一種基于脂肪酸去飽和酶基因的抗寒轉(zhuǎn)基因煙草的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于脂肪酸去飽和酶基因的抗寒轉(zhuǎn)基因煙草的構(gòu)建方法，首先，利用RT-PCR法擴增出了菠菜的硬脂酰基載體蛋白去飽和酶基因(SAD)，連接該基因至植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pBI121上；經(jīng)核苷酸序列分析克隆并重組正確的載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌Agrobacterium?tumefaciens?LBA4404中；含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌以葉盤法轉(zhuǎn)化煙草無菌苗外植體，篩選出卡那霉素抗性植株并移栽于花盆中，生長成熟后收集種子；種子播種于含卡那霉素的MS培養(yǎng)基上使其萌發(fā)生長；從卡那霉素抗性植株的葉片提取核DNA進行PCR檢測、點雜交及Southern雜交鑒定；最后，以分子鑒定的陽性轉(zhuǎn)基因煙草作為實驗材料，在低溫脅迫下，分別進行電導(dǎo)率測定和葉綠素含量測定，轉(zhuǎn)SAD基因煙草的抗寒性有明顯的改善。
【專利說明】一種基于脂肪酸去飽和酶基因的抗寒轉(zhuǎn)基因煙草的構(gòu)建方 法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種基于脂肪酸去飽和酶基因的抗寒轉(zhuǎn) 基因煙草的構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物尤其是農(nóng)作物的抗寒性問題一直是國內(nèi)外研究的熱點。倘若農(nóng)作物在較低的 溫度下也能夠正常生長，這對農(nóng)作物抵抗低溫寒害、尤其是對防止我國農(nóng)作物種植中的倒 春寒、早霜等農(nóng)業(yè)災(zāi)害具有重大的經(jīng)濟意義。
[0003] 已有的研究結(jié)果表明，植物抵御低溫脅迫的能力與植物細(xì)胞的膜脂不飽和度呈正 相關(guān)性，也就是說，膜脂的不飽和度越高，則植物對低溫環(huán)境的抵抗力越強。硬脂?；d體 蛋白去飽和酶（SAD)是植物脂肪酸去飽和代謝過程的關(guān)鍵酶，它催化植物最主要的脂肪 酸--硬脂酸的第一個去飽和反應(yīng)，并通過隨后的一系列去飽和反應(yīng)提高植物細(xì)胞、尤其 是植物細(xì)胞膜上的脂?；牟伙柡投?，從而提高植物的抗寒能力。
[0004] 以往對植物寒害的生理學(xué)與生物化學(xué)研究闡明了植物遭受寒害的過程與機理，t匕 如，零上低溫對植物傷害的主要原發(fā)部位是細(xì)胞膜、膜脂不飽和度與寒害程度密切相關(guān)。然 而，目前尚未見國內(nèi)外通過導(dǎo)入高表達硬脂?；d體蛋白去飽和酶基因來改良植物抗寒性 的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于脂肪酸去飽和酶基因的抗寒轉(zhuǎn)基因煙草的構(gòu)建 方法，旨在解決植物在零上低溫條件下遭受傷害的問題。
[0006] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種基于脂肪酸去飽和酶基因的抗寒轉(zhuǎn)基因煙草的構(gòu)建方 法，包括以下步驟：
[0007] (1)利用RT-PCR法擴增出的菠菜硬脂?；d體蛋白去飽和酶基因連接至植物遺 傳轉(zhuǎn)化載體pBI 121上；
[0008] (2)將核苷酸序列測定正確的重組載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404中并鑒定陽性轉(zhuǎn)化菌落；
[0009] (3)將陽性轉(zhuǎn)化子浸染煙草葉盤，形成愈傷組織并分化出芽后，在抗性MS培養(yǎng)基 (含100mg/L Km，500mg/L CB)上進行誘導(dǎo)生根，待根長達數(shù)厘米時，移栽于盛有營養(yǎng)土的花 盆中，在自然光下生長；提取卡那霉素抗性植株的葉片DNA進行點雜交及Southern雜交，確 定SAD基因?qū)氲臒煵葜仓辏?br> [0010] (4)以SAD基因?qū)氲霓D(zhuǎn)基因煙草作為實驗材料，-20°C冷凍40分鐘后置于室溫 下，測定葉綠素含量隨時間的變化；室溫（27°C)下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因煙草移至6°C生長，測定電 導(dǎo)率隨時間的變化；以轉(zhuǎn)SAD基因煙草的葉綠素含量和電導(dǎo)率變化判斷轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒 性是否有明顯改善。
[0011] 在步驟⑴中，所述RT-PCR法擴增所用引物為：
[0012] 上游引物：5 ' -AGATTCGAACAATGGCTCTGAATCTCAACC-3 '，
[0013] 下游引物：5 ' -AGATCTAGAACTCAAAGCTTTACTTG-3 '。
[0014] 本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，提供了一種抗寒性轉(zhuǎn)基因煙草的制備方法，通過將一 個能夠提高植物抗寒性的基因即菠菜硬脂?；d體蛋白去飽和酶基因（SAD)轉(zhuǎn)化至煙草 植株并進行了抗寒性分析。結(jié)果表明，構(gòu)建的轉(zhuǎn)SAD基因煙草的抗寒性具有顯著改善。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是菠菜SAD基因 RT-PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，1 :DNA分子量 標(biāo)志（BamH I+Hind III digested λ DNA) ;2:RT-PCR 擴增產(chǎn)物。
[0016] 圖2是重組質(zhì)粒pBI 121-13(含正向SAD基因 ），pBI 121-6(含反義SAD基因）經(jīng)酶 切后的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，1 :重組質(zhì)粒PBI121-13經(jīng)Xba I酶切后的瓊脂糖凝膠電 泳圖；2 :pBI121-6經(jīng)Xba I酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖；3 :DNA分子量標(biāo)志（BamH I+Hind III digested λDNA)〇
[0017] 圖3是卡那霉素抗性煙草植株的DNA點雜交圖，以NOS終止子區(qū)域為探針。其中， A:重組載體pBI121-13轉(zhuǎn)化的煙草植株1至6號；B:重組載體pBI121-13轉(zhuǎn)化的煙草植株 8至13號；C:a - b為重組載體pBI 121-13轉(zhuǎn)化的煙草植株14至15號；c - f為重組載體 pBI 121-6轉(zhuǎn)化的煙草植株1至4號；D: a -b為重組載體pBI 121-13轉(zhuǎn)化的樣品1至2號； c - d為未轉(zhuǎn)化的煙草植株（陰性對照），f為pBI121空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的煙草植株（陽性對 照）。
[0018] 圖4是轉(zhuǎn)基因煙草的Southern雜交分析圖。其中，泳道1 :含有⑶S+N0STOT片段的 陽性對照；泳道2 :pBI121質(zhì)粒；泳道3、4、7、8 :用重組質(zhì)粒pBI121-13轉(zhuǎn)化的2號、13號、9 號、14號植株；泳道5、6、9、10 :用重組質(zhì)粒pBI 121-6轉(zhuǎn)化的3號、4號、1號、2號植株。

【具體實施方式】
[0019] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0020] 實施例1植物遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建
[0021] 硬脂?；d體蛋白去飽和酶（SAD)是植物脂肪酸去飽和代謝過程的關(guān)鍵酶，而細(xì) 胞膜脂的不飽和度又與植物的抗寒性呈正相關(guān)。SAD基因在植物中表達較低，SAD酶是硬 脂酰去飽和的第一步，也是隨后一系列去飽和反應(yīng)的限速步驟。所以本發(fā)明將克隆到的菠 菜SAD基因插入到CaMV的35S啟動子下游，構(gòu)建成可高效表達SAD基因的植物遺傳轉(zhuǎn)化 載體PBI121-13。同時將反義的SAD基因也構(gòu)建至pBI121，獲得重組植物遺傳轉(zhuǎn)化載體 pBI 121-6,作為陰性對照。
[0022] 首先，用酚/氯仿抽提法提取菠菜總RNA，根據(jù)GenBank的菠菜SAD基因的cDNA序 列設(shè)計并合成一對特異性引物，用于SAD基因的克?。?br> [0023] 上游引物：5 ' -AGATTCGAACAATGGCTCTGAATCTCAACC-3 '，
[0024] 下游引物：5' -AGATCTAGAACTCAAAGCTTTACTTG-3' ；
[0025] 用合成的這一對引物及提取的菠菜總RNA進行RT-PCR擴增。經(jīng)0. 8 %瓊脂糖凝膠 電泳檢測，得到一條約1. 2Kb的擴增產(chǎn)物（圖1)。
[0026] 將植物雙元表達載體pBI121和純化后的RT-PCR產(chǎn)物分別經(jīng)CSP45I和Xbal雙酶 切，用T4DNA連接酶將線性化的載體和PCR產(chǎn)物進行16度過夜連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 大腸桿菌（Escherichia coli)DH5a菌株，37°C培養(yǎng)過夜。次日挑選陽性菌落進行培養(yǎng)、制 備重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，檢測有無插入片段及片段大小 (圖2)。通過對重組質(zhì)粒上插入的DNA片段進行核苷酸序列測定并與SAD基因序列比對， 結(jié)果表明擴增出來的DNA片段是SAD基因的cDNA。所得到的重組質(zhì)粒命名為pBI121-13。 同時，利用上述方法，將反義的SAD基因也克隆在pBI121載體上，所得重組質(zhì)粒命名為 PBI121-6。
[0027] 實施例2pBI 121、pBI 121-13、pBI 121-6等植物遺傳轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化煙草
[0028] 取出儲存于 _70°C冰箱的農(nóng)桿菌 Agrobacterium tumefaciens LBA4404,劃線于 YEB平板上，28°C培養(yǎng)，直至長出單菌落。挑取單菌落于5ml YEB培養(yǎng)基中，28°C，250rpm培 養(yǎng)過夜。取2ml接種于40ml YEB中繼續(xù)培養(yǎng)。約3小時后，倒入預(yù)冷的離心管中，冰浴30 分鐘，6000rpm離心10分鐘，沉淀懸浮于lmlO. 1M CaCl2溶液中，吸取200 μ 1分裝于預(yù)冷的 離心管中，分別加入約800ng ρΒΙ121，ρΒΙ121-13，ρΒΙ121-6。冰浴5分鐘，置于液氮中8分 鐘，取出后立即放入37°C水浴5分鐘，加入ΥΕΒ至lml，28°C、250rpm培養(yǎng)4?5小時，離心， 沉淀懸浮于200μ1 YEB中，涂布于含有卡那霉素（50yg/ml)的LB平板上，28°C培養(yǎng)，直至 長出單菌落。挑取單菌落接種于含有卡那霉素（50yg/ml)的液體LB培養(yǎng)基中，待到生長 至對數(shù)期，提取質(zhì)粒并電泳檢測。
[0029] 將上述以凍融法導(dǎo)入了植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pBI121，pBI121-13, pBI121-6的農(nóng)桿 菌菌株進行篩選并鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。挑取陽性農(nóng)桿菌單菌落分別接種于5ml含卡那霉素 (50yg/ml)的YEB培養(yǎng)基中，28°C、250rpm培養(yǎng)至0D6QQ = 0. 8?1.0,離心收集菌體，用MS 培養(yǎng)基洗滌后，調(diào)節(jié)菌體濃度到〇D_ = 0. 5?0. 6。將煙草（革新29號）無菌葉片切成 lcm見方小塊，浸于不同農(nóng)桿菌懸液中，5?7分鐘，然后置于MS平板上，28°C光照培養(yǎng)三天 后，將轉(zhuǎn)化處理的葉盤置于MS培養(yǎng)液中，5?7分鐘后，再轉(zhuǎn)到MS平板，25°C培養(yǎng)，光/暗為 12h/12h，直至形成愈傷并分化出芽。將順利分化出的芽切割并轉(zhuǎn)接至MS固體培養(yǎng)基中，誘 導(dǎo)生根，待根長達數(shù)厘米時，移栽至盛有營養(yǎng)土的花盆中，于實驗室自然光照下使其生長。 當(dāng)長至6?7片葉時，取植株葉片提取核DNA進行分子鑒定。
[0030] 實施例3點雜交及Southern雜交篩選轉(zhuǎn)基因煙草
[0031] 準(zhǔn)備雜交用尼龍膜，將尼龍膜用雙蒸水浸濕，在2X SSC溶液中浸泡5分鐘，抽濾點 樣，加150 μ 12X SSC沖洗，待DNA完全干燥，放置在用0. 4MNaOH飽和的濾紙上變性5分鐘， 然后再用2XSSC飽和的濾紙中和5分鐘，80°C真空烘箱中烤膜1小時，干燥處存放備用。
[0032] 將pBI121質(zhì)粒用BamHI和EcoRI雙酶切，電泳檢查酶切完全后，用低熔點瓊脂糖 膠電泳回收⑶S+N0S Te,片段作為探針DNA。探針DNA的放射性標(biāo)記，采用Random Primer方 法標(biāo)記。
[0033] 雜交：將放射性標(biāo)記的DNA探針100°C煮沸5分鐘，冰浴冷卻，加 EDTA至20mM。倒出 預(yù)雜交液，加入雜交液，加入探針，42°C雜交16?24小時。洗膜與放射自顯影：棄去雜交液， 雜交膜先用2X SSC+0. 5% SDS溶液沖洗一次，再在室溫下洗滌5分鐘，再用2X SSC+0. 1% SDS洗滌5分鐘，最后在68°C于0. IX SSC+O. 5%SDS中洗滌30分鐘，并用0. IX SSC洗去 SDS，然后用濾紙吸去尼龍膜殘留液，包上保鮮膜，壓上X-光片及增感屏于-70°C放射自顯 影，2?3天后顯影X-光片。
[0034] 選取經(jīng)卡那霉素抗性篩選出來的pBI 121-13, pBI 121-6, pBI 121轉(zhuǎn)化植株及2株未 遺傳轉(zhuǎn)化植株做對照，提取葉片DNA并進行點雜交實驗。根據(jù)點雜交結(jié)果（圖3)，選雜交 信號最強的PBI121-13轉(zhuǎn)化植株的2、13號，pBI121-6轉(zhuǎn)化的3、4號提取核DNA做雙酶切； PBI121-13轉(zhuǎn)化的9、4號和pBI121-6轉(zhuǎn)化的1、2號提取核DNA做單酶切。以Gus+N0STOT為 探針進行Southern雜交檢測。Southern雜交結(jié)果表明，雙酶切樣品在2. 0Kb的位置有一條 雜交帶，單酶切樣品在不同位置有多條雜交帶（圖4)。說明這些植物是轉(zhuǎn)基因植物，且為多 個拷貝。
[0035] 實施例4對照煙草和轉(zhuǎn)SAD基因煙草的抗寒性分析
[0036] 電導(dǎo)率變化測定：將Southern雜交呈陽性的62, 63, 64, 139, 1315, 1314植株及未經(jīng)遺 傳轉(zhuǎn)化的植株（對照），從室溫（約27°C)、光下移至6°C、黑暗的培養(yǎng)箱中。分別于40小 時、88小時后測室溫下和低溫下植株的電導(dǎo)率。然后將植株轉(zhuǎn)移至室溫（約27°C )，自然光 下，48小時后測電導(dǎo)率。
[0037] 取大小相近的葉片，用打孔器打取10?15個小圓片，放入10mlddH20中，斜放在 搖床上搖lh，測電導(dǎo)，然后沸水煮15分鐘，冷卻后測電導(dǎo)，以煮沸前電導(dǎo)值占煮沸后電導(dǎo)值 的百分率為每種植物的相對電導(dǎo)率。
[0038] 葉綠素含量測定：從Southern雜交呈陽性的62, 63, 64, 139, 1315, 1314植株及未經(jīng)遺 傳轉(zhuǎn)化的植株（對照）上，各剪取大小，葉齡一致的兩片葉子，放入一次性使用的薄膜手套 中，封口。其中一片置于-20°C冷凍40分鐘，取出后放于室溫（約27°C )下，另一片葉保持 于室溫下作對照。4天后測葉綠素含量。
[0039] 取lg左右葉片組織，加少量0&0)3及80%的丙酮，研磨至勻楽，過濾。再用80%丙 酮洗研缽數(shù)次并將洗液過濾合并，用80%丙酮定容濾液至10ml。在652nm波長下測0D值， 計算葉綠素的總量。比較各組葉綠素含量的變化。
[0040] 低溫處理前各組煙草葉片的相對電導(dǎo)率基本一致。6度下40小時后，各組的電導(dǎo) 率出現(xiàn)差異、但相對較小。低溫處理88小時后，對照組和pBI121-6轉(zhuǎn)化植株組的相對電導(dǎo) 率都明顯升高。而PBI121-13轉(zhuǎn)化植株組的相對導(dǎo)電率始終保持在較低的水平（表1)。
[0041] 表1不同溫度下對照組和處理組的電導(dǎo)率
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于脂肪酸去飽和酶基因的抗寒轉(zhuǎn)基因煙草的構(gòu)建方法，其特征在于、包括以 下步驟： (1) 利用RT-PCR法擴增出的菠菜硬脂酰基載體蛋白去飽和酶基因連接至植物遺傳轉(zhuǎn) 化載體PBI121上； (2) 將核苷酸序列測定正確的重組載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404中并鑒定陽性轉(zhuǎn)化菌落； (3) 將陽性轉(zhuǎn)化子浸染煙草葉盤，形成愈傷組織并分化出芽后，在抗性MS培養(yǎng)基（含 100mg/L Km，500mg/LCB)上進行誘導(dǎo)生根，待根長達數(shù)厘米時，移栽于盛有營養(yǎng)土的花盆 中，在自然光下生長；提取卡那霉素抗性植株的葉片DNA進行點雜交及Southern雜交，確定 SAD基因?qū)氲臒煵葜仓辏? (4) 以SAD基因?qū)氲霓D(zhuǎn)基因煙草作為實驗材料，-20°C冷凍40分鐘后置于室溫下，測 定葉綠素含量隨時間的變化；室溫（27°C )下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因煙草移至6°C生長，測定電導(dǎo)率 隨時間的變化；以轉(zhuǎn)SAD基因煙草的葉綠素含量和電導(dǎo)率變化判斷轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性是 否有明顯改善。
2. 如權(quán)利要求1所述的基于脂肪酸去飽和酶基因的抗寒轉(zhuǎn)基因煙草的構(gòu)建方法，其特 征在于，在步驟（1)中，所述RT-PCR法擴增所用引物為： 上游引物：5' -AGATTCGAACAATGGCTCTGAATCTCAACC-3'， 下游引物：5' -AGATCTAGAACTCAAAGCTTTACTTG-3'。
【文檔編號】C12N15/84GK104195169SQ201410438235
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】馬建忠, 劉丹, 肖成斌, 馬燕林, 王永剛, 張偉杰 申請人:蘭州理工大學(xué)