硒蛋白s激動(dòng)劑多肽及其制備方法、應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及預(yù)防或治療腦卒中的多肽化合物。硒蛋白S激動(dòng)劑多肽2，其特征在于：其序列為GGRLKMAAAAQRSSGGUGEGREFVEKHKEKL。所述多肽2的制備方法，步驟包括（1）煎煮，（2）酶解，（3）蛋白質(zhì)分離，（4）半制備RP-HPLC分離純化，（5）凍干。所述的酶解采用中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶酶解。所述的蛋白質(zhì)分離采用大孔樹(shù)脂、葡聚糖凝膠。硒蛋白S激動(dòng)劑多肽2在預(yù)防或治療腦卒中中的應(yīng)用。本發(fā)明中的硒蛋白S激動(dòng)劑多肽2可以靶向促進(jìn)硒蛋白S表達(dá)，提高腦組織中硒蛋白S的含量，達(dá)到預(yù)防或治療腦卒中的作用，且安全性好。
【專利說(shuō)明】硒蛋白S激動(dòng)劑多肽及其制備方法、應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及用于預(yù)防或治療腦卒中的多肽提取物。

【背景技術(shù)】：
[0002] 腦卒中已繼心臟病和癌癥成為人類第三大死亡原因，也是全球成人致殘的主要原 因之一?，F(xiàn)階段，治療腦卒中的方法多為藥物治療。多采用尿激酶，華法林和阿斯平林等抗 凝血藥物治療，或采用活血化瘀的中藥治療，但往往因劑量不當(dāng)反而引起腦出血，給治療帶 來(lái)更大的危害。
[0003]近幾年關(guān)于缺血性腦卒中的研究已逐漸發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)對(duì)卒中后腦組織損傷具有 重要影響，腦缺血后持續(xù)發(fā)展的炎癥可加重缺血損傷，所以抗炎治療的研究逐漸受到重視 并廣泛開(kāi)展。硒蛋白S是一種新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜駐留硒蛋白。以往的研究結(jié)果揭示 硒蛋白S可以保護(hù)細(xì)胞拮抗氧化損傷及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；參與脂蛋白代謝、精 子發(fā)育過(guò)程、炎癥反應(yīng)及將錯(cuò)誤折疊蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔逆向轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中然后降解的過(guò)程 (即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解）。曾有報(bào)道，硒蛋白S基因多態(tài)性與糖尿病、冠狀動(dòng)脈心臟病或 先兆子癇等疾病密切相關(guān)。最新的研究發(fā)現(xiàn)，硒蛋白S與腦卒中密切相關(guān)。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)體 外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞受到缺血損害時(shí)，硒蛋白S的表達(dá)增加，并且可以減輕星形膠質(zhì)的 缺血損傷，進(jìn)而在疾病的發(fā)生發(fā)展中起到預(yù)防或治療腦卒中的作用。
[0004] 茶葉中除了富含硒以外，還富含具有硒蛋白S激動(dòng)劑作用的多肽，但是過(guò)去的技 術(shù)有限，沒(méi)有從茶葉中提取制備硒蛋白S激動(dòng)劑多肽的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明目的是針對(duì)現(xiàn)有預(yù)防或治療腦卒中藥物的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種從茶葉中天然提 取的多肽提取物，能有效治療或預(yù)防腦卒中。
[0006] 技術(shù)方案
[0007] 硒蛋白S激動(dòng)劑多肽2，其特征在于：其序列為 GGRLKMAAAAQRSSGGUGEGREFVEKHKEKL。所述多肽2的制備方法，步驟包括（1)煎煮，⑵酶 解，（3)蛋白質(zhì)分離，（4)半制備RP-HPLC分離純化，（5)凍干。所述的酶解采用中性蛋白 酶、復(fù)合蛋白酶酶解。所述的蛋白質(zhì)分離采用大孔樹(shù)脂、葡聚糖凝膠。硒蛋白S激動(dòng)劑多肽 2在預(yù)防或治療腦卒中中的應(yīng)用。
[0008] 有益結(jié)果：
[0009]本發(fā)明中的硒蛋白S激動(dòng)劑多肽2可以靶向促進(jìn)硒蛋白S表達(dá)，提高腦組織中硒 蛋白S的含量，達(dá)到預(yù)防或治療腦卒中的作用，且安全性好。

【具體實(shí)施方式】
[0010] 實(shí)施例1
[0011] 多肽的化學(xué)合成方法
[0012] 將茶葉加水煎煮I. 5h后，冷卻至室溫；加入0. 5%中性蛋白酶和1%復(fù)合蛋白酶酶 解2h ;采用大孔樹(shù)脂按照分子量分離蛋白質(zhì)，再用半制備RP-HPLC分離純化，得到的產(chǎn)物凍 干后，即為硒蛋白S激動(dòng)劑多肽2。應(yīng)用上述方法提取的激動(dòng)劑多肽2,經(jīng)過(guò)質(zhì)譜鑒定，序列 為GGRLKMAAAAQRSSGGUGEGREFVEKHKEKL，該序列為全新序列。
[0013] 實(shí)施例2
[0014] 硒蛋白S激動(dòng)劑多肽2的體外細(xì)胞凋亡的測(cè)定
[0015] 本實(shí)驗(yàn)研究了硒蛋白S激動(dòng)劑多肽2抑制大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的作用。當(dāng)細(xì) 胞用lOymol/LTNF-a處理后，經(jīng)TUNEL染色后發(fā)現(xiàn)與培養(yǎng)基對(duì)照組相比出現(xiàn)了很多綠色 亮點(diǎn)，說(shuō)明體系中存在凋亡的細(xì)胞。當(dāng)lOumol/L硒蛋白S激動(dòng)劑多肽2與TNF-a共孵 育后，鏡檢看到比單純加TNF-a的對(duì)照組較少的綠色亮點(diǎn)。對(duì)拍攝照片進(jìn)行計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì) 后，發(fā)現(xiàn)用10^111〇1/1^即-〇處理的細(xì)胞凋亡率約為87.3%，而1011111 〇1/1激動(dòng)劑多肽2 與TNF-a共同處理的細(xì)胞凋亡率減少到42. 2% (p〈0. 05)。并且只用IOiimol/L激動(dòng)劑多 肽2處理的細(xì)胞的凋亡情況與培養(yǎng)基對(duì)照組并無(wú)明顯差別，說(shuō)明激動(dòng)劑多肽2顯著減少了 TNF-a誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但此濃度的激動(dòng)劑多肽2自身對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性作用。
[0016] 實(shí)施例3
[0017]硒蛋白S激動(dòng)劑多肽2治療大鼠腦卒中模型的作用
[0018] 雄性8周齡的SD大鼠40只，隨機(jī)分為4組，建立MCAO的模型，分別在造模同時(shí)給 予藥物干預(yù)，分別為：A組為空白對(duì)照組：生理鹽水；B組為模型對(duì)照組：造模+生理鹽水；C 組為藥物干預(yù)組：造模+硒蛋白S激動(dòng)劑多肽2 (5mg/kg/d) ;D為陽(yáng)性藥干預(yù)組：造模+尿 激酶（l〇mg/kg)。連續(xù)10天。（1)觀察大鼠局部腦缺血再灌注后梗死體積的大??；（2)采 用神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，觀察MCAO動(dòng)物的康復(fù)情況；(3)檢測(cè)腦組織中硒蛋白S的含量。
[0019] 結(jié)果：治療性給予多肽2組的腦卒中模型大鼠與模型組相比，腦卒中面積減少 (P〈0. 01)，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低（P〈0. 01)，腦組織中硒蛋白S的含量升高（P〈0. 01)，與模型 對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表1)。
[0020] 表1硒蛋白S激動(dòng)劑多肽2對(duì)治療大鼠腦卒中模型的作用

【權(quán)利要求】
1. 一種硒蛋白S激動(dòng)劑多肽，其特征在于：其序列為GGRLKMAAAAQRSSGGUGEGREFVEKHK EKL。
2. -種權(quán)利要求1所述多肽的制備方法，其特征在于：步驟包括（1)煎煮，（2)酶解， (3)蛋白質(zhì)分離，（4)半制備RP-HPLC分離純化，（5)凍干。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽的制備方法，其特征在于：所述的酶解采用中性蛋白酶、 復(fù)合蛋白酶酶解。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽的制備方法，其特征在于：所述的蛋白質(zhì)分離采用大孔 樹(shù)脂、葡聚糖凝膠。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的多肽在制備預(yù)防或治療腦卒中藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK104262473SQ201410509068
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】羅瑞雪 申請(qǐng)人:蘇州普羅達(dá)生物科技有限公司