多肽、編碼該多肽的dna分子、載體、制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種多肽、編碼該多肽的DNA分子、載體、制備方法及應(yīng)用。該多肽具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一個(gè)：(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得的氨基酸序列。其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、厭氧菌、臨床耐藥病原菌均具有廣譜高效抑制作用，同時(shí)能促進(jìn)組織修復(fù)與創(chuàng)面愈合，可用于制備治療或預(yù)防細(xì)菌、厭氧菌特別是耐藥細(xì)菌導(dǎo)致的非特異性感染、特異性感染的相關(guān)疾病的藥物與促進(jìn)組織修復(fù)和傷口愈合的藥物。
【專利說(shuō)明】多肽、編碼該多肽的DNA分子、載體、制備方法及應(yīng)用
[0001] 本申請(qǐng)要求于2013年07月17日提交中國(guó)專利局、申請(qǐng)?zhí)枮?01310300278. 6、發(fā) 明名稱為"多肽、編碼該多肽的DNA分子、載體、制備方法及應(yīng)用"的中國(guó)專利申請(qǐng)的優(yōu)先 權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在本申請(qǐng)中。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種多肽、編碼該多肽的DNA分子、載體、制 備方法及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0003] 在各類(lèi)創(chuàng)傷中，無(wú)論是燒傷、冷傷、擠壓傷、戰(zhàn)創(chuàng)傷、動(dòng)物咬傷、核放射傷、及復(fù)合傷 等各類(lèi)創(chuàng)傷，還是開(kāi)放傷或閉合傷的臨床治療中，防治感染和促進(jìn)組織修復(fù)和創(chuàng)傷愈合始 終是創(chuàng)傷治療中的永恒的主題。
[0004] 細(xì)菌感染是致病菌或條件致病菌侵入血循環(huán)或局部環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生毒素和 其他代謝產(chǎn)物所引起的急性全身性感染或局部感染，臨床上以寒戰(zhàn)、高熱、皮疹、關(guān)節(jié)痛及 肝脾腫大為特征，部分可有感染性休克和遷徙性病灶。尤其是老人、兒童、有慢性病或免疫 功能低下者、治療不及時(shí)有并發(fā)癥者，可發(fā)展為敗血癥或者膿毒血癥。
[0005] 人體感染的致病菌或條件致病菌種類(lèi)很多，可侵入人體不同部位的組織器官，弓丨 起局部組織或全身炎癥反應(yīng)及多種病變。
[0006] 在非特異性的感染中，也就是化膿性感染中，常見(jiàn)的有癤、癰、丹毒、急性淋巴管 炎、急性淋巴結(jié)炎、甲溝炎、膿性指頭炎、手指?jìng)?cè)化膿性腱鞘炎、滑囊炎、掌深間隙感染、膿血 癥、菌血癥等，致病菌有金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等，可 由單一病菌導(dǎo)致感染，也可以由幾種細(xì)菌共同致病形成混合感染，所以臨床用藥的廣譜性 顯得特別重要。
[0007] 痤瘡也是一種非特異性感染，為青少年常見(jiàn)病、多發(fā)病，中年亦有發(fā)生。臨床表現(xiàn) 為白頭痤瘡、黑頭痤瘡、炎性丘疹、繼發(fā)性膿瘡、囊腫或結(jié)節(jié)、發(fā)痛、發(fā)癢如若感染可留下疤 痕，影響容顏和身心健康。現(xiàn)己知許多發(fā)病因素及環(huán)節(jié)在痤瘡發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中起關(guān)鍵作 用。其中最為重要的原因是毛囊及皮脂腺單位中的微生物作用，首先是厭氧的丙酸痤瘡桿 菌，其次為需氧的表皮及金黃色葡萄球菌等優(yōu)勢(shì)化膿菌。細(xì)菌感染在痤瘡的發(fā)生中是重要 發(fā)病因素。
[0008] 特異性感染是指結(jié)核、破傷風(fēng)、氣性壞疽、炭疽、百日咳、流行性腦脊髓炎、淋病、傷 寒、細(xì)菌性痢疾、白喉等是分別由結(jié)核桿菌、破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、炭疽桿菌、百日咳 鮑特菌、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、傷寒沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、白喉棒狀桿菌引起的獨(dú)特病 變。特異性感染在致病菌、病程演變及治療等方面與一般的感染不同，這是傳染病學(xué)研究的 主要內(nèi)容。
[0009] 促進(jìn)傷口愈合，是創(chuàng)傷學(xué)中與抗感染同樣重要的二大問(wèn)題之一。近年來(lái)，現(xiàn)代細(xì)胞 生物學(xué)和分子生物學(xué)研究的介入，及大量的實(shí)驗(yàn)觀察到了創(chuàng)傷愈合過(guò)程中的細(xì)胞活動(dòng)及其 影響因素，認(rèn)為多種生長(zhǎng)因子參與調(diào)控創(chuàng)傷愈合過(guò)程，其可能的機(jī)理也十分復(fù)雜。
[0010] 慢性難愈合感染創(chuàng)面，是體表慢性難愈合創(chuàng)面中感染了細(xì)菌的創(chuàng)面的統(tǒng)稱。體表 慢性難愈合創(chuàng)面，是一種由系列創(chuàng)傷和疾病所致。發(fā)生在體表的長(zhǎng)期未愈合的創(chuàng)面，主要包 括創(chuàng)傷性潰瘍、下肢靜脈性潰瘍、壓迫性潰瘍以及糖尿病潰瘍。由于發(fā)生在體表，且病程長(zhǎng)， 外觀影響大、并發(fā)癥多及治療費(fèi)用極其昂貴等特點(diǎn)，因此對(duì)患者生活和質(zhì)量產(chǎn)生重大影響， 是現(xiàn)代社會(huì)必須面對(duì)的重要問(wèn)題。
[0011] 在體表慢性難愈合創(chuàng)面中有87%的創(chuàng)面有細(xì)菌感染，主要為金黃色葡萄球菌，銅 綠假單胞菌和大腸埃希菌。由于患者治療時(shí)間長(zhǎng)，其創(chuàng)面細(xì)菌很大部分產(chǎn)生了不同程度的 耐藥性，特別是難愈合創(chuàng)面感染MRSA、MRCNS、耐紅霉素化膿性鏈球菌、產(chǎn)ESBLs大腸埃希 菌、銅綠假單胞菌亞胺培南耐藥株（IPM-R株）時(shí)，由于臨床缺乏有效的治療藥物，可能會(huì)給 病人造成截肢的嚴(yán)重后果。
[0012] 濕疹（eczema)是由多種復(fù)雜的內(nèi)、外因素引起的一種具有多形性皮損傷和易有 滲出傾向的皮膚炎癥性反應(yīng)，病因復(fù)雜多難以確定。自覺(jué)癥狀瘙癢劇烈。病情易反復(fù)，并伴 有細(xì)菌的繼發(fā)感染，可遷延多年不愈。
[0013] 就防治傷口感染而言，常用藥物是抗生素，但抗生素濫用所致病原菌的耐藥性已 使許多創(chuàng)傷無(wú)藥可用，導(dǎo)致病人出現(xiàn)膿血癥、菌血癥、其他器官嚴(yán)重?fù)p傷的全身感染，或在 體表形成慢性難愈合感染創(chuàng)面?？股啬退幮詥?wèn)題已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。耐藥菌另一個(gè) 危害是可以在不同地區(qū)、國(guó)家之間的人群之間傳播。肺炎鏈球菌是引起細(xì)菌性肺炎的常見(jiàn) 病源菌，近年來(lái)肺炎鏈球菌對(duì)抗生素耐藥性呈上升趨勢(shì)，并已出現(xiàn)多重耐藥菌株，是臨床感 染控制中棘手的難題。當(dāng)前許多抗細(xì)菌感染治療藥物大部分療效不佳是由于耐藥細(xì)菌特別 是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA)感染所導(dǎo)致。因此，急需發(fā)現(xiàn)新的抗菌物質(zhì)。
[0014] 近年來(lái)，生物活性抗菌肽的研究已成為國(guó)際藥學(xué)界抗生素發(fā)展的前沿科學(xué)，目前 已經(jīng)有1300多種抗菌肽被分離鑒定，其共同特點(diǎn)為：分子量?。?2-100個(gè)氨基酸殘基）、多 聚陽(yáng)離子型、兩親建構(gòu)。這些被稱為肽類(lèi)抗生素的生物活性物質(zhì)，因?yàn)榫哂屑兩镂镔|(zhì)、穩(wěn) 定性強(qiáng)、抗菌力強(qiáng)、廣譜、無(wú)抗藥耐藥性、無(wú)毒副作用和"三致"作用特點(diǎn)，已被認(rèn)為是現(xiàn)有抗 生素的最佳替代品?？咕钚远嚯腃tryamp或其結(jié)構(gòu)同源多肽是從西藏特里豚蝎獲得的天 然抗菌肽分子，由于產(chǎn)生機(jī)制、殺菌機(jī)制和作用方式與傳統(tǒng)抗生素不同，可很快殺滅微生物 (包括使用由傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生的耐藥菌）而自身不產(chǎn)生耐藥性，且肽水解后的氨基酸有利 于皮膚組織的生成。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種多肽、編碼該多肽的DNA分子、載體、制備方法及應(yīng)用。 該西藏特里豚蝎抗菌活性多肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、厭氧菌、臨床耐藥病原菌均 具有廣譜高效抑制作用，同時(shí)能促進(jìn)組織修復(fù)與創(chuàng)面愈合，可用于制備治療或預(yù)防細(xì)菌、厭 氧菌特別是耐藥細(xì)菌導(dǎo)致的非特異性感染、特異性感染的相關(guān)疾病的藥物與促進(jìn)組織修復(fù) 和傷口愈合的藥物。本發(fā)明提供的以廣譜抗菌活性多肽為有效成分的預(yù)防細(xì)菌感染與促進(jìn) 組織修復(fù)的添加劑（如化妝品添加劑、保健品添加劑、飼料添加劑等），用于預(yù)防細(xì)菌感染 與促進(jìn)組織修復(fù)。預(yù)防細(xì)菌感染效果好、促進(jìn)皮膚組織修復(fù)佳、無(wú)副作用。
[0016] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0017] 本發(fā)明提拱了一種多肽，其具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一個(gè)：
[0018] ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0019] ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸獲得的氨基酸序列。
[0020] 本發(fā)明公開(kāi)了一組西藏特里豚蝎Ctryamp多肽的同源結(jié)構(gòu)多肽，其序列為SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。根據(jù)Ctryamp的成熟肽序列（FIRIARLLRIF)，使用在線NPSO server [DSC 法（Discrimination of protein Secondary structure Class)]對(duì)其進(jìn)行二 級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并利用軟件AHTHEPR0T2000顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)圖像。結(jié)果表明，Ctryamp含有 100%的a-Helix結(jié)構(gòu)，具有典型的兩親性（amphiphilic) a-Helix結(jié)構(gòu)，含有大量帶凈正 電荷的堿性殘基（Arg)。根據(jù)多肽序列的螺旋圖，然后對(duì)Ctryamp多肽序列FIRIARLLRIF進(jìn) 行大量點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)FiX 1IAX2LLX3IF (X1, X2和X3為His、Arg和Lys的3個(gè)堿性氨基酸中任 意一個(gè)氨基酸）（SEQ ID NO: 1)序列并不影響其雙親性的特征（表1)。因此，本發(fā)明提供了 一組西藏特里豚蝎Ctryamp多肽的同源結(jié)構(gòu)多肽（SEQ ID NO :1)。
[0021] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，修飾包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙?；?、泛素化、糖 基化或羰基化。
[0022] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，修飾為乙酰化；具體地，修飾所得多肽具有如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
[0023] 作為優(yōu)選，取代為取代1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)氨基酸。
[0024] 當(dāng)取代為1個(gè)時(shí)，不具有如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
[0025] 更為優(yōu)選地，取代所得多肽具有下述氨基酸序列中的任意一個(gè)：
[0026] 具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；
[0027] 具有SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；
[0028] 具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；
[0029] 具有SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；
[0030] 具有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；
[0031] 具有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
[0032] 作為優(yōu)選，缺失為缺失1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)氨基酸。更為優(yōu)選地，缺失為缺 失1個(gè)或2個(gè)氨基酸。進(jìn)一步優(yōu)選地，當(dāng)缺失為1個(gè)時(shí)，缺失的氨基酸殘基不為第四位或第 九位。
[0033] 更為優(yōu)選地，缺失所得多肽具有下述氨基酸序列中的任意一個(gè)：
[0034] 具有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列；
[0035] 具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列；
[0036] 具有SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
[0037] 作為優(yōu)選，添加為添加1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10氨基酸。 當(dāng)添加為添加在具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的多肽的N端時(shí)，優(yōu)選為添加1個(gè)、2 個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)氨基酸。
[0038] 更為優(yōu)選地，添加所得多肽具有下述氨基酸序列中的任意一個(gè)：
[0039] 具有SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列；
[0040] 具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；
[0041] 具有SEQ ID NO :38所示的氨基酸序列；
[0042] 具有SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；
[0043] 具有SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；
[0044] 具有SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；
[0045] 具有SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列；
[0046] 具有SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列；
[0047] 具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列；
[0048] 具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
[0049] 作為優(yōu)選，其不具有 SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6 或 SEQ ID NO: 53 或 SEQ ID NO: 54所述的氨基酸序列。
[0050] 作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的多肽具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7?SEQ ID NO:20、 SEQ ID NO: 22 ?SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 36 ?SEQ ID NO:45 或 SEQ ID NO:52中任意一個(gè)所示的氨基酸序列。
[0051] 本發(fā)明具體公開(kāi)了一種西藏特里豚蝎Ctryamp多肽，其序列為SEQ ID NO :2所示 的氨基酸序列。Ctryamp的前體組織形式編碼68個(gè)氨基酸殘基，由三個(gè)部分組成，即信號(hào)肽 (23個(gè)殘基）、成熟肽（I 1個(gè)殘基）和前體肽（34個(gè)殘基）。如圖1所示，cDNA序列下方為推斷 的對(duì)應(yīng)氨基酸序列；信號(hào)肽氨基酸以斜體標(biāo)記；成熟肽氨基酸為陰影部分氨基酸；下劃線 部分氨基酸為C端前體肽。因此，本發(fā)明提供一個(gè)西藏特里豚蝎抗菌肽：FIRIARLLRIF(SEQ ID NO:2)。
[0052] 本發(fā)明還提供了多肽在制備抗菌劑中的應(yīng)用；多肽具有（I )、（ II )所示的氨基 酸序列中任意一個(gè)：
[0053] ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0054] ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸獲得的氨基酸序列；
[0055] 其中，修飾包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化；取代為 取代1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)氨基酸；缺失為缺失1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)氨基酸；添 加為添加1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10氨基酸；且其不具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:53 或 SEQ ID NO:54 所述的氨基酸序列。作 為優(yōu)選，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0056] 在本明的一些實(shí)施例中，抗菌劑用于抑制細(xì)菌。
[0057] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性菌和/或革蘭氏陰性菌。
[0058] 抗菌結(jié)果表明合成多肽Ctryamp及其結(jié)構(gòu)同源多肽對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的革蘭氏陰性細(xì)菌大 腸桿菌CCTCCAB94012和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌金黃色葡萄球菌CCTCCAB94004的生長(zhǎng)具有高效抑 制作用。在6. 25 μ g/mL時(shí)，Ctryamp多肽及其結(jié)構(gòu)同源多肽對(duì)大腸桿菌CCTCCAB94012的 抑制率就可以達(dá)到100%，而在6. 25 μ g/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌CCTCCAB94004的抑制率 就可以達(dá)到100% (表2)。Ctryamp多肽對(duì)革蘭氏陰性菌，特別是致病性大腸桿菌和銅綠假 單胞菌增殖具有高效抑制作用（表3)，Ctryamp多肽對(duì)銅鋁價(jià)擔(dān)保桿菌的最小抑菌濃度為 8-16 μ g/mL?？咕Y(jié)果還表明Ctryamp多肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的增殖、厭氧菌的生長(zhǎng)具有 高效抑制作用（表3)。
[0059] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，革蘭氏陽(yáng)性菌為葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、分 枝桿菌屬、厭氧細(xì)菌或棒狀桿菌屬。抗菌結(jié)果表明合成Ctryamp多肽對(duì)臨床耐藥細(xì)菌（耐 甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌、耐紅霉素化膿性鏈球菌、耐青 霉素類(lèi)和頭孢類(lèi)，耐單酰胺類(lèi)，對(duì)喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、磺胺類(lèi)有交叉耐藥的產(chǎn)ESBLs大 腸埃希菌、耐亞胺培南的銅綠假單胞菌（IPM-R株））具有高效抑制作用（表3)。
[0060] 抗菌結(jié)果表明化學(xué)合成Ctryamp多肽對(duì)引起特異性感染的細(xì)菌（包括百日咳鮑特 菌、破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、志賀氏菌、傷寒沙門(mén)菌和白喉棒狀桿菌）具有高效抑制作 用（表3)。
[0061] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，革蘭氏陰性菌為奈瑟菌屬、腸道桿菌科、假單胞菌 屬、不動(dòng)桿菌屬、鮑特菌屬或嗜血桿菌屬。
[0062] 本發(fā)明還提供了多肽在制備預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染疾病和/或濕疹的藥物中的 應(yīng)用；多肽具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一個(gè)：
[0063] ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0064] ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸獲得的氨基酸序列；
[0065] 其中，修飾包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙?；?、泛素化、糖基化或羰基化；取代為 取代1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)氨基酸；缺失為缺失1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)氨基酸；添 加為添加1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10氨基酸；且其不具有如SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:53 或 SEQ ID N0:54 所述的氨基酸序列。作 為優(yōu)選，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0066] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，多肽在制備預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染疾病和/或濕疹 的藥物中的應(yīng)用中細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性菌和/或革蘭氏陰性菌。
[0067] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，多肽在制備預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染疾病和/或濕疹 的藥物中的應(yīng)用中革蘭氏陽(yáng)性菌為葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、分枝桿菌屬、厭氧細(xì) 菌或棒狀桿菌屬。
[0068] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，多肽在制備預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染疾病和/或濕 疹的藥物中的應(yīng)用中革蘭氏陰性菌為奈瑟菌屬、腸道桿菌科、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、鮑 特菌屬或嗜血桿菌屬。
[0069] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，多肽在制備預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染疾病和/或濕疹 的藥物中的應(yīng)用中感染為非特異性感染和/或特異性感染。
[0070] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，多肽在制備預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染疾病和/或濕疹 的藥物中的應(yīng)用中，非特異性感染為市、癰、丹毒、急性淋巴管炎、急性淋巴結(jié)炎、甲溝炎、膿 性指頭炎、手指?jìng)?cè)化膿性腱鞘炎、滑囊炎、掌深間隙感染、膿血癥、菌血癥。
[0071] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，多肽在制備預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染疾病和/或濕疹 的藥物中的應(yīng)用中，特異性感染為結(jié)核、破傷風(fēng)、氣性壞疽、炭疽、百日咳、流行性腦脊髓炎、 淋病、傷寒、細(xì)菌性痢疾或白喉。
[0072] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，感染為MRSA、MRCNS、耐紅霉素化膿性鏈球菌、產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌、銅綠假單胞菌亞胺培南耐藥株（IPM-R株）引起的感染。
[0073] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為金黃色葡萄球菌引起的局部感染、全身感染 或毒素性疾病。
[0074] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為凝固酶陰性葡萄球菌引起的泌尿系統(tǒng)感染、 敗血癥或術(shù)后感染。
[0075] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為鏈球菌引起的化膿性炎癥、風(fēng)濕熱與急性腎 小球腎炎、猩紅熱、細(xì)菌性肺炎、齲齒、亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎或新生兒感染。
[0076] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為肺炎鏈球菌引起的大葉性肺炎、氣管炎、中耳 炎、腦膜炎、胸膜炎、心內(nèi)膜炎或敗血癥。
[0077] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為無(wú)乳鏈球菌引起的孕婦產(chǎn)褥期膿毒血癥、新 生兒腦膜炎、產(chǎn)后感染、菌血癥、心內(nèi)膜炎、皮膚和軟組織感染或骨髓炎。
[0078] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為腸球菌引起的心血管系統(tǒng)感染或尿路感染。
[0079] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為屎腸球菌引起的尿路感染、化膿性腹部感染、 敗血癥、心內(nèi)膜炎或腹瀉發(fā)燒。
[0080] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為糞腸球菌引起的心內(nèi)膜炎，膽囊炎，腦膜炎， 尿路感染或傷口感染。
[0081] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為腦膜炎奈瑟菌引起的流行性腦脊髓炎。
[0082] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為淋病奈瑟菌引起的淋病。
[0083] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為埃希菌引起的泌尿系統(tǒng)感染、腸道外的化膿 性感染、腸道感染或出血性結(jié)腸炎。
[0084] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為志賀氏菌引起的細(xì)菌性痢疾。
[0085] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為沙門(mén)菌引起的傷寒與副傷寒。
[0086] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為肺炎克雷伯菌引起的肺炎、支氣管炎泌尿道 感染、創(chuàng)傷感染、腦膜炎或腹膜炎。
[0087] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為產(chǎn)酸克雷伯菌引起的抗生素相關(guān)性出血性結(jié) 腸炎。
[0088] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為枸櫞酸桿菌引起的肺炎或腦膜炎；
[0089] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為陰溝腸桿菌引起的皮膚軟組織感染、泌尿道 感染、呼吸道感染、腹部感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、眼部感染、傷口感染、心內(nèi)膜炎或敗血 癥；
[0090] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為沙雷菌引起的肺炎、泌尿道感染、菌血癥或手 術(shù)后感染。
[0091] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為破傷風(fēng)梭菌引起的破傷風(fēng)。
[0092] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的氣性壞疽或食物中毒等 臨床感染。
[0093] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為無(wú)芽孢厭氧菌引起的腹部感染、女性生殖道、 盆腔感染或菌血癥。
[0094] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為白喉棒狀桿菌引起的白喉。
[0095] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為痤瘡棒狀桿菌引起的痤瘡、粉刺。
[0096] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為銅綠假單胞菌引起的傷口感染、燒傷組織感 染等局部化膿性感染、肺部感染、泌尿道感染、中耳炎、角膜炎、心膜炎或敗血癥。
[0097] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為鮑曼不動(dòng)桿菌引起的呼吸道感染、菌血癥、泌 尿系感染、繼發(fā)性腦膜炎、手術(shù)部位感染或呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎。
[0098] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為百日咳鮑特菌引起的百日咳。
[0099] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為流感嗜血桿菌等嗜血桿菌屬細(xì)菌引起的嬰兒 及孩童菌血病癥、急性細(xì)菌性腦膜炎、蜂窩組織炎、骨髓炎或關(guān)節(jié)感染。
[0100] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病。
[0101] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，感染為慢性難愈合感染創(chuàng)面。
[0102] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，多肽在制備預(yù)防和/或治療濕疹的藥物中的應(yīng)用。
[0103] 本發(fā)明還提供了多肽在制備促進(jìn)組織修復(fù)和/或傷口愈合的藥物中的應(yīng)用；多肽 具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一個(gè)：
[0104] ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0105] ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸獲得的氨基酸序列；
[0106] 其中，修飾包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙?；⒎核鼗?、糖基化或羰基化；取代為 取代1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)氨基酸；缺失為缺失1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)氨基酸；添 加為添加1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10氨基酸；且其不具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:53 或 SEQ ID NO:54 所述的氨基酸序列。作 為優(yōu)選，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0107] 本發(fā)明還提供了多肽在制備治療燒傷、冷傷、擠壓傷、戰(zhàn)創(chuàng)傷、動(dòng)物咬傷、核放射傷 或復(fù)合傷的藥物中的應(yīng)用；多肽具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一個(gè)：
[0108] ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0109] ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸獲得的氨基酸序列；
[0110] 其中，修飾包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙?；⒎核鼗?、糖基化或羰基化；取代為 取代1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)氨基酸；缺失為缺失1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)氨基酸；添 加為添加1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10氨基酸；且其不具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:53 或 SEQ ID NO:54 所述的氨基酸序列。作 為優(yōu)選，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0111] 本發(fā)明還提供了一種編碼上述多肽的DNA分子，其具有I、11所示的核苷酸序列 中任意一個(gè)：
[0112] I具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
[0113] II具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)堿基 獲得的核苷酸序列。
[0114] 本發(fā)明構(gòu)建高質(zhì)量西藏特里豚蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)，具體包括蝎毒腺總RNA的分 離和mRNA純化，cDNA的第一鏈和第二鏈合成，雙鏈cDNA與pSPORTl載體的連接和轉(zhuǎn)化，獲 得蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)。在構(gòu)建文庫(kù)的基礎(chǔ)上，隨機(jī)挑選3000克隆子進(jìn)行測(cè)序，序列分析 發(fā)現(xiàn)第2007克隆子為一個(gè)新的西藏特里豚蝎抗菌肽基因，命名為Ctryamp，其序列為SEQ ID NO:3所不的核昔酸序列：ttcctctgtgaaagtaagttctgtgaaactcactcttcgataaaatgaaatct cagacctttttccttctttttctagttgttttattattagcaatttcacaatcagaagcttttatcaggatcgccag gctcctcaggatctttggaaaaagaagtatgagagatatggatactatgaaatacttatatgaaccaagtttgagtg cagctgacttgaaaaccttacaaaaactaatggaaaattactgattatttgaatataataatgttatctctatttta gattataaatatttcttttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa (圖 I) 〇
[0115] 本發(fā)明還提供了 一種重組載體，其含有上述DNA分子。
[0116] 本發(fā)明還提供了一種多肽的制備方法，包括以下步驟：
[0117] 獲得具有編碼如（I )或（II )所限定的氨基酸序列的DNA分子；
[0118] 取DNA分子與表達(dá)載體融合，構(gòu)建重組表達(dá)載體；
[0119] 取重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化體；
[0120] 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化體表達(dá)蛋白，經(jīng)分離純化，即得；
[0121] 其中（I )為：具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0122] ( II )為：具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或 多個(gè)氨基酸獲得的氨基酸序列。
[0123] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，多肽的制備方法中DNA分子為具有I、II所示的核苷 酸序列中任意一個(gè)：
[0124] I具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
[0125] II具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)堿基 獲得的核苷酸序列。
[0126] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，宿主細(xì)胞為原核系統(tǒng)宿主細(xì)胞或真核宿主細(xì)胞。
[0127] 作為優(yōu)選，原核系統(tǒng)宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
[0128] 本發(fā)明還提供了一種治療創(chuàng)面感染和/或促進(jìn)組織修復(fù)愈合的藥物制劑，由多肽 及藥學(xué)上可接受的輔料組成；其中，多肽具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一個(gè)：
[0129] ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0130] ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸獲得的氨基酸序列；
[0131] 其中，修飾包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙?；⒎核鼗?、糖基化或羰基化；取代為 取代1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)氨基酸；缺失為缺失1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)氨基酸；添 加為添加1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10氨基酸；且其不具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:53 或 SEQ ID NO:54 所述的氨基酸序列。作 為優(yōu)選，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，多肽占藥物制 劑的質(zhì)量百分含量為0.01 %?1.5%。
[0132] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，輔料包括羥丙甲基纖維素，羥丙甲基纖維素占所述藥 物制劑的質(zhì)量百分含量為7. 0%。
[0133] 作為優(yōu)選，以重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，本發(fā)明提供的藥物制劑由多肽0. 01?1. 5%、丙三醇 5%、羥丙甲基纖維素7%、乙醇酸0. 1%、EDTA0. 1%，余量為水組成。
[0134] 作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的藥物制劑為凝膠劑、粉針劑、氣霧劑、噴劑、擦劑、膜劑、貼 齊IJ、膏劑、軟膏劑、橡膠膏劑、水劑、湯劑、沖劑、片劑、丸劑、緩釋劑、控釋劑、粉劑、糊劑、搽 齊?、洗劑、涂膜劑、離子透人劑、滴眼劑、滴鼻劑、含漱劑、舌下片、吹人劑、栓劑、氣霧劑、吸入 齊?、煙劑、口服液、口服片、注射液、糖漿劑、煎膏劑、酒劑、散劑、顆粒劑、丸劑、片劑、膠囊劑、 灌腸劑或栓劑。
[0135] 本發(fā)明還提拱了多肽在制備飼料添加劑、保健品添加劑、食品添加劑、化妝品添加 劑中的應(yīng)用；多肽具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一個(gè)：
[0136] ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0137] ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸獲得的氨基酸序列；
[0138] 其中，修飾包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙?；⒎核鼗?、糖基化或羰基化；取代為 取代1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)氨基酸；缺失為缺失1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)氨基酸；添 加為添加1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10氨基酸；且其不具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:53 或 SEQ ID NO:54 所述的氨基酸序列。作 為優(yōu)選，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0139] 本發(fā)明提拱了一種多肽，其具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一個(gè)：
[0140] ( I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0141] ( II )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸獲得的氨基酸序列?？咕Y(jié)果表明合成多肽Ctryamp及其結(jié)構(gòu)同源多肽對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的 革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌CCTCCAB94012和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌金黃色葡萄球菌CCTCCAB94014 的生長(zhǎng)具有高效抑制作用。在6. 25yg/mL時(shí)，Ctryamp多肽及其結(jié)構(gòu)同源多肽對(duì)大腸 桿菌CCTCCAB94012的抑制率就可以達(dá)到100 %，而在6. 25 μ g/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌 CCTCCAB94014的抑制率就可以達(dá)到100%。進(jìn)一步抗菌結(jié)果表明合成Ctryamp多肽對(duì)革蘭 氏陰性菌，特別是致病性大腸桿菌和銅綠假單胞菌增殖具有高效抑制作用（表3)，Ctryamp 多肽對(duì)銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度為8-16 μ g/mL?？咕Y(jié)果還表明化學(xué)合成Ctryamp多 肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的增殖具有高效抑制作用（表3)?？咕Y(jié)果表明化學(xué)合成Ctryamp多 肽對(duì)厭氧菌的生長(zhǎng)具有高效抑制作用（表3)。Ctryamp多肽對(duì)臨床耐藥細(xì)菌（耐甲氧西林 金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌、耐紅霉素化膿性鏈球菌、耐青霉素類(lèi)和 頭孢類(lèi)，耐單酰胺類(lèi)，對(duì)喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、磺胺類(lèi)有交叉耐藥的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌、 耐亞胺培南的銅綠假單胞菌（IPM-R株））具有高效抑制作用（表3)。Ctryamp多肽對(duì)引起 特異性感染的細(xì)菌（包括百日咳鮑特菌、破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、志賀氏菌、傷寒沙門(mén) 菌和白喉棒狀桿菌）具有高效抑制作用（表3)。
[0142] 本發(fā)明還提供了外用凝膠抗菌制劑?？咕Y(jié)果表明其抗菌制劑對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì) 菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、厭氧菌、及臨床耐藥細(xì)菌具有高效抑制作用。其對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的革蘭氏陰性 細(xì)菌大腸桿菌CCTCCAB94012的最小抑菌濃度MIC為6. 25μ g/mL，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌金黃色 葡萄球菌CCTCCAB94004的最小抑菌濃度MIC為6. 25 μ g/mL，對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球 菌（MRSA)最小抑菌濃度MIC為6. 25 μ g/mL、對(duì)銅綠假單孢菌的最小抑菌濃度MIC為8 μ g/ mL、對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌最小抑菌濃度MIC為25 μ g/mL (表4)(按照制劑中有效成分抗菌多肽 Ctryamp多肽或其結(jié)構(gòu)同源多肽計(jì)算）。
[0143] 選用來(lái)醫(yī)院治療的各種外傷患者、體表慢性難愈合感染創(chuàng)面病人，所有病人隨機(jī) 分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組用制備的外用Ctryamp多肽抗菌凝膠制劑，對(duì)照組常規(guī)用藥 (給予5%的硫磺霜）。對(duì)于創(chuàng)面細(xì)菌感染，治療組82例患者創(chuàng)面均一期愈合，未出現(xiàn)感染 及創(chuàng)面延遲愈合，未出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)及其他不良反應(yīng)。根據(jù)衛(wèi)生部1988年頒布的抗菌藥物臨 床試驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)分為四級(jí)：痊愈、顯效，有效，無(wú)效。結(jié)果治療組82例中顯效80例，有效2 例，有效率100%。對(duì)照組74例中顯效50例，有效20例，無(wú)效4例，有效率95%，兩組經(jīng)統(tǒng) 計(jì)學(xué)F檢驗(yàn)，p < 0. 05。兩組促進(jìn)創(chuàng)面愈合時(shí)間比較見(jiàn)表5,經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)F檢驗(yàn)，p < 0. 05。 臨床治療結(jié)果表明，本發(fā)明提供的外用凝膠能有效的預(yù)防和治療細(xì)菌感染，特別對(duì)MRSA和 銅綠假單胞菌亞胺培南耐藥株（IPM-R株）有獨(dú)特的殺菌作用，同時(shí)能顯著的促進(jìn)傷口的修 復(fù)愈合。
[0144] 痤瘡治療的臨床觀察，選擇痤瘡、青春痘、粉刺患者258例為對(duì)象，記錄實(shí)驗(yàn)組（用 Ctryamp多肽外用抗菌凝膠制劑治療）、對(duì)照組兩組患者面部痤瘡皮損數(shù)目、變化和不良反 應(yīng)。按痤瘡各種損害（粉刺、炎性疤疹、膿瘡、結(jié)節(jié)、囊腫）減少的總百分率統(tǒng)計(jì)療效?？桂?瘡丙酸桿菌的抗菌制劑實(shí)驗(yàn)組有效率達(dá)到97%。而常規(guī)用藥對(duì)照組有效率為41%。兩組 療效差異有高度顯著性，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組對(duì)治療痤瘡療效優(yōu)于對(duì)照組。
[0145] 湖北省人民醫(yī)院燒傷整形外科用本發(fā)明的Ctryamp多肽外用抗菌凝膠制劑抗 治療了 22例慢性濕疹患者，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蝎肽抗菌凝膠對(duì)濕疹有獨(dú)特的療效，治愈率 100%，臨床隨訪無(wú)復(fù)發(fā)，而實(shí)驗(yàn)組臨床癥狀減輕，但隨訪復(fù)發(fā)嚴(yán)重。
[0146] 本發(fā)明還提供了以傳統(tǒng)中藥材蝎的活性多肽為有效成分配制的更為有效的治療 創(chuàng)面細(xì)菌感染和痤瘡、濕疹的新藥劑，用于治療創(chuàng)面細(xì)菌感染、體表慢性難愈合感染創(chuàng)面、 痤瘡、濕疹與促進(jìn)組織修復(fù)和傷口愈合，治療效果顯著。本發(fā)明也涉及了一種預(yù)防細(xì)菌感染 與促進(jìn)組織修復(fù)的添加劑，用于制備預(yù)防細(xì)菌感染與促進(jìn)組織修復(fù)的化妝品、保健品、飼料 等，預(yù)防細(xì)菌感染與促進(jìn)皮膚組織修復(fù)效果顯著。本發(fā)明所采用的原料均為傳統(tǒng)中藥材蝎 的活性成分，無(wú)毒副作用，不留后遺癥。此藥物或者添加劑能夠真正達(dá)到見(jiàn)效快、無(wú)副作用、 治愈后不復(fù)發(fā)的效果。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0147] 圖1示本發(fā)明提供的西藏特里豚蝎廣譜抗菌活性多肽Ctryamp基因及其氨基酸序 列；
[0148] 圖2西藏特里豚蝎廣譜抗菌活性多肽Ctryamp的純度；
[0149] 圖3西藏特里豚蝎廣譜抗菌活性多肽Ctryamp質(zhì)譜。

【具體實(shí)施方式】
[0150] 本發(fā)明公開(kāi)了一種多肽、編碼該多肽的DNA分子、載體、制備方法及應(yīng)用，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換 和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法 及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范 圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0151] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0152] 實(shí)施例1西藏特里豚蝎廣譜抗菌活性多肽基因的制備
[0153] A :西藏特里豚蝎毒腺總RNA的提取（Trizol LS-步法：Trizol LS購(gòu)自美國(guó) Invitrogen)
[0154] ①取500mg的蝎尾腺在液氮中研成細(xì)粉末，加入IOmL TRIZOL試劑混勻，室溫 (20-25°C，以下相同）放置5分鐘；②然后加入2mL氯仿混合15秒，室溫放置2-3分鐘，4°C 下12000g離心15分鐘；③取水相加1倍體積異丙醇，室溫放置10分鐘，4°C下12000g離 心10分鐘得RNA沉淀；④沉淀用5ml75%乙醇洗滌，7500g離心5分鐘；⑤RNA沉淀干燥后 溶于DEPC處理水，55-60°C保溫10分鐘以徹底溶解RNA。整個(gè)過(guò)程參照TRlZOL (Total RNA Isolation) Reagent Kit推薦方法進(jìn)行。制備的蝎毒腺總RNA采用甲醒變性凝膠電泳檢測(cè) 其質(zhì)量。得到了高質(zhì)量的蝎毒腺總RNA。
[0155] B:mRNA的分離純化
[0156] 采用PolyA Tract mRNA分離系統(tǒng)（Promega, USA)分離和純化mRNA,其工作原理是 基于Oligo (dT)與mRNA3'端poly (A)尾的互補(bǔ)配對(duì)特性，用生物素標(biāo)記Oligo (dT)，通過(guò)它 與mRNA3'端poly (A)的退火形成雜交體，然后用標(biāo)有親合素的磁珠和磁性分離架捕獲并洗 滌生物素 Oligo (dT)/mRNA雜交體，最后用無(wú) RNA酶的滅菌雙蒸水（CldH2O)將之洗脫下來(lái)，達(dá) 到從總RNA中分離mRNA的目的。①樣品的制備：將RNA加入到含有32 μ LP -巰基乙醇的 800yL的結(jié)合緩沖液中。②探針的退火：取250ρΜ濃度01igo(dT)5yL，加蒸餾水至50yL ; 加入 1.6mL 預(yù)熱的 dilution buffer (dilution buffer 已加入 32 μ LP -巰基乙醇），與 RNA混勻，70°C溫育5分鐘。③磁珠的活化：取I. 2mL的磁珠 SA-PMPS(購(gòu)自美Promega) 于I. 5mL的離心管中；用0. 5X SSC重懸SA-PMPS，以磁架吸附磁珠，原體積0. 5X SSC洗滌 SA-PMPS3次。④mRNA的獲?。簩?0°C溫育的RNA與SA-PMPS混合，室溫放置5分鐘放磁架 上吸附磁珠，棄上清液；2mL的0. 5XSSC懸浮磁珠，洗滌重復(fù)2次，最后一次盡量去除SSC ;加 入無(wú) RNA酶的CldH2O至磁珠中，輕輕混勻，然后離心（12000gX3分鐘）或磁架吸附磁珠；取 上清，獲得mRNA。通過(guò)電泳和紫外測(cè)定mRNA的濃度和純度。⑤mRNA的沉淀：將④獲得的 mRNA中加入糖原和2. 5倍體積的無(wú)水乙醇，沉淀過(guò)夜，mRNA將用于cDNA的合成。
[0157] C:第一鏈 cDNA 合成
[0158] ①在 I. 5mL Ep 管中力口入 2 μ L Not I Primer-adapter 和 6 μ L mRNA (含 3 μ gmRNA)，70°C溫育IOmin,迅速放于冰上，離心后，加入下列成分：4 μ L5Xfirst strand buffer ;2μ?λ IM DTT ;lyL10mM dNTPs ;lyL H20。輕輕混勻后離心，37°C放至 2min ;②加 入5 μ L逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻后取2 μ L，加 I μ L [ a -32P] dCTP (4 μ Ci)(示蹤管）。與上述反應(yīng)組分 (樣品管）同時(shí)37°C溫育lh，然后放入冰上終止反應(yīng)；③對(duì)于示蹤管，依次加入43yL20mM EDTA和5 μ L酵母tRNA，混勻后，分別取兩份10 μ L點(diǎn)于兩張濾膜上，1份用10% TCA洗3次， 每次5min，95%乙醇洗1次，空氣干燥后，放入1.5mL閃爍液中（為1#樣品）；另1份空氣干 燥后，放入I. 5mL閃爍液（為2#樣品）。另30 μ L示蹤液，加1. 5 μ L7. 5M醋酸氨（NH4Oac) 和90 μ L無(wú)水乙醇（_20°C )，混勻后立即14, OOOrpm離心20min，棄上清，加入0. 5mL70%無(wú) 水乙醇（_20°C )，14,000rpm離心2min，棄上清，37°C干燥IOmin讓乙醇揮發(fā)，溶于IOyL TEN溶液，加入10 μ L2X加樣緩沖液，取10 μ L用于堿性凝膠電泳。用[a -32P]dCTP標(biāo)記 λ DNA HindIII片段作分子量標(biāo)記；④混勻后室溫下放置15min，加入2 μ L0. 2M EDTA終止 反應(yīng)。取6 μ L反應(yīng)液和6mL2X堿性電泳緩沖液混勻，電泳5h后，用7% TCA浸泡20min，直 至溴酚蘭變黃。然后用衛(wèi)生紙吸干（8h左右），進(jìn)行放射自顯影；⑤對(duì)于樣品管，用于第二 鏈的合成。
[0159]

【權(quán)利要求】
1. 一種多肽，其特征在于，其具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一個(gè)： (I )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； (Π )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基 酸獲得的氨基酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述修飾包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙 酰化、泛素化、糖基化或羰基化。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述取代為取代1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5 個(gè)氨基酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述缺失為缺失1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5 個(gè)氨基酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述添加為添加1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5 個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10個(gè)氨基酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，其不具有SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:53 或 SEQ ID NO:54 所述的氨基酸序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，其具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:22?SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 36 ?SEQ ID NO: 45 或 SEQ ID NO: 52 中任意一個(gè)所 示的氨基酸序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的多肽在制備抗菌劑中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗菌劑抑制細(xì)菌。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性菌和/或革蘭氏 陰性菌。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于，所述革蘭氏陽(yáng)性菌為葡萄球菌屬、鏈球 菌屬、腸球菌屬、分枝桿菌屬、厭氧細(xì)菌或棒狀桿菌屬。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌為奈瑟菌屬、腸道桿 菌科、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、鮑特菌屬或嗜血桿菌屬。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的多肽在制備預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染疾病和/ 或濕疹的藥物中的應(yīng)用。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性菌和/或革蘭氏 陰性菌。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于，所述革蘭氏陽(yáng)性菌為葡萄球菌屬、鏈球 菌屬、腸球菌屬、分枝桿菌屬、厭氧細(xì)菌或棒狀桿菌屬。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌為奈瑟菌屬、腸道桿 菌科、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、鮑特菌屬或嗜血桿菌屬。
17. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于，所述感染為非特異性感染和/或特異性 感染。
18. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于，所述非特異性感染為癤、癰、丹毒、急性 淋巴管炎、急性淋巴結(jié)炎、甲溝炎、膿性指頭炎、手指?jìng)?cè)化膿性腱鞘炎、滑囊炎、掌深間隙感 染、膿血癥、菌血癥。
19. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于，所述特異性感染為結(jié)核、破傷風(fēng)、氣性 壞疽、炭疽、百日咳、流行性腦脊髓炎、淋病、傷寒、細(xì)菌性痢疾或白喉。
20.根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于，所述感染為MRSA、MRCNS、耐紅霉素化膿 性鏈球菌、產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌、銅綠假單胞菌亞胺培南耐藥株引起的感染； 或所述感染為金黃色葡萄球菌引起的局部感染、全身感染或毒素性疾?。? 或所述感染為凝固酶陰性葡萄球菌引起的泌尿系統(tǒng)感染、敗血癥或術(shù)后感染； 或所述感染為鏈球菌引起的化膿性炎癥、風(fēng)濕熱與急性腎小球腎炎、猩紅熱、細(xì)菌性肺 炎、齲齒、亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎或新生兒感染； 或所述感染為肺炎鏈球菌引起的大葉性肺炎、氣管炎、中耳炎、腦膜炎、胸膜炎、心內(nèi)膜 炎或敗血癥； 或所述感染為無(wú)乳鏈球菌引起的孕婦產(chǎn)褥期膿毒血癥、新生兒腦膜炎、產(chǎn)后感染、菌血 癥、心內(nèi)膜炎、皮膚和軟組織感染或骨髓炎； 或所述感染為腸球菌引起的心血管系統(tǒng)感染或尿路感染； 或所述感染為屎腸球菌引起的尿路感染、化膿性腹部感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎或腹瀉發(fā) 燒； 或所述感染為糞腸球菌引起的心內(nèi)膜炎，膽囊炎，腦膜炎，尿路感染或傷口感染； 或所述感染為腦膜炎奈瑟菌引起的流行性腦脊髓炎； 或所述感染為淋病奈瑟菌引起的淋??； 或所述感染為埃希菌引起的泌尿系統(tǒng)感染、腸道外的化膿性感染、腸道感染或出血性 結(jié)腸炎； 或所述感染為志賀氏菌引起的細(xì)菌性痢疾； 或所述感染為沙門(mén)菌引起的傷寒與副傷寒； 或所述感染為肺炎克雷伯菌引起的肺炎、支氣管炎泌尿道感染、創(chuàng)傷感染、腦膜炎或腹 膜炎； 或所述感染為產(chǎn)酸克雷伯菌引起的抗生素相關(guān)性出血性結(jié)腸炎； 或所述感染為枸櫞酸桿菌引起的肺炎或腦膜炎； 或所述感染為陰溝腸桿菌引起的皮膚軟組織感染、泌尿道感染、呼吸道感染、腹部感 染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、眼部感染、傷口感染、心內(nèi)膜炎或敗血癥； 或所述感染為沙雷菌引起的肺炎、泌尿道感染、菌血癥或手術(shù)后感染； 或所述感染為破傷風(fēng)梭菌引起的破傷風(fēng)； 或所述感染為產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的氣性壞疽或食物中毒； 或所述感染為無(wú)芽孢厭氧菌引起的腹部感染、女性生殖道、盆腔感染或菌血癥； 或所述感染為白喉棒狀桿菌引起的白喉； 或所述感染為痤瘡棒狀桿菌引起的痤瘡、粉刺； 或所述感染為銅綠假單胞菌引起的傷口感染、燒傷組織感染、肺部感染、泌尿道感染、 中耳炎、角膜炎、心膜炎或敗血癥； 或所述感染為鮑曼不動(dòng)桿菌引起的呼吸道感染、菌血癥、泌尿系感染、繼發(fā)性腦膜炎、 手術(shù)部位感染或呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎； 或所述感染為百日咳鮑特菌引起的百日咳； 或所述感染為流感嗜血桿菌等嗜血桿菌屬細(xì)菌引起的嬰兒及孩童菌血病癥、急性細(xì)菌 性腦膜炎、蜂窩組織炎、骨髓炎或關(guān)節(jié)感染； 或所述感染為結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病； 或所述感染為慢性難愈合感染創(chuàng)面。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的多肽在制備促進(jìn)組織修復(fù)和/或傷口愈合的藥 物中的應(yīng)用。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的多肽在制備治療燒傷、冷傷、擠壓傷、戰(zhàn)創(chuàng)傷、動(dòng) 物咬傷、核放射傷或復(fù)合傷的藥物中的應(yīng)用。
23. -種編碼如權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的多肽的DNA分子，其特征在于，其具有I、 Π 所示的核苷酸序列中任意一個(gè)： I具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列； Π 具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)堿基獲得 的核苷酸序列。
24. -種重組載體，其特征在于，其含有如權(quán)利要求23所述的DNA分子。
25. -種多肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 獲得具有編碼如（I )或（II )所限定的氨基酸序列的DNA分子； 取所述DNA分子與表達(dá)載體融合，構(gòu)建重組表達(dá)載體； 取所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化體； 誘導(dǎo)所述轉(zhuǎn)化體表達(dá)蛋白，經(jīng)分離純化，即得； 所述的（I )為：具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； 所述的（II )為：具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè) 或多個(gè)氨基酸獲得的氨基酸序列。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的制備方法，其特征在于，所述DNA分子為具有I、II所示的 核苷酸序列中任意一個(gè)： I具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列； Π 具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)堿基獲得 的核苷酸序列。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的制備方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為原核系統(tǒng)宿主細(xì) 胞或真核宿主細(xì)胞。
28. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的制備方法，其特征在于，所述原核系統(tǒng)宿主細(xì)胞為大腸桿 菌。
29. -種治療創(chuàng)面感染和/或促進(jìn)組織修復(fù)愈合的藥物制劑，其特征在于，由如權(quán)利要 求1至7任一項(xiàng)所述的多肽及藥學(xué)上可接受的輔料組成。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的藥物制劑，其特征在于，所述多肽占所述藥物制劑的質(zhì)量 百分含量為〇· 01%?1. 5%。
31. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的藥物制劑，其特征在于，所述輔料包括羥丙甲基纖維素，所 述羥丙甲基纖維素占所述藥物制劑的質(zhì)量百分含量為7. 0%。
32. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的藥物制劑，其特征在于，以重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，其由如權(quán)利要求 1至7任一項(xiàng)所述的多肽0. 01?1. 5 %、丙三醇5 %、輕丙甲基纖維素7 %、乙醇酸0. 1 %、 EDTA0. 1%，余量為水組成。
33. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的藥物制劑，其特征在于，其為凝膠劑、粉針劑、氣霧劑、噴 劑、擦劑、膜劑、貼劑、膏劑、軟膏劑、橡膠膏劑、水劑、湯劑、沖劑、片劑、丸劑、緩釋劑、控釋 齊?、粉劑、糊劑、搽劑、洗劑、涂膜劑、離子透入劑、滴眼劑、滴鼻劑、含漱劑、舌下片、吹入劑、 栓劑、氣霧劑、吸入劑、煙劑、口服液、口服片、注射液、糖漿劑、煎膏劑、酒劑、散劑、顆粒劑、 丸劑、片劑、膠囊劑、灌腸劑或栓劑。
34. 根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的多肽在制備飼料添加劑、保健品添加劑、食品添 力口劑、化妝品添加劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K38/08GK104292298SQ201410327573
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月17日
【發(fā)明者】李文鑫, 曹志賤, 吳英亮, 王澤勝, 韓松 申請(qǐng)人:武漢摩爾生物科技有限公司