一種恒河猴外周血單核巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及恒河猴外周血單核巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)方法，具體為分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，收集的外周血單個(gè)核細(xì)胞用PBS重懸、洗滌2次，洗過的細(xì)胞經(jīng)離心回收，每次1200rpm離心8min，最后用含2%-4%猴自體血清、1%青鏈霉素和1‰HEPES的RPMI1640培養(yǎng)液重懸，重懸的細(xì)胞的密度在3×106個(gè)細(xì)胞/ml，立即加入到CELLBINDSurface的96孔培養(yǎng)板，0.8×106個(gè)細(xì)胞/孔，或48孔培養(yǎng)板，3×106個(gè)細(xì)胞/孔中培養(yǎng)，24h后將未貼壁細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)液洗棄，之后用含2%-4%猴自體血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞，以后每2~3天換一次培養(yǎng)液，7天后觀察細(xì)胞形態(tài)，判定細(xì)胞分化結(jié)果。分化培養(yǎng)得到的恒河猴單核巨噬細(xì)胞純度高，具有典型巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)特性。該方法簡單、經(jīng)濟(jì)、有效。
【專利說明】-種恒河猴外周血單核巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種恒河猴外周血單核巨噬細(xì)胞的培 養(yǎng)和鑒定方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 巨噬細(xì)胞分布于機(jī)體的多種組織中，其功能不僅僅限于清除體內(nèi)垃圾，并且在機(jī) 體的不同組織和器官中也發(fā)揮了監(jiān)視入侵病原微生物及誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答等多種生理功 能。在機(jī)體與病原微生物密切接觸的免疫前沿器官內(nèi)有大量巨噬細(xì)胞，如淋巴系統(tǒng)、肺、 腸的固有層等。巨噬細(xì)胞"常駐"各組織器官中，通過清除凋亡和壞死細(xì)胞及外來入侵 微生物，發(fā)揮其生理平衡和免疫功能（Gordon S, Taylor PR:Monocyte and macrophage heterogeneity. Nature Reviews Immunology[J]2005;5:953-964)。巨噬細(xì)胞可引起適度 的對抗感染的免疫反應(yīng)，能通過吞噬和識(shí)別病原微生物誘導(dǎo)天然免疫，亦可通過發(fā)揮抗原 遞呈功能激活T細(xì)胞，從而引起獲得性免疫應(yīng)答（Peiser L, Gordon S:The function of scavenger receptors expressed by macrophages and their role in the regulation of inflammation. Microbes and Infection[J]2001 ；3:149-159 ；Peiser L, Mukhopadhyay S,Gordon S: Scavenger receptors in innate immunity. Current Opinion in Immunology [J]2002 ; 14:123-128 ;Aderem A:Phagocytosis and the inflammatory response. Journal of Infectious Diseases[J]2003 ;187:S340-S345)〇
[0003] 分離培養(yǎng)巨噬細(xì)胞對免疫學(xué)與病毒學(xué)等相關(guān)研究十分重要，因此，有必要建立分 化培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的方法。由于組織中的巨噬細(xì)胞很難分離和富集，使用外周血單核細(xì)胞 體外分化培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，建立體外培養(yǎng)單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞已成為廣泛接受的科學(xué)手 段。盡管已有諸多有關(guān)體外分化培養(yǎng)人巨嗤細(xì)胞的方法學(xué)的報(bào)道（Plesner A: Increasing the yield of human mononuclear cells and low serum conditions for in vitro generation of macrophages with m-csf. Journal of immunological methods [J]2003 ； 279:287-295 ；Plesner A，Greenbaum CJ，Lernmark A： Low serum conditions for in vitro generation of human macrophages with macrophage colony stimulating factor. Journal of immunological methods[J]2001 ；249:53-61 ；Gersuk G，Hiraoka A，Marr KA: Human monocytes differentiate into macrophages under the influence of human kpb_ml5 conditioned medium. Journal ofimmunological methods[J]2005 ； 299:99-106)，但有關(guān)體外培養(yǎng)非人靈長類動(dòng)物單核巨噬細(xì)胞的報(bào)道卻十分有限。鑒于非 人靈長類動(dòng)物，已被廣泛用于作為人類疾病的模型來研究，建立體外培養(yǎng)非人靈長類動(dòng)物 原代單核巨噬細(xì)胞的方法十分必要。Rozner等在RPMI-1640中加入1%人血清、M-CSF 及IL-Ιβ成功使用恒河猴外周血單核細(xì)胞分化培養(yǎng)巨噬細(xì)胞（Rozner AE，Dambaeva SV,Drenzek JG，Durning M，Golos TG:Generation of macrophages from peripheral blood monocytes in the rhesus monkey. Journal of immunological methods[J]2009 ； 351:36-40) ;Sisk等利用恒河猴和短尾猴的外周血，通過在HBSS培養(yǎng)基中加入M-CSF 及20%的自體血清，體外分化培養(yǎng)獼猴原代巨噬細(xì)胞（Sisk JM，Witwer KW，Tarwater PM, Clements JE:Siv replication is directly downregulated by four antiviral mirnas. Retrovirology[J]2013 ;10:95)。盡管這些方法的確能在體外分化培養(yǎng)猴巨噬細(xì) 胞，但這些方法存在以下缺點(diǎn)：1)需在培養(yǎng)基中加入細(xì)胞生長因子，除了大大增加實(shí)驗(yàn)的 費(fèi)用外，這些細(xì)胞生長因子（巨噬細(xì)胞集落刺激因子M-CSF和白細(xì)胞介素 IL-Ιβ等）在 促進(jìn)單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞的同時(shí)，也能激活巨噬細(xì)胞，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果；2)由于人血清 中的多種抗原成分可激活或抑制非人靈長類動(dòng)物巨噬細(xì)胞，因此，在培養(yǎng)基中加入人血清 也會(huì)直接或間接地影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；3)盡管將高濃度的自體血清用于體外分化培養(yǎng)單核巨 噬細(xì)胞沒有環(huán)境改變的影響，含有能夠最大限度的滿足細(xì)胞生長分化所需要的各種理化因 素，但用于試驗(yàn)的非人靈長類動(dòng)物如獼猴體重僅僅4?5kg，與人類比較個(gè)體非常小，全身 血容量少，因此需要在保證體外分化培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞正常生長的前提下降低自體血清的用 量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明是針對目前體外培養(yǎng)非人靈長類動(dòng)物外周血單核巨噬細(xì)胞存在的問題而 做出的，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種用于分離和培養(yǎng)外周血單核巨噬細(xì)胞的可重復(fù)性 方法，使用的RPMI1640培養(yǎng)基中加入低濃度（2^-4%)的自體血清，不加細(xì)胞生長因子， 能較快且穩(wěn)定地在體外培養(yǎng)出高純度的，具有典型巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)特性的恒河猴 單核巨噬細(xì)胞。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的體外培養(yǎng)恒河猴外周血單核巨噬細(xì)胞的方法，其 步驟是：
[0006] 1、分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC);
[0007] 2、培養(yǎng)收集的PBMCs :收集的PBMCs用PBS重懸、洗滌2次，洗過的細(xì)胞經(jīng)離心回 收（每次1200rpm離心8min)，最后用含2% -4%猴自體血清、1%青鏈霉素和IXqHEPES的 RPMI 1640培養(yǎng)液重懸（重懸的細(xì)胞的密度在3X 106個(gè)細(xì)胞/ml)。立即加入到CELLBIND Surface的96孔培養(yǎng)板（0. 8 X 106個(gè)細(xì)胞/孔）或48孔培養(yǎng)板（3 X 106個(gè)細(xì)胞/孔）中 培養(yǎng)，24h后將未貼壁細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)液洗棄，之后用含2% -4%猴自體血清的完全培 養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞。以后每2?3天換一次培養(yǎng)液，7天后觀察細(xì)胞形態(tài)，判定細(xì)胞 分化結(jié)果；
[0008] 3、培養(yǎng)細(xì)胞鑒定，包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面⑶14表達(dá) 水平、細(xì)菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS)刺激后巨噬細(xì)胞特異性細(xì)胞因子的表達(dá)檢 測；
[0009] 所述的完全培養(yǎng)基含2%的恒河猴自體血清；
[0010] 其中細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，將培養(yǎng)第4天和第7天的貼壁細(xì)胞直接置于倒置顯顯微鏡 下，高倍鏡（200x)觀察、拍照；
[0011] 巨噬細(xì)胞表面抗原⑶14表達(dá)水平的檢測，采用如下步驟：分化培養(yǎng)第4天和第7 天的恒河猴單核巨噬細(xì)胞先用PBS洗3遍，加0. 25%的胰酶消化5分鐘至大部分細(xì)胞收縮 變圓，加入含2%自體血清的完全培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞吹打懸浮，收集細(xì)胞。繼續(xù)用PBS 洗2遍后加50 μ 1 PBS重懸，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，并加入CD14-Percp-Cy5. 5 (BD，USA)抗體 2μ 1，陰性對照管加 2μ 1 同型（Isotype)抗體 IgG2-PerCp-Cy5. 5(BD，USA)，4°C避光孵育 15分鐘后用PBS洗2遍，去除多余抗體后加入固定液（2%多聚甲醛）重懸細(xì)胞，用流式細(xì) 胞儀（BD FACS Verse，USA)檢測細(xì)胞表面⑶14表達(dá)水平；
[0012] 細(xì)菌脂多糖LPS刺激后巨噬細(xì)胞特異性細(xì)胞因子的表達(dá)檢測，采用如下步驟：細(xì) 菌脂多糖LPS(10ng/ml或100ng/ml)加入到分化7天的恒河猴單核巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中，4h 后用 Tri-reagent (Molecular Research Center，Cincinnati，USA)提取總 RNA 用于實(shí)時(shí)定 量 RT-PCR 檢測細(xì)胞因子 TLR4、IFN- β、IFN- λ 3、TNF- a、IL-6、MxA 和 GAPDH 的 mRNA 表達(dá) 水平；
[0013] 猴免疫缺陷病毒SIV或人-猴嵌合免疫缺陷病毒SHIV感染恒河猴原代巨噬細(xì)胞， 并產(chǎn)生增殖性復(fù)制。使用l〇 3TCID50的病毒（SIVmac251、SIVmacl7E-Br和SHIV KU-1)感 染上述方法培養(yǎng)的猴巨噬細(xì)胞，37°C感染2h，RPMI 1640培養(yǎng)液洗3遍去除殘余病毒后，力口 入含2%猴自體血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每天收集細(xì)胞培養(yǎng)上清200 μ 1用于提取細(xì)胞 總RNA(存于-80°C )。提取的RNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄PCR得到cDNA產(chǎn)物，再對所得的cDNA進(jìn)行 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，測定病毒載量，計(jì)算每毫升上清中病毒的拷貝數(shù)，證明這些病毒可以在 巨噬細(xì)胞中擴(kuò)增，因此，本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法獲得的恒河猴外周血單核巨噬細(xì)胞可以應(yīng) 用于治療或預(yù)防HIV藥物的篩選。
[0014] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0015] 本研究提供了一種簡單、經(jīng)濟(jì)、有效地體外培養(yǎng)分化和鑒定恒河猴巨噬細(xì)胞的方 法。這種方法適于原代恒河猴單核細(xì)胞的貼壁和分化，分化出的恒河猴單核巨噬細(xì)胞純度 高，且經(jīng)過7天培養(yǎng)后的細(xì)胞具有典型的巨噬細(xì)胞形態(tài)特征和免疫學(xué)特性，此外，我們的方 法能避免細(xì)胞被活化，降低對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾、步驟少，減少污染的機(jī)會(huì)，適合于需使用恒 河猴單核巨噬細(xì)胞的科研工作及治療或預(yù)防HIV藥物的篩選。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為恒河猴外周血單核細(xì)胞分化培養(yǎng)第4天和第7天200倍倒置顯微鏡下觀察 圖，比例尺=50 μ m ;
[0017] A為經(jīng)過貼壁培養(yǎng)第4天的細(xì)胞鏡下生長形態(tài)；B為經(jīng)過貼壁培養(yǎng)第7天的細(xì)胞鏡 下生長形態(tài)；
[0018] 圖2為恒河猴外周血單核細(xì)胞分化培養(yǎng)第4天和第7天細(xì)胞表面抗原⑶14表達(dá) 示意圖；
[0019] A為經(jīng)過貼壁培養(yǎng)第4天的細(xì)胞表面抗原⑶14表達(dá)；B為經(jīng)過貼壁培養(yǎng)第7天的 細(xì)胞表面抗原⑶14表達(dá)；
[0020] 圖3為貼壁培養(yǎng)第7天，不同濃度胎牛血清和自體血清對恒河猴單核巨噬細(xì)胞分 化的作用，比例尺=50 μ m ;
[0021] 圖4為在10ng/ml或100ng/ml LPS刺激的誘導(dǎo)下，分化7天的恒河猴外周血單核 巨噬細(xì)胞特異性細(xì)胞因子表達(dá)水平比較圖；
[0022] A為培養(yǎng)液中未加 M-CSF培養(yǎng)分化的恒河猴外周血單核巨噬細(xì)胞特異性細(xì)胞因子 表達(dá)水平；B為培養(yǎng)液中加入M-CSF(10ng/ml)培養(yǎng)分化的恒河猴外周血單核巨噬細(xì)胞特異 性細(xì)胞因子表達(dá)水平；
[0023] 圖5為猴免疫缺陷病毒SIV或人-猴嵌合免疫缺陷病毒SHIV在猴巨噬細(xì)胞中的 增殖性復(fù)制及細(xì)胞病變示意圖；
[0024] A為SIVmac251、SIVmacl7E-Br和SHIVKU-1在培養(yǎng)7天分化良好的恒河猴原代巨 噬細(xì)胞中復(fù)制示意圖；B為未感染或感染SIVmacl7E-Br的恒河猴原代巨噬細(xì)胞示意圖，t匕 例尺=50 μ m ;
[0025] 圖6為聚肌胞苷酸（PolyI:C)抑制猴免疫缺陷病毒（SIV)或人-猴嵌合免疫缺陷 病毒（SHIV)在恒河猴巨噬細(xì)胞中的復(fù)制示意圖；

【具體實(shí)施方式】
[0026] 現(xiàn)結(jié)合以下實(shí)施例來更加詳細(xì)地描述本發(fā)明的用于非人靈長類動(dòng)物外周血單核 巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定方法。提供這些實(shí)施例的目的僅在于示例性地說明本發(fā)明，不能將 其理解為是對本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)的限制。
[0027] 本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理 解的含義。
[0028] 相關(guān)溶液如下：
[0029] 磷酸鹽緩沖液/PBS ρΗ7· 4
[0030] 淋巴細(xì)胞分離液/Ficoll (GE Healthcare)
[0031] 細(xì)菌脂多糖/LPS (InvivoGen公司）
[0032] 完全培養(yǎng)液（體積百分比）：96. 9% RPMI 1640培養(yǎng)液（Gibco, 11875-093) ;2%恒 河猴自體血清；1%青鏈霉素（l〇4U/ml) jQ/^HEPES/^-O-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸（Gibco， 15630-080,10mol/L)
[0033] 【實(shí)施例1】恒河猴外周血單核巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)
[0034] 用氯胺酮對健康成年（4-5歲）中國恒河猴進(jìn)行肌注麻醉（10mg/kg)，分別用含肝 素鈉抗凝的真空采血管采集靜脈血5-10ml和無抗凝劑真空采血管采集全血5ml。抗凝血用 于PBMCs的分離，非抗凝血自凝后用于猴血清的分離。將抗凝全血（5-10ml)用磷酸鹽緩沖 液（PBS)對倍稀釋，然后緩慢加入到稀釋血液1/2體積的淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll)上層， 22°C 1800rpm/min離心30分鐘，吸出介于血漿稀釋液與Ficoll之間的PBMCs層。收集的 細(xì)胞用等體積PBS重懸、洗滌2次，洗過的細(xì)胞經(jīng)離心回收（每次1200rpm離心8分鐘）， 最后用含2 %猴自體血清、1 %青鏈霉素和IXqHEPES (4-(2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸）的 RPMI1640培養(yǎng)液重懸（重懸的細(xì)胞的密度在3 X 106個(gè)細(xì)胞/ml)。分離出的恒河猴PBMCs 立即加入CELLBINDSurface的96孔培養(yǎng)板（0. 8 X 106個(gè)細(xì)胞/孔）或48孔培養(yǎng)板（3 X 106 個(gè)細(xì)胞/孔）中培養(yǎng)。24h后將未貼壁細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)液洗棄，之后用含2%猴自體 血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞。將培養(yǎng)第4天和第7天的貼壁細(xì)胞直接置于倒置 顯微鏡下，高倍鏡（200x)觀察、拍照，觀察細(xì)胞形態(tài)，判定細(xì)胞分化結(jié)果。分化良好的恒河 猴單核巨噬細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)，占據(jù)培養(yǎng)板板底的大部分區(qū)域，細(xì)胞的胞體形態(tài)多樣，多數(shù)呈 長梭形，或不規(guī)則形，邊緣多不整齊，有的可見偽足。細(xì)胞核形態(tài)呈圓或橢圓，亦有腎形，位 于細(xì)胞中央或偏一側(cè)，胞質(zhì)多少不一，有時(shí)可見空泡或包涵體（如圖1)。
[0035] 【實(shí)施例2】流式細(xì)胞術(shù)鑒定培養(yǎng)的恒河猴外周血單核巨噬細(xì)胞
[0036] 分化培養(yǎng)第4天和第7天的恒河猴單核巨噬細(xì)胞先用PBS洗3遍，加0. 25%的 胰酶消化5分鐘至大部分細(xì)胞收縮變圓，加入含2%自體猴血清的完全培養(yǎng)基終止消化， 將細(xì)胞吹打懸浮，收集細(xì)胞。繼續(xù)用PBS洗2遍后加50 μ 1 PBS重懸，制成單個(gè)細(xì)胞懸液， 并加入⑶14-Percp_Cy5. 5 〇D，USA)抗體2 μ 1，陰性對照管加2 μ 1同型（Isotype)抗體 IgG2-PerCp-Cy5. 5 (BD，USA)，4°C避光孵育15分鐘后用PBS洗2遍，去除多余抗體后加入固 定液（2%多聚甲醛）重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀（BD FACS Verse，USA)檢測細(xì)胞表面⑶14 表達(dá)水平。經(jīng)檢測，經(jīng)過4天和7天分化培養(yǎng)得到的恒河猴單核巨噬細(xì)胞表面⑶14的陽 性表達(dá)率分別為91. 7±2. 33%和96. 4±1. 93% (如圖2)。
[0037]【實(shí)施例3】不同濃度猴自體血清或胎牛血清對恒河猴單核巨噬細(xì)胞分化的作用
[0038] 用含2%，4%，8%和10%猴自體血清或胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)置于96孔 (0. 8 X 106個(gè)細(xì)胞/孔）或48孔（3 X 106個(gè)細(xì)胞/孔）培養(yǎng)板中的猴PBMCs，24h后將未貼壁 細(xì)胞洗棄，繼續(xù)培養(yǎng)7天后拍照。如圖3所示（圖中所有圖比例尺一致），對恒河猴單核巨噬 細(xì)胞分化的作用，猴自體血清優(yōu)于胎牛血清，低比例自體血清優(yōu)于高比例血清。隨著血清比 例降低，貼壁細(xì)胞增多，且分化的巨噬細(xì)胞形態(tài)一致性高。含2%猴自體血清的RPMI 1640 培養(yǎng)條件下，大多數(shù)（>85%)單核細(xì)胞能貼壁，并分化為巨噬細(xì)胞。相比而言，含2%-10% 的胎牛血清或高濃度（4% -10% )猴自體血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)下，猴單核細(xì)胞的 貼壁和分化較差（如圖3)。分化良好的巨噬細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)，占據(jù)板底大部分區(qū)域。胞體 形態(tài)多樣，多數(shù)呈長梭形，或不規(guī)則形，邊緣多不整齊，有的可見偽足（圖ΙΑ、B)，細(xì)胞核形 態(tài)呈圓或橢圓，亦有腎形，位于細(xì)胞中央或偏一側(cè)，胞質(zhì)多少不一，有時(shí)可見空泡或包涵體。
[0039] 【實(shí)施例4】不同濃度LPS刺激的誘導(dǎo)下，比較培養(yǎng)液中未加 M-CSF和加入M-CSF 分化7天的恒河猴外周血單核巨噬細(xì)胞特異性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平
[0040] 細(xì)菌脂多糖LPS (10ng/ml或100ng/ml)加入到分化7天的恒河猴單核巨噬 細(xì)胞培養(yǎng)液中（此培養(yǎng)液中未加 M-CSF)，4h后用Tri-reagent (Molecular Research Center，Cincinnati，USA)提取總RNA用于實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測細(xì)胞因子TLR4、IFN-β、 IFN- λ 3、TNF- a、IL-6、MxA 和 GAPDH 的 mRNA 表達(dá)水平。使用 NanoDrop2000 (Thermo, USA)測定細(xì)胞總RNA濃度，取1 μ g總RNA用于mRNA表達(dá)水平檢測。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Promega，USA)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用隨機(jī)引物37°C擴(kuò)增lh，然后95°C 5分鐘終止反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn) 物4°C保存。實(shí)時(shí)定量PCR用SYBR green Supermix(Bi〇-Rad，USA)試劑盒。反應(yīng)條件為 95°〇111^11，951：58 - 601：108,40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)定量？〇?引物序列如表1所示。（^值相對 GAPDH進(jìn)行均一化，采用方法計(jì)算mRNA的表達(dá)水平。如圖4A所示，分化培養(yǎng)得到的 恒河猴單核巨噬細(xì)胞對LPS敏感。在LPS刺激的誘導(dǎo)下，恒河猴單核巨噬細(xì)胞的TLR4、干擾 素（IFN-β，IFN-λ 3)、炎性因子（TNF-α，IL-6)和干擾素誘導(dǎo)因子（MxA)表達(dá)顯著升高，與 未用LPS刺激細(xì)胞相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且表達(dá)水平與LPS誘導(dǎo)劑量成正相關(guān)。
[0041] 培養(yǎng)液中加入M-CSF(10ng/ml)培養(yǎng)分化的巨噬細(xì)胞的部分信號通路被激活，LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的表達(dá)相對較低（如圖4B)，與未加 M-CSF培養(yǎng)的細(xì)胞相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。
[0042] 表1實(shí)時(shí)定量PCR所用引物序列
[0043]

【權(quán)利要求】
1. 一種恒河猴外周血單核巨噬細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟： A、 分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC); B、 培養(yǎng)收集的PBMCs :收集的PBMCs用PBS重懸、洗滌2次，洗過的細(xì)胞經(jīng)離心回收， 每次1200 rpm離心8 min，最后用含2%-4%猴自體血清、1%青鏈霉素和1%。HEPES的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，重懸的細(xì)胞的密度在3 X 106個(gè)細(xì)胞/ml，立即加入到CELLBIND Surface 的96孔培養(yǎng)板，0. 8 X 106個(gè)細(xì)胞/孔，或48孔培養(yǎng)板，3 X 106個(gè)細(xì)胞/孔中培養(yǎng)，24h后將 未貼壁細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)液洗棄，之后用含2%-4%猴自體血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 貼壁的細(xì)胞，以后每2~3天換一次培養(yǎng)液，7天后觀察細(xì)胞形態(tài)，判定細(xì)胞分化結(jié)果； C、 培養(yǎng)細(xì)胞鑒定：包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面⑶14表達(dá)水平、 細(xì)菌脂多糖刺激后巨噬細(xì)胞特異性細(xì)胞因子的表達(dá)檢測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒河猴外周血單核巨噬細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，含猴自 體血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中猴自體血清的濃度為2%。
3. 權(quán)利要求1所述方法制備的恒河猴外周血單核巨噬細(xì)胞應(yīng)用于治療或預(yù)防HIV藥物 的篩選。
【文檔編號】C12Q1/02GK104232579SQ201410510022
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】桑明, 霍文哲, 劉金彪, 代明, 周立, 高建峰, 楊四軍, 劉航 申請人:武漢大學(xué)