本發(fā)明涉及單域重鏈抗體技術(shù)(又稱納米抗體技術(shù))，以及基因工程抗體技術(shù)，特別是針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體或多肽。

技術(shù)背景

黃曲霉毒素(aflatoxin)是由黃曲霉(aspergillusflavus)、寄生曲霉(aspergillusparasiticus)、集蜂曲霉(aspergillusnomius)和溜曲霉(aspergillustamarii)等真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有強(qiáng)致癌性和強(qiáng)免疫抑制性。黃曲霉毒素是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的二呋喃香豆素衍生物，主要包括黃曲霉毒素b1(afb1)、b2(afb2)、g1(afg1)、g2(afg1)和m1(afm1)等。在已發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素中，黃曲霉毒素b1的毒性最強(qiáng)，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為ⅰ類致癌物。產(chǎn)毒真菌菌株廣泛存在于自然界中，糧食油料等農(nóng)產(chǎn)品在生產(chǎn)、加工以及儲(chǔ)藏等過(guò)程中均可能受到污染，導(dǎo)致黃曲霉毒素超標(biāo)。我國(guó)是黃曲霉毒素污染情況較為嚴(yán)重的地區(qū)。因此，開發(fā)穩(wěn)定、快速、高靈敏、高通量的黃曲霉毒素檢測(cè)方法，對(duì)于保障我國(guó)食品安全、減少由此帶來(lái)的損失具有重要意義。

現(xiàn)有的黃曲霉毒素檢測(cè)方法主要有免疫分析法、儀器分析法以及薄層層析法。其中免疫分析法可避免其它兩類方法存在的一些缺陷，具有靈敏度高、成本低以及可現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。免疫分析法的原理是基于抗原抗體的特異性識(shí)別，抗體的性能是免疫分析方法靈敏度、準(zhǔn)確度等指標(biāo)的決定性因素。因此獲得針對(duì)黃曲霉毒素的抗體是建立相關(guān)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的前提和關(guān)鍵。

單域重鏈抗體(又稱納米抗體)是由羊駝重鏈抗體的可變區(qū)組成，又稱為納米抗體，具有耐酸堿、耐高溫以及易于生產(chǎn)等特性。這些特性對(duì)于黃曲霉毒素的低成本、可重復(fù)使用的免疫學(xué)檢測(cè)方法有重要的實(shí)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體，可以被用于制備檢測(cè)黃曲霉毒素的試劑和工具。

本發(fā)明提供一個(gè)針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體(即本發(fā)明能特異識(shí)別afb1的納米抗體，下同)，具有seqidno.:1、seqidno.:3、seqidno.:5、seqidno.:7、seqidno.:9、seqidno.:11、seqidno.:13所示的氨基酸序列。

其氨基酸序列的imgt編號(hào)和結(jié)構(gòu)域的劃分包括四個(gè)框架區(qū)(frameworkregion,fr)和三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity-determiningregion,cdr)。

本發(fā)明提供一個(gè)核酸分子，其特征是編碼seqidno.:1，通過(guò)遺傳密碼子可以隨時(shí)獲得該核酸分子的具體序列。

本發(fā)明還提供一個(gè)核酸分子，其特征是編碼seqidno.:1、seqidno.:3、seqidno.:5、seqidno.:7、seqidno.:9、seqidno.:11、seqidno.:13部分結(jié)構(gòu)域，通過(guò)遺傳密碼子可以隨時(shí)獲得該核酸分子的具體序列。對(duì)應(yīng)的，可以為seqidno.:2、seqidno.:4、seqidno.:6、seqidno.:8、seqidno.:10、seqidno.:12、seqidno.:14核酸分子。

本發(fā)明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通過(guò)合適的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)以得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽。這些表達(dá)系統(tǒng)包括細(xì)菌，酵母菌，絲狀真菌，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞，或無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。

本發(fā)明還提供一種載體，包含所述核酸序列。由于遺傳密碼子具有簡(jiǎn)并性，該核酸序列可以根據(jù)不同的應(yīng)用目的而不同。

本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，包括所述蛋白質(zhì)或表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供一種檢測(cè)黃曲霉毒素的方法，含有本發(fā)明所述針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體。基于本發(fā)明提供的針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體與黃曲霉毒素特異性結(jié)合的能力，建立黃曲霉毒素的檢測(cè)方法。其中，優(yōu)選的方法包括酶連免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)，熒光免疫法(fluoroimmunoassay,fia)，免疫芯片法，親和層析法和免疫層析法等。

本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過(guò)隨機(jī)或定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行改造，能夠獲得性質(zhì)(水溶性、穩(wěn)定性、親和力以及特異性等)更好的突變體。

本發(fā)明還涉及前述針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體在免疫檢測(cè)、黃曲霉毒素富集以及純化中的應(yīng)用。這些免疫檢測(cè)指的是非疾病診斷治療目的的免疫檢測(cè)。

本發(fā)明所敘述的一些術(shù)語(yǔ)具有如下含義：

結(jié)構(gòu)域：蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位，通常具有一定的功能。

imgt編號(hào)：imgt數(shù)據(jù)庫(kù)(theinternationalimmunogeneticsdatbase)中的一種已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的抗體氨基酸序列編號(hào)方法。具體編號(hào)方法可以參考文獻(xiàn)(ehrenman,f.,q.kaas,et.al.(2010).imgt/3dstructure-dbandimgt/domaingapalign：adatabaseandatoolforimmunoglobulinsorantibodies,tcellreceptors,mhc,igsfandmhcsf.nucleicacidsres38(databaseissue):d301-307.lefranc,m.p.,c.pommie,etal.(2003).imgtuniquenumberingforimmunoglobulinandtcellreceptorvariabledomainsandigsuperfamilyv-likedomainsdevcompimmunol27(1):55-77.)中的描述。

密碼子(codon)：又稱為三連體密碼子(tripletcode)，指對(duì)應(yīng)于某種氨基酸的核苷酸三聯(lián)體。在轉(zhuǎn)譯過(guò)程中決定該種氨基酸插入生長(zhǎng)中多肽鏈的位置。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)單域重鏈抗體(多肽)的制備、分析及應(yīng)用，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，這些具體實(shí)施例不應(yīng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。

實(shí)施例1：

抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體(即針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體)免疫文庫(kù)的構(gòu)建

將黃曲霉毒素b1與匙孔血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemocyanin，klh)共價(jià)偶聯(lián)，得到黃曲霉毒素人工抗原afb1-klh，取300μgafb1-klh與弗氏完全佐劑乳化后，對(duì)羊駝(lamapacos)進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射免疫。加強(qiáng)免疫采用150μgafb1-klh與弗氏不完全佐劑乳化，間隔2周進(jìn)行，每次免疫7天后靜脈取血，采用間接elisa法測(cè)定血清效價(jià)，選擇血清效價(jià)最高的樣品分離淋巴細(xì)胞，提取rna。

rna的提取參照takara公司rnaiso試劑說(shuō)明書進(jìn)行。以rna為模板，oligodt為引物，參照takara公司反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書合成cdna第一鏈。

采用primestar高保真dna聚合酶，經(jīng)巢式pcr獲得重鏈抗體的可變區(qū)編碼基因(采用的引物見表1)。第一輪pcr分別以引物alpvh-ld和ch2-r擴(kuò)增cdna，反應(yīng)條件為，98℃，10s，55℃，20s，72℃，1min，20個(gè)循環(huán)，98℃，10s，68℃，1min，72℃延伸10min。

將第一輪pcr產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳，回收600bp～750bp的dna片段，作為第二輪pcr的模板，分別用引物alpvh-sfii和alpvhhr1-noti，alpvh-sfii和alpvhhr2-noti，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為，98℃，10s，50℃，20s，72℃，40s，5個(gè)循環(huán)，98℃，10s，68℃，40s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。經(jīng)dna片段回收試劑盒回收、定量，于-20℃保存?zhèn)溆?。將噬菌粒phen1和pcr擴(kuò)增產(chǎn)物分別用sfii、noti雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、定量后，以1∶3摩爾比，在16℃，過(guò)夜連接。

表1文庫(kù)構(gòu)建及鑒定所用的引物

注：下劃線表示限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列

連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，溶于10μl無(wú)菌水，分十次進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌tg1。取10μl電擊、培養(yǎng)后的菌液倍比稀釋，涂布氨芐青霉素2×yt培養(yǎng)板，37℃，倒置培養(yǎng)12～16h，采用引物m13-r和phen-r進(jìn)行菌落pcr，計(jì)算庫(kù)容；其余部分全部涂布于24cm×24cm氨芐青霉素2×yt培養(yǎng)板，37℃，倒置培養(yǎng)12～16h。用10ml，2×yt培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的菌苔刮洗后，加入終濃度15～30％甘油，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)計(jì)算的庫(kù)容量結(jié)果，接種10倍庫(kù)容量的活細(xì)胞于20ml的2×yt(含2％葡萄糖，100μg/ml氨芐青霉素)，30℃，220r/min培養(yǎng)至od600達(dá)0.5，按感染復(fù)數(shù)20∶1加入輔助噬菌體，37℃，220r/min，60min。將培養(yǎng)物離心，用50ml的2×yt(含100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素)重懸沉淀，30℃，220r/min過(guò)夜培養(yǎng)后，3000g離心取上清，加入5×peg/nacl溶液，冰上放置1h或4℃過(guò)夜，12000rpm離心30min，重懸沉淀于含10％甘油的磷酸緩沖液(pbs，0.01m，ph7.4)，即得到抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體免疫文庫(kù)，取10μl測(cè)定滴度，其余分裝于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2：

抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的淘選與鑒定

采用固相親和淘選的方法從實(shí)施例1所得抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體免疫文庫(kù)文庫(kù)中淘選針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體。將afb1與卵清白蛋白(albumin，ova)共價(jià)偶聯(lián)，得到人工抗原afb1-ova。每孔加入100μl用pbs稀釋的人工抗原afb1-ova，4℃，包被過(guò)夜，每輪淘選的包被濃度分別為100，75，50μg/ml；吸出包被液，pbs洗板3次，每孔加入300μl3％bsa-pbs，37℃，封閉2h；pbs洗板6次，加入100μl噬菌體抗體文庫(kù)(約含2×10¹¹cfu)，37℃，孵育1.5h；吸出未結(jié)合的噬菌體，用pbst(含0.5％tween-20)洗板5次(逐輪增加5次)，再用pbs洗板10次(洗板次數(shù)逐輪增加5次)；以100μl洗脫液(甘氨酸-鹽酸，ph2.2)洗脫吸附在酶標(biāo)孔中的噬菌體，用50μltris-hcl(1mol/l，ph8.0)中和洗脫物，取10μl用于滴度測(cè)定，其余洗脫物擴(kuò)增后用于下一輪淘選。第二輪和第三輪淘選采用競(jìng)爭(zhēng)洗脫，分別用50和25ng/ml的afb1溶液在37℃，孵育1h。

經(jīng)三輪淘選后，采用輔助噬菌體km13對(duì)隨機(jī)挑取的單克隆進(jìn)行救援，分別得到展示抗體可變區(qū)的噬菌體顆粒，再用間接phage-elisa和間接競(jìng)爭(zhēng)phage-elisa測(cè)定噬菌體顆粒的結(jié)合活性和特異性，實(shí)驗(yàn)設(shè)定陰性對(duì)照及背景對(duì)照，具體加樣步驟見表2。

表2間接phage-elisa加樣表

將elisa陽(yáng)性克隆送生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行序列測(cè)定，得到插入片段的dna序列，其編碼針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體，具體如下：

g8(seqidno.:2):

cagttgcagctcgtggagtcagggggaggattggtgcaggctggggactctctgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgtagcgactctttggtggactgttggtgccccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctctagagacaacgacaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccacgtattactgtgcattagataaccgccgcagttatgttgattaccactccgtaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca

g4(seqidno.:4)：

caggtgcagctcgtggagtctgggggaggattggtgcaggctgggggctctacgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgtagcgactatttggtggactgttggtgccccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctctagagacaacgacaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccatttattactgtgcattagataaccgccgcagttatgttgattactactccgtaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca

d7：(seqidno.:6)：

cagttgcagctcgtggagtccggtggaggcttggtgcaggttggggggtctctgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgtagcaactatttggtggactgttggtgctccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctctagagacaacgccaagaacacggtatatctgcaaatgaatagcctgaaagttgaggacacggccatttattactgtgcattagataaccgccgcagttatgttaattactactcctcaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca

c6:(seqidno.:8)：

caggtgcagctcgtggagtcggggggaggattggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtacagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgttgcgactatttggtggactgttggtgccccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctctagagacaacgacaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccatttattactgtgcattagataatcgccgcagttatgttgattaccactccgtaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca

h4:(seqidno.:10)：

cagttgcagctcgtggagtcggggggaggattggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtacagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgttgcgactatttggtggactgttggtgccccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctctagagacaacgacaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccatttattactgtgcattagataatcgccgcagttatgttgattaccactccgtaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca

h8：(seqidno.:12)：

caggtgcagctcgtggagtcggggggaggagcggtgcaggctgggggctctttgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgttgcgactatttggtggacttttgatgccccatactatgcagactccgtgaagggtcgattcaccatctctagagacaacgacaagaacacggtgtatctacaaatgaacaacctgagccctgaggacacggccatttattactgtgcattagataatcgccgcagttatgttgattaccgctccgtaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca

e12:(seqidno.:14)：

cagttgcagctcgtggagtcggggggaggcttggtgcagcctggggggtctctcacactctcctgtgcagcctctggacgcaccttcacaacgtatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgtagcaactatgtggtggactgttggtgccccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatcactagagacagcgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttattactgtgcgttagatacccgccgcagttatgttgattaccgctcctcaagtgagtatgattactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca

依據(jù)dna測(cè)序結(jié)果及密碼子表可獲得相應(yīng)的針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體的氨基酸序列：

g8(seqidno.:1)：

qlqlvesggglvqagdslrlscaasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatlwwtvgapyyadsvkgrftisrdndkntvylqmnslkpedtatyycaldnrrsyvdyhsvseydywgqgtqvtvss

g4(seqidno.:3)：

qvqlvesggglvqaggstrlscaasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatiwwtvgapyyadsvkgrftisrdndkntvylqmnslkpedtaiyycaldnrrsyvdyysvseydywgqgtqvtvss

d7：(seqidno.:5)：

qlqlvesggglvqvggslrlscaasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatiwwtvgapyyadsvkgrftisrdnakntvylqmnslkvedtaiyycaldnrrsyvnyyssseydywgqgtqvtvss

c6:(seqidno.:7)：

qvqlvesggglvqaggslrlsctasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatiwwtvgapyyadsvkgrftisrdndkntvylqmnslkpedtaiyycaldnrrsyvdyhsvseydywgqgtqvtvss

h4:(seqidno.:9)：

qlqlvesggglvqaggslrlsctasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatiwwtvgapyyadsvkgrftisrdndkntvylqmnslkpedtaiyycaldnrrsyvdyhsvseydywgqgtqvtvss

h8:(seqidno.:11)：

qvqlvesgggavqaggslrlscaasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatiwwtfdapyyadsvkgrftisrdndkntvylqmnnlspedtaiyycaldnrrsyvdyrsvseydywgqgtqvtvss

e12:(seqidno.:13)：

qlqlvesggglvqpggsltlscaasgrtfttygmgwfreapgkerefvatmwwtvgapyyadsvkgrftitrdsakntvylqmnslkpedtavyycaldtrrsyvdyrssseydywgqgtqvtvss

采用間接競(jìng)爭(zhēng)phage-elisa法對(duì)陽(yáng)性克隆與幾種不同黃曲霉毒素亞型的交叉反應(yīng)率進(jìn)行測(cè)定，將afb1、afb2、afg1、afg2和afm1五種標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至12個(gè)不同的工作濃度，在同樣的條件下進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)phage-elisa測(cè)定，分別繪制競(jìng)爭(zhēng)elisa曲線，計(jì)算抑制率為50％時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ic50)，按照公式：交叉反應(yīng)率(％)＝(afb1ic50/類似物ic50)×100％，所述類似物為afb2、afg1、afg2或afm1，得到本發(fā)明陽(yáng)性克隆(針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體)對(duì)于afb1的50％抑制濃度。結(jié)果表明，本發(fā)明陽(yáng)性克隆(針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體)對(duì)于afb1具有較好的特異性，對(duì)afg1和afg2也有一定的結(jié)合能力。

實(shí)施例3：

抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的規(guī)模制備

編碼抗afb1單域重鏈抗體的dna片段的獲取：1.采用限制性內(nèi)切酶sfii/noti，雙酶切噬菌粒phen-抗afb1單域重鏈抗體基因，瓊脂糖凝膠電泳回收抗afb1單域重鏈抗體基因；2.直接將抗afb1單域重鏈抗體編碼序列送生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行化學(xué)合成；3.設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)pcr技術(shù)從羊駝(lamapacos)來(lái)源的cdna庫(kù)中擴(kuò)增。

將得到的抗afb1單域重鏈抗體基因片段克隆至表達(dá)載體pet25，經(jīng)pcr和酶切鑒定，構(gòu)建完成抗afb1單域重鏈抗體的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒。

將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21，挑取單菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將單菌落接入4mllba(luria-bertanibrothwith100μg/mlampicillin)液體培養(yǎng)基中，37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)12h；以1％培養(yǎng)基體積的接種量將其轉(zhuǎn)接到50mllba液體培養(yǎng)基中，37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)至od600達(dá)到0.5(約需2.5～3h)，加入終濃度0.1mm的iptg，30℃、200r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)。

誘導(dǎo)培養(yǎng)物8000r/min離心，在細(xì)胞沉淀中加入20ml磷酸緩沖液(ph7.4)混勻，8000r/min離心，去上清，保留細(xì)胞沉淀；在細(xì)胞沉淀中加入10ml相同緩沖液，混勻，冰上超聲波細(xì)胞破碎處理，超聲破碎條件為200w，破碎2s，間歇3s，共240個(gè)循環(huán)，在4℃下對(duì)細(xì)胞破碎物12000r/min離心20min，取上清進(jìn)行親和層析純化和sds-page電泳分析，或在上清中加入終濃度30％的甘油，混勻，保存于-20℃冰柜待用。

通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件(如宿主菌、表達(dá)載體、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間、溫度以及iptg濃度等)，可以進(jìn)一步提高目的蛋白(單域重鏈抗體)表達(dá)量，為大量制備抗afb1單域重鏈抗體提供了途徑。

實(shí)施例4：

抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的融合表達(dá)

將本發(fā)明抗afb1單域重鏈抗體基因克隆至融合表達(dá)載體pap，經(jīng)pcr和酶切鑒定，構(gòu)建完成抗afb1單域重鏈抗體的堿性磷酸酶融合表達(dá)質(zhì)粒。

堿性磷酸酶可以非特異性催化磷酸單酯水解生成無(wú)機(jī)磷酸和相應(yīng)的醇、酚或糖類化合物。該酶常作為信號(hào)標(biāo)簽用于elisa、免疫印跡、組織化學(xué)等檢測(cè)方法。融合表達(dá)質(zhì)粒將抗afb1單域重鏈抗體融合于堿性磷酸酶的n端，參考應(yīng)用實(shí)例2中的表達(dá)方法，可以在大腸桿菌中表達(dá)、純化出融合蛋白ap-抗afb1單域重鏈抗體基因。

實(shí)施例5：

抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體用于黃曲霉毒素b1的檢測(cè)

樣品準(zhǔn)備：稱取不含黃曲霉毒素的花生、玉米樣品各三份，分別加入afb1標(biāo)準(zhǔn)品10μg/kg,50μg/kg,100μg/kg，用25ml60％的甲醇-pbs溶液渦旋振蕩15min，9000g離心10min，上清經(jīng)pbs稀釋后待用。

間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)：

用pbs(0.01m，ph7.4)將afb1人工抗原稀釋至0.25μg/ml，100μl/孔，包被于酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜，含0.5％tween-20(v/v)的磷酸緩沖液(pbst)洗板5次，拍干板條，加入3％脫脂牛奶(w/v)，300μl/孔，37℃封閉2h。pbst洗板3次后，每孔加入50μl加入本發(fā)明針對(duì)afb1單域重鏈抗體和50μlafb1標(biāo)準(zhǔn)品溶液或待測(cè)樣品，水平方向輕輕混勻，37℃溫育1h。pbst洗板5次，拍干，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗histag標(biāo)簽抗體，100μl/孔，37℃溫育1h。pbst洗板5次，拍干，加入100μl/孔tmb顯色液，37℃避光顯色5min。加入50μl/孔終止液(2mh2so4)，酶標(biāo)儀讀數(shù)。根據(jù)測(cè)定的吸光值計(jì)算樣品中afb1的含量。

sequencelisting

<110>南昌大學(xué)

<120>特異識(shí)別afb1的納米抗體

<130>2015

<160>21

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>prt

<213>人工序列

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151015

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202530

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354045

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115120125

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<213>人工引物

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<220>

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