)樣品例如臨床樣品 中病原體的存在情況的方法。所述方法包括：
[0017] 提供來自疑似被病原體感染的受試者的試樣；
[0018] 在釋放信使核糖核酸（mRNA)的條件下處理所述試樣；
[0019] 將所述試樣暴露給包含多個(gè)探針子集的多種核酸探針，其中各子集包含與靶mRNA 特異性結(jié)合的一種或多種探針，所述靶mRNA唯一地鑒定病原體，其中所述暴露在使探針和 靶mRNA之間的結(jié)合可發(fā)生的時(shí)間內(nèi)和條件下進(jìn)行；和
[0020] 確定探針與靶mRNA之間的結(jié)合水平，從而確定靶mRNA水平。試樣相對(duì)于參考樣 品在祀mRNA方面的增加表明試樣中病原體的身份（identity)。
[0021] 在一些實(shí)施方案中，所述方法在樣品中或自樣品中鑒定傳染病病原體，所述樣品 為或包括痰、血、尿、糞便、關(guān)節(jié)液、腦脊液和子宮頸/陰道拭子。這類樣品可含有多種其它 生物（例如一種或多種非致病細(xì)菌、真菌、病毒或寄生蟲）或病原體。在一些實(shí)施方案中， 所述樣品為臨床樣品，例如來自正在經(jīng)受或可能經(jīng)受衛(wèi)生保健提供者的醫(yī)學(xué)治療的患者或 人的樣品。
[0022] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述一種或多種核酸探針選自表2。
[0023] 在一些實(shí)施方案中，所述mRNA在與探針接觸之前為粗制的（例如未純化的）和/ 或不包括擴(kuò)增所述mRNA，例如以產(chǎn)生cDNA。
[0024] 在一些實(shí)施方案中，所述方法包括以酶法、化學(xué)法和/或機(jī)械法裂解細(xì)胞。
[0025] 在一些實(shí)施方案中，所述方法包括微流體裝置的使用。
[0026] 在一些實(shí)施方案中，所述方法用來監(jiān)測(cè)病原體感染（例如發(fā)生率、患病率）以用于 病原體爆發(fā)（例如在特定地區(qū)內(nèi)病原體數(shù)量的突然上升）的公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)。
[0027] 本文所述方法在病原體在來自受試者的樣品中時(shí)有效，所述受試者包括人和動(dòng) 物，例如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如小鼠、大鼠、兔或猴，或者馴養(yǎng)動(dòng)物和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，如貓、狗、山羊、綿羊、 豬、母牛、馬和鳥類，如雞。
[0028] 在一些實(shí)施方案中，所述方法另外的特征在于基于如本文所述的測(cè)定結(jié)果，確定 和/或選擇用于受試者的治療以及任選給予受試者所述治療。
[0029] 在另一個(gè)總的方面，本發(fā)明特征在于選擇用于受試者的治療的方法。所述方法包 括：
[0030] 任選例如利用本文所述方法鑒定傳染病病原體（例如檢測(cè)樣品中具體病原體的 存在情況和/或身份）；
[0031] 利用本文所述方法確定病原體的藥物敏感性；和
[0032] 選擇所述病原體對(duì)其敏感的藥物用于治療受試者。
[0033] 在又另一個(gè)方面，本發(fā)明提供在受試者中監(jiān)測(cè)病原體感染的方法。所述方法包 括：
[0034] 在第一時(shí)間獲得包含病原體的第一樣品；
[0035] 利用本文所述方法確定第一樣品中病原體的藥物敏感性；
[0036] 任選選擇所述病原體對(duì)其敏感的治療并給予受試者所選治療；
[0037] 在第二時(shí)間獲得包含病原體的第二樣品；
[0038] 利用本文所述方法確定第二樣品中病原體的藥物敏感性；和
[0039] 將第一樣品和第二樣品中病原體的藥物敏感性進(jìn)行比較，從而在受試者中監(jiān)測(cè)感 染。
[0040] 在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，所述受試者為免疫缺損的。
[0041] 在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，所述方法包括選擇病原體對(duì)其敏感的治療并 給予受試者所選治療，在病原體的藥物敏感性上的改變表明所述病原體對(duì)所述治療有抗性 或變?yōu)閷?duì)所述治療有抗性，例如所述方法包括確定病原體對(duì)待給予治療的藥物敏感性。
[0042] 在一些實(shí)施方案中，在病原體的藥物敏感性上的改變表明所述病原體對(duì)治療有抗 性或變?yōu)閷?duì)治療有抗性，所述方法進(jìn)一步包括給予受試者不同的治療。
[0043] 在又另一方面，本發(fā)明特征在于在受試者群體中監(jiān)測(cè)病原體感染的方法。所述方 法包括：
[0044] 在第一時(shí)間獲得來自群體中受試者的第一多種樣品；
[0045] 利用本文所述方法確定第一多種樣品中病原體的藥物敏感性，以及任選利用本文 所述方法鑒定第一多種樣品中的傳染病病原體；
[0046] 任選給予受試者治療；
[0047] 在第二時(shí)間獲得來自群體中受試者的第二多種樣品；
[0048] 利用本文所述方法確定第二多種樣品中病原體的藥物敏感性，以及任選利用本文 所述方法鑒定第一多種樣品中的傳染病病原體；
[0049] 將第一多種樣品和第二多種樣品中病原體的藥物敏感性以及任選所述病原體的 身份進(jìn)行比較，從而在受試者群體中監(jiān)測(cè)感染。
[0050] 在又另一方面，提供與固相支持體結(jié)合的多種多核苷酸。所述多種多核苷酸的每 種多核苷酸選擇性地與來自表2的一個(gè)或多個(gè)基因雜交。在一些實(shí)施方案中，所述多種多 核苷酸包括SEQ ID NO: 1-227及其任何組合。
[0051] "傳染病"也稱為可傳染的疾病或可傳播的疾病，包括因受試者感染、存在和生長(zhǎng) 致病生物劑而引起的臨床上明顯的疾?。醇膊〉奶卣餍葬t(yī)學(xué)體征和/或癥狀）（Ryan和 Ray(編輯）（2004). Sherris Medical Microbiology(第 4版）.McGraw Hill)。醫(yī)師可通 過例如診斷性試驗(yàn)（例如血試驗(yàn)法）、病歷回顧和臨床病史回顧來確證傳染病的診斷。在某 些情況下，傳染病在其部分或全部病程中可為無癥狀的。傳染性病原體可包括病毒、細(xì)菌、 真菌、原生動(dòng)物、多細(xì)胞寄生蟲和朊病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，病原體的傳播可通過 不同途徑進(jìn)行，無例外地包括物理接觸、污染的食物、體液、物體、空氣傳播性吸入，以及通 過病媒生物進(jìn)行。特別具傳染性的傳染病有時(shí)稱為接觸傳染性的并且可通過與病人或其分 泌物接觸而傳播。
[0052] 本文所用術(shù)語"基因"是指染色體中編碼產(chǎn)物（RNA或其翻譯產(chǎn)物多肽）的DNA序 列?；虬幋a區(qū)并包括編碼區(qū)前后的區(qū)（分別稱為"前導(dǎo)"和"尾部"）。編碼區(qū)由多 個(gè)編碼區(qū)段（"外顯子"）和各個(gè)編碼區(qū)段之間的間插序列（"內(nèi)含子"）組成。
[0053] 本文所用術(shù)語"探針"是指與靶mRNA特異性結(jié)合的寡核苷酸。探針在與靶標(biāo)雜交 時(shí)可為單鏈的。
[0054] 除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員通常理解的意義相同。本文描述了用于本發(fā)明的方法和材料；還可使用本領(lǐng)域已知 的其它合適的方法和材料。所述材料、方法和實(shí)施例僅為說明性的且不意圖其成為限制。本 文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利、序列、數(shù)據(jù)庫條目和其它參考文獻(xiàn)通過引用以其整 體結(jié)合。如有沖突，以本說明書（包括定義）為準(zhǔn)。
[0055] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將從下列詳述和附圖以及從權(quán)利要求中顯而易見。
[0056] 附圖描述
[0057] 圖1A-1D為說明利用NanoString?(使用顏色編碼探針直接多路測(cè)定基因表達(dá)） 技術(shù)定量樣品中的mRNA分子的示例性方法的流程圖。1A.向粗制樣品裂解物中加入對(duì)應(yīng) 于每個(gè)目的mRNA的兩種分子探針。捕獲探針由50bp寡聚物組成，所述寡聚物與給定mRNA 分子互補(bǔ)，所述探針與生物素綴合。報(bào)告探針由不同的50bp寡聚物組成，所述寡聚物與上 述mRNA分子的不同部分互補(bǔ)，所述探針與熒光標(biāo)記綴合。每個(gè)標(biāo)記唯一地鑒別給定的mRNA 分子。捕獲探針和報(bào)告探針在裂解物內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的mRNA分子雜交。1B.通過與每個(gè)聚合 物上的柄（handle)雜交的珠粒純化來去除過量的報(bào)道分子，僅留下雜交的mRNA復(fù)合體。 1C.將mRNA復(fù)合體固定并對(duì)齊在表面上。通過生物素綴合的捕獲探針將mRNA復(fù)合體捕獲 至鏈霉抗生物素（strepavidin)包被的表面。施加電場(chǎng)使復(fù)合體全部以相同的方向?qū)R在 表面上。1D.將表面成像并對(duì)編碼進(jìn)行計(jì)數(shù)。將mRNA復(fù)合體顯微成像并且可計(jì)數(shù)對(duì)齊的報(bào) 告標(biāo)記，從而提供mRNA分子的定量測(cè)定。（圖片獲自nanostring, com)。
[0058] 圖2A-2F為顯示抗藥性基因表達(dá)特征（signature)的診斷的一組圖片。2A.來自 患者的樣品，例如痰。2B.誘導(dǎo)表達(dá)程序以區(qū)分藥物敏感株和抗藥株。將樣品分開并暴露 給不同的藥物以誘導(dǎo)表達(dá)程序，所述表達(dá)程序取決于所述菌株是抗藥的還是藥物敏感的。 2C.條形碼探針與mRNA分子雜交。裂解細(xì)胞并向粗制樣品中加入探針。2D.捕獲mRNA復(fù) 合體并使其對(duì)齊。2E.將復(fù)合體成像并計(jì)數(shù)。2F.特征分析。將測(cè)定的mRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化并 與無藥物對(duì)照以及藥物敏感性標(biāo)準(zhǔn)品和抗藥性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，以確定跨越所有藥物的抗 藥譜。
[0059] 圖3為顯示大腸桿菌（E. coli)臨床隔離群的陽性鑒定的直方圖。使用針對(duì)6個(gè) 大腸桿菌基因（ftsQ、murC、opgG、putP、secA和uup)設(shè)計(jì)的探針，將4個(gè)臨床隔離群陽性 鑒定為大腸桿菌。每個(gè)值代表4-6次重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
[0060] 圖4為顯示銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)臨床隔離群的陽性鑒定的 直方圖。使用針對(duì)5個(gè)銅綠假單胞菌基因（pr〇A、SltBl、nadD、dacC和IipB)設(shè)計(jì)的探針， 將2個(gè)臨床隔離群陽性鑒定為銅綠假單胞菌。
[0061] 圖5為顯示肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)臨床隔離群的陽性鑒定的 直方圖。使用針對(duì)5個(gè)肺炎克雷伯氏菌基因（lrp、yCbK、clpS、ihfB、mraW)設(shè)計(jì)的探針，陽 性鑒定出1個(gè)臨床隔離群。
[0062] 圖6為顯示金黃色葡萄球菌臨床隔離群的陽性鑒定的直方圖。使用針對(duì)3個(gè)金黃 色葡萄球菌基因（pi~〇C、rp 〇B和fabD)設(shè)計(jì)的探針，陽性鑒定出4個(gè)臨床隔離群。
[0063] 圖7為一組顯示使用病原體特異性探針鑒定病原體的三個(gè)直方圖。
[0064] 圖8為一組顯不病原體鑒定靈敏性的三個(gè)直方圖。
[0065] 圖9A和9B為幾組顯示自模擬的臨床樣品中鑒定病原體的三個(gè)直方圖。
[0066] 圖10為一組顯示銅綠假單胞菌的2個(gè)臨床隔離群鑒定的兩個(gè)直方圖。
[0067] 圖11為顯示在大腸桿菌中鑒定氟喹諾酮抗性的直方圖。
[0068] 圖12為顯示在大腸桿菌中鑒定氨基糖苷抗性的直方圖。
[0069] 圖13為顯示在金黃色葡萄球菌中鑒定甲氧西林抗性的直方圖。
[0070] 圖14為顯示在腸球菌（Enterococcus)中鑒定萬古霉素抗性的直方圖。
[0071] 圖15為一組顯示藥物敏感性結(jié)核分枝桿菌（M. tuberculosis)中的藥物特異性基 因誘導(dǎo)的四個(gè)直方圖。
[0072] 圖16為一組比較異煙肼敏感性TB菌株和抗異煙肼TB菌株的三個(gè)散點(diǎn)圖。每個(gè)點(diǎn) 代表24種基因探針之一。軸報(bào)告如通過數(shù)字基因表達(dá)技術(shù)（NanoString?)所測(cè)定的轉(zhuǎn)錄 物數(shù)量。左--無藥物處理的情況下異煙肼抗性株和異煙肼敏感株中表達(dá)的比較。中-- 經(jīng)藥物處理與未經(jīng)藥物處理的異煙肼敏感株中表達(dá)的比較。右--經(jīng)藥物處理與未經(jīng)藥物 處理的異煙肼抗性株中表達(dá)的比較。
[0073] 圖17為一組利用NanoString?比較藥物敏感性和抗藥性結(jié)核分枝桿菌的轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)的四個(gè)直方圖。（A)如本文所述用INH(0. g/ml)處理菌株A50(INH-R)。（B)用g/ ml鏈霉素處理SM-R克隆S10。
[0074] 圖18為顯示敏感性TB菌株與抗藥性TB菌株中的差異基因誘導(dǎo)的直方圖。將每 個(gè)基因在經(jīng)INH處理的INH敏感（野生型）細(xì)胞/未處理細(xì)胞中的表達(dá)比率除以每個(gè)基因 在經(jīng)INH處理的抗INH細(xì)胞/未處理細(xì)胞中的表達(dá)。
[0075] 圖19為顯示結(jié)核分枝桿菌中INH誘導(dǎo)基因的誘導(dǎo)時(shí)程的線圖。將異煙肼敏感性 H37Rv暴露給0. g/mlINH(5XMIC)，在1、2和5小時(shí)自IOml培養(yǎng)物中制備RNA。然后使 用qRT-PCR定量針對(duì)kasA、kasB和SigA的轉(zhuǎn)錄物的豐度，將水平對(duì)SigA標(biāo)準(zhǔn)化并與t = 0比較。
[0076] 圖20為用于檢測(cè)表達(dá)特征的示例性工作流程。由于桿菌在痰中的實(shí)際生理狀態(tài) 為未知的，因此在過程開發(fā)中模擬復(fù)制和非復(fù)制細(xì)菌二者。以純性培養(yǎng)（在富含7H9/0ADC/ SDS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)或在7H9/四丁酚醛中饑餓培養(yǎng)）生長(zhǎng)的H37Rv代表這些試驗(yàn)中在痰中 的桿菌。在暴露給豐富培養(yǎng)基的情況下使桿菌脈沖若干時(shí)間h以刺激自休眠狀態(tài)的復(fù)蘇 并激活轉(zhuǎn)錄。最佳^以實(shí)驗(yàn)確定。然后在暴露給藥物的情況下使桿菌脈沖若干時(shí)間1 2以 引起轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。最佳t2以實(shí)驗(yàn)確定。最后，將全部樣品加工并通過表達(dá)概況分析進(jìn)行分析 以及通過定量RT-PCR確證。
[0077] 圖21為比較基因的表達(dá)比率以區(qū)分藥物敏感性桿菌和抗藥性桿菌的示例性方 法。利用定量RT-PCR，對(duì)于候選包含在表達(dá)特征中的基因測(cè)定mRNA水平。在存在藥物時(shí) (誘導(dǎo)的-藥物）和不存在藥物時(shí)（未誘導(dǎo)的-無藥物），在稱為"實(shí)驗(yàn)的（exp)"的樣品 (即臨床隔離群）中測(cè)定關(guān)注基因的mRNA水平。亦在存在（持家-藥物）和不存在（持 家-無藥物）藥物時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)持家基因的mRNA水平。關(guān)注基因和持家基因的水平比率允 許對(duì)存在藥物（A)和不存在藥物（B)時(shí)的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。預(yù)期的是，對(duì)于一些藥物敏感 株，A>B ;而對(duì)于抗藥株，A = B。最后，對(duì)于已知其為藥物敏感的和抗藥的對(duì)照菌株（C和D) 產(chǎn)生相同的對(duì)應(yīng)比率。這些對(duì)照值充當(dāng)用于比較獲自未知菌株的實(shí)驗(yàn)比率的標(biāo)準(zhǔn)。
[0078] 圖22為一組顯示直接自培養(yǎng)物或患者標(biāo)本中陽性鑒定細(xì)菌種類的直方圖和散 點(diǎn)圖。使用針對(duì)檢測(cè)種特異性轉(zhuǎn)錄物設(shè)計(jì)的NanoString?探針分析細(xì)菌樣品。Y軸：轉(zhuǎn) 錄物原始計(jì)數(shù)；X軸：基因名稱。對(duì)大腸桿菌（黑色）、肺炎克雷伯氏菌（白色）、銅綠假 單胞菌（灰色）特異的探針。誤差棒反映兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。（A)來自革蘭氏 陰性菌培養(yǎng)物的檢測(cè)。（B)混合培養(yǎng)物（斯氏普羅威登斯菌（Providencia stuartii)、 奇異變形菌（Proteus mirabilis)、粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)、產(chǎn)氣腸桿 菌（Enterobacter aerogenes)、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae)、摩氏摩根氏 菌（Morganella morganii)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca)、弗氏朽1檬酸桿菌 (Citrobacter freundii))內(nèi)的檢測(cè)。（C)培養(yǎng)物中分枝桿菌的屬特異性和種特異性檢測(cè)。 結(jié)核分枝桿菌（Mtb)、鳥分枝桿菌胞內(nèi)亞種（M. avium subsp.intracellulare(MAI))、副結(jié) 核分枝桿菌（M.paratuberculosis (Mpara))和海分枝桿菌（M.marinum(Mmar))。屬廣泛性 探針（灰色），結(jié)核分枝桿菌特異性探針（黑色）。（D)對(duì)直接來自臨床尿標(biāo)本的大腸桿菌 的檢測(cè)。（E)大腸桿菌樣品與非大腸桿菌樣品相比身份的統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)定。對(duì)每個(gè)探針的計(jì)數(shù) 取平均值、對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換并求和。（F)mecA mRNA(其在葡萄球菌（Staphylococci)中賦予對(duì)甲氧 西林的抗藥性）和vanA mRNA(其在腸球菌中賦予對(duì)萬古霉素的抗藥性）的檢測(cè)。每個(gè)點(diǎn) 代表不同的臨床隔離群。
[0079] 圖23為一組顯示在抗生素暴露時(shí)區(qū)分敏感菌和抗藥菌的RNA表達(dá)特征的七個(gè)直 方圖。使敏感菌株或抗藥菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，短暫暴露給抗生素、裂解，并使用針對(duì)定量轉(zhuǎn) 錄物設(shè)計(jì)的NanoString?探針集分析，所述轉(zhuǎn)錄物因響應(yīng)抗生素暴露而變化。將原始計(jì)數(shù) 對(duì)樣品的所有探針的平均值標(biāo)準(zhǔn)化，并通過將經(jīng)藥物暴露的樣品與未經(jīng)藥物暴露的樣品比 較來確定倍數(shù)誘導(dǎo)。Y軸：倍數(shù)變化；X軸：基因名稱。在暴露給（A)大腸桿菌：環(huán)丙沙星 (CIP)、氨芐西林（AMP)或慶大霉素（GM)，（B)銅綠假單胞菌：環(huán)丙沙星，和（C)結(jié)核分枝桿 菌：異煙肼（INH)、鏈霉素（SM)或環(huán)丙沙星（CIP)時(shí)敏感株（黑色；上圖）或抗藥株（灰色； 下圖）的特征。每個(gè)菌株以一式兩份進(jìn)行試驗(yàn)；誤差棒代表一個(gè)典型菌株的兩個(gè)生物學(xué)重 復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。關(guān)于試驗(yàn)菌株的完整列表參見表6。
[0080] 圖24為一組顯示使用表達(dá)特征的誘導(dǎo)水平的均方距離的抗生素抗性菌株和敏感 菌株的統(tǒng)計(jì)學(xué)分離的三個(gè)散點(diǎn)圖。將均方距離（MSD)表示為Z分?jǐn)?shù)，其顯示每個(gè)試驗(yàn)菌株 自暴露給抗生素的敏感株的平均信號(hào)的偏差。敏感株：空心菱形；抗藥株：實(shí)心菱形。虛 線：Z = 3. 09 (p = 0. 001) (A)大腸桿菌臨床隔離群。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)菌株的2-4個(gè)生物學(xué) 重復(fù)。（B和C)響應(yīng)抗生素暴露的表達(dá)特征不依賴抗藥機(jī)制。（B)大腸桿菌。將親株J53 及衍生物暴露給環(huán)丙沙星然后如上分析，所述衍生物包含賦予染色體氟喹諾酮抗性的gyrA 中的突變或者質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮抗性決定簇（aac(6'）-Ib、qnrB或oqxAB)。誤差棒代表四 個(gè)生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。（C)結(jié)核分枝桿菌。將異煙肼敏感株和高水平抗性株或低水平抗 性株暴露給異煙肼。在I U g/mL，低水平抗INH inhA顯示敏感性特征，但在0. 2 ii g/mL，其 顯示抗藥性特征。
[0081] 圖25為一組描述病毒和寄生蟲檢測(cè)的五個(gè)直方圖。依照標(biāo)準(zhǔn)NanoString?方 案將細(xì)胞裂解、合并、加入探針集并使樣品雜交。（A)自純性培養(yǎng)物中檢測(cè)的白假絲酵母 (Candida albicans)。（B) HIV-I。使用針對(duì)HIV-Igag和rev設(shè)計(jì)的探針自PBMC裂解物中 進(jìn)行檢測(cè)。（C)A型流感。使用針對(duì)基質(zhì)蛋白1和2設(shè)計(jì)的探針在293T細(xì)胞裂解物中檢測(cè) PR8流感病毒。（D)HSV-I和HSV-2。使用針對(duì)HSV-2糖蛋白G設(shè)計(jì)的探針在Hela細(xì)胞裂解 物中檢測(cè)HSV-2菌株186Syn+。甚至在高M(jìn)OI時(shí)也幾乎沒有HSV-2特異性探針與HSV-I的 交叉雜交。（E)惡性痕原蟲（Plasmodium falciparum)。自在指定的寄生蟲血癥水平下采 集的紅細(xì)胞中檢測(cè)惡性瘧原蟲（P. falciparum)菌株3D7。針對(duì)惡性瘧原蟲的指定血階段設(shè) 計(jì)探針。
[0082] 圖26為一組顯示臨床隔離群的生物鑒定的三個(gè)散點(diǎn)圖。將細(xì)菌培養(yǎng)物裂解并通 過標(biāo)準(zhǔn)NanoString?方案將針對(duì)檢測(cè)種特異性轉(zhuǎn)錄物設(shè)計(jì)的探針加入、雜交并檢測(cè)。將合 并的探針集用于A和B，所述探針集包含鑒定大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌或銅綠假單胞菌的 探針。在C中，用于結(jié)核分枝桿菌的種特異性探針在針對(duì)微生物病原體的更大探針集中。 左Y軸顯示來自每個(gè)生物的1-5個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄物的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換計(jì)數(shù)的總和，X軸顯示試驗(yàn)物種。 虛線描述了 P值為〇. 001，其基于給定樣品的分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)離對(duì)照（"無生物"）樣品的平均值的 標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)量。"無生物"樣品是指包含其他細(xì)菌生物但已知其中不存在限定生物的試樣。對(duì) 于（C)，無生物樣品不含結(jié)核分枝桿菌，包括胞內(nèi)分枝桿菌（M. intracellulare)、副結(jié)核分 枝桿菌、膿腫分枝桿菌（M. abscessus)、海分枝桿菌、戈登分枝桿菌（M. gordonae)和偶發(fā)分 枝桿菌（M. fortuitum)。試驗(yàn)的菌株和臨床隔離群的數(shù)量在表4中顯示，用于病原體鑒定的 基因（對(duì)其設(shè)計(jì)50nt探針）列于表5中。
[0083] 圖27描述慶大霉素（左圖）或氨芐西林（左（left)圖）敏感性和抗性大腸桿菌 菌株的均方距離（MSD)比較。Y軸顯示每個(gè)樣品的MSD相對(duì)于已知敏感株的響應(yīng)形心的Z 分?jǐn)?shù)。虛線表示Z = 3. 09,其對(duì)應(yīng)于p值0.001。
[0084] 圖28為顯示環(huán)丙沙星敏感性和抗性銅綠假單胞菌菌株的均方距離比較的散點(diǎn) 圖。Y軸顯示每個(gè)樣品的MSD相對(duì)于已知敏感株的響應(yīng)形心的Z分?jǐn)?shù)。
[0085] 圖29為一組顯示鏈霉素（SM)或環(huán)丙沙星（CIP)敏感性和抗性結(jié)核分枝桿菌菌株 的均方距離比較的兩個(gè)散點(diǎn)圖。Y軸顯示每個(gè)樣品的MSD相對(duì)于已知敏感株的響應(yīng)形心的 Z分?jǐn)?shù)。
[0086] 圖30為顯示金黃色葡萄球菌隔離群的陽性鑒定的直方圖。使用針對(duì)5個(gè)金黃色 葡萄球菌基因（ileS、ppnK、pyrB、rocD和uvrC)設(shè)計(jì)的探針，陽性鑒定出3個(gè)金黃色葡萄 球菌隔離群。
[0087] 圖31為顯示嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)隔離群的陽 性鑒定的直方圖。使用針對(duì)6個(gè)嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌（S.maltophilia)基因（clpP、dnaK、 purC、purF、sdhA和secD)設(shè)計(jì)的探針，將3個(gè)隔離群陽性鑒定為嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌。
[0088] 發(fā)明詳述
[0089] 本文描述了基于轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜特征，鑒定病原體（例如細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲） 及其抗藥性模式二者的快速、高靈敏性、基于表型的方法。敏感性和抗藥性病原體對(duì)藥物暴 露的反應(yīng)非常不同，最早最迅速的反應(yīng)之一反映在其各自表達(dá)譜上的改變。帶有分子條形 碼的數(shù)字基因表達(dá)可用來檢測(cè)對(duì)藥物暴露的這些早期轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以不需要酶學(xué)或分子生物 學(xué)的快速方式來區(qū)分藥物敏感性和抗藥性病原體。本發(fā)明適用于多種臨床樣品中廣泛范圍 的微生物病原體并且可與當(dāng)前診斷工具聯(lián)用或獨(dú)立使用。所述方法將主要描述用于結(jié)核病 ("TB" ；結(jié)核分枝桿菌），但技術(shù)從業(yè)人員要理解的是，它們可適用于其他病原體及其伴隨 的臨床綜合征（例如，如表1所列舉的）。
[0090] 關(guān)于TB的抗藥性診斷和鑒定特別具挑戰(zhàn)性，這是因?yàn)榧词故褂酶焖俚?顯微鏡 觀察藥物敏感性"（MODS)培養(yǎng)法、噬菌體遞送報(bào)道分子或比色指示劑，培養(yǎng)試驗(yàn)所需的TB 仍極其緩慢地生長(zhǎng)。確定抗藥性的備選方法基于相對(duì)于已知抗藥性賦予突變來確定傳染病 原體的基因型，然而此方法需要相當(dāng)廣泛地鑒定所有抗藥性賦予單核苷酸多態(tài)性（SNP)，以 使試驗(yàn)具有1?靈敏性。
[0091] 可基于病原體的表達(dá)譜特征，將本文所述方法用于例如鑒定樣品例如臨床樣品中 的病原體以及確定病原體的藥物敏感性?？捎糜趨^(qū)分藥物敏感性和抗藥性病原體的最早最 快的反應(yīng)之一為在暴露給關(guān)注藥物時(shí)它們各自的轉(zhuǎn)錄譜。病原體對(duì)于藥物暴露的反應(yīng)非常 不同，這取決于它們對(duì)所述具體藥物為敏感的還是抗性的。例如，在某些情況下，藥物敏感 菌或抗藥菌將在數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)通過增量調(diào)節(jié)和減量調(diào)節(jié)基因來響應(yīng)藥物暴露，或許試 圖克服所述藥物以及跟隨的更多非特異性應(yīng)力，而抗藥菌沒有這類反應(yīng)。此快速反應(yīng)與化 合物殺死病原體或抑制病原體生長(zhǎng)所需的較長(zhǎng)時(shí)間不同。以有效的方式自臨床樣品中檢測(cè) 病原體的死亡或生長(zhǎng)抑制代表甚至更大的挑戰(zhàn)?？墒褂美鐜в蟹肿訔l形碼的數(shù)字基因表 達(dá)來檢測(cè)對(duì)藥物暴露的這些早期轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以不需要酶學(xué)或分子生物學(xué)的快速方式來區(qū)分 藥物敏感性和抗藥性病原體，并因此所述數(shù)字基因表達(dá)可直接在收集自患者的粗制臨床樣 品上進(jìn)行。此讀出為表型的并因此不需要廣泛地確定解釋例如TB抗藥性的SNP。本文描述 了一組基因，其將給病原體例如TB桿菌以及區(qū)分敏感性和抗藥性病原體提供高特異性?；?于構(gòu)成區(qū)分敏感性和抗藥性病原體的表達(dá)特征的基因的選擇，通過選擇大量誘導(dǎo)并因此不 會(huì)僅僅受臨床樣品內(nèi)病原體數(shù)量的限制的轉(zhuǎn)錄物，來優(yōu)化檢出限的靈敏性。確定該組基因 的大小以使所需基因的數(shù)量減到最少。因此，可將本發(fā)明用作診斷帶有其伴隨抗藥性模式 的病原體的高度靈敏的表型試驗(yàn)，其為快速的（例如幾個(gè)小時(shí)）、靈敏的和特異性的。此試 驗(yàn)可改變病原體感染患者的護(hù)理，并且是用于例如全球TB流行區(qū)的成本效益的護(hù)理點(diǎn)診 斷。
[0092] 本發(fā)明方法允許以高度的靈敏性和特異性直接自粗制細(xì)胞樣品中檢測(cè)核酸特征、 特別是RNA水平。此技術(shù)可用于通過測(cè)定不同的表達(dá)特征以高度的靈敏性且快速的簡(jiǎn)單加 工直接從臨床樣品（例如痰、尿、血或糞便）鑒定TB并確定藥物敏感性模式；所述技術(shù)亦 適用于諸如淋巴結(jié)等其他組織。高靈敏性可通過檢測(cè)mRNA而非DNA(因?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞可攜帶 比單基因組DNA拷貝（其通常需要擴(kuò)增以用于檢測(cè)）更多的mRNA拷貝/細(xì)胞（>10 3))和 通過所述技術(shù)的固有高靈敏性（檢測(cè)〈2000拷貝mRNA)來獲得。所述快速簡(jiǎn)單樣品加工為 可能的，這是因?yàn)槿鄙贆z測(cè)mRNA分子所需的酶學(xué)和分子生物學(xué)；反而在一些實(shí)施方案中， 所述方法利用條形碼探針與粗制裂解物中的mRNA分子的雜交，接著直接顯現(xiàn)（例如，如圖 1所述）。由于在這些實(shí)施方案中使用雜交，可直接檢測(cè)mRNA，而無需自粗制細(xì)胞裂解物、 固定的組織樣品以及含有異硫氰酸胍、聚丙烯酰胺和THz〇r'的樣品的任何純化步驟。粗 制mRNA樣品可獲自生物流體或固體，例如痰、血、尿、糞便、關(guān)節(jié)液、腦脊液、子宮頸/陰道拭 子、膽汁液、胸膜液、腹膜液或心包液；或者亦可使用例如來自骨活檢、肝活檢、肺活檢、腦活 檢、淋巴結(jié)活檢、食管活檢、結(jié)腸活檢、胃活檢、小腸活檢、心肌活檢、皮膚活檢和竇活檢的組 織活檢樣品。
[0093] RNA 提取
[0094] 通過用酶法、化學(xué)法或機(jī)械法處理樣品以裂解樣品中的細(xì)胞并釋放mRNA，可自樣 品中的細(xì)胞例如病原體細(xì)胞或臨床樣品中提取RNA。技術(shù)從業(yè)人員要理解的是，可在所述過 程中使用其他破碎方法。
[0095] 酶法去除細(xì)胞壁的使用已在本領(lǐng)域良好地建立。所述酶通常可市購以及在大多數(shù) 情況下最初分離自生物來源。常用的酶包括溶菌酶、溶葡萄球菌素、消解酶、變?nèi)芫亍⒕厶?酶、蛋白酶和甘露糖。
[0096] 化學(xué)品例如去污劑通過干擾脂質(zhì)-脂質(zhì)、脂質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作 用來破壞環(huán)繞細(xì)胞的脂質(zhì)屏障。用于細(xì)胞裂解的理想去污劑取決于細(xì)胞類型和來源。細(xì)菌 和酵母因其細(xì)胞壁的性質(zhì)所致對(duì)最佳裂解有不同的需求。一般而言，非離子型去污劑和兩 性離子去污劑更溫和。TritonX系列非離子型去污劑和兩性離子去污劑3-[(3-膽酰胺基丙 基）二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽（CHAPS)常用于這些目的。相比之下，離子型去污劑為強(qiáng)增 溶劑并且趨于使蛋白質(zhì)變性，從而破壞蛋白質(zhì)活性和功能。在本領(lǐng)域廣泛使用SDS(與蛋白 質(zhì)結(jié)合并使其變性的離子型去污劑）來破碎細(xì)胞。
[0097] 細(xì)胞的物理破碎可能需要超聲處理、弗式壓碎器、電穿孔，或者可使用包含裝配結(jié) 構(gòu)的微流體裝置來機(jī)械破碎細(xì)胞。這些方法為本領(lǐng)域已知的。
[0098] 帶有分子條形碼的數(shù)字基因表達(dá)
[0099] 在圖1中顯示了基于其基因表達(dá)譜來鑒定病原體的示例性過程的流程圖。通過 BLAST軟件將來自關(guān)注病原體的編碼序列與其他生物中的全部基因序列進(jìn)行比對(duì)，來選 擇鑒定各關(guān)注病原體的寡核苷酸探針。僅選擇與關(guān)注病原體完全匹配但與任何其他生物 < 50%匹配的約50個(gè)核苷酸（例如80個(gè)核苷酸、70個(gè)核苷酸、60個(gè)核苷酸、40個(gè)核苷酸、 30個(gè)核苷酸和20個(gè)核苷酸）的探針。選擇對(duì)應(yīng)于每個(gè)關(guān)注mRNA且在彼此的100個(gè)堿基對(duì) 之內(nèi)的兩種探針。
[0100] 向含有HiRNA分子的粗制樣品裂解物中加入兩種分子探針。捕獲探針包含與給定 的mRNA分子互補(bǔ)的50個(gè)核苷酸并且可與生物素綴合。報(bào)告探針包含與相同mRNA分子的 不同部分互補(bǔ)的不同的50個(gè)核苷酸并且可與報(bào)道分子（例如熒光標(biāo)記或量子點(diǎn)）綴合。 每個(gè)報(bào)道分子唯一地鑒別給定的mRNA分子。所述捕獲探針和報(bào)告探針在裂解物內(nèi)與其對(duì) 應(yīng)的mRNA分子雜交。通過與每個(gè)聚合物上的柄雜交的珠粒純化來去除過量報(bào)道分子，僅留 下雜交的mRNA復(fù)合體?？蓪RNA復(fù)合體捕獲并固定在表面例如鏈霉抗生物素包被的表面 上?？墒┘与妶?chǎng)使復(fù)合體全部以相同的方向?qū)R在表面上，然后將所述表面顯微成像。 [0101] 可計(jì)數(shù)報(bào)道分子以提供mRNA分子的定量測(cè)定?？稍谒鲞^程中使用可市 購的 nCounter?Analysis System (NanoString, Seattle, WA)。然而，技術(shù)從業(yè)人員要 理解的是，在所述過程中亦可使用其他系統(tǒng)。例如，可使用量子點(diǎn)而不用條形碼來標(biāo) 記探針；參見例如 Sapsford 等，"Biosensing with luminescent semiconductor quantum dots. "Sensors6(8):925-953(2006) ;Stavis 等，"Single molecule studies of quantum dot conjugates in a submicrometer fluidic channel.，'Lab on a Chip5(3):337-343(2005);和 Liang等，"An oligonucleotide microarray for microRNA expression analysis based on labeling RNA with quantum dot and nanogold probe. "Nucleic Acids Research33 (2):el7(2005)。
[0102] 在一些實(shí)施方案中，可在本方法中使用微流體（例如"芯片實(shí)驗(yàn)室"）裝置來 檢測(cè)和定量樣品中的mRNA。這類裝置已成功用于微流體流式細(xì)胞術(shù)、連續(xù)的基于尺 寸的分離和色譜分離。具體而言，這類裝置可用于檢測(cè)如本文所述粗制樣品中的特定 靶mRNA?？墒褂枚喾N方法來檢測(cè)在特定mRNA水平上的變化。因此，可在用于本文所述 方法的診斷和預(yù)后裝置中使用這類微流體芯片技術(shù)。例如，參見例如Stavis等，Lab on a Chip5 (3):337-343 (2005) ;Hong 等，Nat.Biotechnol.22 (4):435-439 (2004); Wang 等，Biosensors and Bioelectronics22(5):582-588(2006) ;Carlo 等，Lab on a Chip3 (4):287-291 (2003) ;Lion 等，Electrophoresis24213533-3562(2003) ;Fortier 等，Anal. Chem.，77(6) :1631-1640(2005);美國專利公布號(hào) 2009/0082552 ;和美國專利號(hào) 7, 611，834。本申請(qǐng)還包括包含結(jié)合部分的微流體裝置，所述結(jié)合部分例如與本文所述病原 體特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0103] 這些微流體裝置可并入標(biāo)記的量子點(diǎn)和其他報(bào)道分子的激光激發(fā)。這些裝置亦可 通過多種檢測(cè)機(jī)制（包括可見光）和多種數(shù)字成像傳感器方法（包括基于照相機(jī)的電荷耦 合裝置），并入所得發(fā)射的檢測(cè)。這些裝置還可并入圖像處理及分析能力以將所得原始信號(hào) 和數(shù)據(jù)翻譯成診斷信息的。
[0104] 利用表達(dá)特征快速表型診斷病原體身份和病原體抗藥性
[0105] 此技術(shù)可用于獲得病原體身份或抗藥性的快速測(cè)定。
[0106] 可基于獨(dú)特基因的檢測(cè)在樣品中鑒定病原體。因此，例如可自具有以下癥狀的受 試者中獲得痰樣，所述癥狀與諸如肺炎或支氣管炎等呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)，并進(jìn)行測(cè)定以確 定存在何種疾病以及何種病原體為所述疾病的原因（參見例如表1)。可獲得尿樣以診斷膀 胱炎、腎盂腎炎或前列腺炎（參見例如表1)。技術(shù)從業(yè)人員要理解的是，可根據(jù)患者表現(xiàn)出 癥狀的性質(zhì)及其鑒別診斷來獲得和分析具體形式的樣品。用于鑒定各種生物的特定基因可 通過本文所述方法鑒定；表2包含了用于鑒定某些病原體的示例性基因。
[0107] 用于大大加速抗藥性試驗(yàn)的原理基于檢測(cè)在暴露給特定關(guān)注藥物時(shí)，在病原體的 藥物敏感株和抗藥株之間存在的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)上的差別。這些轉(zhuǎn)錄譜是可測(cè)定的對(duì)藥物暴露的 最早表型反應(yīng)，并且可在藥物暴露時(shí)，早在桿菌死亡之前將其測(cè)定。此基于轉(zhuǎn)錄的方法亦相 對(duì)于基于基因型的方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)，這是因?yàn)槠錅y(cè)定病原體對(duì)藥物暴露的直接反應(yīng)而 非測(cè)定替代物SNP。
[0108] 在一些實(shí)施方案中，可如圖2所述進(jìn)行所述試驗(yàn)。將樣品（例如來自患有TB患者 的痰樣）分成數(shù)個(gè)較小的子樣品。將不同的子樣品不暴露給藥物或暴露給不同的已知或潛 在藥物（例如，在TB樣品的情況下為異煙肼、利福平、乙胺丁醇、莫西沙星、鏈霉素）達(dá)限定 的時(shí)間（例如少于4小時(shí)、少于3小時(shí)、少于2小時(shí)、少于1小時(shí)、少于30分鐘、少于20分 鐘、少于10分鐘、少于5分鐘、少于2分鐘、少于1分鐘），期間在藥物敏感株中誘導(dǎo)使其與 抗藥株區(qū)分的表達(dá)譜。然后將子樣品中的TB桿菌裂解、加入條形碼分子探針用于雜交以及 在固定和成像之后分析所述子樣品。然后基于TB的藥物敏感株和抗藥株的表達(dá)反應(yīng)，分析 轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)集以確定對(duì)一組藥物的抗藥性。因此，可確定唯一鑒別TB的表達(dá)特征及其對(duì)單個(gè) 抗生素的反應(yīng)，建立用于數(shù)字基因表達(dá)應(yīng)用的探針集以及優(yōu)化樣品處理和收集方法。
[0109] 在確定表達(dá)特征和優(yōu)化轉(zhuǎn)錄信號(hào)上應(yīng)考慮的兩個(gè)問題為：1.痰中桿菌當(dāng)前未確 定的代謝狀態(tài)，因?yàn)榧?xì)胞可能處于復(fù)制或非復(fù)制狀態(tài)，和2.收集痰中的TB桿菌已預(yù)暴露給 抗生素的可能性（即所述患者已用抗生素經(jīng)驗(yàn)地治療）。
[0110] 在一些實(shí)施方案中，鑒定病原體的方法和確定藥物敏感性的方法同時(shí)進(jìn)行，例如 用相同的微陣列裝置或微流體裝置在相同的樣品上進(jìn)行，或者先后進(jìn)行，例如一旦確定了 病原體的身份，便選擇和進(jìn)行用于藥物敏感性的適當(dāng)測(cè)定。
[0111] 在隨附提交的表2中提供了可用于本文所述方法的示例性基因和探針集。
[0112] 治療方法
[0113] 本文所述方法包括但不限于用于治療病癥（例如表1所列病癥）的方法。通常，所 述方法包括使用本文所述方法鑒定來自受試者的樣品中的病原體或者鑒定受試者中的病 原體對(duì)其敏感的一種或多種藥物，以及給予需要這類治療或已確定需要這類治療的受試者 治療上有效量的治療化合物，所述治療化合物中和病原體。在本文中所用的"治療"意指改 善病癥的至少一個(gè)癥狀，所述病癥與表1所列病癥之一有關(guān)。例如，所述方法包括治療TB， TB常常導(dǎo)致咳嗽、胸痛、發(fā)燒、疲勞、無意識(shí)的體重減輕、食欲缺乏、寒冷和盜汗，因此治療可 導(dǎo)致這些癥狀的減輕。其他疾病的臨床癥狀為本領(lǐng)域眾所周知的。
[0114] "有效量"為足以產(chǎn)生有益結(jié)果或所需結(jié)果的量。例如，治療量為達(dá)到所需療效的 量。所述量可與預(yù)防上有效量相同或不同，所述預(yù)防上有效量為預(yù)防疾病或疾病癥狀的發(fā) 作所需的量?？梢砸淮位蚨啻谓o予、施用或給藥來給予有效量。組合物的治療上有效量取 決于所選的組合物?？蓮囊淮位蚨啻?天至一次或多次/周（包括每隔一天一次）給予所 述組合物。亦可從一次或多次/月至一次或多次/年給予所述組合物。技術(shù)人員將理解的 是，某些因素可能影響有效治療受試者所需的劑量和時(shí)間安排，所述因素包括但不限于疾 病或病癥的嚴(yán)重性、先前治療、受試者的一般健康和/或年齡以及存在的其他疾病。此外， 使用治療上有效量的本文所述組合物治療受試者可包括單一治療或一系列治療。
[0115] 診斷方法
[0116] 本文包括用于鑒定病原體和/或確定其藥物敏感性的方法。所述方法包括自受 試者獲取樣品并評(píng)價(jià)樣品中病原體的存在情況和/或藥物敏感性，以及將所述存在情況和 /或藥物敏感性與一個(gè)或多個(gè)參照（例如在未受影響的受試者中的水平或野生型病原體） 進(jìn)行比較。可利用本文所述和本領(lǐng)域已知的方法（例如利用定量免疫測(cè)定法）評(píng)價(jià)mRNA 的存在情況和/或水平。在一些實(shí)施方案中，可利用高通量法例如本領(lǐng)域已知的基因芯 片（參見例如第 12 章 ，Genomics, Griffiths 等，編輯 Modern Genetic Analysis, 1999, W. H.Freeman and Company ；Ekins 和 Chu,Trends in Biotechnology, 1999, 17:217-218 ； MacBeath 和 Schreiber, Science2000, 289(5485):1760-1763 ;Simpson, Proteins and Proteomics:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press ；2002 ； Hardi man, Microarrays Methods and App I i cat ions: Nut s&Bo Its, DNA Press, 2003)，來檢 測(cè)mRNA的存在情況和/或水平。
[0117] 在一些實(shí)施方案中，樣品包括生物流體或固體，例如痰、血、尿、糞便、關(guān)節(jié)液、腦脊 液、子宮頸/陰道拭子、膽汁液、胸膜液、腹膜液或心包液；或者例如來自骨活檢、肝活檢、肺 活檢、腦活檢、淋巴結(jié)活檢、食管活檢、結(jié)腸活檢、胃活檢、小腸活檢、心肌活檢、皮膚活檢和 竇活檢的組織活檢樣品。在一些實(shí)施方案中，一旦已確定某人具有病原體（例如表1所列 病原體）或具有抗藥性病原體，即可給予例如本領(lǐng)域已知或如本文所述的治療。
[0118] 試劑盒
[0119] 包含探針的試劑盒亦在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述探針與如本文所述的基因的區(qū)雜交 并且可用來檢測(cè)本文所述的病原體。所述試劑盒可包含一種或多種其他組件，包括：使用 說明書；以及其他試劑，例如標(biāo)記或用于使標(biāo)記與探針連接的試劑。使用說明書可包括關(guān) 于用于在本文所述方法中預(yù)測(cè)對(duì)治療的反應(yīng)的探針的診斷應(yīng)用的說明。其他說明可包括對(duì) 于將標(biāo)記與探針連接的說明、對(duì)于用所述探針進(jìn)行分析的說明和/或?qū)τ趶氖茉囌攉@取待 分析樣品的說明。如上所論述，所述試劑盒可包含標(biāo)記，例如熒光團(tuán)、生物素、地高辛配基 (digoxygenin)和放射性同位素，例如32P和3H。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含與如 文本所述的基因的區(qū)雜交的標(biāo)記探針，例如如本文所述的標(biāo)記探針。
[0120] 所述試劑盒亦可包含一種或多種附加的探針，所述探針與相同基因或同病原體相 關(guān)的另一基因或其部分雜交。包含附加探針的試劑盒可進(jìn)一步包含標(biāo)記，例如用于探針的 一種或多種相同或不同的標(biāo)記。在其他實(shí)施方案中，提供給試劑盒的一種或多種附加探針 可以是一種或多種標(biāo)記的探針。當(dāng)試劑盒進(jìn)一步包含一種或多種附加的探針時(shí)，所述試劑 盒可進(jìn)一步提供用于使用所述附加探針的說明書。
[0121] 亦可提供用于自我測(cè)試的試劑盒。例如，這類測(cè)試試劑盒可包含裝置和說明書，受 試者無需衛(wèi)生保健提供者的幫助便可使用所述裝置和說明書來獲取例如痰、口頰細(xì)胞或血 等樣品。例如，可利用口腔拭子或刷子或者使用漱口水獲取口頰細(xì)胞。
[0122] 本文提供的試劑盒亦可包含郵寄物（mailer)，例如郵費(fèi)已付的信封或郵包，其可 用于將樣品返回例如實(shí)驗(yàn)室以進(jìn)行分析。所述試劑盒可包含一個(gè)或多個(gè)用于樣品的容器， 或者樣品可處于標(biāo)準(zhǔn)采血瓶中。所述試劑盒還可包含一份或多份知情同意書、測(cè)試申請(qǐng)單 以及如何在本文所述方法中使用試劑盒的說明書。本文亦包含使用這類試劑盒的方法?？?例如使用條形碼編碼一份或多份所述表格（例如測(cè)試申請(qǐng)單）和一個(gè)或多個(gè)裝樣品的容 器，以辨別提供樣品的受試者。
[0123] 在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒可包含用于處理樣品的一種或多種試劑。例如，試 劑盒可包含用于自樣品中分離mRNA的試劑。所述試劑盒亦可任選包含用于可檢測(cè)地標(biāo)記 mRNA或mRNA擴(kuò)增子的一種或多種試劑，所述試劑可包括例如酶（例如DNA聚合酶的Klenow 片段、T4多核苷酸激酶）、一種或多種可檢測(cè)標(biāo)記的dNTP或者可檢測(cè)標(biāo)記的Y磷酸ATP (例 如 33P-ATP)。
[0124] 在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒可包含用于分析例如微陣列分析結(jié)果或表達(dá)譜結(jié) 果的軟件包。
[0125] 在下列實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，所述實(shí)施例不限制在權(quán)利要求中描述的本發(fā) 明的范圍。 實(shí)施例
[0126] 實(shí)施例I :病原體鑒定
[0127] 大腸桿菌（Escherichia coli)、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌和金黃色葡萄球 菌（Staphylococcus aureus)。鑒定出大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡 萄球菌和糞腸球菌（Enterococcus faecalis)中的獨(dú)特編碼序列（表2)并將其用于陽性 鑒定這些生物（圖3-6)。使臨床隔離群在LB培養(yǎng)基中于37°C生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期。然后向100 微升異硫氰酸胍裂解緩沖液（RLT緩沖液，Qiagen)中加入5微升各培養(yǎng)物并渦旋5秒鐘。 然后依照用于裂解物的制造商標(biāo)準(zhǔn)方案，將4微升各裂解物制品用于nC 〇UnterTMSyStem測(cè) 定。用于鑒定的標(biāo)準(zhǔn)為對(duì)于全部5種（對(duì)于銅綠假單胞菌或肺炎克雷伯氏菌）或6種（對(duì) 于大腸桿菌）生物鑒定探針的計(jì)數(shù)，其至少在背景平均值（對(duì)用于另兩種生物的所有生物 鑒定探針計(jì)數(shù)的平均值）的兩倍以上。將計(jì)數(shù)對(duì)ProC的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，以在重復(fù)之間比較。 利用表2所述生物鑒定探針，使用針對(duì)6個(gè)大腸桿菌基因（ftsQ、murC、opgG、putP、secA和 imp)設(shè)計(jì)的探針正確鑒定出4個(gè)大腸桿菌臨床隔離群（圖3)。如圖4所示，使用針對(duì)5個(gè) 銅綠假單胞菌基因（proA、sltBl、nadD、dacC和IipB)設(shè)計(jì)的探針將2個(gè)臨床隔離群正確 鑒定為銅綠假單胞菌。如圖5所示，針對(duì)5個(gè)肺炎克雷伯氏菌基因（lrp、ycbK、clpS、ihfB 和mraW)設(shè)計(jì)的探針陽性鑒定出一個(gè)肺炎克雷伯氏菌臨床隔離群。使用針對(duì)3個(gè)金黃色葡 萄球菌基因（ pr〇C、rpoB和fabD)設(shè)計(jì)的探針，陽性鑒定出4個(gè)臨床隔離群（圖6)。用于 鑒定的截止標(biāo)準(zhǔn)為對(duì)rpoB和fabD的計(jì)數(shù)至少在背景平均值（對(duì)用于大腸桿菌、銅綠假單 胞菌和肺炎克雷伯氏菌的所有生物鑒定探針計(jì)數(shù)的平均值）的兩倍以上。
[0128] 平均說來，較大的庫（pool)包含用于各種生物的4-5個(gè)序列以獲得所需的特異性 水平。利用此技術(shù)，通過直接探查粗制裂解物，在純性培養(yǎng)物和在包含8種另外的革蘭氏陰 性病原體的復(fù)雜混合物中檢測(cè)、鑒定和區(qū)分這三種生物的每一種（圖22A和22B)。
[0129] TB。針對(duì)Rvl641. 1和Rv3583c. 1的探針檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌中的高豐度轉(zhuǎn)錄 物（參考文獻(xiàn)8)以及將檢測(cè)鳥分枝桿菌（M. avium)和鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種（M. avium subsp. paratuberculosis)中的直向同源轉(zhuǎn)錄物，因此可用于檢測(cè)任何這三個(gè)種。另外， 針對(duì)3個(gè)TB基因（Rvl980c. 1、Rvl398c. 1和Rv2031c. 1)的探針可用來差異地鑒定結(jié)核 分枝桿菌，即它們不會(huì)檢測(cè)鳥分枝桿菌或鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種。針對(duì)MAP_2121c. 1、 MAV_3252. 1、MAV_3239. 1和MAV_1600. 1的探針可用于檢測(cè)鳥分枝桿菌或鳥分枝桿菌副結(jié) 核亞種，但不會(huì)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌。因此，使用Rvl980c和Rv3853探針獲得最大靈敏性，而 針對(duì) Rvl980c. 1、Rvl398c. 1 和 Rv2031c. 1 以及 MAP_2121c. 1、MAV_3252. 1、MAV_3239. 1 和 MAV_1600. I的探針使得能夠區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染和鳥分枝桿菌或鳥分枝桿菌副結(jié)核亞 種感染。
[0130] 針對(duì)既對(duì)遍及分枝桿菌屬保守又僅對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異的基因設(shè)計(jì)探針。泛分枝 桿菌探針識(shí)別多個(gè)種，而結(jié)核分枝桿菌探針為高度特異的（圖22C)。
[0131] 金黃色葡萄球菌和嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌
[0132] 利用表2所述生物鑒定探針，使用針對(duì)5個(gè)金黃色葡萄球菌基因（ileS、ppnK、 pyrB、r 〇cD和uvrC)設(shè)計(jì)的探針正確鑒定出3個(gè)金黃色葡萄球菌隔離群（圖30)。類似地， 使用針對(duì)6個(gè)嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌基因（clpP、dnaK、purC、purF、sdhA和secD)設(shè)計(jì)的探 針正確鑒定出3個(gè)嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌隔離群（表2 ;以及圖31)。
[0133] 實(shí)施例2 :方法的靈敏性
[0134] 如圖7-10所示，本方法對(duì)各種關(guān)注病原體為特異的并且在臨床樣品（例如血和 尿）中靈敏地檢測(cè)少于100個(gè)細(xì)胞。
[0135] 用24基因探針集探查分離自三種病原體的每一種的RNA(Ing)(圖7)。大腸桿菌 基因，左；肺炎克雷伯氏菌基因，中；銅綠假單胞菌基因，右。大腸桿菌RNA，上；肺炎克雷伯 氏菌，中；銅綠假單胞菌，下。y軸顯示如通過利用數(shù)字基因表達(dá)技術(shù)所測(cè)定的對(duì)每個(gè)基因 的計(jì)數(shù)數(shù)量。來自各個(gè)生物的RNA顯示不同的表達(dá)特征，其允許容易地鑒定各種病原體。
[0136] 將此24基因探針集用于探查來自10, 000個(gè)細(xì)胞、1000個(gè)細(xì)胞和100個(gè)細(xì)胞的粗 制大腸桿菌裂解物（圖8)?？蓞^(qū)分低至100個(gè)細(xì)胞的不同的大腸桿菌表達(dá)特征。
[0137] 在經(jīng)摻加（spiked)的尿樣和血樣中模擬臨床樣品。在經(jīng)摻加的尿樣中，用105 個(gè)大腸桿菌AiL尿摻加尿樣。使樣品在4°C冷藏過夜，然后將所述粗制細(xì)菌樣品裂解并使 用用于革蘭氏陰性菌的24-基因探針集探查以鑒定大腸桿菌（圖9A上圖和9B)。將血以 lOOOcfu/ml摻加并且亦用24-基因探針集探查（圖9A下圖）。
[0138] 使用用于革蘭氏陰性菌的24-基因探針集探查銅綠假單胞菌的2個(gè)臨床隔離群 (獲自Brigham和Women臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室）以證實(shí)所述基因集能夠鑒定相同細(xì)菌屬的 臨床多樣化菌株（圖10)。
[0139] 直接在尿樣中鑒定大腸桿菌。使大腸桿菌菌株K12在LB培養(yǎng)基中于37°C生長(zhǎng)至 對(duì)數(shù)培養(yǎng)晚期。然后向來自健康供體的尿液標(biāo)本中加入細(xì)菌至1〇〇, OOOcfu/ml的終濃度 (如通過0D_所估計(jì)）。然后將尿樣置于室溫下達(dá)0小時(shí)、4小時(shí)、24小時(shí)或48小時(shí)或者 置于4°C達(dá)24小時(shí)。將Iml經(jīng)摻加的尿在13, OOOxg離心1分鐘。去除上清液；用100微 升LB培養(yǎng)基重懸沉淀物。用Bacteria RNase Protect(Qiagen)處理細(xì)菌，然后在異硫氰 酸胍（guianidinium isothiocyanate)裂解緩沖液（RLT緩沖液，Qiagen)中裂解細(xì)菌。依 照制造商方案將裂解物用于nCounter?System測(cè)定。
[0140] 直接測(cè)定患者尿液標(biāo)本的等分部分以檢測(cè)尿路感染中的大腸桿菌轉(zhuǎn)錄物（圖 22D)。為了將來自多種轉(zhuǎn)錄物的信號(hào)簡(jiǎn)化成評(píng)價(jià)生物存在或不存在的單一度量，將來自每 個(gè)探針的原始計(jì)數(shù)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換并求和。當(dāng)應(yīng)用于一組17個(gè)臨床大腸桿菌隔離群時(shí)，各個(gè)隔離 群容易地區(qū)別于一組13個(gè)無大腸桿菌樣品（相對(duì)于無大腸桿菌對(duì)照，Z分?jǐn)?shù)>6. 5,圖22E)。
[0141] 實(shí)施例3 :病原體的藥物敏感性
[0142] 大腸桿菌中氟喹諾酮抗性和氨基糖苷抗性的鑒定。利用大腸桿菌在暴露給氟喹 諾酮和氨基糖苷時(shí)已公布的表達(dá)陣列數(shù)據(jù)（Sangurdekar DP, Srienc F, Khodursky AB. A classification based framework for quantitative description of large-scale microarray data. Genome Biol2006 ;7 (4): R32),選擇預(yù)期其在暴露給氟喹諾酮和氨基糖 苷時(shí)顯著減量調(diào)節(jié)或增量調(diào)節(jié)的基因集。使泛敏感性實(shí)驗(yàn)室菌株（K12)、抗氟喹諾酮臨床隔 離群1和2以及抗慶大霉素臨床隔離群（E2729181和EB894940)在LB培養(yǎng)基中于37°C生 長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期。取出各培養(yǎng)物的2ml等分部分，并且向所述等分部分中加入抗生素至8 y g/ ml環(huán)丙沙星或128 ii g/ml慶大霉素的終濃度。將培養(yǎng)物在37°C孵育10分鐘。向100微升 異硫氰酸胍裂解緩沖液中加入5微升各培養(yǎng)物并渦旋5秒鐘。依照制造商方案將裂解物用 于nCounter?System測(cè)定。將計(jì)數(shù)對(duì)proC的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化；proC似乎再次為實(shí)驗(yàn)之間最具 可比性的；通過比較在存在和不存在抗生素暴露時(shí)的計(jì)數(shù)來確定每個(gè)基因的倍數(shù)誘導(dǎo)。來 自9個(gè)探針（〇8^、(16〇(]、；1^]^?、111：1^、代〇4、11￥^、：713111(、11即和€3&0)的明確信號(hào)顯示了在 藥物敏感性K12菌株中誘導(dǎo)或阻遏，這將其與2個(gè)抗藥性臨床隔離群區(qū)分開（圖11)。第 十個(gè)探針WbbK既不誘導(dǎo)也不阻遏，給具有變化表達(dá)的基因提供有用的比較。類似地，針對(duì) 8個(gè)基因的探針顯示這些基因在藥物敏感性K12菌株中阻遏（flgF、 CysD、glnA、〇pgG)或誘 導(dǎo)（ftsQ、bl649、recA、dinD)，這將其與2個(gè)抗藥性臨床隔離群區(qū)分開（圖12)。
[0143] 葡萄球菌（Staphylococcus)中甲氧西林抗性的鑒定。使6個(gè)金黃色葡萄球菌臨床 隔離群在LB培養(yǎng)基中于37°C生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期。然后取出各培養(yǎng)物的2ml等分部分；加入氯唑 西林至25 ii g/ml的終濃度。將培養(yǎng)物在37 °C孵育30分鐘。向100微升異硫氰酸胍裂解緩 沖液中加入5微升各培養(yǎng)物并潤(rùn)旋5秒鐘。依照制造商方案將裂解物用于nCounter?Sy stem 測(cè)定。利用兩個(gè)獨(dú)立的探針（表2)，在已知為抗甲氧西林的4個(gè)隔離群中鑒定mecA表達(dá)。 相比之下，在已知為甲氧西林敏感性的2個(gè)隔離群中沒有可檢測(cè)的mecA表達(dá)，在不存在氯 唑西林時(shí)有極微的mecA表達(dá)（圖13)。
[0144] 腸球菌中萬古霉素抗性的鑒定。使4個(gè)腸球菌臨床隔離群在LB培養(yǎng)基中于37°C生 長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期。取出2ml等分部分；加入萬古霉素至128ii g/ml的終濃度。將培養(yǎng)物在37°C 孵育30分鐘。向100微升異硫氰酸胍裂解緩沖液中加入5微升各培養(yǎng)物并渦旋5秒鐘。依 照制造商方案將裂解物用于nCounter?System測(cè)定。利用兩個(gè)獨(dú)立的探針（表2)，在已知 為抗萬古霉素的2個(gè)隔離群中鑒定vanA表達(dá)。相比之下，在已知為萬古霉素敏感性的2個(gè) 隔離群中沒有可檢測(cè)的vanA表達(dá)，在不存在萬古霉素時(shí)有極微的vanA表達(dá)（圖14)。在所 述4個(gè)隔離群的任何中均無可檢測(cè)的vanB表達(dá)。
[0145] 除檢測(cè)轉(zhuǎn)錄物用于生物鑒定之外，檢測(cè)在可動(dòng)遺傳因子上編碼的基因可提供關(guān)于 特定隔離群的更多基因組詳情。例如，探查細(xì)菌隔離群的mecA mRNA(其在葡萄球菌中賦予 對(duì)甲氧西林的抗藥性）和vanA mRNA(其在腸球菌中賦予對(duì)萬古霉素的抗藥性）。在兩種情 況下，檢測(cè)允許快速鑒定MRSA和抗萬古霉素腸球菌（VRE)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄物（圖22F)。因此， RNA的直接檢測(cè)能夠檢出已知的抗藥性元件。此外，此方法能夠通過其他遺傳因子（例如通 過在食物傳播病原體中的水平基因交換獲得的毒力因子，即腸出血性大腸桿菌或產(chǎn)志賀毒 素大腸桿菌中的志賀毒素（Shiga toxin))來辨別隔離群。
[0146] TB中抗藥性的鑒定。自公布的基因表達(dá)數(shù)據(jù)中鑒定24基因探針集以鑒定表達(dá)特 征，所述表達(dá)特征將允許鑒定藥物敏感性TB在暴露給不同抗生素時(shí)的表達(dá)變化，所述抗生 素包括異煙肼（isoniaid)、利福平、鏈霉素和氟喹諾酮（圖15-18)。藥物暴露后誘導(dǎo)或阻 遏的量在表3中顯示。
[0147] 在存在四種不同的藥物（異煙肼，0. 4iig/ml ;鏈霉素，2iig/ml ;氧氟沙星，5iig/ ml ;利福平，0. g/ml)之一的情況下，使處于A_0. 3的對(duì)數(shù)期結(jié)核分枝桿菌在墨水池 (inkwell)瓶（IOml體積，平行培養(yǎng)）中生長(zhǎng)。在開始藥物治療之后的指定時(shí)間（圖15)， 通過離心（3000xg，5分鐘）收獲培養(yǎng)物，用Iml Trizol重懸并且以珠粒攪打（IOOnm玻璃 珠，最大速度，兩次1分鐘脈沖）。向樣品中加入氯仿（〇.2ml)，接著以6000xg離心5分鐘， 收集水相用于分析。
[0148] 以1:10稀釋樣品并依照制造商方案利用表2所述NanoString?探針集分析。首 先通過對(duì)三個(gè)持家基因（sigA、rpoB和mpt64)的平均計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化來計(jì)算各轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)豐 度，然后將數(shù)據(jù)繪制為相對(duì)于來自未處理對(duì)照的樣品的倍數(shù)變化?？虮硎净谒幬锾禺愋?誘導(dǎo)的先前證據(jù)選擇的探針（Boshoff 等，J Biol Chem. 2004,279(38): 40174-84.)。
[0149] 抗藥性TB菌株相比于藥物敏感株在暴露給異煙肼時(shí)未顯示表達(dá)特征誘導(dǎo)，藥物 敏感株在異煙肼暴露時(shí)清楚地顯示表達(dá)特征的誘導(dǎo)（圖16)。圖16顯示了比較異煙肼敏感 性和抗性TB菌株的三個(gè)散點(diǎn)圖，每個(gè)點(diǎn)代表24個(gè)基因探針之一。軸報(bào)告如通過數(shù)字基因 表達(dá)技術(shù)（NanoString?)測(cè)定的轉(zhuǎn)錄物數(shù)量。左--無藥物處理的情況下異煙肼抗性株和 異煙肼敏感株中表達(dá)的比較。中--經(jīng)藥物處理與未經(jīng)藥物處理的異煙肼敏感株中表達(dá)的 比較。右--經(jīng)藥物處理與未經(jīng)藥物處理的異煙肼抗性株中表達(dá)的比較。
[0150] 根據(jù)圖17所示藥物，在藥物敏感性結(jié)核分枝桿菌中誘導(dǎo)不同的基因集。藥物 敏感性和抗藥性結(jié)核分枝桿菌的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（A)如本文所述用INH(0.4iig/ml)處理菌株 A50 (INH-R)。（B)用2 ii g/ml鏈霉素處理SM-R克隆S10。可通過TB24基因探針集的數(shù)字 基因表達(dá)來測(cè)定差異基因誘導(dǎo)，以顯示清楚的特征并允許藥物敏感性的鑒定（圖18)。
[0151] 將二個(gè)持豕基因mpt64、rpoB和sigA用于標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品，將實(shí)驗(yàn)基 因的原始計(jì)數(shù)對(duì)這三個(gè)持家基因原始計(jì)數(shù)的平均值標(biāo)準(zhǔn)化，提供試驗(yàn)基因相對(duì)于對(duì)照基因 的豐度測(cè)定。將誘導(dǎo)或阻遏定義為經(jīng)藥物暴露的樣品相對(duì)于未藥物暴露的樣品在這些標(biāo)準(zhǔn) 化計(jì)數(shù)上的變化。利用此方法，發(fā)現(xiàn)下列基因在暴露給異煙肼、利福平、氟喹諾酮和鏈霉素 之后，在藥物敏感性TB中受到誘導(dǎo)或阻遏。
[0152] 異煙肼：對(duì)于藥物依賴性誘導(dǎo)：kasA、fadD32、accD6、efpA和Rv3675. 1。
[0153] 利福平：對(duì)于藥物依賴性誘導(dǎo)：bioD、hisl、era和Rv2296。
[0154] 氟喹諾酮：對(duì)于藥物依賴性誘導(dǎo)：rpsR、alkA、recA、Itpl和Ihr ;對(duì)于藥物依賴性 阻遏：kasA 和 accD6。
[0155] 鏈霉素：對(duì)于藥物依賴性誘導(dǎo)：CHP、bcpB、gcvB和groEL。
[0156] 實(shí)施例4 :利用帶有分子條形碼的數(shù)字基因表達(dá)鑒定藥物敏感性和抗藥性TB的基 于表型表達(dá)特征的試驗(yàn)
[0157] 本實(shí)施例描述了用于診斷痰中TB并快速確定抗藥譜的基于表型表達(dá)特征的試 驗(yàn)。所述方法基于在創(chuàng)建帶條形碼的成對(duì)分子探針的探針集的情況下對(duì)基因的檢測(cè)，所述 基因的表達(dá)譜將唯一檢出TB并區(qū)分抗藥株和藥物敏感株?；虻倪x擇通過表達(dá)譜數(shù)據(jù)的 生物信息學(xué)分析來確定，所述表達(dá)譜數(shù)據(jù)在不同生長(zhǎng)條件下利用微陣列獲得，包括純性培 養(yǎng)中的TB(復(fù)制和非復(fù)制狀態(tài)二者）、細(xì)胞培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中的TB以及摻加到痰中的TB。
[0158] A.確定用于TB鑒定的特征
[0159] 已鑒定一組分子探針，其與來自復(fù)制和非復(fù)制TB二者的mRNA特異性雜交。所述 探針對(duì)下列mRNA為特異的，所述mRNA在所有生長(zhǎng)條件下為高豐度的并且跨越所有TB菌 株為保守的。盡管先前已確定獨(dú)特DNA序列以鑒定TB識(shí)別16SrRNA(Ampli C〇r，R〇Che)或 IS6110區(qū)（Gen-probe)，但這些確定的區(qū)不具有數(shù)字基因表達(dá)中的特征所需的最佳特征。 16SrRNA在分枝桿菌物種中沒有足夠分歧而不能利用50-堿基寡聚物基因探針區(qū)分不同的 種，所述探針因其長(zhǎng)度所致可容許低水平的遺傳變異性。基因組的IS6110區(qū)并非在所有生 長(zhǎng)條件下以足夠高的水平表達(dá)，而不允許其被用作鑒定TB的穩(wěn)健信號(hào)。因此，描述了一種 表達(dá)特征，其將允許自其他分枝桿菌物種中鑒定出TB。
[0160] i.對(duì)保守TB基因的生物信息學(xué)基因分析。已確定用于相對(duì)于其他分枝桿菌物種 檢測(cè)TB的獨(dú)特表達(dá)特征。一般而言，用于包含在特征中的最佳基因?qū)M足下列標(biāo)準(zhǔn)：1.具 有高表達(dá)水平（高mRNA拷貝數(shù)）以增加靈敏性，2.跨越所有TB菌株為高度保守的并且具 有高度保守的序列，和3.相對(duì)于所有其他分枝桿菌物種對(duì)TB基因組為高度特異的。利用可 得TB基因組中保守基因的生物信息學(xué)分析鑒定這類基因，所述TB基因組并非存在于所有 其他測(cè)序的分枝桿菌屬（即海分枝桿菌、鳥-胞內(nèi)分枝桿菌（M. avium-intracellulaire)、 堪薩斯分枝桿菌（M.kansasii)、偶發(fā)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌）中?？傻玫絹碜耘R床分離株 的超過40個(gè)TB基因組用于分析，所述基因組已在Broad Institute測(cè)序。
[0161] ii.候選基因mRNA水平的表達(dá)譜分析。選擇用于檢測(cè)痰中TB桿菌的分子探針的 第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)為，它們與高豐度的穩(wěn)定的mRNA雜交以使靈敏性最高。預(yù)期這類mRNA對(duì)應(yīng)于 基本的持家基因。利用對(duì)數(shù)據(jù)庫（在Broad Institute和Stanford University(tbdb. org)創(chuàng)建）中的現(xiàn)存公開可得表達(dá)數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析和對(duì)TB菌株H37Rv的實(shí)驗(yàn)表達(dá) 譜的組合來選擇基因，所述實(shí)驗(yàn)表達(dá)譜利用表達(dá)概況分析來確證候選基因在允許復(fù)制（對(duì) 數(shù)生長(zhǎng)）和不允許復(fù)制（通過碳饑餓、穩(wěn)定期和低氧來誘導(dǎo)）的條件下的高水平表達(dá)。對(duì) H37Rv的表達(dá)概況分析實(shí)驗(yàn)使用已建立的TB碳饑餓模型（在7H9/四丁酚醛中饑餓培養(yǎng)5 周）、穩(wěn)定期生長(zhǎng)以及用于厭氧生長(zhǎng)的Wayne模型（在密閉管中緩慢攪動(dòng)培養(yǎng)物）進(jìn)行。， 將Solexa/Illumina測(cè)序用于通過將mRNA轉(zhuǎn)換成cDNA和將測(cè)序用于計(jì)數(shù)cDNA分子而確 定表達(dá)譜。用于鑒定表達(dá)水平的此定量方法比微陣列數(shù)據(jù)更可能反映利用數(shù)字基因表達(dá)獲 得的水平，并且其為已使用Broad Institute測(cè)序平臺(tái)建立的方法。有可能進(jìn)行多路測(cè)定 12個(gè)樣品/測(cè)序泳道，假定75bp讀出和1千萬讀出/泳道。
[0162] iii.鑒定TB的表達(dá)特征的探針選擇。由于所述數(shù)字基因表達(dá)技術(shù)基于兩種50 個(gè)核苷酸探針與關(guān)注mRNA的雜交，因此自（Ai)和（Aii)鑒定基因中的兩個(gè)50個(gè)堿基對(duì)的 區(qū)，所述區(qū)在基因組內(nèi)為唯一的以使非特異性雜交減到最少，并且如測(cè)序的TB基因組所證 實(shí)，其包含最少多態(tài)性。以生物信息學(xué)法選擇探針，以在5度解鏈溫度窗口內(nèi)適合并具有最 少mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用可得技術(shù)針對(duì)分離自復(fù)制和無復(fù)制TB (包括多個(gè)菌株，即H37Rv、 ⑶C1551、Fll、Erdman)、海分枝桿菌、胞內(nèi)海分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌（M. kansaii)和偶 發(fā)分枝桿菌的mRNA測(cè)試探針，以確證整個(gè)探針集的特異性?？舍槍?duì)這些其他的分枝桿菌物 種選擇探針，其將同樣允許自痰中鑒定這些病原體。在感染的巨噬細(xì)胞模型中測(cè)試鑒定胞 內(nèi)桿菌的能力，以證實(shí)在宿主mRNA存在下檢測(cè)TB mRNA的能力。最后，通過向下滴定試樣 中的TB桿菌的數(shù)量（和因此存在于細(xì)胞裂解物中的mRNA)來確定測(cè)定的靈敏性。利用數(shù) 字基因表達(dá)的所有實(shí)驗(yàn)使用針對(duì)相同基因集的定量RT-PCR來確證。所述集合的改進(jìn)和精 化將以迭代方式進(jìn)行。
[0163] B.確定特征以區(qū)分敏感性和抗藥性TB
[0164] 已鑒定與mRNA雜交的一組分子探針，其允許獲得區(qū)分藥物敏感株和抗藥株的特 征，所述mRNA在暴露給各單獨(dú)的TB藥物時(shí)被特異性誘導(dǎo)。已確定暴露給異煙肼、利福平、 乙胺丁醇、鏈霉素和莫西沙星的特征。
[0165] 對(duì)于待包含在特征中的理想基因，除以上特性（即跨越TB菌株為保守的、對(duì)TB基 因組為特異的）之外，在選擇用于抗藥性特征的基因上，還要優(yōu)先考慮數(shù)個(gè)其他特性。由于 抗藥性將通過藥物敏感株和抗藥株的轉(zhuǎn)錄物誘導(dǎo)之間的差異來確定，理想的候選基因應(yīng)在 暴露給給定藥物時(shí)在藥物敏感株中高度誘導(dǎo)。理想的是，早期和快速地誘導(dǎo)這些基因，因?yàn)?這段時(shí)間將在很大程度上決定整個(gè)診斷試驗(yàn)的速度。基于使用qRT-PCR的數(shù)據(jù)，在短達(dá)1-2 小時(shí)中觀察到對(duì)藥物暴露的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（圖19)。考慮到mRNA分子的半壽期，利用基因誘導(dǎo) 而非利用基因阻遏提供更快且更可檢測(cè)的反應(yīng)。
[0166] 對(duì)于涉及異煙肼和鏈霉素的所有描述的實(shí)驗(yàn)，將TB菌株H37Rv用于BSL3環(huán)境，其 中已產(chǎn)生一組單獨(dú)抗藥株以用于與野生型完全藥物敏感性H37Rv對(duì)比。為了確保利福平 在實(shí)驗(yàn)室獲得性感染的不可能事件中仍然是治療選項(xiàng)，將在TB的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株（lysA、 panC)中產(chǎn)生抗利福平突變型，所述TB的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株需要加入賴氨酸和泛酸鹽用于生 長(zhǎng)。
[0167] 最后，鑒定了對(duì)每種抗生素唯一的特征而非對(duì)任何或所有抗生素的普遍應(yīng)激反 應(yīng)。此特異性的基本原理為，在臨床環(huán)境中，許多患者已用不同的抗生素經(jīng)驗(yàn)地治療，并因 此可能已在痰樣內(nèi)的桿菌中激活一些普遍的應(yīng)激反應(yīng)。然而，保留藥物特異性反應(yīng)用于測(cè) 試和分析。
[0168] i.響應(yīng)抗生素暴露的表達(dá)概況分析。進(jìn)行了表達(dá)概況分析以鑒定候選基因，所述 候選基因區(qū)分在H37Rv的藥物敏感株和抗藥株中的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。由于桿菌在痰中的復(fù)制狀態(tài) 或轉(zhuǎn)錄活性為未知的，因此對(duì)非復(fù)制（通過5周碳饑餓模型誘導(dǎo)）桿菌進(jìn)行附加的實(shí)驗(yàn)。其 將確定非復(fù)制桿菌在豐富培養(yǎng)基（7H9/0ADC)中是否需要短時(shí)間U 1)的"生長(zhǎng)刺激"以刺激 一些基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄，所述基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄之后可響應(yīng)藥物暴露（圖20)。亦確定了為了獲得區(qū)分藥物敏 感株和抗藥株的穩(wěn)健特征以及最佳藥物濃度對(duì)藥物暴露而言所需的最佳時(shí)間（t 2)，以獲得 穩(wěn)健的可重現(xiàn)的反應(yīng)。對(duì)每個(gè)單獨(dú)的抗生物素進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。
[0169] 如果痰中桿菌處于非復(fù)制的休眠狀態(tài)，則完全非復(fù)制狀態(tài)為"最壞情況"（即將需 要最長(zhǎng)時(shí)間）。實(shí)際上，基于檢查患者痰中桿菌的表達(dá)譜的已公布工作，如果真的需要的話， 此時(shí)間將極其短，假定表達(dá)譜直接獲自痰桿菌。（注意，此公布數(shù)據(jù)亦將結(jié)合到分析中以提 供對(duì)痰中細(xì)菌的可能候選基因的最初見識(shí)。）進(jìn)行概況分析實(shí)驗(yàn)矩陣，從〇、1和2小時(shí)改變 暴露給富含7H9/0ADC培養(yǎng)基的時(shí)間U 1);對(duì)于每個(gè)&，改變暴露給各抗生素的時(shí)間（t2)。對(duì) 于敏感性和抗藥性H37Rv菌株二者，對(duì)于每組^和t 2，對(duì)各抗生物素從最小抑菌濃度（MIC) 的lx、3x和5x改變抗生素濃度，以確定最佳參數(shù)。表達(dá)概況分析將用來鑒定用于產(chǎn)生穩(wěn)健 的可重現(xiàn)特征的最適條件。
[0170] 基于最適條件U1和t2)，在這些條件下對(duì)藥物敏感性和抗藥性H37Rv菌株進(jìn)行表 達(dá)譜分析。進(jìn)行生物信息學(xué)分析以鑒定用于每種藥物的基因，其中藥物敏感株中的誘導(dǎo)水 平比抗藥株高（除在利福平中之外，其中藥物敏感株中的阻遏水平比抗藥株高）。在藥物敏 感株和抗藥株之間比較表達(dá)水平并通過定量RT-PCR確證表達(dá)水平。
[0171] ii.開發(fā)分析算法以鑒定抗藥性。確定了優(yōu)化算法以分析基因集的表達(dá)比率，所述 表達(dá)比率區(qū)分敏感株和抗藥株（如通過標(biāo)準(zhǔn)MIC測(cè)定所確定的）。本方法的優(yōu)勢(shì)之一為，對(duì) 于大多數(shù)情況（即未經(jīng)預(yù)暴露給TB抗生素的那些情況），可在未經(jīng)暴露給給定抗生素和暴 露給給定抗生素的相同菌株的基因表達(dá)水平之間完成比較。將定量RT-PCR用于在下列條 件下自H37Rv測(cè)定mRNA水平，所述條件包括1.未暴露給抗生素，2.暴露給異煙肼，3.暴露 給利福平，4.暴露給乙胺丁醇，5.暴露給鏈霉素，和6.暴露給莫西沙星。將暴露給抗生素 之后的給定基因的表達(dá)水平對(duì)來自一組穩(wěn)態(tài)持家基因（即sigA，其編碼刺激持家基因轉(zhuǎn)錄 的主要〇因子；和rpoB，其編碼RNA聚合酶的合成亞基）的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化，并與經(jīng)同樣 標(biāo)準(zhǔn)化的無抗生素暴露情況下相同基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較。亦與標(biāo)準(zhǔn)的敏感性和抗藥性 對(duì)照菌株進(jìn)行比較（圖21)。理想的是，暴露給特定藥物將誘導(dǎo)藥物敏感株中的基因表達(dá)至 高水平，A?B，而對(duì)于對(duì)藥物暴露不敏感的抗藥株，A = B。（對(duì)于利福平將有例外，其中鑒 于利福平的機(jī)制，檢測(cè)具有最短半壽期的mRNA的基因阻遏，即A = C〈〈B = D。）由于轉(zhuǎn)錄 水平的大動(dòng)態(tài)范圍，選擇對(duì)其而言C/D比率為最大的基因，從而允許敏感株和抗藥株的明 顯強(qiáng)烈的差異。此外，對(duì)于每個(gè)單獨(dú)的抗生素選擇最佳唯一的基因集，使得在誘導(dǎo)反應(yīng)上與 其他抗生素沒有重疊。
[0172] iii.預(yù)先抗生素暴露對(duì)TB桿菌特征的影響的分析。為了確定這些特征即使在 患者已用抗生素預(yù)治療的情況下鑒定抗藥性模式的有效性，在施用此測(cè)試之前，將藥物敏 感性和抗藥性TB桿菌（復(fù)制、非復(fù)制，巨噬細(xì)胞內(nèi)）預(yù)暴露給阿莫西林、頭孢菌素、甲氧芐 啶-磺胺甲?唑和紅霉素，其為在TB地方性環(huán)境中患者可能暴露給其的普通抗生素。亦 進(jìn)行TB桿菌對(duì)當(dāng)前TB藥物的不同組合的預(yù)暴露，以確定這類預(yù)暴露是否也會(huì)影響轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)和我們檢測(cè)這類反應(yīng)的能力。應(yīng)保留獨(dú)特的特征，因而不會(huì)削弱我們確定抗藥性的能力。 關(guān)注基因集的基因表達(dá)水平將使用定量RT-PCR確定。
[0173] iv.表達(dá)特征的探針選擇以鑒定抗藥譜。基于在Sub-aim Bi中獲得的數(shù)據(jù)，選擇 了一組候選基因，所述候選基因?qū)a(chǎn)生用于對(duì)抗生素暴露的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的特征。在整個(gè)TB基 因組內(nèi)高度保守的區(qū)內(nèi)選擇用于每個(gè)基因的兩個(gè)50個(gè)堿基對(duì)的區(qū)。以生物信息學(xué)法選擇 探針，以在5度解鏈溫度窗口內(nèi)適合并具有最少mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。這些探針將用于在下述 條件下利用可得的技術(shù)比較藥物敏感株和抗藥株，包括純性培養(yǎng)中最初復(fù)制或非復(fù)制的桿 菌、我們實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)巨噬細(xì)胞感染模型中的胞內(nèi)桿菌以及預(yù)暴露給不同抗生素 組合的細(xì)菌。將所有結(jié)果與通過定量RT-PCR獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。所述集合的改進(jìn)和精 化將以迭代方式進(jìn)行。
[0174] C.優(yōu)化樣品處理用于帶有分子條形碼的數(shù)字基因表達(dá)。
[0175] 除確定用于鑒定表達(dá)特征的探針集之外，第二個(gè)主要挑戰(zhàn)為優(yōu)化樣品處理以從存 在于樣品內(nèi)的桿菌測(cè)定數(shù)字基因表達(dá)。由于大多數(shù)TB病例為肺起源的以及大多數(shù)待處理 的樣品為患者痰，因此優(yōu)化痰樣的處理以從感染性TB桿菌獲得mRNA測(cè)定。使用經(jīng)摻加的 痰模型，其中用處于復(fù)制或非復(fù)制（碳饑餓）狀態(tài)的TB桿菌摻加收集自健康未感染患者 (其未用抗生素治療）的痰。待處理的問題包括處理痰的可變粘度以及有效地在痰樣內(nèi)裂 解TB桿菌。數(shù)字基因表達(dá)的主要優(yōu)點(diǎn)之一為使mRNA在極其粗制的樣品中與其各自的探針 雜交的能力，所述樣品包括粗制的細(xì)胞裂解物、固定的組織樣品、全血和尿中的細(xì)胞、來自 蜱的粗制裂解物的細(xì)胞以及含有400mM異硫氰酸胍（GITC)、聚丙烯酰胺和trizol的樣品。 因此，最初跡象表明，在裂解痰內(nèi)的細(xì)菌后將不需要純化步驟，因?yàn)槿⒛蚧蚬潭ǖ慕M織 樣品已不需要純化。僅需要充分混合以允許探針與mRNA之間的接觸。
[0176] 對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，未感染的痰獲自Brigham和Women' s醫(yī)院（BWH)標(biāo)本庫。所述標(biāo) 本庫為IRB管理的單位，由BWH病理科的LynBry，MD, PhD管理。廢棄的痰將在實(shí)驗(yàn)室中完 成所有處理之后獲得（一般在收集的12-24小時(shí)之內(nèi)）。僅從前48個(gè)小時(shí)中未接受任何抗 生素的受試者中收集痰。將所有樣品去識(shí)別化并且收集未受保護(hù)的衛(wèi)生信息?；跇?biāo)本實(shí) 驗(yàn)室的當(dāng)前工作量，在大約數(shù)周內(nèi)獲得所需量的痰（25-50mL)。
[0177] i.痰處理。痰樣在細(xì)菌接種量、稠度和粘度上不同。測(cè)試了數(shù)種方法使以下速度 達(dá)到最大，細(xì)菌以所述速度與培養(yǎng)基條件中殺菌水平的抗生素接觸并暴露給寡聚物探針以 雜交。使用了處理痰的數(shù)種方法，包括不處理、使痰通過注射器針頭、用溶菌酶和/或DNA 酶、Sputalysin(Calbiochem ;0. 1% DTT，標(biāo)準(zhǔn)地用于處理來自囊性纖維化患者的痰）處理 或者將樣品簡(jiǎn)單稀釋到某些輕微變性劑（即GITC)中。用H37Rv摻加痰并通過多種方法處 理以改變其粘度，進(jìn)行上述以確定這些方法中的任一種是否干擾所述技術(shù)。
[0178] ii.用TB桿菌摻加的痰中的細(xì)菌裂解。在測(cè)定中使用了有效裂解細(xì)菌細(xì)胞、阻止 轉(zhuǎn)錄和基于酶的mRNA降解以及使mRNA易接近探針的數(shù)種方法。檢測(cè)痰中細(xì)菌轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的 先前研究首先向樣品中加入GTC或類似試劑以阻止轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后可在GTC處理后使用離 心自痰樣中濃縮細(xì)菌。分枝桿菌的裂解通常通過物理方法完成，即用〇. Iml玻璃珠或鋯珠 勻漿。開發(fā)這類物理方法破碎經(jīng)處理痰內(nèi)的細(xì)菌，以利用來自IA的經(jīng)設(shè)計(jì)以檢測(cè)TB桿菌 的探針集分析摻加到未感染人痰中的桿菌。
[0179] 用于裂解的備選方法可能更遵從基于領(lǐng)域的考慮，包括噬菌體裂解。加入噬菌 體或者更優(yōu)化的純化的噬菌體溶素可提供用于細(xì)菌裂解的低成本、簡(jiǎn)易且非電的選項(xiàng)。 Fischetti實(shí)驗(yàn)室（Rockefeller University)近期已證實(shí)利用純化的噬菌體溶素快速 并徹底裂解數(shù)種革蘭氏陽性物種，所述噬菌體溶素以酶法水解肽聚糖，導(dǎo)致滲透性裂解。 Hatfull實(shí)驗(yàn)室（University of Pittsburgh)目前正致力于從數(shù)種裂解性分枝桿菌噬菌體 表征LysA酶的活性并優(yōu)化其性能。在不存在純化的溶素時(shí)，進(jìn)行研究以確定裂解性噬菌體 例如D29對(duì)TB的高M(jìn)OI感染可否在痰中有效地裂解TB。目前不清楚此方法將如何影響細(xì) 菌的轉(zhuǎn)錄譜，因?yàn)槠鋵⒖赡苄枰诓淮嬖谧冃詣┑那闆r下進(jìn)行，所述變性劑會(huì)影響噬菌體 的結(jié)合、進(jìn)入和隨后的裂解性質(zhì)。分枝桿菌噬菌體TM4亦表達(dá)具有肽聚糖水解酶活性的結(jié) 構(gòu)蛋白Tmp，所述Tmp可允許將其用作高M(jìn)OI下細(xì)胞裂解的快速方法。一旦裂解，用GITC、 RNAlater或者可鈍化內(nèi)源RNA酶活性的其他試劑穩(wěn)定mRNA。
[0180] 實(shí)施例5:
[0181] 細(xì)菌和真菌培養(yǎng)：使大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、斯氏普羅 威登斯菌、奇異變形菌（P. mirabilis)、粘質(zhì)沙雷氏菌（S. marcescens)、產(chǎn)氣腸桿菌 (E. aerogenes)、陰溝腸桿菌（E. cloacae)、摩氏摩根氏菌（M. morganii)、產(chǎn)酸克雷伯 氏菌（K. oxytoca)、弗氏朽1檬酸桿菌（C. freundii)或白假絲酵母（C. albicans)在 Luria-Bertani培養(yǎng)基（LB)中生長(zhǎng)至OD6tltl約為1。對(duì)于混合實(shí)驗(yàn)，在裂解用于NanoString? 分析之前，將如通過〇D_所確定的相等數(shù)量的細(xì)菌組合。如上所述在收獲或抗生素暴露之 前，使分枝桿菌隔離群在Middlebr 〇〇k7H9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期。
[0182] 抗藥性實(shí)驗(yàn)室菌株的衍生：自Hooper實(shí)驗(yàn)室，Massachusetts General Hospital, Boston, MA獲得在gyrA中具有限定的抗氟喹諾酮染色體突變（gyrAl-G81D ; gyrA2-S83L)的大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室菌株J53。從預(yù)先確定含有這些質(zhì)粒的臨床隔離群中純化 血楽介導(dǎo)的喹諾酮抗性決定簇（oqxAB、qnrB、aac6_Ib)。用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌親株 J53,并且用PCR確證其存在。
[0183] 病毒和瘧原蟲感染：在所示的MOI下分別用HSV-I菌株KOS和HSV-I菌株 186Syn+、A 型流感 PR8 或 HIV-1NL-ADA 感染 HeLa 細(xì)胞（IxlO6)、293T 細(xì)胞（2xl05)和人外 周血單核細(xì)胞（5xl05)。用惡性瘧原蟲菌株3D7感染原代紅細(xì)胞（5xl0 9)直至其達(dá)到指定 的寄生蟲血癥水平。在所示的時(shí)間，將所述細(xì)胞用PBS清洗一次并采集。
[0184] 抗生素暴露：使大腸桿菌或銅綠假單胞菌的培養(yǎng)物在LB中生長(zhǎng)至0D_約為1。 然后將培養(yǎng)物分成兩個(gè)樣品，其中之一用抗生素處理（大腸桿菌處理10分鐘：環(huán)丙沙星 4-811〖/1111或300叩/1111、慶大霉素64或12811〖/1111或者氨節(jié)西林50011〖/1111;銅綠假單胞菌 處理30分鐘：環(huán)丙沙星16 ii g/ml)。將處理部分和未處理部分二者維持在37°C，以200rpm 振蕩。使金黃色葡萄球菌或屎腸球菌的培養(yǎng)物在LB中生長(zhǎng)至OD 6tltl約為1。然后將培養(yǎng)物 分別暴露給氯唑西林（25 ii g/mL)或萬古霉素（128 ii g/mL)達(dá)30分鐘。
[0185] 使結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)物生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期，然后對(duì)0D_0. 2標(biāo)準(zhǔn)化。不用抗生素 或用以下抗生素之一（終濃度）處理2ml各培養(yǎng)物：異煙肼0. 2-1. 0 ii g/ml ;鏈霉素5 ii g/ ml、利福平0. 5 ii g/ml或環(huán)丙沙星5 ii g/ml。將平板密封并在無振蕩的情況下孵育3或6小 時(shí)。然后制備裂解物并如上所述使用表6所列探針分析。
[0186] 樣品處理：對(duì)于革蘭氏陰性隔離群，將5-lOiU培養(yǎng)物直接加入IOOiURLT緩沖液 中并渦旋。對(duì)于臨床標(biāo)本，將來自患者的20 ill尿直接加入100 UlRLT緩沖液中，所述患者 經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)室確定為患有大腸桿菌尿路感染。對(duì)于分枝桿菌，將I. 5ml培養(yǎng)物離心，然后用 Trizol(Gibco)重懸，進(jìn)行或不進(jìn)行通過珠粒攪打的機(jī)械破碎，收集最初水相用于分析。使 用Trizol和氯仿類似地制備病毒和寄生蟲RNA。對(duì)于所有裂解物，依照標(biāo)準(zhǔn)NanoString? 方案，將3-5 iU直接用于雜交。將原始計(jì)數(shù)對(duì)樣品的所有探針的平均值標(biāo)準(zhǔn)化，并且通過 將抗生素處理的樣品與未經(jīng)抗生素處理的樣品比較來確定每個(gè)基因的倍數(shù)誘導(dǎo)。
[0187] 生物鑒定探針的選擇：為了選擇NanoString?探針用于生物的示差檢測(cè)，將相關(guān) 生物的所有公開可得經(jīng)測(cè)序的基因組進(jìn)行比對(duì)。通過選擇與所述物種的所有經(jīng)測(cè)序基因 組的至少70%編碼序列（⑶S)長(zhǎng)度具有至少50%同一性的⑶S，來鑒定在各物種之內(nèi)保 守的基因。將CDS斷裂成重疊的50-聚體并且僅保留以下50-聚體，所述50-聚體在物種 內(nèi)完全保守并且與研究中任何其他物種的CDS具有不高于50 %的同一性?；仡櫫?Gene Expression Omnibus中可得的已公布表達(dá)數(shù)據(jù)，并且選擇在多數(shù)條件下良好表達(dá)的基因。 為了鑒定唯一的結(jié)核分枝桿菌探針，使用已公布的微陣列數(shù)據(jù)鑒定落入以下兩類之一的高 表達(dá)基因：結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物獨(dú)有的類別（使用BLASTN與非冗余數(shù)據(jù)庫中的任何其他 基因具有>70%同一性并且跨越所有可得的結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌（Ebovis)基因組 為保守的），以及在一組臨床上相關(guān)的分枝桿菌（包括結(jié)核分枝桿菌、鳥分枝桿菌和副結(jié)核 分枝桿菌）內(nèi)具有>85%同一性的類別。針對(duì)白假絲酵母基因組的50-聚體區(qū)段設(shè)計(jì)白假 絲酵母探針，所述50-聚體區(qū)段與包含在其探針集中的十個(gè)附加病原生物的完整基因組相 比為唯一的。針對(duì)在病毒（即所有HSV-2或HIV-I隔離群）內(nèi)高度保守的基因設(shè)計(jì)病毒探 針，所述基因在相同家族內(nèi)的病毒之間（即HSV-I和HSV-2之間）較不保守。針對(duì)在寄生 蟲生命周期的每個(gè)血階段中大量表達(dá)的基因設(shè)計(jì)惡性瘧原蟲探針。對(duì)所有探針進(jìn)行篩選以 避免與人RNA的交叉雜交。
[0188] 探針集：對(duì)于革蘭氏陰性生物鑒定，使用包含用于大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和銅 綠假單胞菌的探針的合并探針集。對(duì)于分枝桿菌生物鑒定，用于結(jié)核分枝桿菌的種特異性 探針和更廣泛的分枝桿菌屬探針在針對(duì)微生物病原體的更大探針集中。
[0189] 為在暴露給不同抗微生物劑時(shí)差異調(diào)節(jié)的基因設(shè)計(jì)探針，以測(cè)定反 應(yīng)的存在或不存在（Sangurdekar 等，Genome Biology7，R32(2006) ;Anderson 等,Infect. Tmmun. 76, 1423-1433, (2008) ；Brazas 和 Hancock, Antimicrob. Agents Chemother. 49, 3222-3227,（2005))。在將野生型大腸桿菌K-12暴露給環(huán)丙沙星、慶大霉素 或氨芐西林10-30分鐘之后，觀察到在轉(zhuǎn)錄物水平上的預(yù)期改變，所述改變一起限定用于 各抗生素的藥物敏感性表達(dá)特征（圖23A和23B，表7)。在相應(yīng)的抗藥株中沒有引出這些 特征（圖23A和23B)。
[0190] 快速表型藥物敏感性測(cè)試將在結(jié)核病中造成尤其深遠(yuǎn)的影響，因?yàn)橐呀⒌挠糜?表型測(cè)試的方法花費(fèi)數(shù)周至數(shù)月（Minion等，Lancet Infect DislO, 688-698，（2010))。響 應(yīng)抗結(jié)核藥異煙肼、環(huán)丙沙星和鏈霉素的表達(dá)特征能夠在3-6小時(shí)抗生素暴露后區(qū)分敏感 性和抗藥性隔離群（圖23C)。轉(zhuǎn)錄譜中的一些基因?yàn)闄C(jī)制特異性的（即對(duì)于環(huán)丙沙星為： recA、alkA和Ihr ;對(duì)于鏈霉素為：groEL ;以及對(duì)于異煙肼為：kasA和accD6)。其它基因尤 其是涉及分枝菌酸合成或中間代謝的基因，因響應(yīng)多種抗生素而減量調(diào)節(jié)，表明自生長(zhǎng)轉(zhuǎn) 向損傷控制。
[0191] 為了將這些復(fù)雜響應(yīng)簡(jiǎn)化成單一定量的度量以區(qū)分敏感株和抗藥株，利用以下度 量，即每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的表達(dá)反應(yīng)離對(duì)照抗生素敏感樣品的形心的均方距離（MSD)?？股孛?感株緊密聚簇，因此具有小MSD。相反地，抗生素抗性株具有較大值，因?yàn)樵S多基因未能以 類似于一般敏感株的方式響應(yīng)抗生素。將MSD報(bào)告為無因次的Z分?jǐn)?shù)，表不樣品離大腸桿 菌（圖24A、24B、27和28)或結(jié)核分枝桿菌（圖24C和29)的敏感性隔離群平均值的標(biāo)準(zhǔn) 差數(shù)量。
[0192] 由于表達(dá)譜反映表型而不是基因型，因此可使用單一整合的表達(dá)特征測(cè)定通過多 種機(jī)制介導(dǎo)的抗藥性。將環(huán)丙沙星敏感性大腸桿菌J53菌株的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與具有不同抗藥性 機(jī)制的一系列同基因突變型比較：兩個(gè)突變型在氟喹諾酮靶基因拓?fù)洚悩?gòu)酶gyrA中具有 單突變（G81D或S83L)，三個(gè)突變型攜有附加型喹諾酮抗性基因，包括aac(6'）-Ib(乙?；?鈍化酶）、qnrB(其阻斷gyrA的活性部位）和oqxAB(流出泵）。與親株相比，所有J53衍 生物具有高Z分?jǐn)?shù)，反映了抗藥性（圖24B)。
[0193] 將對(duì)異煙肼的反應(yīng)與一系列敏感性臨床隔離群和實(shí)驗(yàn)室隔離群以及兩個(gè)抗異煙 肼菌株比較，包括攜有在katG(前藥激活所需的過氧化氫酶）的突變（S315T)的H37Rv衍 生實(shí)驗(yàn)室菌株，以及在異煙肼靶標(biāo)inhA的啟動(dòng)子具有突變（C-15T)的臨床隔離群。因它們 不同的抗藥性機(jī)制所致，這兩個(gè)菌株對(duì)異煙肼具有不同水平的抗藥性，katG突變型具有高 水平抗藥性（在最小抑菌濃度（MIC)上>100倍增加至>6. 4 ii g/mL)，而inhA啟動(dòng)子突變?cè)?MIC上僅具有8倍增加至0. 4 ii g/mL。暴露給低異煙肼濃度（0. 2 ii g/mL)在任一個(gè)抗藥株 中均未引起轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，但是在更高異煙肼濃度（ly g/mL)下，inhA突變型以與katG突變型 相比敏感的方式反應(yīng)（圖24C)。因此，本方法不僅是機(jī)制獨(dú)立的，而且也可提供區(qū)分高水平 和低水平抗藥性的相對(duì)衡量。
[0194] 最后，由于RNA幾乎普遍存在于范圍從細(xì)菌、病毒、真菌到寄生蟲的病原體中，因 此可將RNA檢測(cè)整合到適用于跨越廣泛范圍傳染劑的單一診斷平臺(tái)中。利用一大群混合 的病原體探針，我們能夠直接和特異地檢測(cè)信號(hào)以鑒定真菌病原體白假絲酵母（圖25A); 以劑量依賴性方式在細(xì)胞培養(yǎng)物中鑒定人免疫缺陷病毒（HIV)、流感病毒和單純皰疹病 毒-2(HSV-2)(圖25B-D);以及在受感染紅細(xì)胞中鑒定惡性瘧原蟲生命周期的不同階段 (圖 25E)。
[0195] NanoString?數(shù)據(jù)分析以及對(duì)于藥物敏感性的距離度量均方距離的計(jì)算：對(duì)于所 有經(jīng)藥物處理的樣品，首先將每個(gè)探針的原始NanoString?計(jì)數(shù)對(duì)每個(gè)樣品的所有相關(guān) (即種適當(dāng)?shù)模┨结樀钠骄禈?biāo)準(zhǔn)化。通過將每個(gè)測(cè)試條件下經(jīng)抗生素處理的樣品中每個(gè) 探針的標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)數(shù)與未經(jīng)處理的基線樣品中的相應(yīng)計(jì)數(shù)進(jìn)行比較，確定在轉(zhuǎn)錄水平上的倍 數(shù)變化。
[0196] 為了將定性的表達(dá)特征轉(zhuǎn)換成敏感性或抗藥性的二元結(jié)果，開發(fā)了算法以計(jì)算樣 品的轉(zhuǎn)錄譜離暴露給相同藥物的敏感株的轉(zhuǎn)錄譜的均方距離（MSD)。藥物敏感性實(shí)驗(yàn)中的 MSD度量如下計(jì)算 ：
[0197] 1.通過將原始值對(duì)樣品中所有相關(guān)探針計(jì)數(shù)的平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，來修正在樣品量上 的變化。
[0198] 2?選擇一組NanoString?探針，我們將其表示為Pj。下標(biāo)j為I-N探針（所選探針 的總數(shù)）。將所述分析限于在藥物敏感性和抗藥性隔離群之間差異變化的探針。
[0199] 3.將藥物敏感株的重復(fù)定義為Nsanip。對(duì)于每個(gè)重復(fù)，將在藥物處理前后對(duì)每個(gè)探 針匕的標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)數(shù)表示為或(^^，i表示樣品指數(shù)。
[0200] 4.接著計(jì)算"對(duì)數(shù)誘導(dǎo)比率"：
[0201]

【權(quán)利要求】
1. 一種確定病原體的藥物敏感性的方法，所述方法包括： 提供包含病原體的樣品； 使所述樣品與一種或多種試驗(yàn)化合物接觸以提供試樣； 在將信使核糖核酸（mRNA)自病原體釋放進(jìn)入試樣的條件下處理所述試樣； 將所述試樣暴露給包含多個(gè)探針子集的多種核酸探針，其中各子集包含與靶mRNA特 異性結(jié)合的一種或多種探針，與抗藥性生物相比，所述靶mRNA在對(duì)試驗(yàn)化合物敏感的生物 中差異表達(dá)，其中所述暴露在使探針和靶mRNA之間的結(jié)合可發(fā)生的時(shí)間內(nèi)和條件下進(jìn)行； 確定探針與祀mRNA之間的結(jié)合水平，從而確定祀mRNA水平；和 將存在試驗(yàn)化合物時(shí)的靶mRNA水平與參考水平進(jìn)行比較，其中所述靶mRNA水平相對(duì) 于靶mRNA參考水平的差異表明所述病原體對(duì)試驗(yàn)化合物是敏感的還是抗性的。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述試驗(yàn)化合物為針對(duì)病原體的已知或潛在治療。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述方法包括使樣品與兩種或更多種試驗(yàn)化合物接觸。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中使所述樣品與一種或多種試驗(yàn)化合物接觸達(dá)少于4小時(shí)。
5. -種鑒定傳染病病原體的方法，所述方法包括： 提供來自疑似被病原體感染的受試者的試樣； 在釋放信使核糖核酸（mRNA)的條件下處理所述試樣； 將試樣暴露給包含多個(gè)探針子集的多種核酸探針，其中各子集包含與靶mRNA特異性 結(jié)合的一種或多種探針，所述靶mRNA唯一地鑒定病原體，其中所述暴露在使探針和靶mRNA 之間的結(jié)合可發(fā)生的時(shí)間內(nèi)和條件下進(jìn)行；和 確定探針與祀mRNA之間的結(jié)合水平，從而確定祀mRNA水平； 其中試樣相對(duì)于參考樣品在祀mRNA方面的增加，表明試樣中病原體的身份。
6. 權(quán)利要求1或5的方法，其中所述試樣選自痰、血、尿、糞便、關(guān)節(jié)液、腦脊液和子宮頸 /陰道拭子。
7. 權(quán)利要求1或5的方法，其中所述試樣包含多種不同的傳染病病原體或非致病生物。
8. 權(quán)利要求1或5的方法，其中所述一種或多種核酸探針選自表2。
9. 權(quán)利要求1或5的方法，其中所述病原體為細(xì)菌、真菌、病毒或寄生蟲。
10. 權(quán)利要求1或5的方法，其中所述病原體為結(jié)核分枝桿菌。
11. 權(quán)利要求1或5的方法，其中所述mRNA在與探針接觸之前為粗制的。
12. 權(quán)利要求1或5的方法，其中所述方法不包括擴(kuò)增mRNA。
13. 權(quán)利要求1或5的方法，其中所述方法包括以酶法、化學(xué)法或機(jī)械法裂解細(xì)胞。
14. 權(quán)利要求1或5的方法，其中所述方法包括微流體裝置的使用。
15. 權(quán)利要求1或5的方法，其中將所述方法用于監(jiān)測(cè)病原體感染。
16. 權(quán)利要求1的方法，其中所述病原體在來自受試者的樣品中。
17. 權(quán)利要求5或16的方法，其中所述受試者為人。
18. 權(quán)利要求5或16的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括確定或選擇用于受試者的治療， 以及任選給予受試者所述治療。
19. 一種選擇用于受試者的治療的方法，所述方法包括： 任選用以下方法鑒定來自受試者的樣品中的病原體，所述方法包括： 提供來自疑似被病原體感染的受試者的試樣； 在釋放信使核糖核酸（mRNA)的條件下處理所述試樣； 將試樣暴露給包含多個(gè)探針子集的多種核酸探針，其中各子集包含與靶mRNA特異性 結(jié)合的一種或多種探針，所述靶mRNA唯一地鑒定病原體，其中所述暴露在使探針和靶mRNA 之間的結(jié)合可發(fā)生的時(shí)間內(nèi)和條件下進(jìn)行；和 確定探針與祀mRNA之間的結(jié)合水平，從而確定祀mRNA水平； 其中試樣相對(duì)于參考樣品在祀mRNA方面的增加，表明試樣中病原體的身份； 利用權(quán)利要求1的方法確定病原體的藥物敏感性； 以及選擇所述病原體對(duì)其敏感的藥物用于治療受試者。
20. -種在受試者中監(jiān)測(cè)病原體感染的方法，所述方法包括： 在第一時(shí)間獲得包含病原體的第一樣品； 利用權(quán)利要求1的方法確定第一樣品中病原體的藥物敏感性； 任選選擇所述病原體對(duì)其敏感的治療并給予受試者所選治療； 在第二時(shí)間獲得包含病原體的第二樣品； 利用權(quán)利要求1的方法確定第二樣品中病原體的藥物敏感性；和 將第一樣品和第二樣品中病原體的藥物敏感性進(jìn)行比較，從而在受試者中監(jiān)測(cè)感染。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述受試者為免疫缺損的。
22. 權(quán)利要求20的方法，其中所述方法包括選擇病原體對(duì)其敏感的治療并給予受試 者所選治療，以及利用權(quán)利要求1的方法確定第二樣品中的病原體對(duì)所選治療的藥物敏感 性，其中在病原體的藥物敏感性上的改變表明所述病原體是對(duì)所述治療有抗性還是變?yōu)閷?duì) 所述治療有抗性。
23. 權(quán)利要求20的方法，其中在病原體的藥物敏感性上的改變表明所述病原體對(duì)所述 治療有抗性或變?yōu)閷?duì)所述治療有抗性，以及所述方法進(jìn)一步包括給予受試者不同的治療。
24. -種在受試者群體中監(jiān)測(cè)病原體感染的方法，所述方法包括： 在第一時(shí)間獲得來自群體中受試者的第一多種樣品； 利用權(quán)利要求1的方法確定第一多種樣品中病原體的藥物敏感性，以及任選用以下方 法鑒定第一多種樣品中的傳染病病原體，所述方法包括： 提供來自疑似被病原體感染的受試者的試樣； 在釋放信使核糖核酸（mRNA)的條件下處理所述試樣； 將試樣暴露給包含多個(gè)探針子集的多種核酸探針，其中各子集包含與靶mRNA特異性 結(jié)合的一種或多種探針，所述靶mRNA唯一地鑒定病原體，其中所述暴露在使探針和靶mRNA 之間的結(jié)合可發(fā)生的時(shí)間內(nèi)和條件下進(jìn)行；和 確定探針與祀mRNA之間的結(jié)合水平，從而確定祀mRNA水平； 其中試樣相對(duì)于參考樣品在祀mRNA方面的增加，表明試樣中病原體的身份； 任選給予受試者治療； 在第二時(shí)間獲得來自群體中受試者的第二多種樣品； 利用權(quán)利要求1的方法確定第二多種樣品中病原體的藥物敏感性，以及任選用以下方 法鑒定第一多種樣品中的傳染病病原體，所述方法包括： 提供來自疑似被病原體感染的受試者的試樣； 在釋放信使核糖核酸（mRNA)的條件下處理所述試樣； 將試樣暴露給包含多個(gè)探針子集的多種核酸探針，其中各子集包含與靶mRNA特異性 結(jié)合的一種或多種探針，所述靶mRNA唯一地鑒定病原體，其中所述暴露在使探針和靶mRNA 之間的結(jié)合可發(fā)生的時(shí)間內(nèi)和條件下進(jìn)行；和 確定探針與祀mRNA之間的結(jié)合水平，從而確定祀mRNA水平； 其中試樣相對(duì)于參考樣品在祀mRNA方面的增加，表明試樣中病原體的身份； 將第一多種樣品和第二多種樣品中病原體的藥物敏感性以及任選所述病原體的身份 進(jìn)行比較，從而在受試者群體中監(jiān)測(cè)感染。
25. 與固相支持體結(jié)合的多種多核苷酸，其中所述多種多核苷酸包含至少一種多核苷 酸，每種多核苷酸選擇性地與選自表2的一個(gè)或多個(gè)基因雜交。
26. 權(quán)利要求25的多種多核苷酸，所述多種多核苷酸包括SEQ ID NO: 1-227或其任何 組合。
27. -種來自受試者的紅細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104212890SQ201410415201
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2011年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2010年2月24日
【發(fā)明者】D.洪J.戈麥斯, L.科西米, R.尼科爾, M.博羅夫斯基, A.巴查克, A.B.安德東克 申請(qǐng)人:布羅德研究所有限公司, 綜合醫(yī)院公司, 布里格姆婦女醫(yī)院