專利名稱：：脂肪酸乙酯的酶法產(chǎn)生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及酶法產(chǎn)生脂肪酸乙酯。本發(fā)明具體而言涉及脂肪酸乙酯合成中再使用的固定化的酶的活性以及過量乙醇對(duì)酶活性的作用。相關(guān)技術(shù)的描述用于生物柴油的油類和脂肪的酶法加工在技術(shù)上是可行的。通過酶法生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的生物柴油與化學(xué)轉(zhuǎn)化相比，更加環(huán)境友好并因此更加合意。然而除了少數(shù)例外，目前酶技術(shù)并未用于商業(yè)規(guī)模的生物柴油生產(chǎn)。這主要是由于未優(yōu)化的工藝設(shè)計(jì)，以及缺乏可用的劃算的酶。再使用酶的技術(shù)對(duì)于使得工藝具有競(jìng)爭(zhēng)性而言通常被證明是不夠充分的。脂肪酶催化甘油三酯底物與醇如甲醇(MeOH)和乙醇(EtOH)的轉(zhuǎn)酯作用以分別產(chǎn)生脂肪酸烷基酯如脂肪酸甲酯(FAME)和脂肪酸乙酯(FAEE)。此類酶催化工藝的一個(gè)問題是脂肪酶可由于醇而失活。因此，在整個(gè)工藝中一般將醇濃度保持較低。醇耐受性受因素如所述酶、所述醇、酶固定化的方式等影響。一般而言，所述醇愈小，其失活作用愈強(qiáng)。因此MeOHKKOH失活作用更強(qiáng)，而KOH比丙醇(ftOH)失活作用更強(qiáng)，余此類推。(E"Enzymaticbiodieselproduction:Technicalandeconomicalconsiderations，，Nielsen,PM等(2008)Eur.J.LipidSci.Technol.，vol.110，p.692—700)。在生物柴油產(chǎn)生中充分利用脂肪分解酶的主要障礙是成本。因此，脂肪分解酶的再使用從經(jīng)濟(jì)視角而言是必需的，其可通過使用固定化形式的脂肪分解酶來實(shí)現(xiàn)。在生物柴油生產(chǎn)中再使用固定化的脂肪分解酶的方法已得到描述，其中一些如下所述"Differentenzymerequirementsforthesynthesisofbiodiesel-.Novozym435andLipozymeTLIM"Hernandez-Martin,E等(2008)BioresourceTechnologyvol.99，p.277-286描述了在脂肪酸乙酯的產(chǎn)生中通過Novozym435、LipozymeTLIM和LipozymeRMIM轉(zhuǎn)化不同的植物油。Novozyme435的再使用表現(xiàn)為在25°C的7小時(shí)反應(yīng)中使用相對(duì)于底物50%w/w的酶加載量，其中將Novozyme435用氯仿洗滌并在每個(gè)反應(yīng)周期之間干燥。LipozymeTLIM的再使用同樣用10%酶、24h反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)周期之間的氯仿洗滌來進(jìn)行嘗試。該反應(yīng)中使用l(leq)WKOH/FA比例。然而，本文作者發(fā)現(xiàn)在第一個(gè)周期之后所述酶即僅具有10%的殘余活性。"Selectiveenzymaticsynthesisofloweracylglycerolsrichinpolyunsaturatedfattyacids，，Hernandez-Martin,E等(2008)Eur.J.LipidSci.Technol.Vol.110,p.325-333描述了在脂肪酸乙酯的生產(chǎn)中用Novozyme435轉(zhuǎn)化大豆油。Novozyme435的再使用表現(xiàn)為在25°C的1小時(shí)反應(yīng)中使用相對(duì)于底物50%w/w的酶加載量，其中將Novozyme435用氯仿或2_丙醇之一洗滌并隨后在每個(gè)反應(yīng)周期之間干燥?！癐mprovedenzymestabilityinlipase-catalysedsynthesisoffattyacidethylesterfromsoybeanoil，，Rodrigues，RC等(2008)Appl.Biochem.Biotechnol.Vol.152，p.394-404描述了在脂肪酸乙酯的生產(chǎn)中用LipozymeTLIM轉(zhuǎn)化大豆油。LipozymeTLIM的再使用表現(xiàn)為在相對(duì)于底物4%w/w的添加的水的存在下，在的12小時(shí)反應(yīng)中使用相對(duì)于底物25%w/w的酶加載量。將LipozymeTLIM在己烷、水、EtOH或丙醇中洗滌，并隨后在每個(gè)反應(yīng)周期之間在40°C干燥M小時(shí)。使用己烷洗滌時(shí)發(fā)現(xiàn)再使用率(reusability)最高。若沒有洗滌步驟，酶活性迅速衰減。KOH對(duì)油的比例為7.51，意指相對(duì)于脂肪酸為2.5eq0未對(duì)更高量的KOH測(cè)試再使用率。“ImmobilizedPseudomonascepacialipaseforbiodieselfuelproductionfromsoybeanoil，，Noureddini,H等(2005)BioresourceTechnologyvol.96,p769_777描述了在高量醇的存在下轉(zhuǎn)化大豆油以產(chǎn)生脂肪酸乙酯。該反應(yīng)由固定于疏水性溶膠-凝膠基質(zhì)中的洋蔥假單胞菌O3Seudom0nasc印acia)(PQ脂肪酶催化。固定化的PS脂肪酶的再使用表現(xiàn)為在0.3g相對(duì)于底物3%w/w添加的水存在下在1小時(shí)反應(yīng)中使用30%w/w的酶加載量。"Conversionofacidoilby-producedinvegetableoilrefiningtobiodieselfuelbyimmobilizedCandidaantarcticalipase"Watanabe,Y^(2007)JournalofMolecularCatalysisvol.44，p.99-105描述了在1-lOMeOHFA摩爾比的存在下使用固定于疏水載體材料之上的經(jīng)甘油激活的南極假絲酵母(Candidaantarctica)脂肪酶(Novozym435)從酸油產(chǎn)生FAME的兩步反應(yīng)。用于產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法目前是基于相對(duì)高的酶加載量，這對(duì)于工業(yè)目的是不理想的。此外，大多數(shù)應(yīng)用依賴于固定于疏水的支持材料上的酶(例如Novozym435)。疏水性聚合材料通常比無機(jī)親水性材料(例如二氧化硅)更加昂貴。目前在大多數(shù)方法中包含修飾如在每個(gè)反應(yīng)周期之間洗滌并干燥固定化的脂肪分解酶的步驟，此外，將多種量的水添加至反應(yīng)也包含于許多報(bào)道的方法。因此，仍有開發(fā)改進(jìn)的方法的需要，其中在脂肪酸乙酯的產(chǎn)生中，可再使用固定于低成本親水支持材料之上的脂肪分解酶。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明令人意想不到地發(fā)現(xiàn)在高量乙醇存在下固定于親水載體材料之上的脂肪分解酶可有效地再使用以供產(chǎn)生脂肪酸乙酯。在第一個(gè)方面本發(fā)明涉及產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法，包括a)將包含甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、游離脂肪酸或其任意組合的底物與至少一種固定化的脂肪分解酶反應(yīng)以提供反應(yīng)混合物，其中酶加載量相對(duì)于底物為30%w/w以下，而乙醇對(duì)脂肪酸的摩爾比例(EtOHFA)為至少3.O當(dāng)量；b)從所得的反應(yīng)混合物分離固定化的脂肪分解酶；和c)對(duì)固定化的脂肪分解酶不經(jīng)修飾直接進(jìn)行至少另一次反應(yīng)(atleastonefurtherreaction)0在第二個(gè)方面本發(fā)明涉及在通過將乙醇與包含甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、游離脂肪酸或其任意組合的底物反應(yīng)獲得的脂肪酸乙酯的產(chǎn)生中再使用至少一種固定化的脂肪分解酶，其中底物中乙醇對(duì)脂肪酸的摩爾比例(EtOHFA)為至少3.O當(dāng)量；相對(duì)于底物酶加載量為30%w/w以下；且在用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)之后該酶與所得的反應(yīng)混合物分離，并不經(jīng)修飾直接再使用于下一個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)。在第三個(gè)方面本發(fā)明涉及通過所述方法獲得的組合物，其中所述組合物包含至少兩種選自下組的組分脂肪酸乙酯；甘油三酯；甘油二酯；甘油一酯；甘油；和水。在第四個(gè)方面本發(fā)明涉及通過所述方法獲得的組合物作為燃料的用途。在第五個(gè)方面本發(fā)明涉及包含通過所述方法獲得的組合物的燃料。圖1顯示了再使用固定化的細(xì)毛嗜熱霉(Thermomyceslanuginosa)脂肪酶以供使用1-6當(dāng)量的乙醇(EtOH)合成脂肪酸乙酯。標(biāo)記表示為“周期數(shù)”，“eqitOH”。因此，"1,1"意指“第一個(gè)周期，1當(dāng)量EtOH",而“2，3”意指“第二個(gè)周期，3當(dāng)量EtOH，，。白/灰條指在4h反應(yīng)之后脂肪酸乙酯含量(％，w/V)，而黑條指24h反應(yīng)之后的脂肪酸乙酯含量。顯然1當(dāng)量和2當(dāng)量KOH在第二和之后的周期中導(dǎo)致非常少的脂肪酸乙酯形成。關(guān)于更多細(xì)節(jié)，請(qǐng)參考實(shí)施例1。定義生物柴油術(shù)語“生物柴油”在本文中定義為通過下述反應(yīng)獲得的短鏈醇的脂肪酸烷基酯甘油+FFA+醇一脂肪酸烷基酯(生物柴油)+甘油+水，其中短鏈醇為具有1至5個(gè)碳原子(C1-C5)的醇。脂肪分解酶術(shù)語“脂肪分解酶”在本文中定義為甘油三酯?；饷福珽C3.1.1.3，其催化反應(yīng)如水解、相互酯化、轉(zhuǎn)酯、酯化、醇解、酸解和氨解。底物術(shù)語“底物”在本文中定義為包含甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、游離脂肪酸或其任意組合的底物。發(fā)明詳述生物柴油代表了用于壓燃式(柴油)發(fā)動(dòng)機(jī)的有希望的代用燃料。生物柴油標(biāo)準(zhǔn)(DIN51606,EN14214和ASTMD6751)要求或間接地規(guī)定生物燃料應(yīng)為脂肪酸甲酯(FAME)。然而我們廣義地將術(shù)語生物柴油用于由下述反應(yīng)獲得的短鏈醇的脂肪酸烷基酯甘油+FFA+醇一脂肪酸烷基酯(生物柴油)+甘油+水。短鏈醇為具有1至5個(gè)碳原子(C1-C5)的醇。優(yōu)選的短鏈醇是乙醇。醇類的不穩(wěn)定作用固定化的脂肪分解酶在油中通常是非常熱穩(wěn)定的，而酶相互酯化的商用工藝通常在70°C進(jìn)行。然而，短鏈醇對(duì)穩(wěn)定性具有負(fù)面影響，并相應(yīng)地脂肪分解酶的活性和該不穩(wěn)定作用隨著溫度的增加而增加。醇類對(duì)脂肪分解酶的不穩(wěn)定作用似隨著醇分子量的增加而減少。幾個(gè)研究組注意到了醇在油中的溶解度與油的不穩(wěn)定作用之間的相關(guān)性。少數(shù)事例描述了高醇劑量的積極作用在酶非常穩(wěn)定(robust)，或當(dāng)使用不具有失活(inactivating)性質(zhì)的較大的醇的情況下，失活并不是問題。在該情況下高醇濃度可為優(yōu)勢(shì)，其驅(qū)動(dòng)平衡反應(yīng)至完全轉(zhuǎn)化。甘油三酯底物的完全轉(zhuǎn)化導(dǎo)致甘油作為副產(chǎn)物生成。已顯示甘油使固定化的酶失活，可能是通過物理阻斷底物對(duì)酶的接觸。認(rèn)為高醇濃度可能通過將甘油維持在溶液中而有助于避免甘油使固定化的酶失活。已顯示吸附于經(jīng)使用的二氧化硅顆粒上的甘油可通過乙醇處理繼以干燥來去除(“Near-quantitativeproductionoffattyacidalkylestersbylipase-catalyzedalcoholysisoffatsandoilswithadsorptionofglycerolbysilicagel，，Stevenson等(1994)EnzymeMicrob.Technol.,vol.16,p.478-484)。其中在大量過量的乙醇存在下將固定化的脂肪分解酶再使用于生物柴油的生產(chǎn)的方法迄今為止尚未成功或在工業(yè)上具有吸引力。因此，令人意想不到的是脂肪酸乙酯可在至少3.0當(dāng)量，即相對(duì)高的底物中乙醇對(duì)脂肪酸的摩爾比t0HFA)的存在下產(chǎn)生，如在本發(fā)明中公開并由實(shí)施例所闡述的。已經(jīng)反復(fù)地指出水的存在對(duì)于維持脂肪分解酶的活性是重要的，且絕大多數(shù)目前已知的方法要求將水添加至反應(yīng)。令人意想不到的是，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法可無需額外的水而實(shí)施。洗滌和干燥步驟常常包括在本領(lǐng)域中已知的以去除特別是被視為抑制脂肪分解酶的活性的甘油為目的的方法中。包括使用兩種不同溶劑，己烷或叔丁醇(t-BuOH)洗滌步驟令人驚訝地顯示與實(shí)施例2中所示未洗滌相比，當(dāng)使用2.Oeq.KOHFA的摩爾比例時(shí)在至少三個(gè)反應(yīng)周期之內(nèi)(表2)或當(dāng)使用3.kq.KOHFA的摩爾比例時(shí)在至少10個(gè)周期之內(nèi)(表幻洗滌并未改變酶活性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法，包括a)將包含甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、游離脂肪酸或其任意組合的底物與至少一種固定化的脂肪分解酶反應(yīng)以提供反應(yīng)混合物，其中酶加載量相對(duì)于底物為30%w/w以下，而乙醇對(duì)脂肪酸的摩爾比例^tOHFA)為至少3.0當(dāng)量；b)從所得的反應(yīng)混合物分離固定化的脂肪分解酶；和c)對(duì)固定化的脂肪分解酶不經(jīng)修飾直接進(jìn)行至少一次進(jìn)一步的反應(yīng)。脂肪分解酶大多數(shù)在有機(jī)合成中用作催化劑的脂肪分解酶是微生物和真菌來源的，且它們可方便地通過發(fā)酵和基本純化獲得。從多種來源提取的脂肪分解酶已成功地用于產(chǎn)生生物柴油。固定于疏水性丙烯酸樹脂上的南極假絲酵母B脂肪酶(Novozym435)已為最常用的用于產(chǎn)生生物柴油的酶。然而，取決于實(shí)驗(yàn)變量如底物、醇、水、溫度、PH、再使用等等，可利用不同的脂肪分解酶。在本申請(qǐng)中，通過兩種不同的脂肪分解酶細(xì)毛嗜熱霉脂肪酶(TTL)和南極假絲酵母B脂肪酶(CALB)分別使用乙醇(EtOH)和2-丙醇(iftOH)測(cè)試了脂肪酸烷基酯的產(chǎn)生。對(duì)于TLL，其結(jié)果示于實(shí)施例3和5，對(duì)于CALB，實(shí)施例6和7。這些酶的脂肪分解活性與之前報(bào)道的結(jié)果并不相同，即并不一致。然而，根據(jù)這些測(cè)試，一個(gè)共同的特征是顯然的，即當(dāng)使用底物中至少3當(dāng)量醇對(duì)脂肪酸的摩爾比例時(shí)，在10個(gè)反應(yīng)周期之內(nèi)脂肪酸烷基酯的高轉(zhuǎn)化。似乎CALB在2.0當(dāng)量的摩爾比例保持一定活性，但該活性在至少3.0當(dāng)量的摩爾比例時(shí)增加。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法，其中至少一種固定化的脂肪分解酶選自下組細(xì)毛嗜熱霉脂肪酶；南極假絲酵母A脂肪酶；南極假絲酵母B脂肪酶；Candidadeformans脂肪酶；解脂假絲酵母(Candidalipolytica)脂肪酶；近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)脂肪酶；皺落假絲酵母(Candidarugosa)脂肪酶；隱球菌屬菌種(Cryptococcusspp.)S-2脂肪酶；曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶；德氏根毛霉(Miizomucorfdelemar)脂肪酶；洋蔥(假單胞菌)伯克霍爾德氏菌(Burkholderia(Pseudomonas)cepacia)月旨肪Bl；沙門柏干酷假單胞菌(Pseudomonascamembertii)脂肪酶；螢光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)脂肪酶；白地霉(Geotrichiumcandidum)脂肪酶；Hyphozymasp.脂肪酶；產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)脂肪酶；及其變體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法，其中所述至少一種固定化的脂肪分解酶與選自下組的酶至少60%；至少70%；至少75%；至少80%；至少85%；至少88%；至少90%；至少92%；至少94%；至少95%；至少96%；至少97%；至少98%；或至少99%相同細(xì)毛嗜熱霉脂肪酶；南極假絲酵母A脂肪酶；南極假絲酵母B脂肪酶；Candidadeformans脂肪酶；解脂假絲酵母脂肪酶；近平滑假絲酵母脂肪酶；皺落假絲酵母脂肪酶；隱球菌屬菌種S-2脂肪酶；曼赫根毛霉脂肪酶；德氏根毛霉脂肪酶；洋蔥(假單胞菌)伯克霍爾德氏菌脂肪酶；沙門柏干酪假單胞菌脂肪酶；螢光假單胞菌脂肪酶；白地霉脂肪酶；Hyphozymasp.脂肪酶；產(chǎn)酸克雷伯氏菌脂肪酶。該特異性可基于氨基酸序列或核苷酸序列計(jì)算。兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核苷酸序列間的相關(guān)性由參數(shù)“同一性”描述。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度使用如于EMBOSS包(EMBOSS歐洲分子生物開放軟件組(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite),Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276-277；http://emboss,org)的Needle程序，優(yōu)選3.0.O或更晚版本中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)來確定。所使用的任選參數(shù)為缺口開放罰分(gapopenpenalty)為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。使用標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”的Needle的輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性并計(jì)算如下(相同的殘基X100)/(比對(duì)的長(zhǎng)度-比對(duì)中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如于EMBOSS包(EMBOSS歐洲分子生物開放軟件組(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，Rice等，2000，如上；http://emboss,org)的Needle程序，優(yōu)選3.0.O或更晚版本中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，如上)測(cè)定。所使用的任選參數(shù)為缺口開放罰分10，缺口延伸罰分0.5，和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。使用標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”的Needle的輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性并計(jì)算如下(相同的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對(duì)的長(zhǎng)度-比對(duì)中缺口的總數(shù))。脂肪分解酶加載量就本發(fā)明的目的而言，酶加載量表示為相對(duì)于底物，在反應(yīng)混合物中存在的固定化的脂肪分解酶(酶+支持材料)的重量/重量百分比(％W/V)。盡管一般而言增加量的脂肪分解酶減少轉(zhuǎn)化時(shí)間，從經(jīng)濟(jì)觀點(diǎn)在減少的酶加載量水平操作是合意的。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法，其中至少一種固定化脂肪分解酶加載量相對(duì)于底物為25.0%w/w以下；22.5%w/w以下；20.0%w/w以下；17.5%w/w以下；15.0%w/w以下；12.5%w/w以下；10.0%w/w以下；7.5%w/w以下；5.0%w/w以下；或2.5%w/w以下。脂肪分解酶的固定化由于對(duì)于人造黃油(margarine)和起酥油(shortenings)能夠進(jìn)行劃算的甘油三酯相互酯化(以修飾融化性質(zhì))的新技術(shù)開發(fā)，在油和脂肪加工中使用固定化的酶正在經(jīng)歷顯著的發(fā)展。固定化的酶的最基本的優(yōu)勢(shì)是其可從通過簡(jiǎn)單過濾的分批工藝中回收并再使用。此外，將固定化的酶填充于柱允許簡(jiǎn)單地實(shí)施連續(xù)工藝。固定化的酶通常還對(duì)催化劑的操作穩(wěn)定性(與游離酶相比)具有積極作用。其使得操作更加簡(jiǎn)單(與游離酶粉末相比)，且其允許在低水條件下的操作(與液體配制酶相比)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法，其中所述脂肪分解酶通過包埋于天然或合成基質(zhì)如溶膠-凝膠、藻酸鹽和角叉藻聚糖；通過交聯(lián)方法如在交聯(lián)的酶晶體(CLEC)和交聯(lián)的酶聚集物(CLEA)中；或通過沉淀于鹽晶體如包被蛋白的微晶體(PCMC)固定化于載體上。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法，其中所述載體是選自下組的親水載體由氧化鋁、氧化硅和硅酸鹽組成的多孔無機(jī)顆粒如多孔玻璃、沸石、硅藻土、膨潤土、蛭石、水滑石；和由糖聚合物組成的多孔有機(jī)顆粒如瓊脂糖或纖維素。眾所周知載體的特性可對(duì)固定化的酶的性質(zhì)具有非常顯著的作用。兩種通常應(yīng)用的商業(yè)酶Novozym435和LipozymeTLIM代表疏水載體(Novozym435)和親水載體(LipozymeTLIM)的實(shí)例。從成本觀點(diǎn)來看，親水載體通常比疏水聚合樹脂優(yōu)選，但其性質(zhì)可阻止在某些應(yīng)用中被利用。底物中乙醇對(duì)脂肪酸的摩爾比例^tOHFA)過量乙醇可將平衡反應(yīng)向完全轉(zhuǎn)化方向驅(qū)動(dòng)。就本發(fā)明而言，醇的量表示為當(dāng)量(eq.)，其為底物中存在的乙醇對(duì)脂肪酸的摩爾比例(EtOHFA)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法，其中底物中乙醇對(duì)脂肪酸的摩爾比例(EtOHFA)為至少3.5；4.O；4.5；5.O；5.5；6.O；6.5；7.O；7.5；8.O；8.5；9.O;9.5或10.O當(dāng)量。在短鏈醇如甲醇和乙醇的存在下蛋白質(zhì)一般而言是不穩(wěn)定的，且在與不溶性醇(其在油中作為滴狀物存在)接觸之后，脂肪分解酶的失活迅速發(fā)生。因此，通常推薦將醇的量維持在其油中的溶解度極限以下。這可通過連續(xù)或逐步添加醇來獲得。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法，其中連續(xù)或逐步添加乙取決于待用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)的乙醇的總量，在逐步添加中的步驟數(shù)可變化。因此，逐步添加可由至少2個(gè)步驟；至少3個(gè)步驟；至少4個(gè)步驟；至少5個(gè)步驟；至少6個(gè)步驟；至少7個(gè)步驟；至少8個(gè)步驟；至少9個(gè)步驟；或至少10個(gè)步驟組成。酶法生物柴油工藝設(shè)計(jì)工藝設(shè)置是非常重要的，因?yàn)槠浔仨毧紤]技術(shù)問題，如反應(yīng)/產(chǎn)物化合物的均質(zhì)性、醇的溶解性、酶的穩(wěn)定性、酶的回收等。須考慮幾種不同的工藝設(shè)計(jì)分批、連續(xù)攪拌釜反應(yīng)器和填充床反應(yīng)器。在下述段落中將簡(jiǎn)短地概述這些。分批工藝由于其簡(jiǎn)單的設(shè)置是用于實(shí)驗(yàn)室的通常工藝。該工藝可以從起始添加所有組分即大量添加(inbulk)，或以推薦的逐步添加醇來進(jìn)行操作。分批工藝可用于收集關(guān)于工藝的數(shù)據(jù)，例如酶的生產(chǎn)力。在大規(guī)模情況下該工藝設(shè)置的不利因素為所需的罐體積大，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)和該工藝并非連續(xù)的事實(shí)。須考慮的另一個(gè)非常重要的事實(shí)是隨著再使用次數(shù)增加酶活性的逐漸衰減。當(dāng)酶活性減少時(shí)，反應(yīng)時(shí)間必須相應(yīng)地增加以維持恒定程度的轉(zhuǎn)化。隨時(shí)間，設(shè)施的能力將減少并最終變得不可接受的低。此時(shí)必須替換酶。雖然如此，困難的決定是催化劑的能力和成本之間的妥協(xié)。連續(xù)攪拌釜反應(yīng)器是具有連續(xù)補(bǔ)料供應(yīng)和產(chǎn)物收回的容器。該設(shè)計(jì)需要串聯(lián)的多個(gè)罐以確保對(duì)于相同反應(yīng)時(shí)間相同程度的轉(zhuǎn)化，意指總的罐體積也會(huì)很大。此種系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于因?yàn)樗龉蘅删S持不同新舊程度(age)/活性的酶，設(shè)施的能力可更恒定。這也暗示可更有效地使用酶直至活性變得非常低。該設(shè)計(jì)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在罐之間引入分離步驟的可能性，從而消除生成的甘油。具有固定化的酶的填充床柱系統(tǒng)得到液體反應(yīng)物和固體催化劑之間充分限定的接觸時(shí)間。此外，使用該設(shè)置，在任何特定時(shí)間酶對(duì)底物的比例較高，且整個(gè)系統(tǒng)可設(shè)計(jì)得相對(duì)簡(jiǎn)潔。該技術(shù)的商業(yè)規(guī)模的先例已存在于油的酶法相互酯化。對(duì)于酶法生物柴油產(chǎn)生，以高于溶解度的濃度添加醇引起的酶失活問題可通過在每個(gè)柱之前的逐步添加來解決。以類似的方式，可在柱之間去除反應(yīng)中產(chǎn)生的甘油。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法，其中所述方法選自下組工藝設(shè)計(jì)分批、連續(xù)攪拌釜反應(yīng)器、填充床柱和膨脹床反應(yīng)器。酶法產(chǎn)生生物柴油的原料脂肪酸乙酯可從幾種類型的植物油制備。在全球植物油生產(chǎn)中，棕櫚油在產(chǎn)量上領(lǐng)先，且其與其他植物油相比具有最高的得率，因此經(jīng)濟(jì)上直觀地考慮棕櫚油作為用于生物柴油產(chǎn)生的有利的原材料。然而，也可辯論優(yōu)先使用非食用油如麻風(fēng)樹油(Jatrophaoil)，因?yàn)槭秤糜偷墓?yīng)并不多余?？勺鳛樵谥舅嵋阴ギa(chǎn)生中用作底物的植物油的原材料的植物實(shí)例為如巴西棕櫚(babassu)、琉璃苣(borage)、加拿大低酸油植物(canola)、椰子、玉米、棉、大麻、麻風(fēng)樹(jatropha)、卡蘭賈(karanj)、芥子、棕櫚、花生、菜籽、稻、大豆和向日葵。由于微藻(microalga)與植物相比更高的光合作用效率以及因此每單位面積可能更高的生產(chǎn)力，亦考慮將微藻作為生物柴油產(chǎn)生中的原料?；蛘?，可從非植物原料如動(dòng)物脂肪(如豬油、牛脂、乳脂和禽類)；或海生動(dòng)物油(marineoil)如鮪魚油和福氣魚/好吉魚(hoki)肝油來制備脂肪酸乙酯。估計(jì)60-90%的生物柴油成本來自原料油的成本，因此使用較廉價(jià)的廢油會(huì)對(duì)減少生物柴油成本有重大作用。此外，其被認(rèn)為是減少并再循環(huán)廢油中的重要步驟。新鮮植物油及其廢物不同在于其水分和游離脂肪酸含量。與用于柴油燃料合成的常規(guī)化學(xué)路線不同，生物催化路線允許對(duì)廣泛種類的原料油在酸性雜質(zhì)如游離脂肪酸的存在下進(jìn)行轉(zhuǎn)酯作用。因此，脂肪酸餾出物(來自除臭劑/脂肪酸汽提)，酸油(來自化學(xué)油精煉中的皂料裂解(soapstocksplitting)、廢油和經(jīng)使用的油可在生物柴油產(chǎn)生中用作原料。因此，原料可為粗級(jí)別的或經(jīng)進(jìn)一步加工的(經(jīng)精制的、經(jīng)漂白的和經(jīng)除臭的)。合適的油和脂肪可為純甘油三酯或甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯和游離脂肪酸的混合物，常見于廢的植物油和動(dòng)物脂肪。所述原料還可從植物油除臭餾出物獲得。在原料中脂肪酸的類型包括在植物和動(dòng)物油脂中以甘油酯的形式天然存在的那些。這包括油酸、亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸和月桂酸，僅舉數(shù)例。粗植物油中的次要組分通常為磷脂、游離脂肪酸和甘油偏酯即甘油一酯和甘油二酯。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法，其中底物選自下組巴西棕櫚油、琉璃苣油、加拿大低酸油、椰子油、玉米油、棉籽油、大麻油、麻風(fēng)樹油、卡蘭賈油、芥子油、棕櫚油、花生油、菜籽油、米糠油、大豆油和向日葵油、來自微藻的油、動(dòng)物脂肪、牛脂、豬油、乳脂、禽類、海生動(dòng)物油、鮪魚油、福氣魚/好吉魚肝油、脂肪酸餾出物、酸油、廢油、經(jīng)使用的油、甘油偏酯及其任意組合。在脂肪酸乙酯產(chǎn)生中再使用固定化的脂肪分解酶在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在通過將乙醇與包含甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、游離脂肪酸或其任意組合的底物反應(yīng)獲得的脂肪酸乙酯的產(chǎn)生中再使用至少一種固定于親水載體上的脂肪分解酶，其中底物中乙醇對(duì)脂肪酸的摩爾比例(EtOHFA)為至少3.0當(dāng)量；酶加載量相對(duì)于底物為30%w/w以下；且其中將用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)之后的酶從所得的反應(yīng)混合物分離，且不經(jīng)修飾直接再使用于下一步轉(zhuǎn)化反應(yīng)。修飾意指除了將固定化的酶從反應(yīng)混合物分離之外的任何處理或活性如活化、洗滌、干燥等。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在脂肪酸乙酯的產(chǎn)生中再使用至少一種固定化的脂肪分解酶，其中所述固定化的脂肪分解酶選自下組細(xì)毛嗜熱霉脂肪酶；南極假絲酵母A脂肪酶；南極假絲酵母B脂肪酶；Candidadeformans脂肪酶；解脂假絲酵母脂肪酶；近平滑假絲酵母脂肪酶；皺落假絲酵母脂肪酶；隱球菌屬菌種S-2脂肪酶；曼赫根毛霉脂肪酶；德氏根毛霉脂肪酶；洋蔥(假單胞菌)伯克霍爾德氏菌脂肪酶；沙門柏干酪假單胞菌脂肪酶；螢光假單胞菌脂肪酶；白地霉脂肪酶；Hyphozymasp.脂肪酶；產(chǎn)酸克雷伯氏菌脂肪酶；及其變體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在脂肪酸乙酯的產(chǎn)生中再使用至少一種固定化的脂肪分解酶，其中至少一種固定化的脂肪分解酶的加載量相對(duì)于底物為25.0%w/w以下；22.5%w/w以下；20.0%w/w以下；17.5%w/w以下；15.0%w/w以下；12.5%w/w以下；10.0%w/w以下；7.5%w/w以下；5.0%w/w以下；或2.5%w/w以下。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在脂肪酸乙酯產(chǎn)生中再使用至少一種固定化的脂肪分解酶，其中所述脂肪分解酶通過包埋于天然或合成基質(zhì)如溶膠-凝膠、藻酸鹽和角叉藻聚糖；通過交聯(lián)方法如交聯(lián)的酶晶體(CLEC)和交聯(lián)的酶聚集物(CLEA)；或通過沉淀于鹽晶體如包被蛋白的微晶體(PCMC)固定于載體上。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在脂肪酸乙酯產(chǎn)生中再使用至少一種固定化的脂肪分解酶，其中所述載體是選自下組的親水載體由氧化鋁、氧化硅和硅酸鹽組成的多孔無機(jī)顆粒如多孔玻璃、沸石、硅藻土、膨潤土、蛭石、水滑石；和由糖聚合物組成的多孔有機(jī)顆粒如瓊脂糖或纖維素。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在脂肪酸乙酯產(chǎn)生中再使用至少一種固定化的脂肪分解酶，其中底物中乙醇對(duì)脂肪酸的摩爾比例^tOHFA)為至少3.5；4.0；4.5；5.0；5.5；6.0；6.5；7.0；7.5；8.0；8.5；9.0;9·5或10.0當(dāng)量。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在脂肪酸乙酯產(chǎn)生中再使用至少一種固定化的脂肪分解酶，其中連續(xù)或逐步添加乙醇。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在脂肪酸乙酯產(chǎn)生中再使用至少一種固定化的脂肪分解酶，其中所述方法選自下組的工藝設(shè)計(jì)分批、連續(xù)攪拌釜反應(yīng)器、填充床柱和膨脹床反應(yīng)器。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在脂肪酸乙酯產(chǎn)生中再使用至少一種固定化的脂肪分解酶，其中底物選自下組巴西棕櫚油、琉璃苣油、加拿大低酸油、椰子油、玉米油、棉籽油、大麻油、麻風(fēng)樹油、卡蘭賈油、芥子油、棕櫚油、花生油、菜籽油、米糠油、大豆油和向日葵油、來自微藻的油、動(dòng)物脂肪、牛脂、豬油、乳脂、禽類、海生動(dòng)物油、鮪魚油、福氣魚/好吉魚肝油、脂肪酸餾出物、酸油、廢油、經(jīng)使用的油、甘油偏酯及其任意組合。組合物及其作為燃料的用途在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法獲得的組合物，其中所述組合物包含至少兩種選自下組的組分脂肪酸乙酯；甘油三酯；甘油二酯；甘油一酯；甘油和水。脂肪酸烷基酯用于廣泛范圍的產(chǎn)品并用作合成中間物。其一些工業(yè)應(yīng)用包括用作潤滑劑、增塑劑、防銹劑、鉆孔和切削油以及合成超級(jí)酰胺(superamides)和脂肪醇的起始材料。多種脂肪酸烷基酯可用于化妝品或用作色拉油。本發(fā)明的某些實(shí)施方案特別涉及燃料。短鏈醇的脂肪酸烷基酯是無毒的、可生物降解的，并由于其與那些基于石油的燃料在十六烷值、能量含量、粘性和相變中的類似性為基于石油的燃料的完全或部分的優(yōu)秀替代品。根據(jù)某些實(shí)施方案，本發(fā)明涉及由至少兩種下述組分的混合物組成的組合物FAEE；甘油三酯；甘油二酯；甘油一酯；甘油；和水。所述組合物可潛在地通過本領(lǐng)域已知方法如蒸餾(包括閃蒸、汽提和除臭)；相分離；提??；和干燥來精制或純化。此類精制的目的可為從組合物去除或回收一種或多種上述提及的組分。實(shí)例包括但不限于干燥以供去除水；相分離以供去除甘油和蒸餾以供分離FAEE。因此，可涵蓋粗反應(yīng)混合物(組合物)可無需進(jìn)一步精煉而施用，或通過一種或多種方法精煉。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法獲得的組合物作為燃料的用途。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法獲得的組合物作為燃料的用途，其中所述組合物經(jīng)精煉。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及燃料，其包含由產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法獲得的組合物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及燃料，其包含由產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法獲得的組合物，其中所述組合物經(jīng)精煉。本發(fā)明進(jìn)一步由下述實(shí)施例描述，其不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例用作緩沖液和底物的化學(xué)品為至少試劑級(jí)的商品。培養(yǎng)基和溶液經(jīng)精煉、漂白、除臭的大豆油(SBO)購自H0rkramSchulzFoodServiceA/S(Horning,Denmark)。乙醇為購自Sigma-Aldrich的絕對(duì)乙醇(99.8%ν/ν)。所有其他化學(xué)品購自Sigma-Aldrich并不經(jīng)進(jìn)一步純化而使用。NMR分析在VarianMercuryVX_400MHz系統(tǒng)上在30°C使用⑶C13溶劑進(jìn)行。固定于氧化硅上的細(xì)毛嗜熱霉脂肪酶(TLL)和固定于氧化硅上的南極假絲酵母B脂肪酶(CALB)從NovozymesA/S，Bagsvaerd,Denmark獲得。實(shí)施例1在使用1-6當(dāng)量EtOH的FAEE分批合成中再使用固定化的細(xì)毛嗜熱霉脂肪酶我們?cè)谟晒潭ㄓ谘趸枭系募?xì)毛嗜熱霉脂肪酶(TLL)(NovozymesA/S，Bagsvaerd,Denmark)催化的反應(yīng)中研究了使用大豆油(SBO)和乙醇(EtOH)的脂肪酸乙酯合成。FAEE反應(yīng)是在IOOmL螺旋蓋錐形瓶中進(jìn)行的。將2OmLSBO和Ig固定化的酶添加至每個(gè)燒瓶。添加的KOH的量相對(duì)于油中脂肪酸的總量(即[EtOH][FA])從1至6摩爾當(dāng)量變動(dòng)。將KOH以三個(gè)相等的部分在t=Oh，t=池和t=4h逐步添加。為了起始反應(yīng)，添加第一部分的Κ0Η，并將燒瓶閉合并置于35°C的水浴定軌振蕩器中。在轉(zhuǎn)化至FAEE之后，進(jìn)行屯NMR分析。因此，將20微升的等分試樣從反應(yīng)混合物中取出以供在4h和在24h之后進(jìn)行分析，此時(shí)反應(yīng)處于平衡。至FAEE的轉(zhuǎn)化如"Quantificationofsoybeanoilethanolysiswith1HNMR"Neto等0004)J.Am.OilChem.Soc.Vol.81，p.1111-1114中所述進(jìn)行計(jì)算。在24h之后，所有的反應(yīng)通過從固定化的酶傾去反應(yīng)混合物來終止。另一個(gè)反應(yīng)周期通過將新的SBO和KOH添加至固定化的酶來立即起始。表1:4h/24h之后FAEE的含量(％w/w)權(quán)利要求1.一種產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法，包括a)將包含甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、游離脂肪酸或其任意組合的底物與至少一種固定化的脂肪分解酶反應(yīng)以提供反應(yīng)混合物，其中酶加載量相對(duì)于底物為30%w/w以下，而乙醇對(duì)脂肪酸的摩爾比例(EtOHFA)為至少3.0當(dāng)量；b)從所得的反應(yīng)混合物分離固定化的脂肪分解酶；和c)對(duì)固定化的脂肪分解酶不經(jīng)修飾直接進(jìn)行至少另一次反應(yīng)。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述固定化的脂肪分解酶選自下組細(xì)毛嗜熱霉(Thermomyceslanuginose)脂肪酶；南極假絲酵母(CandidaAntarctica)A脂肪酶；南極假絲酵母B脂肪酶；Candidadeformans脂肪酶；解脂假絲酵母(Candidalipolytica)脂肪酶；近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)脂肪酶；皺落假絲酵母(Candidarugosa)脂肪酶；隱球菌屬菌種(Cryptococcusspp.)S-2脂肪酶；曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶；德氏根毛霉(Miizomucordelemar)脂肪酶；洋蔥(假單胞菌)伯克霍爾德氏菌(Burkholderia(Pseudomonas)cepacia)月旨肪Bl；沙門柏干酷假單胞菌(Pseudomonascamembertii)脂肪酶；螢光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)脂肪酶；白地霉(Geotrichiumcandidum)脂肪酶；Hyphozymasp.脂肪酶；產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)脂肪酶；及其變體。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述至少一種固定化脂肪分解酶加載量相對(duì)于底物為25.O%w/w以下；22.5%w/w以下；20.0%w/w以下；17.5%w/w以下；15.0%w/w以下；12.5%w/w以下；10.0%w/w以下；7.5%w/w以下；5.0%w/w以下；或2.5%w/w以下。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述脂肪分解酶通過包埋于天然或合成基質(zhì)如溶膠-凝膠、藻酸鹽和角叉藻聚糖；通過交聯(lián)方法如交聯(lián)的酶晶體(CLEC)和交聯(lián)的酶聚集物(CLEA)；或通過沉淀于鹽晶體如包被蛋白的微晶體(PCMC)固定化于載體上。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述載體是選自下組的親水載體由氧化鋁、氧化硅和硅酸鹽組成的多孔無機(jī)顆粒如多孔玻璃、沸石、硅藻土、膨潤土、蛭石、水滑石；和由糖聚合物組成的多孔有機(jī)顆粒如瓊脂糖或纖維素。6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中底物中乙醇對(duì)脂肪酸的摩爾比例^tOHFA)為至少3.5；4.O；4.5；5.O；5.5；6.O；6.5；7.O；7.5；8.O；8.5；9.O;9·5或10.O當(dāng)量。7.權(quán)利要求6的方法，其中連續(xù)或逐步添加乙醇。8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述方法選自下組的工藝設(shè)計(jì)分批、連續(xù)攪拌釜反應(yīng)器、填充床柱和膨脹床柱反應(yīng)器。9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述底物選自下組巴西棕櫚油、琉璃苣油、加拿大低酸油、椰子油、玉米油、棉籽油、大麻油、麻風(fēng)樹油、卡蘭賈油、芥子油、棕櫚油、花生油、菜籽油、米糠油、大豆油和向日葵油、來自微藻的油、動(dòng)物脂肪、牛脂、豬油、乳脂、禽類、海生動(dòng)物油、鮪魚油、福氣魚/好吉魚肝油、脂肪酸餾出物、酸油、廢油、經(jīng)使用的油、甘油偏酯及其任意組合。10.在通過將乙醇與包含甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、游離脂肪酸或其任意組合的底物反應(yīng)獲得的脂肪酸乙酯的產(chǎn)生中再使用至少一種固定于親水載體上的脂肪分解酶，其中底物中乙醇對(duì)脂肪酸的摩爾比例^tOHFA)為至少3.O當(dāng)量；酶加載量相對(duì)于底物為30%w/w以下；且其中將用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)之后的酶從所得的反應(yīng)混合物分離，且不經(jīng)修飾直接再使用于下一步轉(zhuǎn)化反應(yīng)。11.通過權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法獲得的組合物，其中所述組合物包含至少兩種選自下組的成分脂肪酸乙酯；甘油三酯；甘油二酯；甘油一酯；甘油和水。12.權(quán)利要求11的組合物作為燃料的用途。13.權(quán)利要求12的用途，其中所述組合物經(jīng)精煉。14.一種燃料，包含由權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法獲得的組合物。15.權(quán)利要求14的燃料，其中所述組合物經(jīng)精煉。全文摘要本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生脂肪酸乙酯的方法，包括a)將包含甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、游離脂肪酸或其任意組合的底物與至少一種固定化的脂肪分解酶反應(yīng)以提供反應(yīng)混合物，其中酶加載量相對(duì)于底物為30％w/w以下，而乙醇對(duì)脂肪酸的摩爾比例(EtOH∶FA)為至少3.0當(dāng)量；b)從所得的反應(yīng)混合物分離固定化的脂肪分解酶；和c)對(duì)固定化的脂肪分解酶不經(jīng)修飾直接進(jìn)行至少另一次反應(yīng)。文檔編號(hào)C12P7/64GK102272317SQ200980153070公開日2011年12月7日申請(qǐng)日期2009年10月29日優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日發(fā)明者徐元,杰斯珀.布拉斯克,珀.M.尼爾森申請(qǐng)人:諾維信公司