一種刺桂愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種刺桂愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，包括外植體的消毒、愈傷組織的誘導、愈傷組織的增殖、懸浮細胞的生長及調(diào)控。本發(fā)明的刺桂組培方法操作簡單，細胞增殖率高，克服刺桂生長速度慢、自然繁殖率低等缺點，可以短期內(nèi)獲得大量的刺桂細胞，有助于刺桂藥用成分的有效開發(fā)。
【專利說明】 一種刺桂愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組培條件下刺桂懸浮細胞的培養(yǎng)，屬于植物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]刺桂，Osnmnthus灌木,木犀科,又名柊樹,園林應用主要是觀葉。分布于南部暖帶落葉闊葉林區(qū)，北亞熱帶落葉、常綠闊葉混交林區(qū)，中亞熱帶常綠、落葉闊葉林區(qū)，南亞熱帶常綠闊葉林區(qū)。弱陽性，喜溫暖濕潤氣候，稍耐寒，忌澇地、堿地。對土壤要求低于其他桂花，在排水良好、濕潤肥沃的土壤中生長旺盛。因其適應性強，適合制作盆景。該物種為中國植物圖譜數(shù)據(jù)庫收錄的有毒植物，其毒性為葉有毒，其次是殼斗。牛、馬、羊和家兔等長期大量采食后會引起中毒。其藥用價值:性味:種子:苦、澀、平；樹皮:苦；葉:甘、苦、平。效用:種子:澀腸止痢。治小兒拘僂?。粯淦?治惡瘡，瘰癧，痢疾，腸風下血；葉:治吐血,衄血,血痢,血痔,淋癥。樹皮:治惡瘡,瘰疬,痢疾,腸風下血；葉:治吐血,衄血,血痢，血痔，淋癥。刺桂多以嫁接法繁殖。砧木選用小葉女貞春季進行靠接或切接，靠嫁接產(chǎn)量受限制，自身生長較慢，利用組培技術(shù)可以克服這一缺點，使刺桂資源可以得到有效利用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供刺桂細胞懸浮培養(yǎng)的快速繁殖方法，獲得生長良好，生長速度快的懸浮細胞，可以短期內(nèi)大規(guī)模的提供制藥原料。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用下列技術(shù)方案:
取刺桂葉片先用洗衣粉浸泡三分鐘，然后用三層紗布包裹，流水沖洗半個小時。浙水，在超凈工作臺上用0.1%升汞滅菌12min，用無菌水沖洗4_5次，切成約Icm2的小塊，每瓶接種四塊，觀察并記錄葉片愈傷組織的生長情況，7d后統(tǒng)計污染率、成活率，消毒處理過的刺桂幼嫩種胚和葉片切碎，以MS為基本培養(yǎng)基，添加2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH調(diào)至5.8，每瓶內(nèi)盛30ml固體培養(yǎng)基。誘導出來的愈傷組織接入改良DKW、MS、DY等3種培養(yǎng)基進行增殖試驗，添加2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH調(diào)到5.8，每個處理接種10瓶，每瓶接3塊愈傷組織，重復3次，增殖出來的愈傷組織進行懸浮細胞培養(yǎng)，接入改良MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的稀土 (硝酸鑭)，濃度為10mg/L，附加3mg/L6-BA+0.4mg/LNAA, pH5.8，每個處理接種10瓶，每瓶接3塊愈傷組織，重復3次，接種后分別在第10d、20d、30d測愈傷組織生長量，統(tǒng)計鮮重增量和增長率，10ml三角瓶接種30ml液體，接種后置于搖床水平振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為100r/min，溫度26V。
[0005]采用本發(fā)明制備的刺桂懸浮細胞，生長速度快，產(chǎn)量高，操作簡單，能耗小。
[0006]下面將結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明要求保護的范圍并不局限于下列實施方式。

【具體實施方式】
[0007]實施例1 取刺桂葉片先用洗衣粉浸泡三分鐘，然后用三層紗布包裹，流水沖洗半個小時。浙水，在超凈工作臺上用0.1%升汞滅菌12min，用無菌水沖洗4_5次，切成約Icm2的小塊，每瓶接種四塊，觀察并記錄葉片愈傷組織的生長情況，7d后統(tǒng)計污染率、成活率，消毒處理過的刺桂幼嫩種胚和葉片切碎，以MS為基本培養(yǎng)基，添加2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH調(diào)至5.8，每瓶內(nèi)盛30ml固體培養(yǎng)基。誘導出來的愈傷組織接入改良DKW、MS,DY等3種培養(yǎng)基進行增殖試驗，添加2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH調(diào)到5.8，每個處理接種10瓶，每瓶接3塊愈傷組織，重復3次，增殖出來的愈傷組織進行懸浮細胞培養(yǎng)，接入改良MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的稀土 (硝酸鑭)，濃度為5mg/L，附加2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA, pH5.8，每個處理接種10瓶，每瓶接3塊愈傷組織，重復3次，接種后分別在第10d、20d、30d測愈傷組織生長量，統(tǒng)計鮮重增量和增長率，10ml三角瓶接種30ml液體，接種后置于搖床水平振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為100r/min，溫度26V。
[0008]實施例2
取刺桂葉片先用洗衣粉浸泡三分鐘，然后用三層紗布包裹，流水沖洗半個小時。浙水，在超凈工作臺上用0.1%升汞滅菌12min，用無菌水沖洗4_5次，切成約Icm2的小塊，每瓶接種四塊，觀察并記錄葉片愈傷組織的生長情況，7d后統(tǒng)計污染率、成活率，消毒處理過的刺桂幼嫩種胚和葉片切碎，以MS為基本培養(yǎng)基，添加2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH調(diào)至5.8，每瓶內(nèi)盛30ml固體培養(yǎng)基。誘導出來的愈傷組織接入改良DKW、MS,DY等3種培養(yǎng)基進行增殖試驗，添加2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH調(diào)到5.8。每個處理接種10瓶，每瓶接3塊愈傷組織，重復3次，增殖出來的愈傷組織進行懸浮細胞培養(yǎng)，接入改良MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的稀土 (硝酸鑭)，濃度20mg/L，附加3mg/L6-BA+0.4mg/LNAA, pH5.8，每個處理接種10瓶，每瓶接3塊愈傷組織，重復3次，接種后分別在第10d、20d、30d測愈傷組織生長量，統(tǒng)計鮮重增量和增長率，10ml三角瓶接種30ml液體，接種后置于搖床水平振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為100r/min，溫度26V。
[0009]實施例3
取刺桂葉片先用洗衣粉浸泡三分鐘，然后用三層紗布包裹，流水沖洗半個小時。浙水，在超凈工作臺上用0.1%升汞滅菌12min，用無菌水沖洗4_5次，切成約Icm2的小塊，每瓶接種四塊，觀察并記錄葉片愈傷組織的生長情況，7d后統(tǒng)計污染率、成活率，消毒處理過的刺桂幼嫩種胚和葉片切碎，以MS為基本培養(yǎng)基，添加2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH調(diào)至5.8，每瓶內(nèi)盛30ml固體培養(yǎng)基，誘導出來的愈傷組織接入改良DKW、MS、DY等3種培養(yǎng)基進行增殖試驗，添加2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH調(diào)到5.8。每個處理接種10瓶，每瓶接3塊愈傷組織，重復3次，增殖出來的愈傷組織進行懸浮細胞培養(yǎng)，接入改良MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的稀土 (硝酸鑭)，濃度10mg/L，附加2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA, pH5.8，每個處理接種10瓶，每瓶接3塊愈傷組織，重復3次，接種后分別在第10d、20d、30d測愈傷組織生長量，統(tǒng)計鮮重增量和增長率，10ml三角瓶接種30ml液體，接種后置于搖床水平振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為100r/min，溫度26V。
[0010]實施例4
取刺桂葉片先用洗衣粉浸泡三分鐘，然后用三層紗布包裹，流水沖洗半個小時。浙水，在超凈工作臺上用0.1%升汞滅菌12min，用無菌水沖洗4_5次，切成約Icm2的小塊，每瓶接種四塊，觀察并記錄葉片愈傷組織的生長情況，7d后統(tǒng)計污染率、成活率，消毒處理過的刺桂幼嫩種胚和葉片切碎，以MS為基本培養(yǎng)基，添加2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH調(diào)至5.8，每瓶內(nèi)盛30ml固體培養(yǎng)基，誘導出來的愈傷組織接入改良DKW、MS、DY等3種培養(yǎng)基進行增殖試驗，添加2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH調(diào)到5.8。每個處理接種10瓶，每瓶接3塊愈傷組織，重復3次，增殖出來的愈傷組織進行懸浮細胞培養(yǎng)，接入改良MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的稀土 (硝酸鑭)，濃度10mg/L，附加3mg/L6-BA+0.5mg/LNAA, pH5.8，每個處理接種10瓶，每瓶接3塊愈傷組織，重復3次，接種后分別在第10d、20d、30d測愈傷組織生長量，統(tǒng)計鮮重增量和增長率，10ml三角瓶接種30ml液體，接種后置于搖床水平振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為100r/min，溫度26V。
【權(quán)利要求】
1.一種刺桂愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，包括無菌胚的獲得、愈傷組織的誘導、懸浮細胞培養(yǎng)等，主要步驟如下: (1)取刺桂幼嫩種胚和葉片，按照常規(guī)的消毒方法對其進行消毒； (2)將步驟(I)消毒處理過的刺桂幼嫩種胚和葉片切碎，以MS為基本培養(yǎng)基，添加2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH調(diào)至5.8，每瓶內(nèi)盛30ml固體培養(yǎng)基； (3)取步驟(2)誘導出來的愈傷組織接入改良DKW、MS、DY等3種培養(yǎng)基進行增殖試驗，添加2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH調(diào)到5.8，每個處理接種10瓶，每瓶接3塊愈傷組織，重復3次； (4)取步驟(3)增殖出來的愈傷組織接入改良MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的稀土(硝酸鑭)，濃度梯度分別設為 5、10、20mg/L，附加 2-3mg/L6-BA+0.3-0.5mg/LNAA, pH5.8，每個處理接種10瓶，每瓶接3塊愈傷組織，重復3次，接種后分別在第5d、10d、15d測愈傷組織生長量，統(tǒng)計鮮重增量和增長率。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種刺桂愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(I)中所述刺桂無菌葉片的獲得為:取刺桂葉片先用洗衣粉浸泡三分鐘，然后用三層紗布包裹，流水沖洗半個小時。
3.浙水，在超凈工作臺上用0.1%升汞滅菌12min，用無菌水沖洗4-5次，切成約Icm2的小塊，每瓶接種四塊，觀察并記錄葉片愈傷組織的生長情況，7d后統(tǒng)計污染率、成活率。
4.按照權(quán)利要求1所述的一種刺桂愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(2)中所述刺桂愈傷組織的誘導條件為將分裝好的培養(yǎng)基和包扎好的培養(yǎng)容器、鑷子、解剖刀等試驗用具置于高壓滅菌鍋內(nèi)，121°C，1.1 kg/cm3滅菌20min ;培養(yǎng)溫度26°C ；光照強度50Mmol/m2s，光期14h，暗期10h，相對濕度50%_70%。
5.按照權(quán)利要求1所述的一種刺桂愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(3)中篩選三種培養(yǎng)基改良DKW、MS、DY對刺桂愈傷組織進行增殖。
6.按照權(quán)利要求1所述的一種刺桂愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(4)所述的刺桂懸浮細胞按照下述方法得到:取誘導出來的嫩綠松散的愈傷組織，10ml三角瓶接種30ml液體，接種后置于搖床水平振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為100r/min，溫度26。。。
7.按照權(quán)利要求1所述的一種刺桂愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(4)中加入了稀土硝酸鑭，對細胞懸浮培養(yǎng)有促進作用。
【文檔編號】C12N5/04GK104263693SQ201410463082
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】楊存 申請人:南京通澤農(nóng)業(yè)科技有限公司