專利名稱：海膜愈傷組織育苗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大型海藻海膜的育苗技術(shù)，具體地說是利用愈傷組織進(jìn)行海膜幼苗培育的方法。
背景技術(shù)：
海膜是一種可食用海藻，并可作為提取藻膠的原料。目前藻體的獲得主要是采集自然資源，人工養(yǎng)殖還未進(jìn)行。主要是因?yàn)楹Ｄさ逆咦赢a(chǎn)量比較低，人工培養(yǎng)的孢子苗量少，不能形成養(yǎng)殖規(guī)模。對(duì)它的苗種培育可采用與高等植物組織類似的組織培養(yǎng)技術(shù)。大型海藻的組織培養(yǎng)雖然起始于五十年代，但由于海藻具有許多不同于高等植物的特性，使得組織培養(yǎng)研究進(jìn)展相對(duì)緩慢。與高等植物相比，海藻組織培養(yǎng)的相對(duì)困難在于1.獲得無菌材料困難海藻的表面寄生物多，且生長牢固，必須采用劇烈的刷洗，而海藻的外表細(xì)胞無角質(zhì)層類的保護(hù)層，很容易受損傷；同時(shí)由于寄生的微生物種類多，數(shù)量大，所用的消毒劑和抗生素的量需加大，極易造成外植體畸形或死亡；2.海藻的基礎(chǔ)研究落后，缺乏控制起生長和分化的知識(shí)。由于愈傷組織繼代培養(yǎng)的條件控制存在一定的技術(shù)難度，雖然通過誘導(dǎo)可以獲得愈傷組織，但在嘗試將這種愈傷組織與外植體分離后，愈傷組織一般不能繼續(xù)生長。國內(nèi)外的研究工作主要集中于大型海藻的切段(塊)、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)及愈傷組織的生理生化特性分析方面。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述不足，本發(fā)明提供的是一種誘導(dǎo)海膜產(chǎn)生愈傷組織，對(duì)愈傷組織進(jìn)行分離培養(yǎng)和快速擴(kuò)增，利用培養(yǎng)的愈傷組織進(jìn)行育苗的方法。
本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種海膜愈傷組織育苗方法，首先誘導(dǎo)海膜藻體產(chǎn)生愈傷組織；然后分離這種愈傷組織，將其置于適宜條件下使其不斷擴(kuò)增，快速繁殖，產(chǎn)生大量的愈傷組織，在實(shí)驗(yàn)室保存并繼代培養(yǎng)這種愈傷組織作為苗種；最后進(jìn)行育苗，育苗時(shí)將愈傷組織搗碎后噴附在附著基上，控制條件，使其發(fā)育成完整的幼苗，從而達(dá)到育苗的目的。具體如下首先誘導(dǎo)海膜藻體產(chǎn)生愈傷組織，通過物理傷害誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，采集海膜藻體，進(jìn)行物理傷害，將其置于PES培養(yǎng)液內(nèi)，溫度為15～25℃，光周期L∶D＝12∶12，光強(qiáng)為20～80μmol photons(光子)·m-2s-1，培養(yǎng)時(shí)間為2～3周，長出愈傷組織；然后分離這種愈傷組織，在室內(nèi)保存并繼代培養(yǎng)這種愈傷組織作為苗種，將其置于PES培養(yǎng)液內(nèi)，溫度為15～25℃，光周期L∶D＝12∶12，光強(qiáng)為20～80μmol光子·m-2s-1，對(duì)這種愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，待愈傷組織生長到2～10毫米時(shí)，將其搗碎并置于PES培養(yǎng)液內(nèi)，溫度為15～25℃，光周期L∶D＝12∶12，光強(qiáng)為20～80μmol光子·m-2s-1，每1～2周更換一次培養(yǎng)液，使其不斷擴(kuò)增，快速繁殖，產(chǎn)生大量的愈傷組織；最后進(jìn)行育苗，育苗時(shí)將愈傷組織搗碎后噴附在附著基上，溫度為15-28℃，光周期L∶D＝12∶12，光強(qiáng)為100～300μmol光子·m-2s-1，使其發(fā)育成完整的幼苗。
本發(fā)明在育苗過程中，先靜置培養(yǎng)5～14天后，絲狀體即可附著于附著基上，然后開始流水培養(yǎng)25～45天后即可見到肉眼可見的小苗；附著基采用竹片或玻璃片；育苗時(shí)將大量培養(yǎng)的愈傷組織置于組織搗碎機(jī)中，用10000-12000轉(zhuǎn)/分搗碎30～50秒，至愈傷組織成為短的數(shù)個(gè)細(xì)胞的絲狀體，所述絲狀體長度為50～200μm。
本發(fā)明通過物理傷害誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，不需要添加激素。在有菌和液體環(huán)境中進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，不需要無菌和固體培養(yǎng)。
本發(fā)明通過調(diào)控光照、溫度等環(huán)境條件使愈傷組織能夠快速增長，不需要添加激素和有機(jī)物質(zhì)。在有菌的條件下進(jìn)行，不需要無菌培養(yǎng)條件。
本發(fā)明通過將愈傷組織搗碎、靜置使之附著于附著基上，在合適條件下即可再生出幼苗，不需要添加激素或其它物質(zhì)，不需要無菌操作。
本發(fā)明的原理在于本發(fā)明通過在特定條件下對(duì)海膜進(jìn)行誘導(dǎo)，使之產(chǎn)生絲狀的愈傷組織；分離這種愈傷組織，根據(jù)實(shí)驗(yàn)掌握了光照、溫度、營養(yǎng)鹽等條件對(duì)這種愈傷組織的影響，從而實(shí)現(xiàn)了愈傷組織的繼代培養(yǎng)和保存；對(duì)這種愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，使之快速擴(kuò)增，產(chǎn)生大量愈傷組織。將懸浮培養(yǎng)的愈傷組織噴灑在附著基上，靜水培養(yǎng)使其附著后改為流水培養(yǎng)，并改變培養(yǎng)條件誘導(dǎo)其再生成苗。這種方法可以作為一種有效可行的海膜的育苗方法。應(yīng)用本發(fā)明，可以不受海膜成熟時(shí)間限制隨時(shí)為生產(chǎn)提供種苗，并且由于愈傷組織再生苗不經(jīng)過有性生殖，因此不會(huì)產(chǎn)生性狀分離，有利于良種品質(zhì)的選育。本發(fā)明技術(shù)含量高，穩(wěn)定可靠，易于應(yīng)用。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明愈傷組織誘導(dǎo)和培養(yǎng)的方法簡易，操作方便。
2、本發(fā)明不需要采集孢子，并可以在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保存種質(zhì)，不依賴自然資源。
3、本發(fā)明育苗方式與孢子采苗方式相比不受海藻成熟時(shí)間限制，可隨時(shí)為生產(chǎn)提供苗種。
4、本發(fā)明育苗方式不經(jīng)過有性生殖，不會(huì)產(chǎn)生性狀分離，有利于良種的選育。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1采集海膜葉狀體。經(jīng)無菌海水沖洗5遍后，用刀片切成3毫米大小的小塊，置于盛有20毫升PES培養(yǎng)液(Provasoli′s enriched seawater)的培養(yǎng)皿內(nèi)，在20℃，光周期12∶12h＝L∶D，光強(qiáng)50μmol photons(光子)·m-2s-1下培養(yǎng)。兩周到三周后，切塊邊緣長出絲狀的愈傷組織。在顯微鏡下用刀片切割這種愈傷組織，置于150毫升三角瓶中對(duì)這種愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期與上述誘導(dǎo)愈傷組織的條件相同。待愈傷組織生長到直徑5毫米大小后，將其搗碎，每兩周更換一次培養(yǎng)液，在室內(nèi)保存，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期與上述誘導(dǎo)愈傷組織的條件相同。大量培養(yǎng)時(shí)，將保存的愈傷組織接種至10升培養(yǎng)瓶中，用空氣壓縮泵進(jìn)行充空氣培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期與上述誘導(dǎo)愈傷組織的條件相同。育苗時(shí)將大量培養(yǎng)的愈傷組織置于組織搗碎機(jī)中，用10000轉(zhuǎn)/分搗碎30秒，至愈傷組織成為短(100μm左右)的數(shù)個(gè)細(xì)胞的絲狀體后，噴于底部放有竹片、玻璃片等表面光滑的附著基的育苗池中，于20℃，光周期12∶12h＝L∶D，200μmol photons·m-2s-1光強(qiáng)下靜置培養(yǎng)。7天左右后絲狀體即可附著于附著基上，然后開始流水培養(yǎng)。一個(gè)月后即可見到肉眼可見的小苗。
實(shí)施例2采集海膜葉狀體。經(jīng)無菌海水沖洗5遍后，用刀片切成3毫米大小的小塊，置于盛有20毫升PES培養(yǎng)液(Provasoli′s enriched seawater)的培養(yǎng)皿內(nèi)，在25℃，光周期12∶12h＝L∶D，光強(qiáng)20μmol photons·m-2s-1下培養(yǎng)。兩周到三周后，切塊邊緣長出絲狀的愈傷組織。在顯微鏡下用刀片切割這種愈傷組織，置于150毫升三角瓶中對(duì)這種愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期與上述誘導(dǎo)愈傷組織的條件相同。待愈傷組織生長到直徑2毫米大小后，將其搗碎，每周更換一次培養(yǎng)液，在室內(nèi)保存，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期與上述誘導(dǎo)愈傷組織的條件相同。大量培養(yǎng)時(shí)，將保存的愈傷組織接種至10升培養(yǎng)瓶中，用空氣壓縮泵進(jìn)行充空氣培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期與上述誘導(dǎo)愈傷組織的條件相同。育苗時(shí)將大量培養(yǎng)的愈傷組織置于組織搗碎機(jī)中，用11000轉(zhuǎn)/分搗碎20秒，至愈傷組織成為短(200μm左右)的數(shù)個(gè)細(xì)胞的絲狀體后，噴于底部放有竹片、玻璃片等表面光滑的附著基的育苗池中，于25℃，光周期12∶12h＝L∶D，100μmol photons·m-2s-1光強(qiáng)下靜置培養(yǎng)。14天左右后絲狀體即可附著于附著基上，然后開始流水培養(yǎng)。45天后即可見到肉眼可見的小苗。
實(shí)施例3采集海膜葉狀體。經(jīng)無菌海水沖洗5遍后，用刀片切成3毫米大小的小塊，置于盛有20毫升PES培養(yǎng)液(Provasoli′s enriched seawater)的培養(yǎng)皿內(nèi)，在15℃，光周期12∶12h＝L∶D，光強(qiáng)80μmol photons·m-2s-1下培養(yǎng)。兩周到三周后，切塊邊緣長出絲狀的愈傷組織。在顯微鏡下用刀片切割這種愈傷組織，置于150毫升三角瓶中對(duì)這種愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期與上述誘導(dǎo)愈傷組織的條件相同。待愈傷組織生長到直徑10毫米大小后，將其搗碎，每周更換一次培養(yǎng)液，在室內(nèi)保存，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期與上述誘導(dǎo)愈傷組織的條件相同。大量培養(yǎng)時(shí)，將保存的愈傷組織接種至10升培養(yǎng)瓶中，用空氣壓縮泵進(jìn)行充空氣培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期同上述誘導(dǎo)愈傷組織相同。育苗時(shí)將大量培養(yǎng)的愈傷組織置于組織搗碎機(jī)中，用12000轉(zhuǎn)/分搗碎50秒，至愈傷組織成為短(50μm左右)的數(shù)個(gè)細(xì)胞的絲狀體后，噴于底部放有竹片、玻璃片等表面光滑的附著基的育苗池中，于15℃，光周期12∶12h＝L∶D，300μmol photons·m-2s-1光強(qiáng)下靜置培養(yǎng)。5天左右后絲狀體即可附著于附著基上，然后開始流水培養(yǎng)。40天后即可見到肉眼可見的小苗。
實(shí)施例4采集海膜盤狀體。經(jīng)無菌海水沖洗5遍后，用刀片切成2毫米大小的小塊，置于盛有20毫升PES培養(yǎng)液(Provasoli′s enriched seawater)的培養(yǎng)皿內(nèi)，在20℃，光周期12∶12h＝L∶D，光強(qiáng)50μmol photons·m-2s-1下培養(yǎng)。兩周到三周后，切塊邊緣長出絲狀的愈傷組織。在顯微鏡下用刀片切割這種愈傷組織，置于150毫升三角瓶中對(duì)這種愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期與上述誘導(dǎo)愈傷組織的條件相同。待愈傷組織生長到直徑5毫米大小后，將其搗碎，每兩周更換一次培養(yǎng)液，在室內(nèi)保存，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期同上述誘導(dǎo)愈傷組織相同。大量培養(yǎng)時(shí)，將保存的愈傷組織接種至10升培養(yǎng)瓶中，用空氣壓縮泵進(jìn)行充空氣培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期與上述誘導(dǎo)愈傷組織的條件相同。育苗時(shí)將大量培養(yǎng)的愈傷組織置于組織搗碎機(jī)中，用10000轉(zhuǎn)/分搗碎30秒，至愈傷組織成為短(100μm左右)的數(shù)個(gè)細(xì)胞的絲狀體后，噴于底部放有竹片、玻璃片等表面光滑的附著基的育苗池中，于20℃，光周期12∶12h＝L∶D，200μmol photons·m-2s-1光強(qiáng)下靜置培養(yǎng)。7天左右后絲狀體即可附著于附著基上，然后開始流水培養(yǎng)。一個(gè)月后即可見到肉眼可見的小苗。
實(shí)施例5采集海膜盤狀體。經(jīng)無菌海水沖洗5遍后，用刀片切成1毫米大小的小塊，置于盛有20毫升PES培養(yǎng)液(Provasoli′s enriched seawater)的培養(yǎng)皿內(nèi)，在25℃，光周期12∶12h＝L∶D，光強(qiáng)20μmol photons·m-2s-1下培養(yǎng)。兩周到三周后，切塊邊緣長出絲狀的愈傷組織。在顯微鏡下用刀片切割這種愈傷組織，置于150毫升三角瓶中對(duì)這種愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期與上述誘導(dǎo)愈傷組織的條件相同。待愈傷組織生長到直徑2毫米大小后，將其搗碎，每周更換一次培養(yǎng)液，在室內(nèi)保存，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期同上述誘導(dǎo)愈傷組織相同。大量培養(yǎng)時(shí)，將保存的愈傷組織接種至10升培養(yǎng)瓶中，用空氣壓縮泵進(jìn)行充空氣培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期與上述誘導(dǎo)愈傷組織的條件相同。育苗時(shí)將大量培養(yǎng)的愈傷組織置于組織搗碎機(jī)中，用12000轉(zhuǎn)/分搗碎20秒，至愈傷組織成為短(200μm左右)的數(shù)個(gè)細(xì)胞的絲狀體后，噴于底部放有竹片、玻璃片等表面光滑的附著基的育苗池中，于25℃，光周期12∶12h＝L∶D，100μmol photons·m-2s-1光強(qiáng)下靜置培養(yǎng)。14天左右后絲狀體即可附著于附著基上，然后開始流水培養(yǎng)。45天后即可見到肉眼可見的小苗。
實(shí)施例6采集海膜盤狀體。經(jīng)無菌海水沖洗5遍后，用刀片切成1毫米大小的小塊，置于盛有20毫升PES培養(yǎng)液(Provasoli′s enriched seawater)的培養(yǎng)皿內(nèi)，在15℃，光周期12∶12h＝L∶D，光強(qiáng)80μmol photons·m-2S-1下培養(yǎng)。兩周到三周后，切塊邊緣長出絲狀的愈傷組織。在顯微鏡下用刀片切割這種愈傷組織，置于150毫升三角瓶中對(duì)這種愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期與上述誘導(dǎo)愈傷組織的條件相同。待愈傷組織生長到直徑10毫米大小后，將其搗碎，每周更換一次培養(yǎng)液，在室內(nèi)保存，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期與上述誘導(dǎo)愈傷組織的條件相同。大量培養(yǎng)時(shí)，將保存的愈傷組織接種至10升培養(yǎng)瓶中，用空氣壓縮泵進(jìn)行充空氣培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)液、光強(qiáng)和光周期同上述誘導(dǎo)愈傷組織相同。育苗時(shí)將大量培養(yǎng)的愈傷組織置于組織搗碎機(jī)中，用10000轉(zhuǎn)/分搗碎50秒，至愈傷組織成為短(50μm左右)的數(shù)個(gè)細(xì)胞的絲狀體后，噴于底部放有竹片、玻璃片等表面光滑的附著基的育苗池中，于28℃，光周期12∶12h＝L∶D，300umol photons·m-2s-1光強(qiáng)下靜置培養(yǎng)。5天左右后絲狀體即可附著于附著基上，然后開始流水培養(yǎng)。40天后即可見到肉眼可見的小苗。
權(quán)利要求
1.一種利用愈傷組織進(jìn)行海膜幼苗培育的方法，其特征在于首先誘導(dǎo)海膜藻體產(chǎn)生愈傷組織，通過物理傷害誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，采集海膜藻體，進(jìn)行物理傷害，將其置于PES培養(yǎng)液內(nèi)，溫度為15～25℃，光周期L∶D＝12∶12，光強(qiáng)為20～80μmol光子·m-2s-1，培養(yǎng)時(shí)間為2～3周，長出愈傷組織；然后分離這種愈傷組織，在室內(nèi)保存并繼代培養(yǎng)這種愈傷組織作為苗種，將其置于PES培養(yǎng)液內(nèi)，溫度為15～25℃，光周期L∶D＝12∶12，光強(qiáng)為20～80μmol光子·m-2s-1，對(duì)這種愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，待愈傷組織生長到2～10毫米時(shí)，將其搗碎并置于PES培養(yǎng)液內(nèi)，溫度為15～25℃，光周期L∶D＝12∶12，光強(qiáng)為20～80 μmol光子·m-2s-1，每1～2周更換一次培養(yǎng)液，使其不斷擴(kuò)增，快速繁殖，產(chǎn)生大量的愈傷組織；最后進(jìn)行育苗，育苗時(shí)將愈傷組織搗碎后噴附在附著基上，溫度為15-28℃，光周期L∶D＝12∶12，光強(qiáng)為100～300μmol光子·m-2s-1，使其發(fā)育成完整的幼苗。
2.按照權(quán)利要求1所述利用愈傷組織進(jìn)行海膜幼苗培育的方法，其特征在于在育苗過程中，先靜置培養(yǎng)5～14天后，絲狀體即可附著于附著基上，然后開始流水培養(yǎng)25～45天后即可見到肉眼可見的小苗。
3.按照權(quán)利要求1或2所述利用愈傷組織進(jìn)行海膜幼苗培育的方法，其特征在于在育苗過程中，附著基采用竹片或玻璃片。
4.按照權(quán)利要求1所述利用愈傷組織進(jìn)行海膜幼苗培育的方法，其特征在于育苗時(shí)將大量培養(yǎng)的愈傷組織置于組織搗碎機(jī)中，用10000-12000轉(zhuǎn)/分搗碎30～50秒，至愈傷組織成為短的數(shù)個(gè)細(xì)胞的絲狀體。
5.按照權(quán)利要求4所述利用愈傷組織進(jìn)行海膜幼苗培育的方法，其特征在于所述絲狀體長度為50～200μm。
全文摘要
一種利用愈傷組織進(jìn)行海膜幼苗培育的方法，通過在特定條件下對(duì)海膜進(jìn)行誘導(dǎo)，使之產(chǎn)生絲狀的愈傷組織。分離這種愈傷組織，根據(jù)實(shí)驗(yàn)掌握了光照、溫度、營養(yǎng)鹽等條件對(duì)這種愈傷組織的影響，從而實(shí)現(xiàn)了愈傷組織的繼代培養(yǎng)和保存。對(duì)這種愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，使之快速擴(kuò)增，產(chǎn)生大量愈傷組織。將懸浮培養(yǎng)的愈傷組織噴灑在附著基上，靜水培養(yǎng)使其附著后改為流水培養(yǎng)，并改變培養(yǎng)條件誘導(dǎo)其再生成苗。這種方法可以作為一種有效可行的海膜的育苗方法。應(yīng)用本發(fā)明，可以不受海膜成熟時(shí)間限制隨時(shí)為生產(chǎn)提供種苗，并且由于愈傷組織再生苗不經(jīng)過有性生殖，因此不會(huì)產(chǎn)生性狀分離，有利于良種品質(zhì)的選育。本發(fā)明技術(shù)含量高，穩(wěn)定可靠，易于應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01G33/00GK1739338SQ20041005031
公開日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2004年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月25日
發(fā)明者胡曉燕, 殷明焱, 夏娃 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院海洋研究所