包含葡萄糖啟動(dòng)子的載體、宿主菌以及重組牛源胰蛋白酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種在畢赤酵母中通過基因重組的手段異源表達(dá)牛源胰蛋白酶原基因的方法，該重組牛胰蛋白酶原通過采用新型啟動(dòng)子在畢赤酵母中表達(dá)并分泌到培養(yǎng)基中，酶原通過自激活、腸激酶或胰蛋白酶等處理可制備活性牛胰蛋白酶，由此制備的活性牛胰蛋白酶可用于生產(chǎn)重組人胰島素及人胰島素類似物。此方法可避免組成型啟動(dòng)子三磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子醇氧化酶(AOX1)啟動(dòng)子的缺點(diǎn)。
【專利說明】包含葡萄糖啟動(dòng)子的載體、宿主菌以及重組牛源胰蛋白酶 的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組表達(dá)牛源胰蛋白酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。具體 地，涉及一種采用新型啟動(dòng)子啟動(dòng)牛源胰蛋白酶表達(dá)的基因工程菌的構(gòu)建方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 胰蛋白酶（TRYPSIN，EC 3. 4. 21. 4)在脊椎動(dòng)物中，作為消化酶而起作用。胰蛋白 酶是由胰腺分泌的一種內(nèi)肽酶，最初分泌物為胰蛋白酶原，受腸激酶或胰蛋白酶的限制分 解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內(nèi)切酶。主要作用于精氨酸或賴氨酸羧基端的肽鍵。它不僅起 消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活 化作用。是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。 其中牛胰臟來源的胰蛋白酶氨基酸殘基223個(gè)，分子量為23. 3kDa，活性部位的絲氨酸殘基 是不可缺少的絲氨酸蛋白酶。
[0003] 胰蛋白酶在臨床上用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷、瘺管等所產(chǎn)生的 局部水腫、血腫及膿腫等。噴霧吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治療毒蛇咬傷。還常用于 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)前對(duì)組織的處理。在基因工程領(lǐng)域，胰蛋白酶也獲得了越來越廣泛的應(yīng)用，特 別在重組人胰島素及人胰島素類似物的生產(chǎn)過程中，胰蛋白酶為不可或缺的酶，其比活性 的高低及穩(wěn)定性是影響胰島素原活化收率的一個(gè)至關(guān)重要的參數(shù)。牛源胰蛋白酶作為切割 第三代胰島素的有效工具酶被廣泛研究。
[0004] 目前制備胰蛋白酶的方法主要有兩類：一是提取自動(dòng)物如豬、牛的胰臟，因其方法 相對(duì)簡(jiǎn)單，被廣泛采用，但是該方法因不能完全除去其他蛋白質(zhì)，且產(chǎn)品中的動(dòng)物源病毒如 口蹄疫病毒、瘋牛病病毒等不能完全除去，因此其應(yīng)用存在一定的局限性及風(fēng)險(xiǎn)性；二是生 產(chǎn)重組胰蛋白酶，多以豬源性胰蛋白酶為多，牛源性幾乎沒有，僅見美國禮來和江蘇萬邦以 大腸桿菌表達(dá)的包涵體復(fù)性的牛胰蛋白酶和印度拜康以畢赤酵母發(fā)酵的雜合牛胰蛋白酶 的專利。
[0005] 本方法以酵母為宿主制備牛源胰蛋白酶，優(yōu)勢(shì)在于：酵母的真核表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生 的胰蛋白酶結(jié)構(gòu)正確，產(chǎn)量較高，且是以分泌表達(dá)的方式存在于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的成分有 利于胰蛋白酶的穩(wěn)定性，且有利于純化；本方法采用新型啟動(dòng)子通過加入葡萄糖誘導(dǎo)牛源 胰蛋白酶的表達(dá)，由于胰蛋白酶的表達(dá)具有毒性，此方法避免了組成型啟動(dòng)子三磷酸甘油 醛脫氫酶（GAP)啟動(dòng)子不需要誘導(dǎo)就可直接表達(dá)對(duì)細(xì)胞的傷害作用，也避免了醇氧化酶啟 動(dòng)子（A0X1)誘導(dǎo)需要甲醇，甲醇易燃易爆及對(duì)健康有害的缺點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為克服現(xiàn)有技術(shù)表達(dá)表達(dá)牛源胰蛋白酶所用的GAP啟動(dòng)子和A0X1啟動(dòng)子的缺陷， 本發(fā)明涉及一種表達(dá)牛源胰蛋白酶的新型啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子為葡萄糖啟動(dòng)子。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供一種酵母表達(dá)載體，所述酵母表達(dá)載體包括啟動(dòng)子及目 的基因，所述啟動(dòng)子為葡萄糖啟動(dòng)子，所述目的基因?yàn)榫幋a牛胰蛋白酶的核苷酸序列，所述 葡萄糖啟動(dòng)子與所述目的基因構(gòu)成一個(gè)表達(dá)盒，所述的表達(dá)盒可以通過體外構(gòu)建或抗生素 濃度及遺傳霉素濃度篩選多拷貝。
[0008] 本發(fā)明中，所述葡糖糖啟動(dòng)子，可以是選自PG1或PG6葡萄糖啟動(dòng)子，優(yōu)選為PG6 葡萄糖啟動(dòng)子，所述PG6葡萄糖啟動(dòng)子具有SEQ ID NO. 1所述的部分或全部核苷酸序列，所 述編碼牛胰蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示，其編碼的牛源胰蛋白酶的氨基酸序 列如SEQ ID N0. 3所示。
[0009] 為了在后續(xù)純化牛源胰蛋白酶是更為簡(jiǎn)化，本發(fā)明中，在所述編碼牛胰蛋白酶的 核苷酸序列的C端加入6個(gè)組氨酸作為純化標(biāo)簽。
[0010] 本發(fā)明中，所述酵母表達(dá)載體為能夠用以表達(dá)外源蛋白的穿梭載體，這些能夠用 以表達(dá)外源蛋白的穿梭載體均含有表達(dá)外源蛋白所必需的元件，優(yōu)選以pPIC9K、pPIC3. 5K、 pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZ a C、pPICZA、pPICZB、pPICZC 或 pA0815 為基礎(chǔ)改造的載體，所 述改造的酵母表達(dá)載體包含所述葡萄糖啟動(dòng)子和編碼牛胰蛋白酶的核苷酸序列。
[0011] 進(jìn)一步地，所述酵母表達(dá)載體為具有篩選標(biāo)記的酵母表達(dá)載體，優(yōu)選地，所述酵母 表達(dá)載體的篩選標(biāo)記為zeocin、geneticin或his。
[0012] 本發(fā)明的另一目的，在于提供一種含有本發(fā)明所述酵母表達(dá)載體的宿主菌，其中 所述宿主為酵母菌，優(yōu)選畢赤酵母，更優(yōu)選為畢赤酵母GS115。含有本發(fā)明所述表達(dá)載體的 宿主菌，其可以是至少含有一種改造的酵母表達(dá)載體，如在一個(gè)宿主菌中，可以是只包括含 有一種篩選標(biāo)記并含有編碼牛源胰蛋白酶的基因，此時(shí)的宿主菌，為含有一種改造的酵母 表達(dá)載體；或者，在所述宿主菌中，也可以是包括兩種篩選標(biāo)記并含有編碼牛源胰蛋白酶的 基因，此時(shí)的宿主菌，為含有兩種改造的酵母表達(dá)載體。
[0013] 本發(fā)明的還一目的，在于提供一種制備重組牛胰蛋白酶的方法，所述方法包括： (1)以葡萄糖作為唯一碳源，誘導(dǎo)本發(fā)明用以所述宿主菌表達(dá)C端帶有組氨酸標(biāo)簽的牛胰 蛋白酶原；（2)通過自激活、腸激酶或胰蛋白酶處理上述牛胰蛋白酶原，生成牛胰蛋白酶； (3)以鎳柱親和一步純化法純化所得牛胰蛋白酶，純化中洗脫液通過梯度為20mM至250mM 的咪唑溶液洗脫目的蛋白。
[0014] 具體地，以酵母作為宿主并采用葡萄糖啟動(dòng)子制備重組牛胰蛋白酶的方法，該方 法包括：
[0015] 1、提供編碼葡萄糖啟動(dòng)子的核苷酸序列；
[0016] 2、提供編碼牛胰蛋白酶原的核苷酸序列；
[0017] 3、將上述啟動(dòng)子和目的基因構(gòu)建成表達(dá)盒，代替其他啟動(dòng)子表達(dá)盒克隆到不同篩 選標(biāo)記的酵母表達(dá)載體中；
[0018] 4、將上述載體轉(zhuǎn)化至同一酵母宿主；
[0019] 5、誘導(dǎo)上述酵母宿主表達(dá)C端帶有組氨酸標(biāo)簽（His tag)的牛胰蛋白酶原；
[0020] 6、通過自激活、腸激酶或胰蛋白酶處理上述牛胰蛋白酶原，生成牛胰蛋白酶；
[0021] 7、純化上述牛胰蛋白酶。
[0022] 優(yōu)選地，步驟1中所述的葡萄糖啟動(dòng)子的序列來源于畢赤酵母菌；
[0023] 步驟2中所述編碼牛胰蛋白酶原的核苷酸序列可以根據(jù)所用宿主的密碼子偏好 性來確定，以增加宿主的表達(dá)效率。該方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的技術(shù)，具體地密碼子 優(yōu)化由基因合成公司確定（本專利中核苷酸序列由金唯智公司按畢赤酵母密碼子偏好優(yōu) 化并合成）。
[0024] 步驟3中的所述酵母表達(dá)載體框架可以為任意一種具有篩選標(biāo)記的酵母表達(dá)載 體框架，優(yōu)選地，所述酵母表達(dá)載體的篩選標(biāo)記為zeocin、geneticin、his等。
[0025] 步驟4中的所述酵母宿主作為一種真核表達(dá)系統(tǒng)，能夠直接表達(dá)構(gòu)象正確的目的 蛋白，無需后續(xù)的變性和復(fù)性過程。因此本發(fā)明的方法對(duì)酵母宿主的種類沒有任何限制，優(yōu) 選的酵母菌株可為漢遜酵母、畢赤酵母、假絲酵母、光滑球擬酵母等，更優(yōu)選的酵母菌株為 畢赤酵母。
[0026] 步驟5中的誘導(dǎo)酵母宿主表達(dá)蛋白的方法采用葡萄糖作為唯一碳源誘導(dǎo)目的蛋 白的表達(dá)。優(yōu)選地，葡萄糖的誘導(dǎo)終濃度達(dá)到〇. 002g_10g/L，更優(yōu)選的，葡萄糖的誘導(dǎo)終濃 度達(dá)到lg/L。
[0027] 步驟6中的自激活、腸激酶或胰蛋白酶切方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，
[0028] 步驟7中的純化帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的技術(shù)和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公 知的。本發(fā)明的純化方法優(yōu)選采用鎳柱親和一步純化法進(jìn)行，并通過梯度為20mM至250mM 的咪唑溶液來洗脫目的蛋白。
[0029] 步驟6中的所述酶切和步驟7中的所述純化過程可以順序進(jìn)行，也可以同時(shí)進(jìn)行。
[0030] 本發(fā)明制備牛胰蛋白酶的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0031] 1.采用新型啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因牛源胰蛋白酶的表達(dá)，避免組成型啟動(dòng)子不需要 誘導(dǎo)就可表達(dá)牛源胰蛋白酶進(jìn)而對(duì)細(xì)胞具有毒性和醇氧化酶啟動(dòng)子利用甲醇誘導(dǎo)存在易 燃易爆并對(duì)健康有害的缺點(diǎn)。
[0032] 2、在酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行重組表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物牛胰蛋白酶原無需經(jīng)過變性和 復(fù)性，在直接酶切去除前肽后即可得到有活性的牛胰蛋白酶。
[0033] 3、表達(dá)生成C端帶有組氨酸標(biāo)簽（His tag)的牛胰蛋白酶原，使得在后續(xù)的酶切 和親和純化過程中，能夠使純化產(chǎn)物（牛胰蛋白酶）保留在洗脫液中，純化產(chǎn)物體積小，不 需后續(xù)濃縮步驟。
[0034] 4.純化簡(jiǎn)單，利用his標(biāo)簽一步純化即可得到產(chǎn)品。
[0035] 5.如根據(jù)酵母偏好密碼子提供編碼牛胰蛋白酶原的核苷酸序列，還可以進(jìn)一步提 高表達(dá)量。
[0036] 6.如在誘導(dǎo)表達(dá)過程中使葡萄糖的終濃度達(dá)到lg/L，能夠更高效的表達(dá)牛胰蛋 白酶原。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1 :重組BT的Western Blot檢測(cè)圖，圖中A泳道為牛胰蛋白酶活化后純化 SDS-PAGE，B泳道為培養(yǎng)液上清牛胰蛋白酶原純化，經(jīng)活化后牛胰蛋白酶分子量明顯小于酶 原。
[0038] 圖2 :重組BT的SDS-PAGE電泳檢測(cè)圖，A泳道為20度誘導(dǎo)分泌上清，B泳道為28 度誘導(dǎo)分泌上清，從WB圖可以看出20度誘導(dǎo)較28度誘導(dǎo)可以獲得更多的目標(biāo)產(chǎn)物。

【具體實(shí)施方式】
[0039] 材料:
[0040] 菌株和質(zhì)粒：克隆菌種Escherichia coli (T0P10)是基因工程常用菌種；巴斯德 畢赤酵母（Pichia pastoris)GS-115、KM-71、KM-71H、X-33、SMD-1168、SMD-1168-H ;質(zhì)粒 pPIC9K、pPIC3. 5K、pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZ a C、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pA0815 購于 invitrogen 公司。
[0041] 酶和試劑：
[0042] 實(shí)施例中涉及分子生物學(xué)操作所用的限制性內(nèi)切酶均購于NEB公司，所用的基因 擴(kuò)增酶購自北京全式金公司，連接酶購自寶生物公司，相應(yīng)的操作步驟完全按照相關(guān)的產(chǎn) 品說明書進(jìn)行。
[0043] 瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司、酵母DNA提取試劑盒購 自北京天根公司，相應(yīng)的操作步驟完全按照相關(guān)的產(chǎn)品說明書進(jìn)行。
[0044] 實(shí)施例中所涉及的編碼牛胰蛋白酶原的核苷酸序列的合成、引物的合成和DNA的 測(cè)序由金唯智公司完成。
[0045] TAME 購于 sigma 公司。
[0046] Zeocin 購于 invitrogen 公司。
[0047] Anti-trypsin (Rabbit)購自 Abeam 公司。
[0048] Donkey anti Rabbit二抗購自北京博奧森公司
[0049] 培養(yǎng)基：
[0050] LB、YPD、MD、YPDS、BMGY、BMMY
[0051] 抗性培養(yǎng)基為相應(yīng)培養(yǎng)基加相應(yīng)抗生素或遺傳霉素，如：Ampicillin、Zeocin、 G418。
[0052] 以上培養(yǎng)基是基因工程領(lǐng)域常用培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基的配方可參見分子克隆第三版 下冊(cè)附錄2以及invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊(cè)（Multi-Copy Pichia Expression Kit)第 64 頁-第 70 頁；及 pPICZ a A、B and C 第 17-第 18 頁。
[0053] 方法:
[0054] 聚合酶鏈反應(yīng)，PCR產(chǎn)物純化，基因和質(zhì)粒的酶切、回收、連接和轉(zhuǎn)化，以及大 腸桿菌轉(zhuǎn)化子的篩選，鑒定，這些基因工程常規(guī)操作方法，可參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh EF, Maniatis T. MolecularCloning ；A Laboiatory Manual 2nd ed.NY:Cold Spring Harbor Laboratory Piess, 1989, pp. 16-340。重組酵母表達(dá)載體質(zhì)粒的線性化，酵母轉(zhuǎn) 化，轉(zhuǎn)化子的篩選、誘導(dǎo)表達(dá)以及表達(dá)鑒定，可參見invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊(cè) (Multi-Copy Pichia Expression Kit)第 32 頁-第 63 頁。及pPICZ aA、B and C第 9-第 14頁。
[0055] 實(shí)施例1巴斯德畢赤酵母基因組的提取及PG6啟動(dòng)子的擴(kuò)增
[0056] 1.將Pichia pastoris X33劃線到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)2天后挑單菌落 接種到Y(jié)ro液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)1天后，按天根公司酵母基因組試劑盒說明書提取基因組。
[0057] 2.以步驟1中提取的基因組為模板，以設(shè)計(jì)的兩條引物為上下游引物，擴(kuò)增PG6啟 動(dòng)子。
[0058] PG6-F ：CGAAGATCTAGACCAGCAGTTTAACTACG(劃線處為 BglII 限制性內(nèi)切酶）
[0059] PG6-R :CCTGCCTTCGAACTTTTCTTTGGGCAAGGAAA (劃線處為 BstBI 限制性內(nèi)切酶）
[0060] PCR反應(yīng)體系：
[0061]

【權(quán)利要求】
1. 一種酵母表達(dá)載體，所述酵母表達(dá)載體包括啟動(dòng)子及目的基因，所述啟動(dòng)子為葡萄 糖啟動(dòng)子，所述目的基因?yàn)榫幋a牛胰蛋白酶的核苷酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述啟動(dòng)子與所述目的基因構(gòu)成一個(gè)表達(dá) 盒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酵母表達(dá)載體，其中所述葡萄糖啟動(dòng)子為PG6啟動(dòng)子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的酵母表達(dá)載體，其中所述PG6啟動(dòng)子的核苷酸序列為SEQ ID No. 1的部分或全部核苷酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酵母表達(dá)載體，所述編碼牛胰蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的酵母表達(dá)載體，其中所述編碼牛胰蛋白酶的核苷酸序列進(jìn)一 步在C端加入6個(gè)組氨酸作為純化標(biāo)簽。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的酵母表達(dá)載體，其中所述酵母表達(dá)載體 為能夠用以表達(dá)外源蛋白的穿梭載體，這些酵母表達(dá)載體均含有表達(dá)外源蛋白所必需的元 件，優(yōu)選以 PPIC9K、pPIC3. 5K、pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZ a C、pPICZA、pPICZB、pPICZC 或 pA0815為基礎(chǔ)改造的載體，所述改造的酵母表達(dá)載體包含所述葡萄糖啟動(dòng)子和編碼牛胰蛋 白酶的核苷酸序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述酵母表達(dá)載體，所述酵母表達(dá)載體為具有篩選標(biāo)記的酵母表達(dá) 載體，優(yōu)選地，所述酵母表達(dá)載體的篩選標(biāo)記為zeocin、geneticin或his。
9. 含有權(quán)利要求1至8中任一權(quán)利要求所述的宿主菌。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主菌，其中所述宿主為酵母菌，優(yōu)選畢赤酵母，更優(yōu)選為 畢赤酵母GS115,所述宿主包含至少一種所述表達(dá)載體。
11. 制備重組牛胰蛋白酶的方法，所述方法包括：（1)以葡萄糖作為唯一碳源，誘導(dǎo)權(quán) 利要求10所述宿主菌表達(dá)C端帶有組氨酸標(biāo)簽的牛胰蛋白酶原；（2)通過自激活、腸激酶 或胰蛋白酶處理上述牛胰蛋白酶原，生成牛胰蛋白酶；（3)以鎳柱親和一步純化法純化所 得牛胰蛋白酶，純化中洗脫液通過梯度為20mM至250mM的咪唑溶液洗脫目的蛋白。
12. 權(quán)利要求11所述方法，所述的葡萄糖終濃度為0. 002g-10g/L，優(yōu)選的為lg/L ;誘 導(dǎo)溫度<30°C，優(yōu)選的為20°C。
13. 權(quán)利要求11所述方法，步驟（2)的酶切和步驟（3)的純化過程可以順序進(jìn)行，也可 以同時(shí)進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】C12R1/84GK104195165SQ201410440706
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】王曉霞, 彭毅 申請(qǐng)人:北京愛必信生物技術(shù)有限公司