一種用于誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)核特異性細(xì)胞因子的融合蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)中的蛋白領(lǐng)域，具體涉及一種用于誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)核特異性細(xì)胞因子的融合蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病(tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種傳染病，近年來隨著流動(dòng)人口增加、人類免疫缺陷病毒(HIV)與結(jié)核桿菌伴發(fā)感染以及結(jié)核桿菌多重耐藥性菌株的出現(xiàn)，使全球結(jié)核病疫情增高，給全球結(jié)核病的防治提出了新的挑戰(zhàn)。全世界約有1/3的人口感染結(jié)核桿菌，每年新發(fā)結(jié)核病人約900萬，每年約有300萬人死于結(jié)核病，結(jié)核病已成為全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之一。中國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，活動(dòng)性肺結(jié)核病人數(shù)居世界第二位。
[0003]結(jié)核分枝桿菌是一種典型的胞內(nèi)感染菌，機(jī)體對(duì)其免疫機(jī)制主要是以T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫。結(jié)核分枝桿菌通過呼吸道進(jìn)入肺部，定植于肺泡巨噬細(xì)胞，逃逸宿主免疫防御機(jī)制；同時(shí)，原肺泡中未活化的樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DC)抗菌活性弱，但可將結(jié)核分枝桿菌吞噬并迀移到其他組織，通過MHC將抗原提呈于T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致其活化，活化的T淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子(INF-γ、IL-2與TNF-α等)，這些細(xì)胞因子可激活其他免疫細(xì)胞，并共同作用于病灶中的結(jié)核分枝桿菌。根據(jù)這一免疫機(jī)制，通過對(duì)已感染結(jié)核分枝桿菌的患者及健康人血液中的細(xì)胞因子進(jìn)行分析對(duì)比，發(fā)現(xiàn)感染結(jié)核分枝桿菌的患者其血液中INF- γ、IL-2、TNF-α的濃度明顯升高。
[0004]使用體外誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生結(jié)核相關(guān)細(xì)胞因子是目前診斷結(jié)核病的主要方式。外周血是人類免疫系統(tǒng)研究的主要對(duì)象，其中的PBMC包括淋巴細(xì)胞(Τ淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞)、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。將已經(jīng)感染了結(jié)核分枝桿菌的患者的外周血采出，提取其中的PBMC，并采用結(jié)核相關(guān)抗原對(duì)其進(jìn)行刺激，PMBC即可對(duì)抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞因子。由于直接使用結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)具有相當(dāng)?shù)奈ｋU(xiǎn)性，不利于進(jìn)行大量研究，因此研究人員采用提取的結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白進(jìn)行研究實(shí)驗(yàn)。
[0005]結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)是從結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中獲得的活性物質(zhì)，其主要成分是蛋白質(zhì)。pro可以刺激T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子，但對(duì)于已經(jīng)經(jīng)過卡介苗(BCG)免疫個(gè)體的樣本，PPD同樣能夠刺激其提取出來的PBMC產(chǎn)生結(jié)核相關(guān)細(xì)胞因子，因此PPD的特異性較低，還需尋找特異性更好的刺激物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述問題，尋找特異性更好的刺激物，本發(fā)明的目的在于提供一種用于誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)核特異性細(xì)胞因子的融合蛋白及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種融合蛋白，包含CFP-10、ESAT-6和EspC三個(gè)蛋白，蛋白之間通過連接肽連接。
[0008]優(yōu)選的，連接肽氨基酸序列為GGGGSGGGSGGSGS (SEQ ID NO:3)。
[0009]優(yōu)選的，CFP-10、ESAT_6和EspC蛋白為全序列蛋白或表達(dá)抗原活性的部分功能區(qū)域多肽。
[0010]優(yōu)選的，該融合蛋白為CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-EspC、CFP-10-連接肽-EspC-連接肽-ESAT-6、ESAT6-連接肽-CFPlO-連接肽-EspC、ESAT6-連接肽-EspC-連接肽-CFP10、EspC-連接肽-CFP-10-連接肽-ESAT-6或者EspC-連接肽-ESAT-6-連接肽-CFP-10。
[0011]優(yōu)選的，該融合蛋白為CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-EspC。
[0012]優(yōu)選的，融合蛋白CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-EspC的氨基酸序列如SEQID NO:1 所示。
[0013]優(yōu)選的，編碼融合蛋白CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-EspC的核酸序列如SEQID NO:2 所示。
[0014]上述任一項(xiàng)所述的融合蛋白能夠誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)核相關(guān)細(xì)胞因子的融合蛋白。
[0015]上述任一項(xiàng)所述的融合蛋白作為結(jié)核病檢測(cè)抗原的應(yīng)用。
[0016]上述任一項(xiàng)所述的融合蛋白在結(jié)核病預(yù)防治療中作為刺激物的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:
I)本發(fā)明提供了一種可以刺激PBMC產(chǎn)生結(jié)核相關(guān)細(xì)胞因子的融合蛋白，與現(xiàn)有的刺激物相比，其作用更高效、敏感性更強(qiáng)、特異性更高、刺激效果好。在本發(fā)明融合蛋白的作用下，PBMC可高效產(chǎn)生結(jié)核桿菌抗原特異性的IFN-γ、IL-2、TNF-α等結(jié)核相關(guān)因子，并且這一刺激誘導(dǎo)反應(yīng)不受BCG (卡介苗)的干擾。
[0018]2)本發(fā)明選用的連接肽鏈為經(jīng)過設(shè)計(jì)、篩選的可以顯著提高融合蛋白活性的短肽。目前蛋白領(lǐng)域研究中常用的連接肽主要有(Gly4Ser)3，而本發(fā)明所采用的連接肽氨基酸序列為GGGGSGGGSGGSGS，使得CFP-lO-ESAT-6-EspC融合蛋白中各自蛋白的空間構(gòu)象及活性得到更好的實(shí)現(xiàn)，與混合肽、或其他融合蛋白相比，本發(fā)明融合蛋白的特異性及誘導(dǎo)效果具有明顯的進(jìn)步。本發(fā)明提供的融合蛋白對(duì)結(jié)核病致病及免疫預(yù)防機(jī)制的研究有重要意義，從而對(duì)結(jié)核病的控制具有積極的意義。
【附圖說明】
[0019]圖1為ELISA檢測(cè)各組中PBMC在融合蛋白CFP-lO-ESAT-6-EspC作用下分泌細(xì)胞因子IL-2的情況；
圖2為ELISP0T檢測(cè)不同處理組中PBMC分泌IFN-γ的水平；
圖3為ELISP0T檢測(cè)不同處理組中PBMC分泌TNF-α的水平；
圖4為ELISP0T檢測(cè)各組PBMC分泌IFN-γ的水平；其中本發(fā)明融合蛋白的連接肽為GGGGSGGGSGGSGS ； (Gly4Ser) 3-融合蛋白組的連接肽為(Gly4Ser) 3，其他序列均與本發(fā)明融合蛋白相冋；
圖5為ELISP0T檢測(cè)各組PBMC分泌IFN-γ的水平；實(shí)驗(yàn)組孔中含有本發(fā)明融合蛋白，陽性對(duì)照組中含有植物凝集素PHA ;
圖6為ELISP0T檢測(cè)不同處理組中PBMC分泌IFN- γ的水平。
【具體實(shí)施方式】
[0020]一種融合蛋白，包含CFP-10、ESAT_6和EspC三個(gè)蛋白，蛋白之間通過連接肽連接。
[0021]優(yōu)選的，連接肽氨基酸序列為GGGGSGGGSGGSGS (SEQ ID NO:3)。
[0022]更優(yōu)選的，連接肽的堿基序列如SEQ ID NO:4所示。
[0023]優(yōu)選的，CFP-10、ESAT_6和EspC蛋白為全序列蛋白或表達(dá)抗原活性的部分功能區(qū)域多肽。
[0024]優(yōu)選的，該融合蛋白為CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-EspC、CFP-10-連接肽-EspC-連接肽-ESAT-6、ESAT6-連接肽-CFPlO-連接肽-EspC、ESAT6-連接肽-EspC-連接肽-CFP10、EspC-連接肽-CFP-10-連接肽-ESAT-6或者EspC-連接肽-ESAT-6-連接肽-CFP-10。
[0025]優(yōu)選的，該融合蛋白為CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-EspC。
[0026]優(yōu)選的，融合蛋白CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-EspC的氨基酸序列如SEQID NO:1 所示。
[0027]優(yōu)選的，編碼融合蛋白CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-EspC的核酸序列如SEQID NO:2 所示。
[0028]上述任一項(xiàng)所述的融合蛋白能夠誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)核相關(guān)細(xì)胞因子的融合蛋白。
[0029]上述任一項(xiàng)所述的融合蛋白作為結(jié)核病檢測(cè)抗原的應(yīng)用。
[0030]上述任一項(xiàng)所述的融合蛋白在結(jié)核病預(yù)防治療中作為刺激物的應(yīng)用。
[0031]上述任一項(xiàng)所述的融合蛋白作為刺激物，應(yīng)用于結(jié)核病致病及免疫預(yù)防機(jī)制的研究，以及進(jìn)一步的對(duì)結(jié)核病的控制中。
[0032]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0033]實(shí)施例1:CFP-10-ESAT-6-EspC融合蛋白目的基因合成及原核表達(dá)載體的構(gòu)建編碼 CFP-10、ESAT-6 和 EspC 蛋白的基因分別為因 ID: 886194，esat~6^
因ID: 862098，e印?基因ID: 885770。利用其全序列或者表達(dá)抗原活性的部分功能區(qū)域序列，設(shè)計(jì)引物。
[0034]I)分別用CFP10、ESAT-6和EspC的上下游引物，用PCR分別擴(kuò)增CFP_10、ESAT_6和EspC的目的片段，使用Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增并回收上述片段。
[0035]2)采用人工合成方式合成兩種帶有連接肽核苷酸序列的核苷酸鏈，其中一種核苷酸鏈(下文簡(jiǎn)稱連接肽鏈I)兩端分別包含CFP-10和ESAT-6部分序列，中間為連接肽的堿基序列(SEQ ID NO:4)，另一種核苷酸鏈(下文簡(jiǎn)稱連接肽鏈2)兩端分別包含ESAT-6和EspC部分序列，中間也為連接肽的堿基序列(SEQ ID NO:4)
3)取CFPlO DNA模板、連接肽鏈I的DNA模板各I μ 1，用CFPlO的上游引物和連接肽鏈I的下游引物進(jìn)行重疊PCR，獲取CFP-10